KR20220033465A - 전구 조절성 세포영양막 세포 및 그의 용도 - Google Patents

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자우-난 리
유타 리
토니 퉁-인 리
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Abstract

시험관내에서 생산된 전구 조절성 세포영약막 세포 및 그의 조성물이 본원에서 개시된다. 본원에 개시된 세포를 이용함으로써 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 또한 본원에서 개시된다.

Description

전구 조절성 세포영양막 세포 및 그의 용도
상호 참조
본 출원은 2019년 5월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/843,925를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
배경
기존의 배아 줄기 세포 및 iPS 세포의 특정한 단점을 극복하기 위한 대안으로서, 다양한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 신규 줄기 세포 요법이 요구된다.
참조로 포함됨
본원에서의 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 특히 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원에서의 용어와 포함된 참고문헌에서의 용어가 상충하는 경우, 본원에서의 용어가 우선한다.
발명의 내용란에서 제공되는 본 발명의 실시양태는 예시적일 뿐이고, 본원에서 개시된 선택적인 실시양태의 개관을 제공하는 것으로 의도된다. 예시적이고 선택적인 본 발명의 개요는 어떠한 청구범위의 범주도 제한하지 않고, 본원에서 개시되거나 구상되는 본 발명의 실시양태의 전체 범주를 제공하지 않으며, 본 개시내용 또는 임의의 청구된 본 발명의 실시양태의 범주를 제한하거나 구속하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
일부 측면에서, 단리된 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)으로서, 여기서 (i) prCTB가 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), CD56, 인슐린, 열 충격 단백질 90 (HSP90), CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현하고; (ii) prCTB가 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인 prCTB가 본원에서 개시된다. 일부 경우에, prCTB는 CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다.
일부 측면에서, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서 (i) 세포 집단이 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), CD56, 인슐린, 열 충격 단백질 90 (HSP90), CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현하고; (ii) 세포 집단이 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 세포 집단이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 집단의 적어도 약 10%는 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 2%는 CD4를 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 2%는 CD8을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 5%는 CD107을 발현하는 prCTB이다.
일부 측면에서, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서 (i) 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이거나; (ii) 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB이거나; (iii) 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB이거나; 또는 (iv) 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB이거나, 또는 그의 임의의 조합인 세포 집단이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, (i) 집단의 적어도 약 10%는 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이고; (ii) 집단의 적어도 약 2%는 CD4를 발현하는 prCTB이고; (iii) 집단의 적어도 약 2%는 CD8을 발현하는 prCTB이고; (iv) 집단의 적어도 약 5%는 CD107을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 세포 집단의 적어도 약 2%는 CD16, CD56, 및 CD107을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는 인터류킨 15 (IL-15)를 발현한다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG),　가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G), 전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 인터류킨 10 (IL-10), CD105, CD146, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 발현한다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는 신시틴, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 그의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비한다. 일부 경우에, 시토카인은 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5 (CCL5), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-3), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2 (CXCL2), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11 (CCL11), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24 (CCL24), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26 (CCL26), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22 (CCL22), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10), 프랙탈카인, 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4 (CCL4), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨 1α(IL-1α), 인터류킨 1β (IL-1β), 인터류킨 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12p40 (IL-12p40), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터페론 α (IFN-α) 또는 인터페론 γ (IFN-γ)를 포함한다. 일부 경우에, 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 AA (PDGF-AA), PDGF 동종이량체 BB (PDGF-BB), PDGF 이종이량체 (PDGF-AB), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질, FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1β (IL-1β), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, prCTB 또는 복수의 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에, prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에, prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 SOX2 단백질을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53, 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합의 발현이 결여된 융모막 융모-유래 선조 세포로부터 시험관내에서 분화된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 융모막 융모-유래 선조 세포로부터 시험관내에서 분화되고, 융모막 융모-유래 선조 세포 및 단리된 prCTB 둘 다는 열 충격 단백질 90 (HSP90)을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 인간 세포이다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원으로부터 유래된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 유전자 조작된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 세포 수용체, 면역학적 체크포인트 단백질, 시토카인, 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 T 세포 수용체 (TCR), B 세포 수용체 (BCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 측면에서, 제약상 허용되는 부형제 또는 담체; 및 본원에 기술된 바와 같은 prCTB 또는 세포 집단을 포함하는 제약 조성물이 본원에서 개시된다.
일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 prCTB 또는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 방법은 항원-보유 표적 세포를 사멸시킨다. 일부 경우에, 항원-보유 세포는 항원-제시 세포가 아니고, 예를 들어 수지상 세포, 대식세포, 또는 B 세포가 아니다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 암 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 방광암 세포, 골암 세포, 뇌암 세포, 유방암 세포, 자궁경부 암종, 결장직장암 세포, 식도암 세포, 위장암 세포, 조혈 악성종양, 두경부 편평세포 암종, 백혈병, 간암 세포, 폐암 세포, 림프종, 골수종, 비암 세포, 비인두암 세포, 구강암 세포, 구인두암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 육종, 위암 세포, 흑색종, 갑상선암 세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 병원체이다. 일부 경우에, 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프리온, 진균, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 항원-보유 표적 세포 집단의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%를 사멸시킨다. 일부 경우에, 방법은 염증 경로를 하향조절한다. 일부 경우에, 방법은 이식 거부, 감염, 감염과 연관된 내독성 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 전신 발병 소아 특발성 관절염 (JIA), 염증성 장 질환 (IBD), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 복강 질환, 담낭 질환, 모발둥지 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 췌장염, 수술로부터의 외상, 이식편-대-숙주 질환, 심장병, 골 재흡수, 화상 환자, 심근 경색증, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간 또는 폐 섬유증, 치주염, 또는 저염산증을 포함하는 질환 또는 병태를 치료한다. 일부 경우에, 방법은 자가면역 질환을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발근염, 만성 활동성 간염, 혼합형 결합 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 애디슨병, 백반증, 글루텐-민감성 장병증, 그레이브스병, 중증 근무력증, 자가면역 호중구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 류마티스 관절염, 경변증, 심상성 천포창, 자가면역 불임, 굿패스쳐병, 수포성 유천포창, 원판상 루푸스, 궤양성 결장염, 고밀도 침착병, 염증성 장 질환, 또는 건선을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 1형 당뇨병을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 이식 거부를 호전시킨다.
엑소솜을 포함하는 시크리톰, 및 제약상 또는 미용상 허용되는 부형제를 포함하며, 여기서 시크리톰이 케모카인, 시토카인, 예를 들어 인터류킨, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 포함하거나 또는 엑소솜이 그를 운반하는 것인 조성물로서, 세포를 함유하지 않는 조성물이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 시크리톰은 (i) CXCL2, MCP-1, 프랙탈카인, IP-10, MCP-3, 에오탁신, MIP-1β 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 케모카인; (ii) IL-6, IL-8, IL-4, IL-1RA, IL-10, IL-12P40, IL-15, IL-1α, IL-17A, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 인터류킨; 및 (iii) PDGF-AA, VEGF, bFGF, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 성장 인자를 포함하거나, 또는 엑소솜이 그를 운반한다. 일부 경우에, 조성물은 MCP-1, 및 CXCL2, IL-6, IL-8 및 VEGF 단백질 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함한다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:1 내지 약 2:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 3:1 내지 약 4:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 2:1 내지 약 3:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 3:1 내지 약 4:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4:1 내지 약 6:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 4:1 내지 약 6:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 7:1 내지 약 9:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA를 추가로 포함하고, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 3:1 내지 약 5:1의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA를 추가로 포함하고, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 6:1 내지 약 9:1의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA 및 G-CSF를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA 및 FGF-2 (bFGF)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 IP-10, 에오탁신, Flt-3L, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1b, IL-1a, IL-1RA, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12P40, IL-13, IL-15, IL-17A, CCL5 (RANTES), MDC, MCP-3, IL-12P70, IFNa, IFNr, PDGF-AB/BB, 또는 EGF 중 1개 이상의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 피부 병태의 조정을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 피부 병태를 조정하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 방법은 질환을 치료하거나 또는 미용 용도를 제공한다. 일부 경우에, 방법은 피부를 타이트닝한다. 일부 경우에, 방법은 피부를 수화시킨다. 일부 경우에, 방법은 피부를 회생시킨다. 일부 경우에, 조성물은 줄기 세포를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 조성물은 대상체에게 국소적으로, 피하로, 경피로, 근육내로, 또는 종양내로 투여된다. 일부 경우에, 조성물은 로션, 크림, 리퀴드, 겔, 에멀젼, 서스펜션, 페이스트, 스틱, 에어로졸, 폼, 패치, 파우더, 연고, 비드, 마스크, 패드, 시트, 상처 드레싱, 붕대 또는 그의 임의의 조합의 투여 형태이다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물이다. 일부 경우에, 대상체는 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다.
일부 측면에서, 줄기 세포를 섬유모세포 성장 인자, 및 뉴클레오시드, L-글루타민, L-글루타민을 포함하는 디펩티드, 혈소판 용해물 또는 그의 조합을 포함하는 배양 배지와 접촉시키는 것에 의해 시험관내에서 만능성 줄기 세포를 분화시키는 것을 포함하는, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 수득하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 배양 배지는 뉴클레오시드, 디펩티드, 및 혈소판 용해물을 포함한다. 일부 경우에, 배양 배지는 약 2 mM 내지 약 200 mM의 L-글루타민을 포함한다. 일부 경우에, 접촉은 약 24 시간 내지 48시간 동안 지속된다. 일부 경우에, 줄기 세포는 융모막 융모-유래 선조 세포이다. 일부 경우에, 방법은 prCTB로 분화되도록 섬유모세포 성장 인자와 접촉시키기 전에 줄기 세포를 배양 배지와 함께 배양하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 배양 배지는 항생제를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, 배양 배지는 레티노산을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 메르캅토에탄올, 니코틴아미드, 또는 그의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4, HGF, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 동물 성분을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 인간 유래 성분을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 혈청을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양 배지는 소 태아 혈청을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 섬유모세포 성장 인자는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)이다.
일부 측면에서, 단리된 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)으로서, 여기서 (i) prCTB가 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), CD56, 인슐린, 열 충격 단백질 90 (HSP90), CD4, CD16, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현하고; (ii) prCTB가 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인 prCTB가 본원에서 개시된다. 일부 경우에, prCTB는 암 세포 또는 병원체를 사멸시킨다. 일부 경우에, prCTB는, 예를 들어, 암 세포의 콜로니를 침윤시키는 것에 의해, 암 세포의 아폽토시스를 유도하고, 임의적으로 여기서 prCTB 자체는 암 세포와 접촉하는 것으로부터 아폽토시스가 진행되지 않는다. 일부 경우에, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 췌장암 세포, 유방암 세포, 간 종양 세포, 난소 종양 세포, 폐 종양 세포, 위 종양 세포, 흑색종 세포, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, prCTB는 염증 경로를 하향조절한다. 일부 경우에, prCTB는 CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, prCTB는 신시틴, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 그의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, prCTB는 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG),　가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G), 전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), CD105, CD146, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 발현한다. 일부 경우에, prCTB는 인간 세포이다. 일부 경우에, prCTB는 유전자 조작된다. 일부 경우에, 유전자 조작된 prCTB는 세포 수용체, 면역학적 체크포인트 단백질, 시토카인, T 세포 수용체 (TCR), B 세포 수용체 (BCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 외인성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, prCTB는 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합, 또는 상기 중 임의의 것을 운반하는 엑소솜을 분비한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 prCTB 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 측면에서, 복수의 본원에 개시된 prCTB를 포함하는 세포 집단이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, prCTB 집단의 적어도 약 10%는 CD16 및 CD56을 발현한다. 일부 경우에, prCTB 집단의 적어도 약 2%는 CD4를 발현하거나; prCTB 집단의 적어도 약 2%는 CD8을 발현하거나; prCTB 집단의 적어도 약 5%는 CD107을 발현하거나; 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, prCTB 집단의 적어도 약 10%는 CD16 및 CD56을 발현하고; prCTB 집단의 적어도 약 2%는 CD4를 발현하고; prCTB 집단의 적어도 약 2%는 CD8을 발현하고; prCTB 집단의 적어도 약 5%는 CD107을 발현한다. 일부 경우에, prCTB 집단의 적어도 약 2%는 CD16, CD56, 및 CD107을 발현한다.
본 발명의 다양한 측면이 첨부된 청구범위에서 상세하게 기재된다. 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 실시양태를 기재하는 하기의 상세한 설명, 및 하기 내용의 첨부 도면을 참조로 본 발명의 특색 및 장점의 더 양호한 이해가 수득될 것이다:
도 1A-1D는 인간 영양막 줄기 (hTS) 세포에서의 인슐린 발현의 특징을 나타낸다. 도 1A는 hTS 세포에서의 인슐린 합성 및 분비의 분자성 메커니즘의 개략도이다. 도 1B는 ChIP-qPCR 분석에 의해 CREB1 및 MAFA 항체가 CREB1 및 MAFA 수준을 감소시킴으로써 인슐린 (INS) 유전자 전사를 억제하였음을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 5; 입력: 양성 대조군 (100%); IgG: 음성 대조군. 도 1C는 시크리톰 분석에서 RIA에 의해 글루코스 (Gluc; 20 mM) 및 술포닐우레아 (Gli, 글리클라지드; 10 μM)가 hTS 세포 (1×106개 세포)에서 인슐린 분비를 촉진한 한편, VDCC 억제제 니페디핀 (Nif; 10 μM)은 인슐린 분비를 억제한다는 것을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 3; 스튜던트 t-검정, *p<0.05를 대조군과 비교 시 유의한 것으로 함. 도 1D는 hTS 세포에서의 생물학적 역할을 특징으로 하는 면역반응성 분자의 대표적인 영상을 나타낸다. 척도 막대는 지시된 바와 같다.
도 2A-2M은 인슐린-발현 hTS 세포에서의 Gαq/11/PIP2/IP3/IP3R/CaMKII/CREB1 및 Gβ/PI3K/AKT/GSK3β/MAFA 신호전달 경로를 도해한다. 도 2A-2C는 hTS 세포에서, 글루코스 (20 mM)가 세포막에서 감미 수용체 T1R2/T1R3의 신속하고 일시적인 활성화를 자극하였음을 qPCR 분석 (도 2A)에 의해 나타내고, 결과적으로 Gαq/11 및 Gβ (도 2B)를 포함하는 G 단백질 신호를 15분 내에 활성화시킨다는 것을 블롯팅 분석 (도 2C)에 의해 나타낸다. 이러한 작용은 T1R2/T1R3 억제제 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D; 100 μg)에 의해 억제되었다 (도 2B). 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 5. 스튜던트 t-검정: *p<0.05 통계적 유의성. 도 2D-2F는 블롯팅 분석에 의해 Gαq/11/PIP2/IP3/IP3R/CaMKII/CREB1 경로의 확립을 나타낸다. 활성 Gαq/11이 이노시톨 트리포스페이트 (IP3)를 세포질 세망 (ER)의 막에서 그의 수용체 IP3R에 작용하도록 유도하여, 세포내 칼슘 수준을 상승시켰고, 이는 결과적으로 CaMKII를 활성화시킨다. 이러한 작용은 Gαq/11과 CaMKII 분자를 연결하는 shGα에 의해 억제되었다. 그 후, CaMKII는 인산화 (p)를 통해 하류 CREB1을 활성화시키고, 이는 CaMKII 억제제 KN93을 사용하여 추가로 입증되었다. 도 2G-2I는 Gβ/PI3K/AKT/GSK3α/β경로의 확립을 도해한다. 활성 Gβ가 ser473 부위에서의 AKT의 인산화 (pAKT), 및 ser21/9 부위에서의 인산화를 통한 그의 하류의 억제성 GSK3α/β에 의해 PI3K/AKT 신호전달을 신속하게 유도하였다. 이러한 작용은 PI3K 억제제 LY294002 및 AKT 억제제 MK2206에 의해 억제되었다. 그 후, 억제성 pGSKα/β가 핵 국소화를 위해 pMAFA를 촉진하였고, 이는 핵에서의 존재가 확인되었으며, pMAFA 발현이 GSK3 억제제 SB216763에 의해 억제되었다. 도 2J는 pCREB1 및 pMAFA 둘 다가 핵에 진입하였음을 나타내고, 이는 핵 세포질 분획화에 의해 증명된다. β-액틴: 로딩 대조군; α-튜불린 및 H3은 각각 세포질 및 핵 구획을 나타낸다. 도 2K는 qPCR 분석에 의해 CREB1 shRNA로의 전처리가 hTS 세포에서 글루코스 자극 (Glu; 20 mM)에 반응하여 인슐린 발현을 유의하게 감소시켰지만, PDX1 shRNA는 그렇지 않았음을 나타낸다. C: 대조군, shGFP: 양성 대조군. 스튜던트 t-검정; *: p < 0.05, n = 4. 도 2L은 유동 세포측정법에 의해 2개의 상이한 항-인슐린 항체로 2개의 hTS 세포주에서의 인슐린 발현을 나타낸다. 이소타입: 대조군. 도 2M은 나이브 hTS 세포가 스트레스 단백질 또는 증식 마커 Ki67을 발현하지 않지만, HSP90을 발현한다는 것을 면역세포화학에 의해 나타낸다. 척도 막대: 50 μm.
도 3은 prCTB에서의 PDX1, HNF-1β, NGN3, SOX9, NKX6.1, 및 인슐린을 포함한인슐린-관련 면역반응성 분자의 대표적인 영상을 나타낸다. 척도 막대: 50 μm.
도 4A 내지 4F가 본원에서 기술된다. 도 4A는 면역세포화학적으로 hTSC가 TGF-β1을 발현한다는 것을 나타낸다. 도 4B는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 bFGF (10 ng/ml)가 TGF-β1 및 비멘틴을 상향-조절하였지만, E-카드헤린을 하향-조절하였음을 나타내는 한편, 도 4D는 항-TGF-β1 항체가 이러한 반응을 중화하였음을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 3, 스튜던트 t-검정: 통계적 유의성: *p<0.05, **p<0.001. 도 4C는 면역세포화학에 의해 bFGF (10 ng/ml)가 TGF-β1 및 비멘틴을 상향-조절하였지만, E-카드헤린을 하향-조절하였음을 나타낸다. 도 4E는 bFGF (10 ng/ml)가 1일 인큐베이션 후 hTSC의 형태학적 변화를 유도하여, 세포 형상은 긴 방추형에서 짧아진 비대형으로, 핵 형상은 타원형에서 더 둥근형으로 전환시켰음을 나타낸다. 도 4F는 bFGF-유도 FOXA2 활성화의 확인을 나타내고, 이에 의해 β-카테닌에 대한 shRNA의 존재 하에 FOXA2가 약화되었다. shGFP (비-특이적 shRNA)로 형질감염된 세포가 대조군으로서, β-액틴이 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 5A-5C는 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)의 생물학적 특성을 도해한다. 도 5A는 난관 자궁외 임신 (임신 7-8주)의 융모막 융모 내의 인슐린 발현과 연관된 면역반응성 분자 및 산화 스트레스 단백질의 대표적인 영상을 나타낸다. 척도 막대: 50 μm. 도 5B는 영상화에 의해 정상 임신 (임신 7-8주)의 융모막 융모 내의 인슐린 및 스트레스 단백질의 분포를 나타낸다. 척도 막대: 200 μm. 도 5C는 스트레스 단백질의 발현에서의 prCTB 및 hTS 세포의 차이의 개략도이고, 영양막 분화 경로 내의 정상적인 자궁 임신에서의 세포에 또한 비교된다.
도 6A 및 6B는 정상 임신과 고사 난자 사이의 융모막 융모 내의 스트레스 단백질 p53- 및 인슐린-발현 융합영양막 결절의 비교를 나타낸다. 스트레스를 받은 융합영양막 결절은 8주의 정상 임신에서 단일 융모막 융모에서 계수된 15개를 초과하는 양성 세포를 함유하는 영역에서 인슐린 및 p53을 발현하는 것에 의해 규정되는 한편 (도 6A); 임신 7-8주의 고사 난자가 있는 환자의 융모막 융모 (도 6B)는 (도 6B)에서 스트레스 융합영양막 결절이 발생하는 빈도가 (도 6A)에서의 것보다 1.96배 더 높다는 것을 나타낸다. 융합영양막 결절의 수는 80개의 필드 (도 6A) 및 50개의 필드 (도 6B)에서 2명의 보조자에 의해 독립적으로 계수되었다. 반면에 또 다른 25개의 필드는 제시되지 않는다. 도 6C는 세포 형질전환 동안의 만능성 전사 인자 발현의 변화를 나타내며, 4시간 유도에 의한 DE 스테이지에서 면역반응성 OCT4가 영상화되었지만, CDX2는 그렇지 않다.
