ES2310469A1 - Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones. - Google Patents

Uso compuestos inhibidores actividad snail1 en elaboracion composiciones farmaceuticas utiles para tratamiento de condrodisplasias, procedimiento identificacion compuestos inhibidores, dichas composiciones farmaceuticas, procedimiento diagnostico condrodisplasias y aplicaciones. Download PDF

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Abstract

Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de Snail1 en la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicaciones. La presente describe que el gen Snail1 transduce la señalización mediada por el receptor FGFR3 responsable de condrodisplasias (acondrodroplasia (ACH), displasia tanatofórica (TD) e hipocondroplasia (HCH)), habiéndose demostrado que la simple activación aberrante de Snail1 es suficiente para reproducir un fenotipo de condrodisplasia. Igualmente, mediante experimentos de RNA de interferencia (siRNA) sobre cultivos primarios se demostró que al impedir la función de Snail1 se impide la señalización mediada por el FGFR3 en condrocitos. Esto permite identificar a Snail1 como una diana terapéutica y diagnóstico de condrodisplasias, así como el uso de sus inhibidores comofármacos para el tratamiento de dicha enfermedad.

Description

Uso de los compuestos inhibidores de la actividad de Snail1 en la elaboración de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de condrodisplasias, procedimiento de identificación de compuestos inhibidores, dichas composiciones farmacéuticas, procedimiento de diagnóstico de condrodisplasias y sus aplicaciones.
Sector de la técnica
La presente invención se enmarca en el campo de la biomedicina, y más concretamente en la aplicación de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas, y más concretamente de las condrodisplasias relacionadas con el receptor 3 del factor de crecimiento fibroblástico (acondrodisplasias (ACH), displasias tanatofóricas (TD) e hipocondrodisplasias (HCH), en adelante denominadas genéricamente como condrodisplasias).
Estado de la técnica
El esqueleto está formado por el cartílago y el hueso. El cartílago, a su vez, está formado por los condrocitos, mientras que el hueso está formado por los osteoblastos y los osteoclastos. Los condrocitos y los osteoblastos tienen origen mesenquimático, mientras que los osteoclastos provienen del linaje hematopoyético.
Los condrocitos tienen un papel primordial en la formación de la mayoría de los componentes esqueléticos. Además de su papel durante la osteogénesis, los condrocitos situados en la placa de crecimiento controlan el crecimiento longitudinal de los huesos. En el interior de las condensaciones mesenquimáticas, se van diferenciando gradualmente, desde condrocitos proliferativos, hasta llegar a su estadio de diferenciación final, los condrocitos hipertróficos. Esta población celular es rodeada gradualmente por matriz extracelular calcificada, que favorece la invasión de vasos sanguíneos provenientes del pericondrio. Es entonces cuando las células del pericondrio empiezan a diferenciarse a osteoblastos, y a formar la estructura mineralizada denominada collar óseo (Caplan, 1987 y St-Jacques y cols., 1999).
Después de la invasión vascular, los condrocitos hipertróficos mueren por apoptosis y los osteoblastos empiezan a depositar la matriz extracelular ósea, consistente principalmente en colágeno tipo I. Los condrocitos se ven restringidos a la placa de crecimiento, donde junto con los osteoblastos, dirigirán el crecimiento longitudinal del hueso.
En la placa de crecimiento, los miembros de la familia FGF y sus receptores, principalmente el receptor 3 (FGFR3), regulan la proliferación e inhiben el crecimiento del hueso (Karsenty y Wagner, 2002). FGFR3 se expresa en los condrocitos proliferativos. Mutaciones de ganancia de función del Fgfr3 causan hipocondroplasia, acondroplasia y displasia tanatofórica, la variante más severa de la acondroplasia (Horton, 1997 y Heuertz y cols., 2006). La hipocondroplasia (HCH, OMIM 146000) es la forma