도 7A 내지 7Q가 본원에서 기술된다. 도 7A는 PLUS가 있는 배양 배지 내의 hTS 세포 (좌측의 진한 칼럼) 및 prCTB 세포 (우측의 밝은 칼럼)로부터 분비된 엑소솜 (상단 패널), 및 사용된 PLUS 배지 내의 성분의 효과를 배제한 후의 나이브 hTS 세포 (좌측의 진한 칼럼) 및 나이브 prCTB (우측의 밝은 칼럼) 내에 존재하는 엑소솜 (하단 패널)의 루미넥스(Luminex) 분석을 나타낸다. 도 7B는 hTS 세포 (좌측) 및 prCTB (우측) 내의 다수의 수용체 분자의 존재를 실연하는 이뮤노블롯팅 검정법 결과를 나타낸다. 도 7C는 이뮤노블롯팅 분석에 의해 hTS 세포 및 prCTB로부터 방출된 단백질의 시크리톰 검정법 결과를 나타낸다. sHLA-G: 가용성 HLA-G. n = 3. 도 7D는 FACS 분석에 의해 hTSC가 혈관형성 인자 CD105 및 CD146을 발현한다는 것을 나타낸다. 도 7E는 hTS 세포 (좌측) 및 prCTB (우측) 내의 다수의 수용체 분자의 존재를 실연하는 이뮤노블롯팅 검정법 결과를 나타낸다. 도 7F는 이뮤노블롯팅 검정법에 의해 bFGF (10 ng/ml)가 STAT3, c-JUN, 및 Fas 리간드 (FasL)의 상향조절을, 그러나 Fas의 하향조절을 유도하였음을 나타낸다. 이러한 작용이 shFGFR1에 의해 억제되었다. shGFP가 음성 대조군으로서 사용되었다. 도 7G-7J는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 bFGF (10 ng/ml)가 CREB1 신호전달의 활성화를 유도하였음을 나타낸다. 도 7G는 bFGF가 그의 수용체 FGFR1 및 하류의 PI3K 신호를 활성화시켰고, 이는 FGFR 억제제 PD166866에 의해 억제되었음을 나타낸다. 도 7H는 PI3K가 AKT를 인산화 (p)시켜 PI3K/pAKT 신호전달을 형성시켰고, 이는 PI3K shRNA에 의해 억제되었음을 나타낸다. 도 7I는 pAKT가 그의 하류 CREB1을 활성화시켰고, 이는 AKT1 shRNA, AKT2 shRNA, 및 AKT3 shRNA를 포함하는 AKT 항체를 사용함으로써 중화되었음을 나타낸다. 도 7J는 면역침전 (IP) 검정법에 의해 pAKT가 직접적인 상호작용을 통해 그의 하류 CREB1을 활성화시켰음을 나타낸다. 도 7K는 bFGF (10 ng/ml)가 시간-의존적 방식으로 IL-6 (좌측 패널) 및 IL-8 (우측 패널)을 유도하였음을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 3개의 독립적인 세포주, 스튜던트 t-검정: 통계적 유의성: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 도 7L은 IL-6 (10 ng/ml)이 hTSC에서 IL-6R mRNA, CREB1 mRNA, 및 β-hCG mRNA를 상향조절하였고 (좌측 패널), IL-8 (30 ng/ml)이 CREB1 mRNA 및 CD56 mRNA를 상향조절하였지만, 통상적인 수용체 IL-8R은 그렇지 않았음 (우측 패널)을 나타내는 RT-qPCR 분석을 나타낸다. 데이터는 평균+/-SD를 나타냄, n = 4, 스튜던트 t-검정, 통계적 유의성 **p<0.01, ***p<0.001. 도 7M-7N은 웨스턴 블롯 검정법에 의해 IL-6이 β-hCG(+)CD56(+) prCTB를 생성시켰음을 나타낸다. 도 7M은 IL-6 (10 ng/ml)이 GnRHR 및 IL-6R을 통해 β-hCG를 유도하였고, 이는 GnRHR 억제제 엘라골릭스 소듐(Elagolix sodium) 및 CREB1 억제제 666-15에 의해 억제되었음을 나타낸다. 도 7N은 IL-8 (30 ng/ml)이 CXCR2/STAT3 신호전달을 통해 CD56을 유도하였고, 이는 CXCR2 억제제 SB225002 및 STAT3 억제제 스태틱(Stattic)에 의해 억제되었음을 나타낸다. 도 7O는 IL-8 (30 ng/ml)이 CXCR2/CREB1 및 CXCR2/STAT3 신호전달 경로 둘 다를 통해 CD4(+) prCTB를 생성시켰고, 이는 CREB1 억제제 666-15, CRCR2 억제제 SB225002, 및 STAT3 억제제 스태틱에 의해 억제되었음을 나타낸다. 도 7P는 IL-8 (30 ng/ml)이 CXCR2/STAT3 신호전달 경로를 통해 Foxp3을 유도하였고, 이는 CRCR2 억제제 SB225002 및 STAT3 억제제 스태틱 (E)에 의해 억제되었음을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 3개의 독립적인 세포주, 스튜던트 t-검정: 통계적 유의성 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 도 7Q는 면역세포화학적으로 bFGF가 prCTB에서 CD4 및 Foxp3의 공동-발현을 유도하였음을 나타낸다. 척도 막대: 50 μm.
도 8은 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 hTS 세포 및 prCTB 내의 CD 분자, 및 유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 hTS 세포 및 prCTB에서 검출된 T 세포 및 NK 세포의 하위유형의 마커를 열거하는 2개의 표를 나타낸다.
도 9A 내지 9N은 hTS 세포 및 prCTB 내의 CD 바이오마커의 분포에 대한 대표적인 세포 유동측정법 분석을 나타낸다. 도 9A-9K는 총 8개 중 대표적인 샘플에서의 FACS 플롯 분석을 나타내고, hTS 세포 (좌측 패널) 및 prCTB (우측 패널)에서CD3 및 CD45 (도 9A), CD34 (도 9B), 뿐만 아니라 CD3 및 gdTCR (도 9C)가 검출불가능하지만, 그러나 CD (16+56) 및 CD107a (도 9D), CD (16+56) (도 9E)이 검출가능하고, CD (16+56)이 검출가능하지만 CD4는 거의 없고 (도 9F), CD (16+56) 및 CD8이 검출가능하고 (도 9G), CD (16+56)이 검출가능하지만 CD19는 없고 (도 9H), CD107a가 검출가능하지만 CD4는 거의 없으며 (도 9I), CD107a 및 CD8이 검출가능하고 (도 9J), CD107a가 검출가능하지만 CD19는 거의 없음 (도 9K)을 나타낸다. 도 9L 및 9M은 hTS 세포 (흑색 칼럼) 및 prCTB (회색 칼럼)의 집단 내의 CD 분자 (도 9L) 및 NK 세포 및 T 세포의 하위유형 (도 9M)의 분포를 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 8개의 독립적인 샘플. 도 9N은 면역염색에 의해 prCTB에서의 CD11b 및 CD49f의 발현을 나타낸다.
도 10A 내지 10K가 본원에서 기술된다. 도 10A-10D는 트랜스웰 침습 및 이동 검정법의 결과를 나타낸다. MCP-1 (도 10A 및 10B) 및 CXCL2 (도 10C 및 10D)가 hTSC 및 prCTB 둘 다의 이동을 용량- 및 시간-의존적 방식으로 유의하게 유도하였다. 도 10E는 임신 7-8주의 정상 융모막 융모에서의 면역조직화학을 나타내고, 침습성 EVT가 면역반응성 p53(+), 신시틴, β-hCG, 및 HLA-G 분자를 발현하였음을 나타낸다. 도 10F-10G는 CD56(+) prCTB (갈색, 도 10F의 상단 및 중간 패널) 및 β-hCG(+) prCTB (갈색, 도 10G의 상단 패널)가 착상을 위해 EVT를 향해 이동한다는 것을 나타낸다 (붉은색 화살표). 다수의 CD56(+) (F의 하단 패널) 및 β-hCG(+) prCTB (도 10G의 중간 패널)가 탈락 상피 아래에 있다. 모체 탈락막에서의 β-hCG(+) prCTB에 의한 동맥 내피 세포의 교체는 SA 리모델링을 시사하고 (도 10G의 중간 패널), 탈락막 정맥의 혈관 강 내부의 β-hCG(+) prCTB (도 10G의 하단 패널)는 정맥의 침습을 또한 시사한다. 도 10H-10K는 침습 및 이동 검정법의 사진을 나타낸다. 도 10H-10I는 MCP-1이 용량-의존적 방식 (도 10H)으로 hTSC (4×103개 세포/ml)의 이동을 구동시켰고, 시간-의존적 방식 (도 10I)으로 hTSC 및 prCTB (각각 4×103개 세포/ml) 둘 다에서 구동시켰음을 나타낸다. 도 10J-10K는 CXCL2가 시간-의존적 방식 (도 10J)으로 hTSC (4×103개 세포/ml)의 이동을 구동시켰고, 용량-의존적 방식 (도 10K)으로 hTSC 및 prCTB (각각 4×103개 세포/ml) 둘 다에서 구동시켰음을 나타낸다. 청색은 0.2% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 115940)으로의 세포-염색을 나타낸다. 이동된 세포 (청색)의 수는 혈구계 또는 유동 세포측정기를 사용하여 계수된다. n = 각각의 테스트에서 3개의 독립적인 샘플.
도 11A 내지 11K가 본원에서 기술된다. 도 11A-11D는 시간 과정으로 2:1 비 (3×104개 세포/웰)의 prCTB (화살촉) 및 PANC-1 (화살표)의 공동-배양을 나타내고, 광학 현미경 (도 11A)에 의해 prCTB에 의해 둘러싸인 PANC-1의 아폽토시스성 변화를 나타낸다. 면역세포화학이 공동-배양에서의 2개의 생세포: prCTB (청색, 시토칼세인(CytoCalcein) 450 염색) 및 PANC-1 (적색, PKH26 염색)의 상호작용을 나타낸다 (도 11B). 아폽토시스성 PANC-1 (녹색, 아폽신 염색, 상단) 및 무손상 prCTB (청색, 중간)가 상호작용에 의해 보인다 (병합, 화살표, 하단) (도 11C). 3D 형광현미경검사가 상호작용 시의 아폽토시스성 PANC-1 (녹색) 및 무손상 prCTB (청색)을 나타낸다 (도 11D). 도 11E는 prCTB는 PD-L1 (상단, 좌측 칼럼)을 발현하였지만, PD-1 (하단, 좌측 칼럼)은 발현하지 않은 한편, PANC-1은 PD-1 (상단, 우측 칼럼) 및 PD-L1 (하단, 우측 칼럼) 둘 다를 발현하였음을 나타내는 면역세포화학을 나타낸다. 도 11F는 FasL은 prCTB (상단, 좌측 칼럼)에서 나타났지만, PANC-1 (하단, 우측 칼럼)에서는 그렇지 않은 한편, Fas는 prCTB (하단, 좌측 칼럼) 및 PANC-1 (상단, 우측 칼럼) 둘 다 내에 있었음을 나타낸다. 척도 막대는 지시된 바와 같다. 도 11G-11K는 prCTB가 상호작용 시 고형 종양 세포의 아폽토시스를 유도하였음을 나타낸다. 도 11G는 3D 세포 익스플로러-플루오(explorer-fluo) 현미경 검사에 의해 prCTB (청색)가 상호작용 시 유방 MCF-7 세포 (녹색)의 아폽토시스를 유도하였음을 나타낸다 (도 11G). 도 11H는 prCTB는 PD-L1을 발현하였지만, PD-1은 발현하지 않은 한편 (좌측 칼럼); PANC-1은 PD-1 및 PD-L1 둘 다를 발현하였음 (우측 칼럼)을 나타낸다. 도 11I는 prCTB가 FasL 및 Fas 둘 다를 발현한 한편 (좌측 칼럼), PANC-1이 둘 다를 발현하였음 (우측 칼럼)을 나타낸다. 도 11J는 RT-qPCR 분석에 의해 prCTB가 항-아폽토시스성 Mcl-1 mRNA 및 Bfl-1 mRNA를 유의하게 상향조절하였음을 나타낸다. 데이터는 평균±SD를 나타냄, n = 4, 스튜던트 t-검정: 통계적 유의성: *p<0.05, **p<0.01. 도 11K는 3D 세포 익스플로러-플루오 현미경검사 (나노라이브(Nanolive), 스위스)에 의해 prCTB가 24시간 공동-배양 시 Huh7 세포 (간), H1299 세포 (폐), MKN45 세포 (위), PA-1 세포 (난소), 및 A375 세포 (흑색종)의 아폽토시스 (아폽신, 녹색)를 야기하였음을 나타낸다. 척도 막대는 지시된 바와 같다.
도 12A-12B는 EVT에서 모체 탈락막으로의 이동에서의 CD56(+) β-hCG(+) 세포의 세포 프로세스를 나타낸다. 난관 자궁외 융모막 융모의 경우. 좌측 패널: CD56-발현 세포 면역세포화학. 중간 패널: CD56(+) 세포가 융모 기질, 융모 CTB의 내층에 산발적으로 분포하고 (흑색 화살표), EVT 구역에 집중됨. 우측 패널: β-hCG-발현 영양막이 융모 표면 및 EVT 구역에 분포됨. 정상 태반 융모의 경우. 좌측 패널: H&E 염색에 의한 고정 융모, EVT, 및 모체 탈락막 조직의 조직학적 확인. 중간 패널: EVT 구역 및 주변의 탈락막 조직에서 CD56(+) 세포가 나타남. 우측 패널: 두드러진 CD56(+) 세포가 모체 탈락막에서 나타난다. β-hCG(+) 영양막은 CD56(+) 세포와 분포가 유사하다.
하나 이상의 본 발명의 실시양태의 상세사항이 본원에서의 첨부 도면, 청구범위 및 상세한 설명에 기재된다. 본원에서 개시되고 구상된 본 발명의 실시양태의 다른 특색, 목적 및 장점은 명시적으로 배제되지 않는 한 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있다.
시험관내에서 생산된 독특한 전구 조절성 세포영양막 세포, 그의 조성물, 및 장애 (예를 들어, 암, 염증 또는 자가면역 질환)를 치료하거나 또는 병태 (예를 들어, 피부 병태)를 개선하는 것에서의 그의 용도가 본원에서 개시된다. 전구 조절성 세포영양막 세포는 영양막 줄기 세포와 구별된다. 전구 조절성 세포영양막 세포는 또한 배아 줄기 세포와 구별된다. 전구 조절성 세포영양막 세포는 또한 원시 세포영양막, 및 융모 세포영양막 (융모 CTB), 원시 융합영양막 (pSTB), 융합영양막 (STB) 및 융모외 세포영양막 (EVT)을 포함하는 원시 세포영양막 유래 세포와 구별되고, 도 5C를 참조한다. 전구 조절성 세포영양막 세포는 또한 태반 세포영양막과 구별된다. 일부 경우에, 전구 조절성 세포영양막 세포는 전구체 융모 세포영양막 세포가 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 대상이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상기의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 예시적이고 설명적일 뿐이고, 어떠한 청구된 대상도 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 형태는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 추가로, 용어 "포함하는", 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함된"은 제한적이지 않다.
본원에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약"의 특정 값 또는 범위, 예를 들어, 언급된 수치의 ±15%로서 표현될 수 있다. 약은 정확한 양을 또한 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL"를 의미하고, 또한 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내일 것으로 예상될 양을 포함한다.
"치료하는", "치료" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하도록 본원에서 사용된다. 일부 경우에, 개체 (예를 들어, 간-연관 질환 또는 장애를 앓고 있고/거나 유전적으로 이에 대한 소인이 있는 것으로 추정되는 개체)가 본원에 기술된 세포의 제제로 예방적으로 처치되고, 이같은 예방적 처치는 간-연관 질환 또는 장애 또는 그의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. 일부 경우에, 개체는 치료적으로 처치되고 (예를 들어, 개체가 간-연관 질환 또는 장애를 앓고 있는 경우), 이같은 치료적 처치는 질환 또는 장애에 대한 부분적이거나 완전한 치유를 야기하고/거나, 질환 또는 장애에 기인하는 유해 효과를 역전시키고/거나, 질환 또는 장애를 안정화시키고/거나, 질환 또는 장애의 진행을 지연시키고/거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 야기한다.
본원에 개시된 세포를 치료를 필요로 하는 영역에 투여 (예를 들어, 이식)하는 것은, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 수술 동안의 국소 주입, 주사, 카테터, 또는 임플란트에 의해 달성되고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 실라스틱 막, 또는 섬유를 포함하는, 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
조성물을 포유동물 내로 "이식"하는 것은 관련 기술분야에 확립된 임의의 방법에 의해 조성물을 포유동물의 신체 내로 도입하는 것을 지칭한다. 도입되는 조성물은 "이식물"이고, 포유동물은 "수용자"이다. 이식물 및 수용자는 동계, 동종이형, 이종일 수 있다. 추가로, 이식은 자가 이식일 수 있다.
용어 "단리된"은, 세포 또는 세포 집단과 관련하여 사용된 경우, 세포 또는 세포 집단이 이로부터 유래되는 숙주 생물로부터 세포 또는 세포 집단이 분리되어 있는 상태를 지칭한다. 일부 경우에, 단리된 세포는 동일한 숙주 생물로부터 단리된 다른 세포와 접촉된다. 일부 경우에, 단리된 세포는 임의의 다른 세포와 분리된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 시험관내에서 선조 세포로부터 유래된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 숙주 생물로부터 수득되고, 숙주 생물과 분리된다.
"유효량"은 의도된 목적을 달성하는데 충분한 치료제의 양이다. 장애를 치료하거나 호전시키기 위한 조성물의 유효량은 장애의 증상을 감소시키거나 제거하는데 충분한 조성물의 양이다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 구성 목적을 위한 것이고, 기술된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
세포 및 조성물
일부 경우에, 시험관내에서 단리된 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)으로서, 여기서 단리된 prCTB가 HSP90, 인슐린, CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합 중 1개 이상의 단백질을 발현하거나; 또는 prCTB가 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 분비하거나, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비하고/거나; prCTB가 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인 prCTB가 개시된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, prCTB는, 예를 들어, 암 세포의 콜로니를 침윤하는 것에 의해, 암 세포의 아폽토시스를 유도하고, 임의적으로 여기서 prCTB 자체는 암 세포와 접촉하는 것으로부터 아폽토시스가 진행되지 않는다. 일부 경우에, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 췌장암 세포, 유방암 세포, 간 종양 세포, 난소 종양 세포, 폐 종양 세포, 위 종양 세포, 흑색종 세포, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, 암 세포는 PD-1 및 PD-L1을 발현하는 한편, prCTB는 PD-L1은 발현하지만 PD-1은 발현하지 않는다. 일부 경우에, 암 세포는 Fas를 발현하지만 FasL은 발현하지 않는 한편, prCTB는 Fas 및 FasL을 발현한다. 일부 경우에, prCTB는 Bfl-1 및 Mcl-1을 발현한다.
일부 경우에, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서 prCTB의 집단이 HSP90, 인슐린, CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합 중 1개 이상의 단백질을 발현하거나; 또는 prCTB가 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 분비하거나, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비하고/거나; prCTB의 집단이 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 세포 집단이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB이다. 일부 경우에, 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB이다.
일부 경우에, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서 (i) 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이거나; (ii) 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB이거나; (iii) 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB이거나; 또는 (iv) 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB이거나, 또는 그의 임의의 조합인 세포 집단이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서 (i) 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이거나; (ii) 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 발현하는 prCTB이거나; (iii) 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 발현하는 prCTB이거나; 또는 (iv) 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB이거나, 또는 그의 임의의 조합인 세포 집단이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 세포 집단은 집단의 적어도 약 2%가 CD16, CD56, 및 CD107을 발현하는 prCTB인 것을 포함한다.
일부 경우에, 단리된 prCTB는 인터류킨 15 (IL-15)를 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG 또는 hCG-β), 가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G), 전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 인터류킨 10 (IL-10), CD105, CD146, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 신시틴, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 그의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비한다. 일부 경우에, 시토카인은 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5 (CCL5), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-3), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2 (CXCL2), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11 (CCL11), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24 (CCL24), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26 (CCL26), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22 (CCL22), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10), 프랙탈카인, 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4 (CCL4), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨 1α (IL-1α), 인터류킨 1β (IL-1β), 인터류킨 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12p40 (IL-12p40), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터페론 α (IFN-α) 또는 인터페론 γ (IFN-γ)를 포함한다. 일부 경우에, 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 AA (PDGF-AA), PDGF 동종이량체 BB (PDGF-BB), PDGF 이종이량체 (PDGF-AB), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질, FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1β (IL-1β), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 단리된 prCTB가, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 SOX2 단백질을 발현한다. 일부 경우에, 융모막 융모-유래 선조 세포는 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53, 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, 융모막 융모-유래 선조 세포 및 단리된 prCTB 둘 다는 열 충격 단백질 90 (HSP90)을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 인간 세포이다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원으로부터 유래된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물 내에 존재한다.
일부 경우에, 본원에서 제공되는 세포, 예를 들어, prCTB는 유전자 조작된다. 일부 경우에, 세포는 외인성 유전자, 예를 들어, 트랜스진을 발현하도록 유전자 조작된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트랜스진" 및 그의 문법적 등가물은 생물 내로 전달되는 유전자 또는 유전 물질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 트랜스진은 생물 내로 도입되는 유전자를 함유하는 DNA의 신장물 또는 분절일 수 있다. 트랜스진이 생물 내로 도입되었을 때, 그 후 생물은 트랜스제닉 생물로 지칭된다. 트랜스진은 트랜스제닉 생물에서 RNA 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)를 생산하는 능력을 유지할 수 있다. 트랜스진은 상이한 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있다. 트랜스진은 조작된 T 세포 수용체, 예를 들어 TCR 트랜스진을 코딩할 수 있다. 트랜스진은 TCR 서열을 포함할 수 있다. 트랜스진은 종양유전자를 포함할 수 있다. 트랜스진은 면역 종양유전자를 포함할 수 있다. 트랜스진은 재조합 아암을 포함할 수 있다. 트랜스진은 조작된 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 면역 종양유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 억제제 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 단백질분해를 직접적으로 또는 간접적으로 촉진하는 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양용해 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 세포를 표적화하는 것에서 림프구를 보조할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 T 세포 인핸서 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양용해 바이러스 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 경우에, 트랜스진은 항암 수용체이다. 일부 경우에, 트랜스진은 항-혈관형성 인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 세포독성 유전자이다. 예시적인 트랜스진은 CD28, 유도성 공동-자극제 (ICOS), CD27, 4-1BB (CD137), ICOS-L, CD70, 4-1BBL, 시그널 3, 시토카인 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), HLA 클래스 I 유전자, B7, CD80, CD83, CD86, CD32, CD64, 4-1BBL, CD3, CD1d, CD2, 막-결합 IL-15, 막-결합 IL-17, 막-결합 IL-21, 막-결합 IL-2, 말단절단 CD19, VEGF, 카스파제, 케모카인, 또는 상기 중 임의의 것에 대한 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 코딩하는 1개 이상의 유전자, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 트랜스진은 세포 또는 조직 복구에 수반되는 단백질 (예를 들어, DNA 복구, 면역 반응 (예를 들어, 인터페론 및 인터류킨), 및 구조 단백질과 연관된 단백질)을 코딩한다. 일부 경우에, 트랜스진은 성장 인자 수용체를 코딩한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 prCTB는 TCR, B 세포 수용체 (BCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 경우에, CAR은 항원 인식 도메인, 힌지 영역, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항원 인식 도메인은 세포의 외부에 노출될 수 있고, 잠재적인 표적 분자와 상호작용할 수 있다. 항원 인식 도메인은 단일쇄 가변 단편으로서 연결될 수 있는 모노클로날 항체의 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일쇄 가변 단편은 링커 펩티드로 연결될 수 있는 이뮤노글로불린의 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 리간드 또는 수용체 시스템이 항체-기반 항원 인식 도메인에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 힌지 도메인은 막횡단 도메인을 항원 인식 부위에 조합시키도록 디자인될 수 있다. 일부 경우에, 힌지 영역은 항원 인식 도메인의 가요성을 증가시키도록 디자인될 수 있는 펩티드일 수 있다. 막횡단 도메인은 세포막에 스패닝될 수 있는 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 예를 들어, CD28 막횡단 도메인이 CAR에서 막횡단 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 CAR을 형질막에 고정시킬 수 있다. 세포내 T-세포 신호전달 도메인이 막횡단 도메인에 연결될 수 있고, 세포 내부에 있을 수 있다. 일부 경우에, 표적 단백질이 항원 인식 도메인에 결합할 때, 세포내 신호전달 도메인이 활성화 신호를 전송할 수 있다. 일부 경우에, 신호전달 도메인의 활성화는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)의 인산화를 포함할 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 변형된 ITAM을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 ITAM은 신호전달 도메인, 예컨대 CD3-제타 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 ITAM 신호전달 도메인은 CD3-제타, CD3-엡실론, CD3-감마, CD3-델타, 그의 유도체, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 1개 이상의 공동-자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 1개 이상의 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 공동자극 도메인은 CD28, CD27, CD40, CD134, CD137, 유도성 공동자극 (ICOS), DAP10, 그의 유도체, 또는 그의 임의의 조합으로부터의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 prCTB는 종양유전자 수용체를 코딩하는 트랜스진을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 세포를 포함하는 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여하기 위한 제약 조성물로서 제형된다. 일부 경우에, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 수성 토닉 완충제 내의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서의 임의의 통증을 호전시키기 위한 국소 마취제를 또한 포함한다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 제약 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 용기로 조제될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전에 혼합되도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 개시된 세포를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 이같은 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 콜로이드성 분산 시스템이 사용된다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다.
시크리톰 및 조성물
일부 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 영양막 줄기 세포 또는 prCTB의 시크리톰을 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 시크리톰은 영양막 줄기 세포 또는 prCTB에 의해 분비된 엑소솜, 및 영양막 줄기 세포 또는 prCTB에 의해 분비된 다른 가용성 분자 (예를 들어, 단백질, 핵산, 및 지질)를 포함한다.
일부 경우에, 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 조성물은 케모카인, 인터류킨, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜, 및 제약상 또는 미용상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 세포를 함유하지 않는다. 일부 경우에, 조성물은 (i) CXCL2, MCP-1, 프랙탈카인, IP-10, MCP-3, 에오탁신, MIP-1β, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 케모카인; (ii) IL-6, IL-8, IL-4, IL-1RA, IL-10, IL-12P40, IL-15, IL-1α, IL-17A, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 인터류킨; 및 (iii) PDGF-AA, VEGF, bFGF, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 성장 인자를 포함하거나, 또는 엑소솜이 그를 운반한다.
일부 경우에, 조성물은 MCP-1, 및 CXCL2, IL-6, IL-8 및 VEGF 단백질 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함한다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:1 내지 약 2.5:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1.0:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2.0:1, 2.1:, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 또는 2.5:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 2.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 3:1 내지 약 4:1 또는 약 3:1 내지 약 5:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 3:1, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.5, 5, 또는 4.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 3.2의 중량비를 갖는다.
일부 경우에, 조성물은 MCP-1, 및 CXCL2, IL-6, IL-8, 및 VEGF 단백질 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함한다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:7 내지 약 1:4의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:7.0, 1:6.8, 1:6.6, 1:6.4, 1:6.2, 1:6, 1:5.8, 1:5.6, 1:5.4, 1:5.2, 1:5.0, 1:4.8, 1:4.6, 1:4.4, 1:4.2, 또는 1:4.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:5.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:4 내지 약 1:1.5의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:4.0, 1:3.8, 1:3.6, 1:3.4, 1:3.2, 1:3.0, 1:2.8, 1:2.6, 1:2.4, 1:2.2, 1:2.0, 1;1.8, 1:1.7, 1:1.6, 또는 1:1.5의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2는 약 1:4 내지 약 1:2.5의 중량비를 갖는다.
일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 2:1 내지 약 3:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 2.3의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 2.5의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 3:1 내지 약 4:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 3.6의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6은 약 3.8의 중량비를 갖는다.
일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4:1 내지 약 6:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 또는 6.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4.6의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4.4의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4.9의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8은 약 4.5의 중량비를 갖는다.
일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 5:1 내지 약 7:1의 중량비를 갖는다. 예를 들어, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 5.6의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 6.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 7:1 내지 약 9:1. 예를 들어, 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 7.6:1의 중량비를 갖는다. 일부 경우에, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF는 약 7.3:1의 중량비를 갖는다.
일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA를 추가로 포함한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 3:1 내지 약 5:1, 예를 들어, 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 3.5의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 6:1 내지 약 9:1, 예를 들어 약 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 또는 9.0의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 7.8의 중량비로 존재한다.
일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA를 추가로 포함한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 1:2.5 내지 약 1:1.5, 예를 들어, 약 1:2.5, 1:2.4, 1:2.3, 1:2.2, 1:2.1, 1:2.0, 1:1.9, 1:1.8, 1:1.7, 1:1.6, 또는 1:1.5의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 0.6의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 1:1.5 내지 약 1.5:1, 예를 들어 약 1:1.5, 1:1.4, 1:1.3, 1:1.2, 1:1.1, 1:1.0, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 또는 1.5:1의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 1.2의 중량비로 존재한다.
일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA를 추가로 포함한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 3:1 내지 약 5:1, 예를 들어, 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 3.5의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 6:1 내지 약 9:1, 예를 들어 약 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 또는 9.0의 중량비로 존재한다. 일부 경우에, MCP-1 및 PDGF-AA는 약 7.8의 중량비로 존재한다.
일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA 및 G-CSF를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 PDGF-AA 및 FGF-2 (bFGF)를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 IP-10, 에오탁신, Flt-3L, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1b, IL-1a, IL-1RA, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12P40, IL-13, IL-15, IL-17A, CCL5 (RANTES), MDC, MCP-3, IL-12P70, IFNa, IFNr, PDGF-AB/BB, 또는 EGF 중 1개 이상의 단백질을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 조성물은 핵산, 예컨대 mRNA, siRNA, shRNA, 또는 DNA를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 prCTB 또는 영양막 줄기 세포로부터 분비되는 지질 분자를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 조성물은 무균성일 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 상주 미생물을 포함할 수 있다. 미생물은 바이러스, 박테리아, 진핵생물 세포 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 미생물은 병원성이 아닐 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 약 10 콜로니 형성 단위 (CFU)/gram (g), 50 CFU/g 100 CFU/g, 150 CFU/g, 200 CFU/g, 300 CFU/g, 400 CFU/g, 500 CFU/g, 600 CFU/g, 700 CFU/g, 800 CFU/g, 900 CFU/g, 또는 1000 CFU/g 미만의 농도로 박테리아 또는 박테리아들을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 약 10 CFU/g 내지 약 1000 CFU/g, 10 CFU/g 내지 약 50 CFU/g, 20 CFU/g 내지 약 100 CFU/g, 50 CFU/g 내지 약 200 CFU/g, 100 CFU/g 내지 약 250 CFU/g, 200 CFU/g 내지 약 500 CFU/g, 500 CFU/g 내지 약 700 CFU/g, 또는 600 CFU/g 내지 약 1000 CFU/g의 농도로 박테리아를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 또는 그의 임의의 조합을 실질적으로 함유하지 않거나 (예를 들어, 적어도 95% 무함유), 또는 함유하지 않는다.
일부 경우에, 본원에 개시된 조성물은 중금속 예컨대 납, 비티오놀, 클로로플루오로카본 추진제, 니트로스아민, 클로로포름, 할로겐화 살리실아닐리드, 헥사클로로펜, 수은 화합물, 1,4-디옥산, 염화메틸렌, 금지된 소 물질, 일광차단 화합물, 비닐 클로라이드, 지르코늄-함유 착물, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 금지된 소 물질은 뇌, 두개골, 눈, 삼차신경절, 척수, 척주, 후근 신경절, 편도, 소장의 원위 회장, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 10 ppm (백만분율) 이하의 수준으로 납을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에서의 조성물은 색소 첨가제, 향료, 파라벤, 프탈레이트, 알콜, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 색소 첨가제, 향료, 파라벤, 프탈레이트 또는 알콜은 조성물 내에 유의하지 않은 수준, 예를 들어 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만으로 존재한다. 일부 경우에, 부수적인 성분은 조성물에서 기술적/구조적이거나, 기능적이거나 또는 그의 임의의 조합인 효과가 없고, 예를 들어, 활성 성분이 아니다. 일부 경우에, 조성물은 함유하지 않는다.
일부 경우에, 본원에 개시된 부형제는 물, 글리세롤, 염수, 식물성 오일 (예를 들어, 종자 오일), 과일 오일, 꽃 추출물, 미네랄 오일, 합성 오일, 당 화합물, 실리케이트, 칼슘 염, 마그네슘 염, 염화나트륨, 염화칼륨, 젖산, 전분, 당 알콜, 셀룰로스, 활성탄, 글리세린, 버터, 아미노산, 파라핀, 꿀, 왁스, 밀랍, 한천, 탄산칼슘, 시트르산, 타르타르산, 스테아르산, 잔탄 검, 벤조산, 폴리에틸렌 글리콜, 규소, 그의 유도체, 그의 염, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
사용 방법
일부 경우에, 단리된 prCTB는 대상체에게 정맥내로, 피하로, 경피로, 흡입에 의해, 경구로, 근육내로, 또는 종양내로 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물이다. 일부 경우에, 대상체는 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 인터류킨 15 (IL-15)를 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG),　 가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G), 전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 인터류킨 10 (IL-10), CD105, CD146, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 발현한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 신시틴, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 그의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비한다. 일부 경우에, 시토카인은 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5 (CCL5), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-3), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2 (CXCL2), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11 (CCL11), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24 (CCL24), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26 (CCL26), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22 (CCL22), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10), 프랙탈카인, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4 (CCL4), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨 1α (IL-1α), 인터류킨 1β (IL-1β), 인터류킨 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12p40 (IL-12p40), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시토카인은 인터페론 α (IFN-α) 또는 인터페론 γ(IFN-γ)를 포함한다. 일부 경우에, 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 AA (PDGF-AA), PDGF 동종이량체 BB (PDGF-BB), PDGF 이종이량체 (PDGF-AB), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질, FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1β (IL-1β), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에,단리된 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 SOX2 단백질을 발현한다. 일부 경우에, 선조 세포는 p53, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합의 발현이 결여된다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 인간 세포이다. 일부 경우에, 단리된 prCTB는 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원으로부터 유래된다.
일부 경우에, 항원-보유 표적 세포의 사멸을 필요로 하는 대상체에게 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 투여하는 것을 포함하는, 항원-보유 표적 세포를 사멸시키는 방법으로서, 여기서 단리된 prCTB가 HSP90, 인슐린, CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합; 및 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53, 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 1개 이상의 단백질을 발현하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 항원-보유 세포는 항원-제시 세포가 아니고, 예를 들어 수지상 세포, 대식세포, 또는 B 세포가 아니다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 암 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 혈액암 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 방광암 세포, 골암 세포, 뇌암 세포, 유방암 세포, 자궁경부 암종, 결장직장암 세포, 식도암 세포, 위장암 세포, 조혈 악성종양, 두경부 편평세포 암종, 백혈병, 간암 세포, 폐암 세포, 림프종, 골수종, 비암 세포, 비인두암 세포, 구강암 세포, 구인두암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 육종, 위암 세포, 흑색종, 갑상선암 세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 병원체이다. 일부 경우에, 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프리온, 진균, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 항원-보유 표적 세포 집단의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%를 사멸시킨다.
일부 경우에, 염증 경로의 하향조절을 필요로 하는 대상체에게 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 투여하는 것을 포함하는, 염증 경로를 하향조절하는 방법으로서, 여기서 (i) 단리된 prCTB가 (a) HSP90, 인슐린, CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합; 및 (b) 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53, 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 1개 이상의 단백질을 발현하고, (ii) 단리된 prCTB가 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 분비하거나, 또는 케모카인, 시토카인, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 분비하는 방법이 본원에서 개시된다.
일부 경우에, 방법은 이식 거부, 감염, 감염과 연관된 내독성 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 전신 발병 소아 특발성 관절염 (JIA), 염증성 장 질환 (IBD), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 복강 질환, 담낭 질환, 모발둥지 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 췌장염, 수술로부터의 외상, 이식편-대-숙주 질환, 심장병, 골 재흡수, 화상 환자, 심근 경색증, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간 또는 폐 섬유증, 치주염, 또는 저염산증을 포함하는 질환 또는 병태를 치료한다. 일부 경우에, 방법은 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발근염, 만성 활동성 간염, 혼합형 결합 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 애디슨병, 백반증, 글루텐-민감성 장병증, 그레이브스병, 중증 근무력증, 자가면역 호중구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 류마티스 관절염, 경변증, 심상성 천포창, 자가면역 불임, 굿패스쳐병, 수포성 유천포창, 원판상 루푸스, 궤양성 결장염, 고밀도 침착병, 염증성 장 질환, 또는 건선을 포함하는 자가 면역 질환을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 1형 당뇨병을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 이식 거부를 호전시킨다.
일부 경우에, 피부 병태 조정을 필요로 하는 대상체에게 케모카인, 시토카인 예컨대 인터류킨, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합, 또는 케모카인, 시토카인 예컨대 인터류킨, 성장 인자 또는 그의 임의의 조합을 운반하는 엑소솜을 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 피부 병태를 조정하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 방법은 방법 적용 전에 비교하여 방법 적용 후에 피부 병태가 하나 이상의 더 양호한 특성을 갖도록 피부 병태를 개선시킨다. 일부 경우에, 케모카인은 GRO, MCP-1, 프랙탈카인, IP-10, MCP-3, 에오탁신, MIP-1β, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 IL-6, IL-8, IL-4, IL-1RA, IL-10, IL-12P40, IL-15, IL-1α, IL-17A, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 인터류킨을 포함한다. 일부 경우에, 성장 인자는 PDGF-AA, VEGF, bFGF, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 미용 용도를 제공한다. 일부 경우에, 방법은 피부를 타이트닝한다. 일부 경우에, 방법은 피부를 수화시킨다. 일부 경우에, 방법은 피부를 회생시킨다. 일부 경우에, 조성물은 줄기 세포를 계대시킨 후의 배지이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 본원에 기술된 단리된 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)이다. 일부 경우에, 계대 횟수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회이다. 일부 경우에, 줄기 세포는, 예를 들어 배지를 수집하기 전에, 적어도 약 1-3일, 예컨대 1-2일 동안 배지에서 배양된다. 일부 경우에, 줄기 세포는, 예를 들어 배지를 수집하기 전에, 적어도 약 12-24시간 동안 배지에서 배양된다. 일부 경우에, 계대 횟수는 5 내지 10회이다. 일부 경우에, 계대는 약 1, 2, 또는 3일마다 발생한다. 일부 경우에, 계대는 약 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 또는 24시간마다 발생한다. 일부 경우에, 배지는 줄기 세포룰 함유하지 않는다. 일부 경우에, 조성물은 크림, 액체, 겔, 로션, 미스트, 캡슐 또는 마스크의 형태이다. 일부 경우에, 방법은 피부 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 피부 질환은 습진, 건선, 여드름, 장미증, 비늘증, 백반증, 두드러기, 지루성 피부염, 대상포진, 일광 화상, 화상, 접촉 피부염, 발진, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부 노화, 광노화, 또는 그의 임의의 조합의 외관을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 흉터의 외관을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 상처 치유를 개선시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 타박상, 양성 성장물, 검버섯, 암성 성장물, 궤양, 감염, 또는 그의 임의의 조합을 예방하거나, 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부의 선, 주름, 또는 그의 임의의 조합을 예방하거나, 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 선 또는 주름은 눈가 주름, 웃음 선, 찌푸림 선, 이마 주름, 눈물 고랑, 콧등 주름, 팔자 주름, 광대 주름, 턱끝 주름, 목주름, 연령-관련 주름, 주름 선, 탄력조직 주름, 표정 주름, 중력 주름, 동적 주름, 정적 주름, 위축성 주름, 위축성의 오그라드는 주름살, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부의 부피, 탄력, 또는 그의 임의의 조합의 상실을 예방하거나, 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부 처짐, 칙칙한 피부 색조, 얼룩덜룩한 변색, 거친 피부, 건성 피부, 가려운 피부, 얇은 피부, 또는 그의 임의의 조합을 예방하거나, 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부 병태, 피부 질환 또는 그의 임의의 조합을 개선하거나 또는 호전시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부를 보습하거나, 타이트닝하거나, 리프팅시키거나, 또는 회생시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 건강하거나, 매끄럽거나, 결점이 없거나, 반투명하거나, 탄력적이거나, 또는 그의 임의의 조합인 피부를 복원시키거나 또는 유지시킬 수 있다. 일부 경우에, 방법은 피부의 글리코스아미노글리칸, 진피, 콜라겐 및 엘라스틴을 치유하거나, 치료하거나, 교정하거나 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 피부의 개선된 건강이 주름 중증도 등급화 척도, 경피 수분 손실 측정, 피부 색상 측정, 피부 표면 지형 측정, 큐토미터(Cutometer)®에 의한 점탄성 측정, 조직학적 검사, 또는 그의 임의의 조합에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에, 개선된 피부 건강이 진단 영상, 예컨대 자기 공명 영상화 (MRI)에 의해 측정될 수 있다. 일부 경우에, 측정은 조성물의 투여 전 및 후에 비교될 수 있다. 일부 경우에, 측정은 표준에 비교될 수 있다.
또 다른 측면에서, 대상체에게 본원에서의 세포를 포함하는 제약 조성물을 세포가 대상체 (예를 들어, 대상체의 간)에 생착되는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 병태를 치료하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 세포는 제약상 허용되는 담체에서 투여된다. 일부 경우에, 제약상 허용되는 담체는 염수, 예를 들어 포스페이트 완충 염수, 또는 소 태아 혈청을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 약 1×106 내지 약 100×106개 세포/ml, 약 1×106 내지 약 250×106개 세포/ml, 약 1×106 내지 약 500×106개 세포/ml, 또는 약 10×106 내지 약 40×106개 세포/ml를 함유하는 현탁액에서 투여된다. 일부 경우에, 세포는 약 1-5 ml, 1-10 ml, 1-50 ml, 1-100 ml, 또는 10-150 ml의 부피로 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사를 포함한다. 일부 경우에, 주사는 간 정맥에 투여된다. 일부 경우에, 주사는 간 동맥에 투여된다. 일부 경우에, 병태는 간-연관 질환 또는 장애이다. 일부 경우에, 병태는 간부전이다. 일부 경우에, 간-연관 질환 또는 장애는 알라질 증후군, 알파 1 항-트립신 결핍증, 자가면역 간염, 양성 간 종양, 담도 폐쇄증, 경변증, 간의 낭성 질환, 알콜-관련 간 질환 및 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)을 포함한 지방간 질환, 갈락토스혈증, 담석, 길버트 증후군, 혈색소증, 간 낭종, 간암, 임신 중 간 질환 (임의적으로, 임신의 급성 지방간, 임신의 간내 담즙 정체, 자간전증, 또는 HELLP 증후군 (용혈, 간 검사 상승, 저혈소판)), 신생아 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 포르피린증, 라이 증후군, 사르코이드증, 독성 간염, 1형 글리코겐 축적병, 티로신혈증, 바이러스성 간염, 윌슨병, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 세포의 투여 방식은 전신 정맥내 주사, 및 의도된 활성 부위 에 직접 주사하는 것 (예를 들어, 내시경 역행 주사)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 제제는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 작용제와 함께 투여될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 전신 국소 투여이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 세포를 대상체에게 이식하기 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 대상체에게 세포가 주사된다 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 경피, 내시경 역행 주사, 또는 복막내). 일부 경우에, 대상체는 이식 전에 면역억제제로 치료되지 않는다. 일부 경우에, 방법은 환자를 면역억제제, 예를 들어, FK-506, 시클로스포린, 또는 GAD65 항체로 치료하는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기술된 세포는 세포를 특정 조직에 표적화하는데 적절한 전달 시스템에 의해 표적화된 부위 (예를 들어, 간의 결함 구역)로 전달된다. 예를 들어, 세포는 표적화된 부위에서의 세포(들)의 저속 방출을 허용하는 전달 비히클에 캡슐화된다. 전달 비히클은 특정 조직에 특이적으로 표적화되도록 변형된다. 표적화된 전달 시스템의 표면은 다양한 방식으로 변형된다. 리포솜-표적화 전달 시스템의 경우, 표적화 리간드를 리포솜 이중층과의 안정적인 회합으로 유지시키기 위해 지질 기가 리포솜의 지질 이중층 내로 혼입된다.
본원에 기술된 세포의 투여는 (1) 주사되는 세포의 양을 증가 또는 감소시키거나; (2) 주사 횟수를 변화시키거나; 또는 (3) 세포 전달 방법을 변화시키는 것에 의해 임의적으로 개체에 맞춰진다.
검출 방법
상기 기술된 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 이러한 세포 표면 마커 중 하나를 발현하는 세포의 유동 세포측정법, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 면역침전, 자기 비드 선별, 및 정량에 의해 측정될 수 있다. 바이오마커 RNA 발현 수준을 RT-PCR, Qt-PCR, 마이크로어레이, 노던 블롯, 또는 기타 유사한 기술에 의해 측정할 수 있다.
"발현 검출" 또는 "발현 수준"의 검출은 생물학적 샘플 내의 바이오마커 단백질 또는 유전자의 발현 수준 또는 존재를 결정하기 위해 의도된다. 따라서, "발현 검출"은 바이오마커가 발현되지 않은 것으로, 검출가능하게 발현되지 않은 것으로, 낮은 수준으로 발현된 것으로, 정상 수준으로 발현된 것으로, 또는 과발현된 것으로 결정되는 경우를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기술된 바이오마커의 발현 또는 존재는, 예를 들어, 면역조직화학 기술 또는 핵산-기반 기술 예컨대 원위치 혼성화 및 RT-PCR을 사용하여, 핵산 수준에서 결정된다. 일부 경우에, 1개 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재는 핵산 증폭을 위한 수단, 핵산 시퀀싱을 위한 수단, 핵산 마이크로어레이 (DNA 및 RNA)를 사용하는 수단, 또는 특이적으로 표지된 프로브를 사용하는 원위치 혼성화를 위한 수단에 의해 수행된다.
일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 겔 전기영동을 통해 수행된다. 일부 경우에, 결정은 막으로의 이동 및 특이적 프로브와의 혼성화를 통해 수행된다. 일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 진단 영상화 기술에 의해 수행된다. 일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 검출가능한 고체 기판에 의해 수행된다. 일부 경우에, 검출가능한 고체 기판은 항체로 관능화된 상자성 나노입자이다.
일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재는 RNA (예를 들어 mRNA) 수준이다. 일부 경우에, RNA (예를 들어 mRNA) 수준을 검출하는 기술은 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응 및 프로브 어레이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
mRNA 수준의 검출을 위한 한 방법은 단리된 mRNA를 검출 중인 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 혼성화하는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 수반한다. 핵산 프로브는, 예를 들어, 전장 cDNA, 또는 그의 일부분, 예컨대 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드의 길이이고, 엄격한 조건 하에 본원에 기술된 바이오마커를 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하는데 충분한 올리고뉴클레오티드로 구성된다. mRNA와 프로브의 혼성화는 관심 대상인 바이오마커 또는 다른 표적 단백질이 발현되고 있음을 가리킨다.
일부 경우에, 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에 러닝시키고, mRNA를 겔에서 막, 예컨대 니트로셀룰로스로 이동시키는 것에 의해, mRNA가 고체 표면 상에 고정되고, 프로브와 접촉된다. 일부 경우에, 예를 들어, 유전자 칩 어레이에서, 프로브(들)가 고체 표면 상에 고정되고, mRNA가 프로브(들)와 접촉된다. 관련 기술분야의 기술자는 공지된 mRNA 검출 방법을 바이오마커 또는 다른 관심 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준을 검출하는 것에서 사용하기 위해 쉽게 개조한다.
샘플 내의 관심 mRNA의 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은 핵산 증폭 프로세스, 예를 들어, RT-PCR, 리가제 연쇄 반응 자가-유지 서열 복제, 전사 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제(Q-Beta Replicase), 롤링 서클 복제 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 프로세스에 이어서 증폭된 분자를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 검출하는 것을 수반한다. 이러한 검출 체계는 핵산 분자가 매우 낮은 개수로 존재하는 경우에 이같은 분자의 검출에 특히 유용하다. 일부 경우에, 바이오마커 발현은 정량적 형광발생 RT-PCR (예를 들어, TAQMAN 시스템(TAQMAN System))에 의해 평가된다.
막 블롯 (예컨대 혼성화 분석 예컨대 노던, 도트 등에서 사용되는 것), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 관심 RNA의 발현 수준을 모니터링한다. 발현 검출은 용액 내의 핵산 프로브를 사용하는 것을 또한 포함한다.
일부 경우에, 1개 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하기 위해 마이크로어레이가 사용된다. 핵산 마이크로어레이는 다수의 유전자의 발현 수준을 동시에 측정하기 위한 한가지 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고체 지지체에 부착된 재현가능한 패턴의 포착 프로브로 이루어진다. 표지된 RNA 또는 DNA가 어레이 상의 상보적 프로브에 혼성화된 후, 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 어레이 상의 각각의 프로브에 대한 혼성화 강도가 결정되고, 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적인 값으로 변환된다. 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이는 샘플 내의 다수의 RNA에 대해 유전자 발현 프로파일을 결정하는데 특히 유용하다.
일부 경우에, 어레이는 실질적으로 임의의 형상의 표면 또는 심지어 다수의 표면 상에 제작된다. 일부 경우에, 어레이는 평면 어레이 표면이다. 일부 경우에, 어레이는 비드, 겔, 중합체 표면, 섬유 예컨대 광섬유, 유리 또는 임의의 다른 적합한 기판 상의 펩티드 또는 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 어레이는 진단 또는 포괄 장치의 기타 조작을 허용하는 방식으로 포장된다.
일부 경우에, 본원에 기술된 바이오마커의 발현 또는 존재는, 예를 들어, 특이적 바이오마커 단백질에 대해 지시된 항체를 사용하여, 단백질 수준에서 결정된다. 이러한 항체는 다양한 방법 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 다중화 기술, 면역침전, 또는 면역조직화학 기술에서 사용된다. 일부 경우에, 바이오마커의 검출은 ELISA에 의해 달성된다. 일부 경우에, 바이오마커의 검출은 전기화학발광 (ECL)에 의해 달성된다.
생물학적 샘플 내의 바이오마커를 특이적으로 확인하고 정량하기 위한 임의의 수단이 구상된다. 따라서, 일부 경우에, 생물학적 샘플 내의 관심 바이오마커 단백질의 발현 수준이 이러한 바이오마커 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 변이체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 결합 단백질에 의해 검출된다. 일부 경우에, 표지된 항체, 그의 결합 부분, 또는 다른 결합 파트너가 사용된다. 본원에서 사용된 경우의 "표지"라는 단어는 "표지된" 항체가 생성되도록 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일부 경우에, 표지는 자체적으로 검출가능하거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매한다.
바이오마커 단백질의 검출을 위한 항체는 기원이 모노클로날 또는 폴리클로날이거나, 또는 합성으로 또는 재조합으로 생산된다. 복합체를 형성한 단백질의 양, 예를 들어, 결합 단백질, 예를 들어, 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 회합된 바이오마커 단백질의 양을 관련 기술분야의 통상의 기술자에에 공지된 표준 단백질 검출 방법을 사용하여 결정한다. 면역학적 검정법 디자인, 이론 및 프로토콜의 상세한 검토는 관련 기술분야의 다수의 교재에서 확인된다.
항체를 표지하는데 사용되는 마커의 선택은 용도에 따라 달라질 것이다. 그러나, 마커의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 임의의 바이오마커 또는 관심 단백질의 존재를 검출하기 위해 면역검정법, 뿐만 아니라 조직학적 용도에서 사용된다. 표지된 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이다. 추가로, 관심 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 방사성 원자, 효소, 발색단 또는 형광 모이어티, 또는 비색 태그로 표지된다. 태그화 표지의 선택 또한 원하는 검출 한계에 좌우될 것이다. 전형적으로 효소 검정법 (예를 들어, ELISA)은 효소-태그 복합체와 효소 기질의 상호작용에 의해 형성된 유색 생성물의 검출을 허용한다. 검출가능한 표지로서의 역할을 하는 방사성핵종은, 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, 및 Pd-109를 포함한다. 검출가능한 표지로서의 역할을 하는 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 발색단 모이어티는 플루오레세인 및 로다민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 항체가 이러한 표지에 접합된다. 예를 들어, 효소 및 발색단 분자가 커플링제, 예컨대 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드 등에 의해 항체에 접합된다. 대안적으로, 리간드-수용체 쌍을 통해 접합이 발생한다. 적절한 리간드-수용체 쌍의 예는 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘, 및 항체-항원이다.
일부 경우에, 생물학적 샘플 내의 1개 이상의 바이오마커 또는 다른 관심 단백질의 발현 또는 존재가 방사성 면역검정법 또는 효소-결합 면역검정법 (ELISA), 경쟁적 결합 효소-결합 면역검정법, 도트 블롯, 웨스턴 블롯, 크로마토그래미 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 검정법에 의해 결정된다. 따라서, 검출 검정법은 이뮤노블롯팅, 면역확산, 면역전기영동 또는 면역침전과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 단계를 수반한다.
전구 조절성 세포영양막을 수득하는 방법
일부 실시양태에서, 본원에서의 prCTB (예를 들어, 인간 prCTB)는 시험관내에서 만능성 줄기 세포, 예를 들어, 융모막 융모-유래 선조 세포로부터 유래된다. 일부 경우에, prCTB는 1개 이상의 분화 인자가 보충된 배양 배지에서 만능성 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 경우에, 줄기 세포는 융모막 융모-유래 선조 세포이다. 일부 경우에, 융모막 융모-유래 선조 세포는 포유동물 영양막 줄기 세포, 예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포를 포함한다.
일부 경우에, 줄기 세포를 배양 배지 내의 섬유모세포 성장 인자와 접촉시키는 것에 의해 시험관내에서 만능성 줄기 세포를 분화시키는 것을 포함하는, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 수득하는 방법이 본원에서 개시된다. 일부 경우에, 배양 배지는 뉴클레오시드, L-글루타민, L-글루타민을 포함하는 디펩티드, 혈소판 용해물, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 배양 배지는 뉴클레오시드, 디펩티드, 및 혈소판 용해물을 포함한다. 일부 경우에, 배양 배지는 약 2 mM 내지 약 200 mM의 L-글루타민을 포함한다.
일부 경우에, 만능성 줄기 세포, 예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포는 약 24시간 내지 48시간 동안 섬유모세포 성장 인자와 접촉되고, 이에 의해 prCTB가 생성된다. 일부 경우에, 접촉은 적어도 약 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 40시간, 또는 44시간이다. 일부 경우에, 접촉은 최대 약 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 40시간, 44시간, 또는 48시간이다.
일부 경우에, 줄기 세포가 계대 5 내지 10일 때 만능성 줄기 세포, 예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포가 섬유모세포 성장 인자와 접촉된다. 일부 경우에, 줄기 세포가 계대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 때 만능성 줄기 세포가 섬유모세포 성장 인자와 접촉된다.
일부 경우에, 방법은 prCTB로 분화되도록 섬유모세포 성장 인자와 접촉시키기 전에 줄기 세포를 배양 배지와 함께 배양하는 것을 포함한다.
일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 항생제, 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 레티노산을 함유하지 않는다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 메르캅토에탄올, 니코틴아미드, 또는 그의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4, HGF, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 제노-무함유이고, 예를 들어, 동물 성분을 함유하지 않는다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 인간-유래 성분 및 동물-유래 성분을 함유하지 않고, 예를 들어, 화학적으로 규정된 배지이다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 혈청을 함유하지 않다. 일부 경우에, prCTB를 수득하고/거나 유지시키기 위한 배양 배지는 소 태아 혈청을 함유하지 않다.
일부 경우에, 섬유모세포 성장 인자는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml bFGF와 접촉된다. 일부 경우에, 줄기 세포는 약 2 ng/ml 내지 약 50 ng/ml, 약 4 ng/ml 내지 약 30 ng/ml, 약 6 ng/ml 내지 약 15 ng/ml, 또는 약 8 ng/ml 내지 약 12 ng/ml bFGF와 접촉된다. 일부 경우에, 줄기 세포는 약 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, 10 ng/ml, 11 ng/ml, 12 ng/ml, 13 ng/ml, 14 ng/ml, 또는 15 ng/ml bFGF와 접촉된다. 일부 경우에, 줄기 세포는 약 10 ng/ml bFGF와 접촉된다.
포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하는 방법
일부 실시양태에서, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, 인간 영양막 줄기 hTS 세포)는 배아를 방해하지 않는 또는 파괴하지 않는 방식으로 탯줄, 양수, 양막, 워튼 젤리, 융모막 융모, 태반 또는 자궁외 임신으로부터 단리될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 포유동물 영양막 줄기 세포는 항생제, 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는 배양 배지에서 배양된다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하기 위한 배양 배지는 레티노산을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 메르캅토에탄올, 니코틴아미드, 또는 그의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4, HGF, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 제노-무함유이고, 예를 들어, 동물 성분을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 인간-유래 성분 및 동물-유래 성분을 함유하지 않고, 예를 들어, 화학적으로 규정된 배지이다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 혈청을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 포유동물 영양막 줄기 세포를 수득하고/거나 계대시키기 위한 배양 배지는 소 태아 혈청을 함유하지 않는다.
한 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 양수천자 생검 또는 양수로부터 단리될 수 있다. 한 경우에, 양수천자는 임신 동안 태아를 둘러싸는 양수의 소량 샘플을 수득하는데 사용되는 절차일 수 있다. 한 경우에, 양수천자는 염색체 이상의 위험이 증가된 임신 15주 내지 20주의 여성, 예를 들어, 분만 시 35세를 초과하는 여성, 또는 모체 혈청 (혈액) 스크리닝 테스트가 비정상적이어서 염색체 이상 또는 신경관 결손의 위험 증가를 지시한 여성에게 제공될 수 있다. 한 경우에, 바늘, 예를 들어, 속이 빈 길고 가느다란 바늘이 초음파 가이드와 함께 복부를 통해 자궁 및 양막 내로 사용될 수 있다. 미리 정해진 양의 양수, 예를 들어 1 온스를 주사기 내로 뽑을 수 있다.
또 다른 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는, 예를 들어, 생식 요법 예컨대 시험관내 수정 (IVF)과 함께, 착상전 유전 진단 (PGD) 동안 할구 생검으로부터 수득될 수 있다. 한 경우에, 본원에서의 세포는 배반포의 생검을 위한 방법에 의해 생산될 수 있고, 여기서 나머지 배반포는 착상되어 임신 및 이후의 출산을 초래하며, 예를 들어, 투명대가 배반포로부터 제거된 후, 배반포가 생검된다.
또 다른 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 출생전 융모막 융모 샘플링 (CVS)으로부터 수득될 수 있다. 한 경우에, CVS는 염색체 이상 및 특정한 다른 유전적 문제에 대해 테스트하기 위해 태반으로부터 조직 샘플을 취하는 것을 수반하는 출생전 테스트일 수 있다. 한 경우에, CVS는 임신 10주 내지 12주에 수행될 수 있다. 한 경우에, CVS 절차는 경경부식이고, 예를 들어, 카테터가 경부를 통해 태반 내로 삽입되어 조직 샘플을 수득한다. 한 경우에, CVS 절차는 경복부식이고, 예를 들어, 바늘이 복부 및 자궁을 통해 태반 내로 삽입되어 조직 샘플을 수득한다.
한 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 만삭 임신 후의 태반 생검으로부터 수득될 수 있다. 한 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 질 분만 또는 제왕절개 분만 후에 태반으로부터 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 제1 삼분기 융모막 융모 샘플링 (예를 들어, 8+3 내지 12+0주 임신 나이) 또는 제왕절개 분만으로부터의 만삭 태반으로부터 단리될 수 있다. 융모막 조직을 양막으로부터 분리하고/거나, 다지고/거나 효소적으로 소화시킬 수 있다 (예를 들어, 0.05% 트립신 EDTA로, 예를 들어, 20분 동안). 이어서 세포를 원심분리하고/거나 (예를 들어, 1500 rpm에서, 예를 들어, 5분 동안), 계수하고/거나, 배지 (예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 + 10% 소 태아 혈청)에 다시 플레이팅한다 (예를 들어, 104개 세포/cm2). 한 경우에, 단리된 세포는 플라스틱 부착성일 수 있다. 한 경우에, 세포는 계대 4-8에서 사용될 수 있다.
한 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는하기 절차에 따라 만삭 (예를 들어, 임신 38-40주) 태반으로부터 단리될 수 있다. 제대혈을 태반으로부터 배출시킨 후, 그를 조심스럽게 절단한다. 수확된 조직 조각을 여러 번 세척한 후 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수에서), 다지고 (예를 들어, 기계적으로), 효소적으로 소화시킨다 (예를 들어, 0.25% 트립신-EDTA로). 이어서 균질화물을 원심분리에 의해 펠릿화시키고, 완전 배지 (예를 들어, 10% 소 태아 혈청, 100 U/ml 페니실린, 및/또는 100 g/ml 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지)에 현탁시킨다. 세포 배양물을 적절한 조건에서, 예를 들어, 37℃, 수분 포화 대기 및 5% CO2에서 유지시킨다. 배지를 주기적으로, 예를 들어, 매주 1 내지 2회 교체한다. 세포가 원하는 전면성장 수준, 예를 들어, 80％ 초과의 전면성장에 도달했을 때, 세포를 예를 들어 0.25% 트립신/EDTA로 회수하고, 예를 들어 1:3의 희석도로 다시 플레이팅한다.
또 다른 경우에, 본원에서의 포유동물 영양막 줄기 세포 (예를 들어, hTS 세포)는 하기와 같은 절차에 따라 분만 후 인간 태반으로부터 단리될 수 있다. 융모막과 양막을 벗겨내어 융모막을 양막에서 분리시킨다. 탈랄막 조직을 긁어 내고 (예를 들어, 기계적으로), 세척한 후 (예를 들어, 둘베코 포스페이트-완충 염수에서), 소형 조각 (예를 들어, ~2×2 cm)으로 절단한다. 융모막을 소형 조각으로 자르고, 효소 (예를 들어, 0.5% 트립신-EDTA, 예를 들어, 5분 동안)에 적용한 후, 콜라게나제 I로 소화시킨다 (예를 들어, 0.3%로 37℃ 인큐베이터에서 20 내지 30분 동안). 그 후, 동원된 세포를 수집하고, 세포 스트레이너 (예를 들어, 100 μm)에 통과시킨다. 여과된 세포를 원심분리로 수집한다 (예를 들어, 2,500 rpm으로, 예를 들어, 5분 동안). 세포를 배지 (예를 들어, 10% 소 태아 혈청 및/또는 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 α-변형 최소 필수 배지)에 재현탁시키고, 용기, 예를 들어, T25 플라스크에서 적절한 조건 (예를 들어, 37℃ 및/또는 5% CO2)에서 배양한다. 융모막 MSC가 원하는 수준의 전면성장, 예를 들어, 70% 전면성장에 도달할 때까지, 배지를 주기적으로, 예를 들어, 3일마다 교체한다.
또 다른 경우에, 융모막 융모는 자궁외 임신 여성 (예를 들어, 임신 나이: 5-7주)의 파열되지 않은 착상전 배아의 나팔관으로부터 수득될 수 있다. 아주 작은 융모 조직을 적절한 배지 (예를 들어, 혈청-무함유 α-MEM)에서 잘게 다지고, 현미경검사에 의해 식별한 후, 일정 기간 (예를 들어, 15분) 동안 트립신으로 처리하고 (예를 들어, 0.025% 트립신/EDTA), 배지 (예를 들어, 10% FBS를 함유하는 α-MEM)를 첨가하여 반응을 정지시킬 수 있다. 부착성 세포를 수득하여, 적절한 조건 (예를 들어, 컨디셔닝된 α-MEM, 10% FBS, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신, 37℃, 5% CO2)에서 배양할 수 있다. 2회의 계대 후, hCG 수준이 상업용 키트 (예를 들어, 다코(Dako), 캘리포니아주 카핀테리아)에 의해 측정 시 검출불가능하게 될 수 있다.
키트/제조 물품
본원에 기술된 하나 이상의 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에서 개시된다. 이같은 키트는 각각의 용기(들)가 본원에 기술된 방법에서 사용될 별개의 요소들 중 하나를 포함하는 하나 이상의 용기 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지 또는 용기를 포함한다. 적절한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 일부 경우에, 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에서 제공되는 제조 물품은 포장 물질을 포함한다. 제약 포장 물질의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 사용 양식에 적절한 임의의 포장 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 용기(들)는, 임의적으로는 본원에 개시된 바와 같은 조성물 내에, hTS 세포를 포함한다. 이같은 키트는 본원에 기술된 방법에서 그를 사용하는 것과 관련된 식별 설명 또는 표지 또는 설명서를 임의적으로 포함한다.
키트는 내용물 및/또는 사용 설명서를 열거하는 표지, 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 전형적으로 포함한다. 또한 설명서 세트가 전형적으로 포함될 것이다.
일부 경우에, 표지는 용기 상에 있거나 또는 용기와 조합된다. 일부 경우에, 표지를 형성하는 글자, 숫자 또는 기타 문자가 용기 자체에 부착되거나, 성형되거나 또는 에칭되는 경우에는 표지가 용기 상에 있고, 예를 들어, 패키지 삽입물과 같이, 용기를 또한 보유하는 저장소 또는 캐리어 내에 표지가 존재하는 경우에는 표지가 용기와 조합된다. 일부 경우에, 표지는 내용물이 특정한 치료 용도를 위해 사용되어야 한다는 것을 지시하기 위해 사용된다. 표지는 내용물의 사용 지침, 예컨대 본원에서 기술된 방법에서의 지침을 또한 지시한다.
실시예
하기 실시예는 비제한적이고, 본 발명의 다양한 측면 및 특색을 대표할 뿐이다.
실시예 1
스트레스 시의 인간 영양막 줄기 (hTS) 세포의 형질전환 특성
난관에서의 배아 운반 동안 배반포 영양막이 모체의 고혈당 위협에 어떻게 도전하는지를 검사하기 위해, 고 글루코스 (20 mM)의 효과를 hTS 세포에서 테스트하였다. 글루코스가 신속하게 세포막에서 감미 수용체 T1R2/T1R3의 활성화를 일시적으로 유도하고 후속적으로 세포 내에서 G-단백질 신호전달을 활성화시켜, Gαq/11/CaMKII/CREB1 및 Gβ/GSK3β/MAFA 신호전달 경로를 일으켰음이 확인되었다 (도 1A). 조절성 분자 메커니즘이 보충 정보 (도 2A 내지 2J)에서 도해되었다. 핵에서, 2개의 G-단백질 경로가 인슐린을 생산하도록 전사를 위해 인슐린 유전자의 프로모터를 공동으로 표적화하였다 (도 1A). 특이적 shRNA에 의한 전사 인자 CREB1 및 MAFA의 녹다운은 ChIP-qPCR 분석에 의해 인슐린 발현을 감소시켰다 (도 1B). 한편, 활성화된 T1R2/T1R3 신호전달은 세포 내로의 글루코스 진입을 촉진하도록 글루코스 센서 및 수송체 GLUT2를 유도하였다. 글루코스는 ATP 생산을 증대시켜 L형 전압-게이팅 Ca2+ 채널 (VGCC)을 개방시켜, 세포외 칼슘의 세포 내로의 진입을 초래하였고, 이는 방사선면역검정법 (RIA)에 의해 검출된 배양 배지 내로의 인슐린 분비를 촉진한다. 이러한 작용은 RIA에 의해 측정 시, 술포닐우레아는 인슐린 분비를 촉진한 한편, VGCC 억제제 니페디핀은 인슐린 분비를 차단한 것에 의해 확인되었다 (도 1C). 이러한 결과들은 hTS 세포에서 글루코스가 인슐린 합성 및 분비를 제어할 수 있다는 것을 시사하였다. qPCR 분석에 의해 측정 시, 이러한 인슐린 발현은 CREB1 신호에 기인할 수 있지만, 통상적인 췌장 및 십이지장 호메오박스 1 (PDX1)은 그렇지 않다 (도 2K).
추가로, 면역형광 영상화 연구는 인슐린, CREB1, CaMKII, GLUT2, 및 MAFA뿐만 아니라, β-hCG, 조직적합성 항원 HLA-G, 및 만능성 전사 인자 CDX2도 hTS 세포에서 발현되었지만, OCT4 (옥타머-결합 전사 인자 4)는 발현되지 않았음을 드러냈다 (도 1D). 스트레스 단백질인 열 충격 단백질 HSP90 또한 발현되었다. 그러나, hTSC는 증식 마커 Ki-67, 단백질 폴딩 활성화제 HSP70, 종양 억제인자 p53, 자가항원 GAD65, 및 세포-세포 융합 단백질 신시틴 또한 발현하지 않았고 (도 2M), 이는 hTSC가 TE-분화 영양막의 제1 위치에 있다는 개념을 지지한다.
형태학적으로 hTS 세포에 대한 글루코스의 스트레스 효과를 추가로 조사하였고, 이는 고 글루코스가 부착된 섬유모세포 특색에서 시험관내 배양에서의 β-세포에 대한 특이적 염색인 아연-킬레이팅제 디티존 (DTZ)의 양성 염색의 3D 응집 세포 클러스터로의 세포 변화를 신속하게 유도하였음을 나타낸다. 고 글루코스를 철회하면 세포가 클러스터에서 신속하게 방출되어 접시에 다시 부착되어, 원래의 섬유모세포 특색으로 되돌아갔다. 세포 프로세스를 보충 온라인 비디오 (비디오 S1)에 제시된 컴퓨터 현미경검사 비디오 시스템 (올림푸스(Olympus), IX-81, DP30, MIU-IBC-IF-2)으로 기록하였다. 또한, 세포 클러스터의 초미세구조 연구는 2개의 세포 사이의 데스모솜 연접과 함께 큰 세포질 대 핵 비를 드러냈다. 췌장 β-세포에서의 것과 유사하게 다양한 빈 소포, 풍부한 미토콘드리아, 및 소포 내의 미성숙 과립이 세포질 구획에서 관찰되었다. 그를 위해, hTS 세포가 외부 위협에 대처하기 위해 인슐린 및 스트레스 단백질 HSP90을 발현하는 능력을 가질 수 있고, 여기서 hTS 세포는 글루코스 자극에 고도로 감수성일 수 있으며, 이는 hTS 세포의 가역적인 세포 형질전환을 야기할 수 있음이 실연되었다.
실시예 2
전구 조절성 세포영양막 (prCTB)의 시험관내 유도
영양외배엽-유래 hTS 세포에 대한 bFGF의 영향을 본 실시예에서 검사하였다. 한 실험에서, prCTB가 시험관내에서 hTS 세포로부터 유래되었다.
bFGF가 TGF-β1을 통해 상피-중간엽 전이 (EMT)를 유도한다.
bFGF가 hTSC에서 TGF-β1 발현을 유도하였고 (도 4A), 중간엽 세포 마커 비멘틴을 상향조절하였지만, 세포-세포 부착 단백질 E-카드헤린을 하향조절하였음이 웨스턴 블롯 검정법 (도 4B) 및 면역세포화학 (도 4C)에 의해 밝혀졌다. 이러한 작용은 TGF-β1 항체로의 전처리에 의해 중화되었다 (도 4D). 광 현미경검사에서 기다란 방추체에서 더욱 둥근 핵과 함께 비대하고 짧아진 특색으로의 세포 형상 전환이 드러났다 (도 4E). 이러한 현상은 bFGF가 EMT를 이동 및 침습에서의 능력을 획득하도록 유도한다는 것을 시사하였다.
bFGF가 mRNA-124a를 통해 완성 내배엽 (DE)의 서명을 촉진한다.
bFGF가 세포막에서 수용체 FGFR1을 표적화하여 PI3K/AKT/CREB1 신호전달 경로의 활성화를 유도하였음이 밝혀졌다. DIANA-mirGen 2.0의 컴퓨터 조사에 의해, bFGF-유도 CREB1이 마이크로RNA-124a (miR-124a)의 프로모터에서 컨센서스 CREB 결합 서열 (TGACGTCA)을 표적화하였음이 qPCR 분석에 의해 입증된 한편, CREB1의 녹다운은 miR-124a 발현을 감소시켰다. CREB1과 miR-124a의 양성 상관관계가 관찰되었다.
miR-124a의 하류 이펙터에 대한 식견을 얻기 위해, pGL4.51 벡터 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)를 사용한 SMAD4, GSK3β 및 CDX2의 플라스미드를 루시퍼라제 유전자 검정법을 위해 구축하였다. 첫째, miR-124a는 SMAD4 유전자를 표적화하여, 억제성 SMAD4를 생산하는 것으로 나타났다. SMAD4는 SMAD2/3과 상호작용하여 전사를 위해 MIXL1 유전자의 근위 프로모터 내의 서열에 결합할 수 있기 때문에, 억제성 SMAD4는 억제성 호메오도메인 단백질 MIXL1을 야기하였다. 이는 SMAD4 shRNA를 사용함으로써 확인되었고, 영상화 연구 (bFGF (10 ng/ml)가 대조군에 비교하여 15분에 MIXL1의 명백한 발현을 유도하였음을 나타냄. MIXL1 발현은 4시간 유도에서 강도가 감소하였고, 이는 일시적인 발현을 지시한다)에 의해 지지되었다. 둘째, miR-124a는 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β)를 억제하는 것으로 나타났고, 이는 miR-124a 및 항-miR-124a 항체의 전처리에 의해 입증되었다. 결과적으로, 억제성 GSK3β가 하류 β-카테닌의 축적을 야기하여, 전사를 위해 FOXA2 유전자를 표적화하도록 핵 전위로 이어지며, 이는 β-카테닌에 대한 shRNA를 사용하는 검정법에 의해 증명되었다 (도 4F). 차례로, 포크헤드 박스 단백질 A2 (FOXA2)가 PDX1 발현을 제어하여, 내분비 세포 분화의 사양에 수반되도록 프로-엔도크린 전사 인자 뉴로제닌 3 (NGN3)에 기여하였다. 세째, miR-124a는 CDX2 유전자를 표적화하여 CDX2 합성을 억제하였고, 이는 miR-124a 및 항-miR-124a 항체의 전처리에 의해 입증되었다. 하향조절된 CDX2는 OCT4의 상향조절을 초래하였다. 차례로, OCT4는 전사를 위해 SOX17 유전자를 표적화하여 SOX17 (SRY-박스 단백질 17)을 생산하였고, 이는 영상화 연구에 의해 지지되었다. 총괄적으로, bFGF가 8시간 유도에서 miR-124a를 촉진하여, 결과적으로 SOX17, FOXA2, 및 OCT4의 상향조절, 뿐만 아니라 MIXL1의 하향조절에 의해 완성 내배엽 (DE)의 서명을 획득할 수 있고, 이는 추가 인슐린 발현에 기여할 수 있다는 것이 실연되었다.
bFGF가 hTS 세포로부터 prCTB의 생성을 유도한다.
PDX1, 췌장 전사 인자 1 단백질 (PTF1a), SOX9, 및 호메오박스 1 단백질 NKX (NKX6.1)를 포함하는 췌장 선조 바이오마커의 유의한 상향조절이 8시간의 bFGF 유도에 주지되었다. 이러한 분자 신호의 출현은 20시간의 유도에 NGN3, 프로-인슐린 C-펩티드, 및 인슐린의 발현을 개시시켰다. 인슐린 이외에도, 면역형광 영상화에서 bFGF-처리 hTS 세포에서 PDX1, 간세포 핵 인자-1-베타 (HNF1B), NGN3, SOX9, NKX6.1, 및 인슐린, 뿐만 아니라 NANOG, SOX2, 글루카곤, 소마토스타틴, GLUT2, 및 폴리펩티드 (PP)를 포함하는 다양한 췌장 선조- 및 내분비 세포-마커의 존재가 확인되었다 (도 3).
다음으로, 초기에, bFGF-유도 hTS 세포가 CDX2를 발현하였지만 OCT4는 발현하지 않았음이 발견되었다 (도 5C). 분화가 진행됨에 따라, OCT4가 상향조절된 한편 CDX2가 하향조절되어, 8시간 유도에서 DE 스테이지의 만능성을 조절한다. 중배엽의 스테이지와 유사하게 12시간 유도에 OCT4가 점진적으로 하향조절되었고, NANOG가 상향조절되어 피크를 이루었다. 여기서, HSP90은 분화 영양막에서 OCT4 및 NANOG의 수준을 유지하였다. 분화가 선조 스테이지에 진입함에 따라, NANOG가 하향조절되었지만, SOX2는 12시간 유도 후에 종료일까지 상향조절을 유지하였고, 여기서 인슐린-발현 prCTB이 형성되었다. 특히, 이러한 분자 프로세스는 췌장에서의 β-세포의 발달과 유사하지만, 기존에 기술된 바와 같은 hTS 세포에서의 글루코스-유도 인슐린 발현과 구별된다. 만능성 전사 인자의 시공간적 신속성은 주로 상호 음성 자가조절 메커니즘에 기인하는 반면, SOX2가 prCTB의 줄기세포능의 유지에서 주요한 역할을 한다. 그를 위해, bFGF가 단리된 hTS 세포의 인슐린을 분비하는 신규 췌장외 조직-특이적 표현형으로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다는 것이 본 발명가들의 실험에서 증명되었고, 이러한 표현형은 본원에서 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)으로 명명된다. 본원에서 실연된 바와 같이, prCTB는 시험관내에서 영양막 분화 동안 주로 SOX2에 의해 유지될 수 있다.
실시예 3
prCTB와 hTS 세포 및 원시 세포영양막의 차이
면역조직화학에서 대부분의 prCTB 세포가 인슐린, GLUT2, CaMKII, Ki67 (증식 인자), β-hCG, 및 HLA-G에 의해 염색되었음이 드러났고, 이는 prCTB가 증식 특성을 갖는다는 것을 시사한다 (도 5A). 신시틴을 제외한, GAD65, HSP70, HSP90, 및 p53을 포함한 스트레스 단백질 또한 prCTB에서 발현되었지만, hTS 세포에서의 발견 (도 2M)과 구별된다. 이러한 결과들은 세포외 스트레스 인자의 효과가 시험관내에서 hTS 세포의 prCTB로의 형질전환을 구동시킬 수 있다는 것을 암시하였다.
정상 자궁 임신에서, 원시 세포영양막 (pCTB)은 1) 융모 세포영양막; 2) 원시 융합영양막 (pSTB) 및 이후의 융합영양막 (STB); 및 3) 융모외 세포영양막 (EVT)을 초래할 수 있다. 융모 세포영양막이 HSP90 및 인슐린을 발현하였지만, p53 및 신시틴은 발현하지 않았음이 밝혀졌다 (도 5B). STB는 인슐린, p53, 및 신시틴을 발현하였지만, HSP90은 발현하지 않았다. EVT는 명백한 인슐린 및 p53을 발현하였지만, HSP90 및 신시틴은 발현하지 않았고, 이는 침습성이지만 증식성이지 않은 특성을 시사한다. 도 5C는 이같은 발달 프로세스를 도해한다.
실시예 4
hTS 세포 및 prCTB로부터의 시크리톰 또는 엑소솜
루미넥스 기술을 기초로 하는 밀리플렉스(Milliplex) 검정법에 의해 hTS 세포 및 prCTB 둘 다의 배양 배지에서 케모카인, 시토카인, 및 성장 인자의 수준을 측정하였다. 결과들은 hTS 세포 및 prCTB 둘 다가 하기를 포함하는 명백한 양의 다양한 시크리톰 또는 엑소솜 (도 7A, 상단 패널)을 방출할 수 있음을 드러냈다:
1) 케모카인
이러한 군은 RANTES (CCL5로도 알려짐), MCP-1 (CCL2, 단핵구 화학유인물질 단백질-1로도 알려짐), GROα (CXCL1, CXCL2, 대식세포 염증 단백질 2-α 또는 MIP2-α로도 알려짐), MCP-3 (CCL7로도 알려짐), IL-8, 에오탁신 (CCL11, CCL24, 및 CCL26으로도 알려짐), MDC (CCL22로도 알려짐), IP-10 (IFN γ-유도 CXCL10으로도 알려짐), 프랙탈카인 (CX3CL1로도 알려짐), MIP-1β (CCL4로도 알려짐), 및 가용성 CD40-리간드 (sCD40L, CD154로도 알려짐)를 포함하였다.
2) 시토카인 및 성장 인자
이러한 군은 IL-6, IL-10, IL-4, IL-7, IL-15, IL-13, IL-1α, IL-1β, IL-12p40, IL-3, 및 IL-2를 포함하였다. IFN-γ 및 IFN-α 또한 분비되었다. 한편 성장 인자는 PDGF-AA 및 PDGF-AB/BB (혈소판-유래 성장 인자　패밀리), VEGF, EGF (표피 성장 인자), bFGF, GM-CSF (과립구-대식세포 콜로니-자극 인자), Flt3L (FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드), 및 IL-1β를 포함하였다.
3) 기타 단백질
또한, 시크리톰 분석 (도 7B)에 의해 hTS 세포 및 prCTB 둘 다 가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G),　전환 성장 인자 베타 1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 및 IL-10을 방출할 수 있었다.
그럼에도 불구하고, 사용된 상업적인 인간 혈소판 용해물 (즉, PLUS, 컴패스(Compass)) 또한 배양 배지에 엑소솜을 분비한다. PLUS의 기본 효과를 배제함으로써, 나이브 hTS 세포 및 prCTB 둘 다 주로 GRO, MCP-1, 프랙탈카인, IP-10, MCP-3, 에오탁신, 및 더 적은 양의 MIP-1β의 케모카인, 및 IL-6 및 IL-8을 더 적은 양의 IL-4, IL-1RA, IL-10, IL-12P40, IL-15, IL-1α 및 IL-17A와 함께 포함하는 시토카인을 포함하는 엑소솜을 실제로 분비할 수 있었음이 확인되었다 (도 7A, 하단 패널). 한편 성장 인자는 PDGF-AA, VEGF, bFGF, 및 G-CSF, 뿐만 아니라 더 적은 양의 Flt-3L 및 GM-CSF를 포함하였다 (도 7A, 하단 패널). 이러한 데이터는 나이브 hTS 세포 및 prCTB 둘 다 기능을 위해 다양한 시크리톰 또는 엑소솜을 방출하는 능력을 가질 수 있다는 것을 시사하였다.
도 7C는 hTSC 및 prCTB 둘 다에서의 시토카인 IL-6 및 IL-8; 케모카인 MCP-1 및 CXCL2; 및 혈관형성 인자 PDGF-AA 및 VEGF 생산의 또 다른 요약을 나타낸다. prCTB는 혈관형성 분자 CD105 (엔도글린(Endoglin), 혈관형성에서 기능하기 위한 TGF-β에 대한 수용체) 및 CD146 (혈관 내피 카드헤린)을 발현하였다 (도 7D). 이러한 결과들은 prCTB가 태아-모체 계면의 탈락막 조직에서 기능하기 위한 능력을 갖는다는 것을 시사하였다.
실시예 5
prCTB가 면역 세포-연관 바이오마커를 나타낸다
면역 세포-연관 바이오마커의 발현을 FACS 분석에 의해 8개의 독립적인 세포주로 prCTB에서 조사하였고, 이는 NK 및 T 세포 바이오마커의 유사한 패턴을 나타냈다. 결과들은 둘 다 CD4+, CD8+, CD107a+, 및 (CD16+CD56)+을 포함하는 CD 바이오마커를 발현하였고, T 세포 및 NK 세포와 유사한 CD 바이오마커를 공유하였음을 드러냈다. 대표적인 세포측정 분석이 도 8의 표 및 도 9A-9M에서 제시된다. (CD16+CD56)+ 세포 및 CD107(+) 세포가 hTSC 및 prCTB 둘 다에서 가장 높은 발현을 나타냈다 (도 8 및 9L). 그의 조합 패널은 또한 분포에서 세포 집단의 대부분의 성분을 차지하였다 (도 8 및 9M). 이러한 결과들은 prCTB가 태아-모체 계면에서 면역 세포-유사 기능을 발휘하는 능력을 갖는다는 것을 시사하였다. prCTB가 CD11b 및 CD49f를 발현하였음이 면역염색에 의해 또한 밝혀졌다 (도 9N).
추가로, 이뮤노블롯팅 검정법에서, hTS 세포 및 prCTB 둘 다 ILT-2 (백혈구 Ig-유사 수용체 1, LILRB1로도 알려짐), ILT-4 (LILRB2로도 알려짐), TCR (T 세포 수용체)를 발현하였고, 특히, 세포용해성 NK 세포 기능을 억제하기 위해 NK 세포 및 CD8+ T 세포의 서브세트에 의해 발현되는 KIR2DL4 (킬러 세포 Ig-유사 수용체)를 발현하였음이 확인되었다 (도 7E). 이들은 또한 PD-L1 (프로그램화된 사멸-리간드 1), Fas (아폽토시스 신호 수용체, APO-1로도 알려짐), 침윤성 림프구의 아폽토시스를 유도하는 FasL (Fas 리간드), 및 NKp46 (주요 NK 세포-활성화 수용체)을 발현하였고 (도 7E), 이들은 표적 세포의 제거에서 수반된다. 흥미롭게도, bFGF가 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 및 전사 인자 c-JUN을 활성화시켜 결과적으로 prCTB의 분화에서 FasL의 발현을 촉진하였다 (도 7F). shRNA에 의한 FGFR1의 녹다운에서 이러한 작용이 확인되었다. 그 결과, prCTB의 (CD16+CD56) 분자가 IFN-γ를 생산하여 PD-L1 생산을 자극하고, 이에 의해 종양 세포 내의 동족 수용체 PD-1을 인식하고, 악성 종양에 대한 면역 반응을 하향-조절한다.
bFGF가 prCTB에서 FGFR1/CREB1 신호전달 경로를 통해 IL-6 및 IL-8을 유도한다.
prCTB가 어떻게 시토카인 IL-6 및 IL-8을 생산하는지를 탐구하기 위해, hTSC를 나팔관에서의 일시적인 체류를 모방하여 1일 동안 bFGF와 함께 인큐베이션하였다. 역학적으로, bFGF는 세포막에서 그의 수용체 FGFR1을 활성화시켜 PI3K/인산화 (p)AKT 신호전달을 유도하였다. 차례로, pAKT가 하류의 pCREB1 (cAMP 반응성 요소 결합 단백질 1)과 상호작용하고 그를 인산화시켜, pCREB1 신호전달을 활성화시켰다. FGFR 1 억제제 PD166866, 및 PI3K 및 pAKT에 대한 특이적 shRNA를 사용하여 이러한 분자 프로세스가 입증되었다 (도 7G-7J). 핵에서, CREB1은 유전자를 표적화하여, 시간-의존적 방식으로 IL-6 (도 7K, 좌측 패널) 및 IL-8 (도 7K, 우측 패널)을 용량-의존적 방식으로 생산하였고, 이는 ELISA 검정법에 의해 확인되었다 (도 7C). 이러한 분자 프로세스는 시공간에서 EMT와 동시에 발생하였다. 결론적으로, bFGF는 자가분비/측분비 방식을 통해 hTSC의 prCTB로의 형질전환 및 prCTB에서의 IL-6 및 IL-8 생산을 유도한다.
prCTB에서 IL-6이 영양막 마커 β-hCG를 유도하고, IL-8이 NK 세포 마커 CD56을 유도한다
prCTB에서, IL-6이 세포막에서 수용체 IL-6R에 결합하여 CREB1 신호전달을 활성화하여, RT-qPCR 검정법에 의해 β-hCG 생산을 초래하였다 (도 7L, 좌측 패널). 흥미롭게도, IL-6은 또 다른 수용체 GnRHR에 결합하여 CREB1 신호전달을 동시에 활성화시켜 결과적으로 웨스턴 블롯 검정법에 의해 β-hCG을 생산할 수 있었다 (도 7M). 한편, RT-qPCR 검정법에 의해 IL-8은 CD56 (NCAM으로도 알려짐) 생산을 유도하였지만, IL-8R을 통한 것은 아니였다 (도 7L, 우측 패널). 그러나, 본 발명가들은 IL-8이 대안적으로 또 다른 수용체 CXCR2에 결합하여 STAT3 (신호 변환제 및 전사 활성화제 3) 신호전달을 활성화시키고, 차례로 전사를 위해 유전자를 표적화시켜, CD56을 생산할 수 있다는 것을 웨스턴 블롯 검정법에 의해 밝혀냈다 (도 7N). 이러한 분자 프로세스가 β-hCG 발현에 대해 GnRHR 억제제 엘라골릭스 및 CREB1 억제제 666-15를 사용함으로써 입증된 한편 (도 7L), CD56 발현에 대해서는 CXCR2 억제제 SB225002 및 STAT3 억제제 스태틱이 사용되었다 (도 7N). 이러한 결과들은 prCTB에서 자가분비/측분비 방식으로 IL-6이 영양막 바이오마커 β-hCG를 유도하는 한편, IL-8이 동시에 NK 세포 바이오마커 CD56을 유도한다는 것을 시사하였다. 그를 위해, 본 발명가들은 bFGF가 hTSC의 prCTB로의 형질전환을 유도하여, 독특한 β-hCG(+)CD56(+) prCTB를 초래한다는 것을 실연하였다.
IL-8이 prCTB에서 CXCR2/CREB1 신호전달을 통해 T 세포 마커 CD4를 유도한다
동시에, IL-8이 prCTB의 세포막에서 수용체 CXCR2에 결합하고, 자가분비/측분비 방식을 통해 활성화시켜 CREB1 신호전달을 유도하여, 그의 핵 전위를 허용하였다. 핵에서, CREB1은 전사를 위해 CD4 유전자를 표적화하여 웨스턴 블롯 검정법에 의해 CD4 분자를 생산하였다 (도 7O). 그러나, 본 발명가들은 IL-8이 또한 수용체 CXCR2에 결합하여 결과적으로 STAT3 신호전달을 활성화시켜, STAT3의 핵 전위에 이를 수 있음을 밝혀냈다. 핵에서, STAT3은 전사를 위해 CD4 유전자의 상이한 부위에서 표적화하여 CD4 분자를 생산하였다 (도 7P). 이러한 분자 프로세스는 CXCR2 억제제 SB225002, CREB1 억제제 666-15, 및 STAT3 억제제 스태틱을 사용함으로써 입증되었다 (도 7O 및 7P).
IL-8이 CD4(+)Foxp3(+) Treg 세포-유사 prCTB를 형성하도록 Foxp3을 유도한다
IL-8-유도 CXCR2 신호전달이 결과적으로 STAT3의 핵 전위를 위해 STAT3 신호전달을 활성화시키도록 결합할 수 있었음이 밝혀졌다. 차례로, STAT3이 전사를 위해 Foxp3 유전자를 표적화하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 Foxp3 단백질 (면역계 반응에서 수반되는 스커핀(scurfin)으로도 알려짐)을 생산하였다 (도 7P). 이러한 분자 프로세스는 CXCR2 억제제 SB225002 및 STAT3 억제제 스태틱을 사용함으로써 입증되었다 (도 7P). 이러한 결과들은 CD4(+)Foxp3(+) Treg 세포를 모방하여 IL-8이 prCTB에서 CD4(+) 및 Foxp3(+) 분자를 생산한다는 것을 시사하였다. prCTB에서 CD4(+)Foxp3(+) 바이오마커의 면역세포화학 공동-염색이 달성되었다 (도 7Q).
실시예 6
태아-모체 계면에서의 prCTB 장벽
prCTB가 탈락막 조직에서 혈관형성을 촉진하는 인자를 발현한다.
prCTB는 밀리플렉스 검정법에 의해 VEGF 및 PDGF-AA를 분비할 수 있었고 (도 7C), ELISA 검정법에 의해 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1) 및 IL-10을 분비할 수 있었을 뿐만 아니라 (도 7B), FACS 분석에 의해 CD105(+) 및 CD146(+) 마커를 발현할 수 있었다 (도 7D). 이러한 분자들의 모든 발현은 prCTB가, 예를 들어, 태아-모체 계면에서의 탈랄막 조직의 SA 리모델링에서, 혈관형성 및 혈관생성을 촉진하는 능력이 있음을 시사하였다.
MCP-1 및 CXCL2가 상승작용적으로 prCTB의 이동을 구동시킨다.
트랜스웰 침습 및 이동 검정법에서, MCP-1이 유의하게 prCTB의 침습 및 이동을 용량-의존적 방식으로 유도하였고 (도 10A), 그리고 hTSC 및 prCTB 둘 다를 시간-의존적 방식으로 유도하였음 (도 10B)이 밝혀졌다. 그러나, CXCL2가 prCTB에서 또한 용량-의존적 방식으로 세포 이동을 촉진하였고 (도 10C), hTSC 및 prCTB 둘 다에서 또한 시간-의존적 방식으로 촉진하였다 (도 10D). 이러한 결과들은 MCP-1 및 CXCL2가 상승작용적으로 시간- 및 용량-의존적 방식으로 prCTB의 구동시키는 능력이 있음을 시사하였다.
태아-모체 계면에서의 신규 prCTB 장벽의 형성.
면역조직화학 영상화에서, prCTB가 신시틴, p53, β-hCG, 및 HLA-G의 발현과 함께 EVT를 향해 이동한 한편, HSP90이 내부 CTB 층에서 나타났음이 밝혀졌다 (도 10E). 태아-모체 계면에서, 면역조직화학에 의해 CD56(+) prCTB가 침습성 EVT에 응집하도록 이동하는 경향이 있으면서 융모 기질 조직에 산발적으로 분포하였다 (도 10F, 상단 및 중간 패널). 이러한 결과들은 prCTB가 신시틴, p53, β-hCG, 및 HLA-G를 발현하는 EVT로 분화하여, 상승작용적으로 착상을 위해 모체 탈락막의 탈락막 상피 세포층으로 침습한다는 것을 시사하였다.
CD56(+) 및 β-hCG(+) prCTB 둘 다가 고정되어 모체 탈락막 내로 침습할 수 있음이 밝혀졌다 (도 10F, 중간 패널; 도 10G, 상단 패널). 침습 및 이동을 우해, CD56(+) prCTB가 탈락막 조직 내의 통상적인 탈락막 천연 킬러 (dNK) 세포와 유사하게 다량의 세포 성분을 차지한 한편 (도 10F, 하단 패널), β-hCG(+) prCTB가 유사한 방식으로 거동하였다 (도 10G, 중간 패널). β-hCG(+) prCTB가 동맥 혈관에서 내피 세포의 위치를 대체하였고 (도 10G, 중간 패널), 또한 정맥의 혈관 강에서 나타났음 (도 10G, 하단 패널)이 밝혀졌고, 이는 SA 리모델링 및 탈락막 정맥 내로의 prCTB의 칩습을 또한 시사한다. 결국, 다수의 CD56(+)β-hCG(+) prCTB가 탈락막 측에 축적되어 세포 장벽을 형성할 수 있고, 이는 본원에서 태아-모체 계면에서의 "prCTB 장벽"으로 칭해진다.
실시예 7
prCTB가 상호작용 시 고형 종양 세포의 아폽토시스를 유도한다
췌장암 세포 (PANC-1, CRL-1469)
췌장암 세포 (PANC-1)가 어떻게 prCTB와 상호작용할지를 조사하였다. prCTB와 PANC-1의 공동-배양에서, prCTB가 이동하여 PANC-1의 세포 콜로니를 둘러싸고 그의 내부로 침투하여, PANC-1의 아폽토시스에 이를 수 있었음이 광 현미경검사에 의해 밝혀졌다 (도 11A). 제조사의 설명서 (ab176749, 앱캠(Abcam))에 따라 아폽토시스/괴사 검출 키트 (청색, 녹색, 적색)를 사용함으로써 이러한 아폽토시스 현상이 추가로 증명되었다. 도 11B는 2개의 생세포의 상호작용을 나타낸 한편, 도 11C는 상호작용 시의 PANC-1의 아폽토시스를 드러냈다. 이러한 상호작용이 PANC-1의 아폽토시스를 나타내는 3D 형광현미경검사에 의해 추가로 증명되었다 (도 11D).
역학적으로, prCTB는 단백질 PD-L1 (프로그램화된 세포 사멸-리간드-1)을 발현하였지만 PD-1 (프로그램화된 세포 사멸 단백질 1)을 발현하지 않은 한편 (도 11E, 좌측 칼럼), PANC-1은 PD-L1 및 PD-1 둘 다를 발현하였음 (도 11E, 우측 칼럼)이 밝혀졌다. 이는 prCTB가 PD-L1/PD-1 세포 사멸 신호전달을 표적 PANC-1 세포에 전달하여, PANC-1 세포 아폽토시스을 야기할 수 있었음을 의미한다. 그러나, PANC-1 세포의 PD-L-1은 prCTB 내의 PD-1의 결여로 인해 prCTB를 향해 사멸 신호전달을 보낼 수 없었고, 이는 prCTB에서 아폽토시스가 발생하지 않았음을 설명한다. Fas/FasL 세포 사멸 신호전달 경로를 다루었을 때, 본 발명가들은 prCTB는 Fas 리간드 (FasL) 및 Fas (FasL 수용체로서) 둘 다를 발현한 한편, PANC-1은 Fas는 발현하였지만 FasL을 발현하지 않았고 (도 11F), 이에 의해 prCTB가 아폽토시스성 FasL/Fas 신호전달을 표적 PANC-1에 전달하여 PANC-1의 아폽토시스를 야기할 수 있었음을 밝혀냈다. 대조적으로, prCTB는 Fas를 발현하지만, PANC-1에서는 FasL이 결여되고, 이는 FasL/Fas 세포 사멸 신호전달이 상호작용 시 prCTB에서 발생하지 않을 것임을 시사한다.
유방암 세포 (MCF-7, HTB22)
prCTB와 유방암 세포주 (MCF-7)의 공동-배양은 인력 및 상호작용이 나타내어, 3D 형광현미경검사에 의해 관찰된 MCF-7의 아폽토시스에 이르렀다 (도 11G). prCTB-발현 PD-L1이 MCF-7 세포 상의 그의 수용체 PD-1에 사멸 신호전달을 보내, 아폽토시스 반응을 초래했을 것이다 (도 11H, 상단 패널). MCF-7은 또한 PD-L1을 발현하였지만, prCTB의 PD-1 수용체 결여가 임의의 아폽토시스를 방지하였다 (도 11H, 하단 패널). 그러나, 다른 FasL/Fas 세포 사멸 축을 조사했을 때, 본 발명가들은 prCTB가 FasL을 발현한 한편 MCF-7은 Fas를 발현하여, MCF-7에서 FasL/Fas 사멸 신호전달의 발생을 허용하였음을 밝혀냈다 (도 11I, 상단 패널).
prCTB가 항-아폽토시스 단백질 Bfl-1 및 Mcl-1을 함유한다
흥미롭게도, prCTB는 Fas를 발현한 한편, MCF-7은 FasL을 발현하였다 (도 11I, 하단 패널). 이러한 사실은 prCTB에서 아폽토시스가 발생했을 수 있다는 것을 암시했지만, 그렇지 않았다. 이를 설명하기 위해, 본 발명가들은 prCTB에서 RT-qPCR 분석에 의해 prCTB가 더 높은 수준의 항-아폽토시스 Bfl-1 및 Mcl-1 mRNA를 발현하였음을 밝혀냈다 (도 11J). Bcl-2 패밀리 단백질의 구성원인 Bfl-1 및 Mcl-1 둘 다 암 세포의 사멸 신호전달을 피하는 항-아폽토시스 능력을 함유하고, 이에 의해 세포 생존을 촉진한다.
기타 고형 종양 세포
이에 따라, prCTB와 일련의 고형 종양 세포의 공동-배양을 수행하고, 면역세포화학 및 3D 형광현미경검사의 조합을 사용하여 검출하였다. 간 Huh 7 세포, 난소 PA-1 (CRL-1572) 세포, 폐 H1299 (CRL-5803) 세포, 위 MNK45 (TCP-1008) 세포, 및 흑색종 A375 (CRL-1619) 세포를 포함한 모든 고형 종양 세포가 공동-배양 동안 아폽토시스를 나타냈다 (도 11K). 이러한 결과들은 수반되는 세포 사멸 신호전달 경로에 의존적으로, prCTB가 다양한 고형 종양 세포를 근절시키는 능력을 함유한다는 것을 시사하였다.
실시예 8
dNK 세포와 prCTB 사이의 유사성
융모막 조직 내의 dNK 세포를 8주의 동일한 임신 나이의 의학적 이유의 유산 여성 및 자궁외 임신 여성으로부터 동의 하에 수득하였다. 먼저, 면역세포화학에 의해 dNK 세포에서의 CD56 바이오마커의 존재 (CD56은 prCTB에서도 발현되었음)가 확인되었다 (도 12A, 상단 패널). 후속적으로, 융모막 융모의 면역조직화학에서, 산발적인 CD56(+) dNK 세포가 내층 융모 CTB와 융모 기질 사이에서 가시적인 한편, EVT 구역에 축적되었음이 드러났다 (도 12A, 중간 패널). β-hCG(+) dNK 세포 (β-hCG는 prCTB에서 또한 발현되었음)가 융모 영양막에서 관찰되었고, EVT 구역에 축적되었다 (도 12A, 우측 패널). 정상적인 착상에서, 축적된 CD56(+) dNK 세포 및 β-hCG(+) CTB가 EVT 구역에서 발견되었고, 주변의 탈락막 조직에 산발적으로 분포하였다 (도 12B, 각각 좌측의 상단 및 하단 패널). 흥미롭게도, 다수의 CD56(+) dNK 세포 및 β-hCG(+) CTB가 모체 탈락막 조직에서 발현되었다 (도 12B, 각각 좌측의 상단 및 하단 패널). 분비성 엑소솜을 통해, dNK 세포처럼 prCTB가 탈락막 조직으로 이동하고, 탈락막 기질 세포와 통신하고, 모체 면역계를 조정하며, 최종적으로 착상을 완료하는 능력을 가질 것이다.
실시예 9
실시예 1-8에서 기술된 실험을 위한 물질 및 방법
실험 모델 및 대상체 상세사항
영양막 조직으로부터 인간 영양막 줄기 (hTS) 세포가 유래되었다. 영양막 조직은 난관 자궁외 임신을 겪은 여성으로부터 임신 7-8주에 사전 동의 하에 수득되었다. 이러한 연구는 KMUH의 연구 윤리 위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. 나이브 hTS 세포를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (FBS; SAFC 바이오사이언시즈(SAFC Biosciences))가 보충된 α-MEM (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에서, 5% CO2를 함유하는 37℃의 습식 대기에서 배양하고 계대시켰다. 배양물을 2-3일마다 1:3-1:6 분할비로 수동으로 계대시켰다. 1) 메센컬트(MesenCult)™-ACF PLUS 500x 보충물 및 L-글루타민이 있고, 기판 예컨대 세포 부착 기판이 있거나 또는 없는 메센컬트™-ACF Plus 배지, 및 2) 뉴클레오시드, 글루타맥스(GlutaMAX)™ 보충물, 및 10% 스테뮬레이트(Stemulate)™ 인간 혈소판 용해물 세포 배양 배지 보충물을 함유하고, 기판이 있거나 또는 없는 알파-MEM을 포함하여, 낮은 시딩 밀도 및 새로운 배양 배지를 hTS 세포를 성장시키는 것에 대해 테스트하였다. CD 분자의 유동 세포측정법 분석을 위해, FBS를 CMP 등급 PLUS (컴패스 바이오케미칼(Compass Biochemical))로 교체하였다. 검출불가능한 CD34 및 CD45와 함께 HLA-G, β-hCG, 및 CDX2를 포함한 특징적인 바이오마커가 안정적으로 발현되었다. 계대 5-10의 hTS 세포에서 24시간 동안의 10 ng/ml bFGF 처리에 의해 hTSC 세포를 prCTB로 유도하는 것을 수행하였다. 1) 메센컬트™-ACF PLUS 500x 보충물 및 L-글루타민이 있고, 기판 예컨대 세포 부착 기판이 있거나 또는 없는 메센컬트™-ACF Plus 배지, 및 2) 뉴클레오시드, 글루타맥스™ 보충물, 및 10% 스테뮬레이트™ 인간 혈소판 용해물 세포 배양 배지 보충물을 함유하고, 기판이 있거나 또는 없는 알파-MEM을 포함하여, 여러 유도용 배지를 테스트하였다. 시딩 밀도는 약 10,000개 세포/cm2였다. 배양물은 페니실린, 스트렙토마이신, 메르캅토에탄올 및/또는 니코틴아미드를 함유하지 않았다. 배양물은 또한 동물 성분, 혈청 예컨대 소 태아 혈청, 항생제, 레티노산, 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4 및/또는 HGF를 함유하지 않을 수 있었다. 분화 체계는 실증적 경험에 의해 결정되었다 (데이터는 제시되지 않음). 계통의 스테이지-특이적 분화는 이전에 기술된 다양한 세포성 바이오마커를 참조하였다. 여러 분석을 위해 지시된 바와 같은 시점에 세포를 수확하였다.
형질감염 실험
hTS 세포를 TransIT-LT1 형질감염 시약 (마이러스 바이오 엘엘씨(Mirus Bio LLC))을 사용하여 siRNA 또는 shRNA 또는 3' UTR 리포터 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염은 100 μl OPTI-MEM (깁코(Gibco)) 내의 2 μg siRNA 또는 shRNA + 4 μl 형질감염 시약로 수행되었다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 형질감염 혼합물을 철야로 부드럽게 세포에 첨가하였다. 그 후, 형질감염된 세포를 추가 처리를 위해 10% FBS가 보충된 α-MEM으로 다시 인큐베이션하였다.
플라스미드 구축 및 이중 루시퍼라제 리포터 검정법
루시퍼라제-3' UTR 리포터 플라스미드를 구축하기 위해, 본 발명가들은 hTS 세포의 게놈 DNA 추출물로부터 3' UTR 단편을 증폭시켰다. 3' UTR 리포터 구축물을 위해 3' UTR 영역을 PsiI 부위가 있는 전방향 프라이머 및 MfeI 부위가 있는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰고, 하기와 같이 열거되었다: Cdx2 3' UTR 영역의 경우: 5'-aaattataagctgtttgggttgttggtct-3' 및 5'-aaacaattgcccccataatttctgactgc-3'; Smad4 3' UTR 영역 1의 경우: 5'-aaattataactcccaaagtgctgggatta-3' 및 5'-aaacaattgctgcactgttcacaggagga-3'; Smad4 3' UTR 영역 2의 경우: 5'-aaattataacagttgtcccagtgctgcta-3' 및 5'-aaacaattgatgacttgcccaaaggtcac-3'; GSK3β 3' UTR 영역의 경우: 5'-aaattataacccacaactggggtaaaaga-3' 및 5'-aaacaattgctgtggaaggggcaaagata-3'. 조합된 PsiI 및 MfeI 소화 (NEB) 후, 3' UTR 삽입물을 T4 DNA 리가제 (타카라(Takara))를 사용하여 pGL4.51 플라스미드 (프로메가(Promega))에 서브클로닝하였다.
이중 루시퍼라제 검정법을 위해, pGL4.74 벡터와 공동-형질감염되는 반딧불이 루시퍼라제 리포터 (500 ng) 또는 어떠한 3' UTR도 없는 빈 벡터, 레닐라 루시퍼라제 플라스미드 (500 ng, 프로메가), 및 비-특이적 대조군 miRNA (30 pmol) 또는 miR-124a 전구체 (30 pmol; 시스템 바이오사이언시즈(System Biosciences))를 hTS 세포 (각각의 웰에 1.5×104개 세포)에 공동-형질감염시켰다. 형질감염 배지를 교체하고 추가로 24시간 후에, 이중 루시퍼라제 리포터 검정법 시스템 (프로메가) 및 센트로(Centro) LB 960 마이크로플레이트 발광측정기 (베르톨드 테크놀로지즈(Berthold Technologies))에 의해 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 평가를 위해, 먼저 레닐라 루시퍼라제 값을 반딧불이 루시퍼라제 활성에 대해 정규화하고, 각각의 3' UTR 리포터의 계산된 활성을 대조군 벡터의 것에 대해 추가로 정규화하였다. 데이터는 평균±SD를 나타내고, n = 8이며, 통계적 유의성으로서 p<0.05이다. 세포 용해 완충제에서 제조된 전체 세포 추출물을 CDX2, SMAD4, GSK3β 및 β-액틴 항체로의 이뮤노블롯팅에 적용하였다.
시크리톰 분석
hTS 세포 배양 배지 (10 ml)를 80-90% 전면성장에서 수확한 후, 원심분리하였다 (3,000 rpm, 30분, 4℃). 3 kDa 비바스핀(Vivaspin) 농축기 (시그마(Sigma))를 사용하여 상청액을 추가로 1 ml로 농축하였다. 농축된 상청액을 이뮤노블롯팅 검정법에 의해 TGF-β1, HLA-G, 및 PAI-1에 대해 추가로 검출하였다. 공급자의 지침 (BD 파민젠(BD Pharmingen), 샌디에고)에 따라 OptEIA ELISA 검정법 키트에 의해 IL-10 수준을 측정하였다. 검출가능한 IL-10 농도의 범위는 2 내지 2,000 pg/ml였다. 100 μL 샘플의 분취량을 삼중으로 측정하였다. 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정법 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 상청액의 총 단백질을 측정하였다. 글루코스 자극 테스트에서 C-펩티드 및 인슐린 수준을 측정하기 위해, bFGF 처리 후 80% 초과의 전면성장 세포에서 α-MEM 배지 (5 ml)에 고 글루코스 (20 mM)를 첨가하였다. 상이한 시점 (5, 10, 20, 30, 60 및 120분)에 배지를 수집하고, 동결건조기 (VirTis; 와민스터(Warminster))에 의해 동결 건조시키고, 방사성 면역검정법 (RIA)을 위해 멸균수 (400 μl)로 재수화시켰다. C-펩티드 및 인슐린 수준을 5회의 검정법에서 각각 C-PEP II-RIA-CT (다이아소스 이뮤노어세이즈 소시에떼 아노님(DIAsource ImmunoAssays S.A.)) 및 Coat-A-Count 인슐린 (시멘스 헬스케어 다이아그노스틱스(Siemens Healthcare Diagnostics))에 의해 결정하였다.
엑소솜 분석
세포 배양 상청액을 1) 24시간 동안의 hTS 세포 배양물 (1×1.86개 세포/10 ml) 및 2) 24시간 동안의 bFGF (10 ng/ml)-처리 hTS 세포 (prCTB)로부터 수확하였다. 이러한 상청액을 루미넥스 LX 200 기기 (R&D 시스템즈(R&D system), 미국)를 사용하여 대만 국립 실험 연구소에서 밀리플렉스 분석에 적용하였고, 데이터를 밀리플렉스 분석 소프트웨어 (5.1.0.0.)에 의해 데이터를 분석하였다.
투과 전자 현미경검사
고 글루코스 자극 후, 배양 접시 상의 hTS 세포-형성 세포 클러스터를 울프람 바늘로 절단하였다. 투과 전자 현미경검사를 위해, 세포 덩어리를 실온에서 1시간 동안, 4℃에서 철야로 3% (w/v) 파라포름알데히드 (머크(Merck)), 1.5% (w/v) 글루타르알데히드 (머크) 및 2.5% (w/v) 사카로스 (머크)를 함유하는 0.1 M PBS (머크; pH 7.4)에서 고정시켰다. 샘플을 1% (v/v) OsO4를 함유하는 팔레이드(Palade) 고정제 (시그마)에서의 4℃에서의 2시간 오스뮴산 처리 전 및 후에 PBS로 세정하고, 우라닐 아세테이트 디히드레이트 (머크)로 처리하고, 일련의 등급화 에탄올 용액을 통해 탈수시키고, EMBed-812 매립 키트 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences))를 사용하여 매립시켰다. 초박막 절편을 우라닐 아세테이트 디히드레이트 및 시트르산납 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈)으로 염색하고, JEM-2000 EXII (JEOL, 일본)를 사용하여 검사하였다.
웨스턴 블롯
세포 배양에서, hTS 세포를 bFGF로 처리하고, 지시된 시점에 수확하고, 프로테아제 (써모 사이언티픽) 및 포스파타제 억제제 (셀 시그널링 테크놀러지(Cell Signaling Technology))가 보충된 RIPA 용해 용액 (밀리포어(Millipore))에 넣었다. 폴리아크릴아미드 겔에서의 30 μg 용해물의 전기영동 후, PDVF 막 (밀리포어)으로의 일렉트로블롯팅을 수행하였다. 실온에서 PBS 내의 5% 무지방 분유의 차단에 의해 (1시간), 표적 단백질을 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 모든 막을 화학발광제 (밀리포어)와 함께 인큐베이션하고, ChemiDoc XRS 시스템 (바이오-래드(Bio-RAD))에 의해 영상화를 포착하였다. 사용된 항체가 주요 자원 표에 열거되었다. 데이터를 알파이즈FC(AlphaEaseFC) (버전 4.0.0)에 의해 분석하였다.
면역형광 영상화
면역세포화학의 경우: 간략하게, 배양된 세포가 있는 슬라이드를 실온에서 30분 동안 95% (v/v) 에탄올에 고정시키고, PBS에서 3회 세정하고, 0.05% (v/v) 트윈(Tween) 20을 함유하는 차단 완충제 PBS (PBST; 시그마) 및 5% (v/v) 정상 당나귀 혈청 (밀리포어)에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 1차 및 2차 항체를 지시된 바와 같이 차단 완충제에서 희석하였다. 1차 항체를 4℃에서 철야로 또는 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 차단 완충제에서 특이적 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 적합한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, 인비트로젠(Invitrogen)) 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 594, 647 (인비트로젠) 또는 딜라이트(Dylight) 488, 594 (바이오레전드(BioLegend))가 접합된 2차 항체를 1시간 동안 첨가하였다. DAPI로의 핵 대비염색에 의해, 슬라이드를 50% 글리세롤에 마운팅하였다. 공초점 레이저 주사 현미경검사 (LSM700; 짜이스(Zeiss) Z1 또는 올림푸스 플루오뷰(Olympus FluoView) 1000 공초점 레이저 주사 현미경) 또는 카운테스(Countess) II FL (인비트로젠), 또는 3D 익스플로러-플루오 현미경검사 (나노라이브(Nanolive), 스위스), 또는 티슈팩스(TissueFAXS) 시스템 (티슈큐노스틱스 게엠베하(TissueQnostics GmbH))에 의해 영상을 포착하였다.
면역조직화학의 경우: 모든 절차를 라이카 본드(Leica Bond)-III 자동화 시스템 (라이카 마이크로시스템즈(Leica microsystems), 배녹번)에서 수행하였다. 염색은 본드 폴리머 리파인(Bond polymer refine) 키트 (카탈로그 #DS9800, 라이카)로부터의 디아미노벤지딘 및 헤마톡실린을 사용하였다. 러닝이 완료되고, 슬라이드 트레이가 제거되었을 때, 커버타일을 목 부분에 의해 조심스럽게 들어 올려 제거하였다. 슬라이드를 각각 95% 및 100% 알콜의 2회의 변화 및 자일렌의 2회의 변화를 통해 탈수시킨 후, 커버슬립을 덮었다.
TaqMan miRNA 및 정량적 실시간 PCR 검정법
제조사의 프로토콜에 따라 DNAase I 온-칼럼 소화 (퀴아젠(Qiagen))와 함께 TRIZOL 시약 (인비트로젠)을 사용하여 3중 또는 5중 샘플에서 hTS 세포로부터 RNA를 단리하였다. 전체 RNA (500 ng)를 iScript cDNA 합성 키트 (바이오-래드)로의 역전사에 사용하였다. 반응 당 cDNA의 1/40 및 400 nM 전방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 2중으로 PCR을 수행하였다. miRNA 스템-루프 qPCR의 경우, 본 발명가들은 제조사의 설명서 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 따라 단일 튜브 TaqMan miRNA 검정법을 사용하였다. 비-주형 대조군 및 RT 마이너스 대조군을 포함한 모든 RT 반응을 진앰프 PCR 9700 써모사이클러(GeneAmp PCR 9700 Thermocycler) (어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행하였다. miR-124 또는 RNU6B에 대한 특이적 프라이머 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여, 비-주형 대조군을 포함하여 비교 실시간 PCR이 3중 또는 5중으로 수행되었다. U6 snRNA (RNU6B; 어플라이드 바이오시스템즈)가 내인성 대조군으로서의 역할을 하였다. SDS2.2.2 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 계산된 상대적 발현이 비교 ΔCt 분석에 사용되었다.
면역침전 (IP) 검정법
bFGF-처리 hTS 세포의 세포 용해물을 수집하였다. 단백질 G-아가로스 (밀리포어)와 함께 30분 동안 인큐베이션함으로써, 총 단백질 (100 μg)을 철야로 열거된 특이적 1차 항체로 처리하였다. 단백질 G-아가로스 비드로 2시간 동안 처리한 후, 샘플을 RIPA 용해 완충제 (밀리포어)로 3회 세정하고, 이어서 단백질 로딩 염료를 첨가하고, 5분 동안 비등시켰다. 8% SDS-PAGE에 의해 샘플을 해상하고, 이뮤노블롯팅 분석에 적용하였다.
염색질 면역침전 (ChIP) 검정법
제조사의 설명서에 따라 ChIP-IT 익스프레스(ChIP-IT Express) 염색질 면역침전 키트 (액티브 모티프(Active Motif))를 사용하여 ChIP 검정법을 수행하였다. 간략하게, 면역침전된 DNA 단편을 hTS 세포 (1×106)로부터 추출하였다. 항-CREB1 또는 항-OCT4 또는 항-β-카테닌 항체를 사용하였다. 특이적 프라이머를 사용하여, miR-124a 또는 SOX17 또는 FOXA2의 프로모터 영역의 보존된 결합 부위를 증폭시켰고, 이는 하기와 같이 열거되었다: miR124-2의 프로모터의 경우: 전방향, 5'-tctgcggctctttggtttca-3', 및 역방향, 5'-tctgccttcagcacaagagg-3'; 및 전방향, 5'-gcggctctttggtttcaagg-3'; 역방향, 5'-ctgccttcagcacaagagga-3'; miR124-3의 프로모터의 경우: 5'-cccgcagttctcaaggacac-3', 및 역방향, 5'-agaagggagccaggcaagtc-3'; SOX17의 프로모터의 경우: 5'-ttgtagattgctctctctcctcc-3', 및 역방향, 5'-gtgaagccttggctagggg-3'; FOXA2의 프로모터의 경우: 5'-cccatcattgattcctggat-3', 및 역방향, 5'-ttgggaggctgagatttgtc-3'.
엑소솜 분석
세포 배양 상청액을 1) 24시간 동안의 hTS 세포 배양물 (1×1.86개 세포/10 ml) 및 2) 24시간 동안의 bFGF (10 ng/ml)-처리 hTS 세포 (prCTB)로부터 수확하였다. 이러한 상청액을 루미넥스 LX 200 기기 (R&D 시스템즈, 미국)를 사용하여 대만 국립 실험 연구소에서 밀리플렉스 분석에 적용하였고, 데이터를 밀리플렉스 분석 소프트웨어 (5.1.0.0.)에 의해 데이터를 분석하였다.
유동 세포측정법
인슐린 분석을 위해, hTS 세포를 긁어내기 또는 1X TrypLE (써모 피셔 사이언티픽)로의 트립신처리에 의해 수집하고, PBS로 세정하였다. 세포 (5×106개 세포/ml)를 얼음 상에서 1시간 동안 차단 완충제 (PBST + 5% 원숭이 혈청)에서 인큐베이션한 후, 4℃에서 30분 동안 알렉사 플루오르® 647 접합 항-인슐린 항체 (9008s, 셀 시그널링(Cell signaling)) 또는 미접합 항-인슐린 항체 (sc-7839, 산타 크루즈(Santa Cruz))와 함께 차단 완충제에 재현탁시켰다. 세포를 차단 완충제에서 2회 세정하고, 미접합 항체로 염색한 후, 암실에서 30분 동안 얼음 상에서 알렉사 플루오르® 647 접합 2차 항체가 있는 차단 완충제와 함께 인큐베이션하였다. 2회 세정한 후, 세포를 유동 세포측정법 (LSR-II 유동 세포측정기; BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 전에 세포 스트레이너 캡이 있는 폴리스티렌 둥근바닥 튜브 (BD 팔콘(BD Falcon))에 통과시켰다. 결과를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에 의해 분석하였다.
만능성 전사 인자 분석을 위해, hTS 세포를 비-특이적 shRNA 또는 CDX2 또는 OCT4 또는 SOX2 또는 NANOG에 대한 shRNA로 형질감염시켰다. 그 후, 세포 (5×106개 세포/ml)를 30분 동안 특이적 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1시간 동안 4℃에서 조정된 희석도의 적합한 형광 염료-접합 1차 항체와 함께 인큐베이션함으로써, 샘플을 세정하고, PBS에 재현탁시킨 후, 유동 세포측정법 (FACScan, BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 산호세) 전에 세포 스트레이너 캡이 있는 폴리스티렌 둥근바닥 튜브 (BD 팔콘)에 통과시켰다. 데이터를 셀-퀘스트(Cell-Quest) 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈)로 분석하였다.
CD 바이오마커 분석을 위해, hTS 세포 또는 prCTB (1×105~1×106개)를 240 μl의 1X FCM 완충제 (레인코(Leinco), F1175)에 현탁시켰다. 세포 (30 μl)를 7-AAD (BD, 5599257), 형광 표지 항체 (BD 멀티테스트 6색 TBNK (BD, 337166) + BV421-표지 항-CD107a (바이오레전드, 328625) 또는 BV421-표지 항-CD34 (BD, 562577) 단독 또는 PerCP Cy5.5-표지 항-CD45 (BD, 340952) + APC-표지 항-CD3 (BD, 555342) + PE-표지 항-γδTCR (BD, 340887) 또는 형광 표지 이소타입 대조군 항체 (FITC-표지 IgG1κ (BD, 556649) + PE-표지 IgG1κ (BD, 556650) + PE-표지 IgG2bκ (BD, 556656) + PerCP-Cy™5.5-표지 IgG1κ (BD, 552834) + PE-Cy™7-표지 IgG1κ (BD, 557872) + APC-표지 IgG1κ (BD, 550854) + APC-Cy7-표지 IgG1κ (BD, 557873) + BV421-표지 IgG1κ (BD, 562438) 또는 BV421-표지 IgG1κ (BD, 562438) 단독으로 염색하였다. 15분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 세포를 1 ml의 1X FCM 완충제로 세정하고, 200 μl의 1X FCM 완충제에 재현탁시켰다. 최종적으로, 세포 샘플을 FACSVerse 유동 세포측정기 (BD, 651155) 및 FACSuite 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
아폽토시스 검정법
PANC-1 세포 (췌장), MCF-7 세포 (유방), H1299 세포 (폐), MKN45 세포 (위), HepG2 세포 (간), PA-1 세포 (난소), A375 세포 (흑색종), 및 PC-3 세포 (전립선)를 포함하는 다양한 암 세포 (2,000개 세포)를 35mm 유리 바닥 접시 (ibidi; 카탈로그# 81158)에 시딩하고, 5% CO2, 37℃ 인큐베이션으로 배양 배지와 함께 배양하였다. 철야 세포 부착 후, bFGF-유도 hTS 세포 (2×104개 세포)를 24시간에 걸친 공동-배양을 위해 첨가하였다. 아폽토시스 검정법을 위해, 공동-배양된 세포를 제조사의 설명서에 따라 아폽토시스/괴사 키트 (ab176749, 앱캠, 영국 캠브리지)를 사용하여 염색하였다. 간략하게, 배지를 제거한 후, 검정법 완충제를 사용하여 세포를 2회 세정하였다. 염색을 위해 아폽신 녹색 지시약 (아폽토시스 세포/녹색) 및 시토칼세인 450 (건강한 세포/청색)을 첨가함으로써, 세포를 실온에서 약 40분 동안 인큐베이션하였다. 완충제로 2회 세정한 후, 세포를 3D 세포 익스플로러-플루오 (나노라이브, 스위스) 하에 관찰하였다.
2:1 비의 prCTB 및 PANC-1 세포의 공동-배양 (3×104개 세포/웰)을 12웰 플레이트에서 37℃에서 6일 동안 수행하고, 광 현미경에 의해 관찰하였다. 아폽토시스 검정법을 위해, 공동-배양된 세포 (24시간에)를 제조사의 설명서에 따라 아폽토시스/괴사 키트 (ab176749, 앱캠, 영국 캠브리지)로 분석하였다. 배지를 제거한 후, 검정법 완충제를 사용하여 세포를 2회 세정하였다. 그 후, 각각의 웰에 아폽신 녹색 지시약 (아폽토시스 세포) 및 시토칼세인 450 (건강한 세포)을 첨가하여, 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 검정법 완충제로 세정하고, 형광 현미경으로 분석하였다.
트랜스웰 검정법
prCTB (1×106개 세포/ml)를 6웰 트랜스웰 삽입물 (세공 크기 8 μm, 코닝(Corring))을 사용하여 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 인큐베이션하여 세포가 침강되도록 하였다. 그를 위해, 세포외 기질 (ECM) 물질을 트랜스웰 막의 상부에 첨가한 후, 세포를 ECM의 상부에 첨가하였다. 예를 들어, 매트리겔(Matrigel)을 해동시키고, 얼음 상에서 액화시킨 후, 30-50 μL의 매트리겔을 24웰 트랜스웰 삽입물에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 15-30분 동안 고체화시켜, 얇은 겔 층을 형성시킨다. 세포 용액을 매트리겔 코팅의 상부에 첨가하여, 세포외 기질을 통과하는 침습을 시뮬레이션한다. 트랜스웰 세포 이동 검정법은 화학유인물질에 대한 세포의 화학주성 능력을 측정한다. 그러나, 트랜스웰 세포 침습 검정법은 세포 화학주성, 및 암 전이 또는 배아 발달에서 통상적으로 발견되는 프로세스인 세포외 기질을 통과하는 세포 침습 둘 다를 측정한다.
파이펫을 사용하여, 매우 조심스럽게 600 μl의 원하는 화학유인물질을 24웰 플레이트의 하부 챔버의 바닥 내로 첨가한다. 트랜스웰 삽입물을 이동시키기 않으면서 화학유인물질을 첨가하고, 기포 발생을 방지한다. 바닥 웰 내의 화학유인물질 액체가 상부 웰 내의 막과 접촉하여 화학주성 구배를 형성하는 것을 확실하게 한다. 인큐베이션 시간은 사용된 세포 유형 및 화학유인물질에 의존적이다. 주: 인큐베이션 기간을 결정하기 위해 추가 테스트가 필요할 수 있다. 주: 부착성 세포의 경우, 이동된 세포는 막의 다른 측에 부착될 것이다1,8. 이동된 세포의 정량을 단계 2.4 내지 2.8에 따라 수행할 수 있다 (단계 2.4-2.8은 멸균 환경에서 수행될 필요가 없다). 비-부착성 세포의 경우, 이동된 세포는 하부 챔버의 배지 내로 떨어질 것이다. 이동된 세포의 수를 혈구계 또는 유동 세포측정기를 사용하여 계수할 수 있다5.
플레이트로부터 트랜스웰 삽입물을 제거한다. 면봉을 필요한 만큼 여러 번 사용하여, 막의 상부로부터 배지 및 이동되지 않은 나머지 세포를 이를 손상시키지 않으면서 조심스럽게 제거한다.
600-1,000 μl의 70% 에탄올을 24웰 플레이트의 웰 내로 첨가한다. 트랜스웰 삽입물을 10분 동안 70% 에탄올 내에 놓아, 세포가 고정되도록 한다. 트랜스웰 삽입물을 24웰 플레이트로부터 제거하고, 면봉을 사용하여 막의 상부로부터 나머지 에탄올을 제거한다. 트랜스웰 막을 건조시킨다 (전형적으로, 10-15분).
600-1,000 μl의 0.2% 크리스탈 바이올렛을 24웰 플레이트의 웰 내로 첨가하고, 염색을 위해 막을 그 안에 위치시킨다. 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션한다.
파이펫 팁 또는 면봉으로 부드럽게 막의 상부로부터 크리스탈 바이올렛을 제거한다. 고정된 세포가 씻겨나가는 것을 방지하기 위해, 매우 조심스럽게, 필요한 만큼 여러 번 막을 증류수에 침지시켜 과량의 크리스탈 바이올렛을 제거한다. 트랜스웰을 건조시킨다.
도립 현미경 하에 관찰하고, 여러 필드에서 세포수를 계수하여, 화학유인물질을 향해 막을 통과하여 이동하고 막의 아래쪽에 부착된 세포의 평균 합계를 수득한다.
통계 분석
이뮤노블롯팅 검정법, qPCR 검정법, 리포터 검정법, 및 인슐린 및 IL-10 검정법의 실험을 3중 또는 4중으로 수행하였고, 지시된 바와 같이 2회 반복하였다. 스튜던트 t 검정과 양측 꼬리 분포에 의해 p-값을 계산하였고, p < 0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
적절한 경우, 본원에서 개시된 하나 이상의 실시양태, 예, 또는 측면이 본원에 개시된 임의의 다른 실시양태(들), 예(들) 또는 측면(들)과 조합될 수 있다.
일부 실시양태가 본원에서 제시되고 기술되었지만, 이같은 실시양태는 단지 예로서만 제공된다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화 및 교체가 발생할 수 있다. 본원에 기술된 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCELERATED BIOSCIENCES CORP. <120> PRECURSORY REGULATORY CYTOTROPHOBLAST CELLS AND USES THEREOF <130> 44980-705.601 <140> PCT/US2020/031509 <141> 2020-05-05 <150> 62/843,925 <151> 2019-05-06 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 aaattataag ctgtttgggt tgttggtct 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 aaacaattgc ccccataatt tctgactgc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 aaattataac tcccaaagtg ctgggatta 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 aaacaattgc tgcactgttc acaggagga 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aaattataac agttgtccca gtgctgcta 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 aaacaattga tgacttgccc aaaggtcac 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 aaattataac ccacaactgg ggtaaaaga 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 aaacaattgc tgtggaaggg gcaaagata 29 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 tctgcggctc tttggtttca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 tctgccttca gcacaagagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 gcggctcttt ggtttcaagg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ctgccttcag cacaagagga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 cccgcagttc tcaaggacac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 agaagggagc caggcaagtc 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 ttgtagattg ctctctctcc tcc 23 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 gtgaagcctt ggctagggg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 cccatcattg attcctggat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 ttgggaggct gagatttgtc 20

Claims (85)

  1. 단리된 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)으로서, 여기서:
    (i) prCTB가 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), CD56, 인슐린, 열 충격 단백질 90 (HSP90), CD4, CD16, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현하고;
    (ii) prCTB가 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인
    prCTB.
  2. 제1항에 있어서, prCTB가 CD4, CD16, CD56, CD107a, CD8, 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인 prCTB.
  3. 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서:
    (i) 집단이 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 인간 백혈구 항원 G (HLA-G), CD56, 인슐린, 열 충격 단백질 90 (HSP90), CD4, CD16, CD107a, CD8, 인터류킨 15 (IL-15), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), CD11b, CD49f, CD3, CD19, CD34, 또는 그의 임의의 조합을 발현하고;
    (ii) 집단이 p53, Ki67, 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), 열 충격 단백질 70 (HSP70), 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인
    세포 집단.
  4. 제3항에 있어서, 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB인 세포 집단.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB인 세포 집단.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB인 세포 집단.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB인 세포 집단.
  8. 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 포함하는 세포의 단리된 집단으로서, 여기서:
    (i) 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이거나;
    (ii) 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB이거나;
    (iii) 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB이거나; 또는
    (iv) 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB이거나,
    또는 그의 임의의 조합인
    세포 집단.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 집단의 적어도 약 10%가 CD16 및 CD56을 발현하는 prCTB이고;
    (ii) 집단의 적어도 약 2%가 CD4를 발현하는 prCTB이고;
    (iii) 집단의 적어도 약 2%가 CD8을 발현하는 prCTB이고;
    (iv) 집단의 적어도 약 5%가 CD107을 발현하는 prCTB인
    세포 집단.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 집단의 적어도 약 2%가 CD16, CD56, 및 CD107을 발현하는 prCTB인 세포 집단.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB가 인터류킨 15 (IL-15)를 발현하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB가 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (LILRB1), 백혈구 이뮤노글로불린-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 2 (LILRB2), T 세포 수용체 (TCR), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 2DL4 (KIR2DL4), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 아폽토시스 신호 수용체 (Fas), Fas 리간드 (FasL), CD335 (NKp46), B 세포 백혈병/림프종 2 관련 단백질 A1 (BCL2A1 또는 Bfl-1), 골수성 세포 백혈병 서열 1 (Mcl-1), 또는 그의 임의의 조합을 발현하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB가 베타-호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG), 가용성 인간 백혈구 항원 G (sHLA-G), 전환 성장 인자 β1 (TGF-β1), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), CD105, CD146, 또는 그의 임의의 조합을 추가로 발현하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB에서 신시틴, 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 또는 그의 조합의 발현이 결여된 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB가 케모카인, 시토카인, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합, 또는 상기 중 임의의 것을 운반하는 엑소솜을 분비하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  16. 제15항에 있어서, 시토카인이 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5 (CCL5), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1), 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-3), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (CXCL1), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2 (CXCL2), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11 (CCL11), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24 (CCL24), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26 (CCL26), 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22 (CCL22), 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10), 프랙탈카인, 및 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4 (CCL4), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 시토카인이 인터류킨 1α (IL-1α), 인터류킨 1β (IL-1β), 인터류킨 (IL-2), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 8 (IL-8), 인터류킨 10 (IL-10), 인터류킨 12p40 (IL-12p40), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 시토카인이 인터페론 α (IFN-α) 또는 인터페론 γ (IFN-γ)를 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자가 혈소판-유래 성장 인자 동종이량체 AA (PDGF-AA), PDGF 동종이량체 BB (PDGF-BB), PDGF 이종이량체 (PDGF-AB), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질, FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), 가용성 CD40 리간드 (sCD40L), 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1β (IL-1β), 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB 또는 복수의 prCTB가, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB가, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 활성화된 신호 변환제 및 전사 활성화제 3 (STAT3) 또는 전사 인자 c-JUN을 갖는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB가, 이뮤노블롯팅에 의해 측정 시, 단리된 prCTB가 이로부터 시험관내에서 분화된 선조 세포보다 적어도 약 1.1, 1.2, 1.5, 1.5, 2, 2.2, 2.5, 2.8, 3, 3.5, 4, 5, 8, 10배 더 높은 수준의 SOX2 단백질을 발현하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 prCTB가 글루타메이트 데카르복실라제 (GAD65), Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53, 가용성 CD40-리간드 (sCD40L), 또는 그의 임의의 조합의 발현이 결여된 융모막 융모-유래 선조 세포로부터 시험관내에서 분화된 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 prCTB가 융모막 융모-유래 선조 세포로부터 시험관내에서 분화되고, 융모막 융모-유래 선조 세포 및 단리된 prCTB 둘 다가 열 충격 단백질 90 (HSP90)을 발현하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 prCTB가 인간 세포인 prCTB 또는 세포 집단.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 prCTB가 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원으로부터 유래되는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 prCTB가 유전자 조작된 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  28. 제27항에 있어서, 단리된 prCTB가 세포 수용체, 면역학적 체크포인트 단백질, 시토카인, 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  29. 제27항에 있어서, 단리된 prCTB가 T 세포 수용체 (TCR), B 세포 수용체 (BCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 외인성 유전자 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 prCTB 또는 세포 집단.
  30. 제약상 허용되는 부형제; 및 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 prCTB 또는 세포 집단을 포함하는 제약 조성물.
  31. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 prCTB 또는 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 방법이 항원-보유 표적 세포를 사멸시키는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 항원-보유 표적 세포가 암 세포인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 암 세포가 방광암 세포, 골암 세포, 뇌암 세포, 유방암 세포, 자궁경부 암종, 결장직장암 세포, 식도암 세포, 위장암 세포, 조혈 악성종양, 두경부 편평세포 암종, 백혈병, 간암 세포, 폐암 세포, 림프종, 골수종, 비암 세포, 비인두암 세포, 구강암 세포, 구인두암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 육종, 위암 세포, 흑색종, 갑상선암 세포, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 항원-보유 표적 세포가 병원체인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 병원체가 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프리온, 진균, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 항원-보유 표적 세포 집단의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%를 사멸시키는 것인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 방법이 염증 경로를 하향조절하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 방법이 이식 거부, 감염, 감염과 연관된 내독성 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 전신 발병 소아 특발성 관절염 (JIA), 염증성 장 질환 (IBD), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 복강 질환, 담낭 질환, 모발둥지 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 췌장염, 수술로부터의 외상, 이식편-대-숙주 질환, 심장병, 골 재흡수, 화상 환자, 심근 경색증, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간 또는 폐 섬유증, 치주염, 또는 저염산증을 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 것인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 방법이 자가면역 질환을 치료하는 것인 방법.
  41. 제31항에 있어서, 방법이 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발근염, 만성 활동성 간염, 혼합형 결합 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 애디슨병, 백반증, 글루텐-민감성 장병증, 그레이브스병, 중증 근무력증, 자가면역 호중구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 류마티스 관절염, 경변증, 심상성 천포창, 자가면역 불임, 굿패스쳐병, 수포성 유천포창, 원판상 루푸스, 궤양성 결장염, 고밀도 침착병, 염증성 장 질환, 또는 건선을 치료하는 것인 방법.
  42. 제31항에 있어서, 방법이 1형 당뇨병을 치료하는 것인 방법.
  43. 제31항에 있어서, 방법이 이식 거부를 호전시키는 것인 방법.
  44. 케모카인, 인터류킨, 성장 인자, 또는 그의 임의의 조합, 및 제약상 또는 미용상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로서, 세포를 함유하지 않는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 조성물이 하기를 포함하는 것인 조성물:
    (i) CXCL2, MCP-1, 프랙탈카인, IP-10, MCP-3, 에오탁신, MIP-1β, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 케모카인;
    (ii) IL-6, IL-8, IL-4, IL-1RA, IL-10, IL-12P40, IL-15, IL-1α, IL-17A, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 인터류킨; 및
    (iii) PDGF-AA, VEGF, bFGF, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 성장 인자.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, MCP-1, 및 CXCL2, IL-6, IL-8 및 VEGF 단백질 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함하는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2가 약 1:1 내지 약 2:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 CXCL2가 약 3:1 내지 약 4:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6이 약 2:1 내지 약 3:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  50. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-6이 약 3:1 내지 약 4:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 IL-8이 약 4:1 내지 약 6:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF가 약 4:1 내지 약 6:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  53. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 내의 MCP-1 및 VEGF가 약 7:1 내지 약 9:1의 중량비를 갖는 것인 조성물.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 PDGF-AA를 추가로 포함하며, MCP-1 및 PDGF-AA가 약 3:1 내지 약 5:1의 중량비로 존재하는 것인 조성물.
  55. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 PDGF-AA를 추가로 포함하며, MCP-1 및 PDGF-AA가 약 6:1 내지 약 9:1의 중량비로 존재하는 것인 조성물.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 PDGF-AA 및 G-CSF를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 PDGF-AA 및 FGF-2 (bFGF)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 IP-10, 에오탁신, Flt-3L, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1b, IL-1a, IL-1RA, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12P40, IL-13, IL-15, IL-17A, CCL5 (RANTES), MDC, MCP-3, IL-12P70, IFNa, IFNr, PDGF-AB/BB, 또는 EGF 중 1개 이상의 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  59. 피부 병태의 조정을 필요로 하는 대상체에게 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 피부 병태를 조정하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 방법이 질환을 치료하거나 또는 미용 용도를 제공하는 것인 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 방법이 피부를 타이트닝하는 것인 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 피부를 수화시키는 것인 방법.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 피부를 회생시키는 것인 방법.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 줄기 세포를 함유하지 않는 것인 방법.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 로션, 크림, 리퀴드, 겔, 에멀젼, 서스펜션, 페이스트, 스틱, 에어로졸, 폼, 패치, 파우더, 연고, 비드, 마스크, 패드, 시트, 상처 드레싱, 붕대 또는 그의 임의의 조합의 투여 형태인 방법.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에게 국소적으로, 피하로, 경피로, 근육내로, 또는 종양내로 투여되는 것인 방법.
  67. 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 대상체가 영장류인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  70. 줄기 세포를 섬유모세포 성장 인자, 및 뉴클레오시드, L-글루타민, L-글루타민을 포함하는 디펩티드, 혈소판 용해물 또는 그의 조합을 포함하는 배양 배지와 접촉시키는 것에 의해 시험관내에서 만능성 줄기 세포를 분화시키는 것을 포함하는, 전구 조절성 세포영양막 (prCTB)을 수득하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 배양 배지가 뉴클레오시드, 디펩티드, 및 혈소판 용해물을 포함하는 것인 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 배양 배지가 약 2 mM 내지 약 200 mM의 L-글루타민을 포함하는 것인 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 약 24시간 내지 48시간 동안 지속되는 것인 방법.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포가 융모막 융모-유래 선조 세포인 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, prCTB로 분화되도록 섬유모세포 성장 인자와 접촉시키기 전에 줄기 세포를 배양 배지와 함께 배양하는 것을 포함하는 방법.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 항생제를 함유하지 않는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 항생제가 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 그의 임의의 조합인 방법.
  78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 레티노산을 함유하지 않는 것인 방법.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 메르캅토에탄올, 니코틴아미드, 또는 그의 조합을 함유하지 않는 것인 방법.
  80. 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4, HGF, 또는 그의 임의의 조합을 함유하지 않는 것인 방법.
  81. 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 동물 성분을 함유하지 않는 것인 방법.
  82. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 인간 유래 성분을 함유하지 않는 것인 방법.
  83. 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 혈청을 함유하지 않는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 배양 배지가 소 태아 혈청을 함유하지 않는 것인 방법.
  85. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자가 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)인 방법.
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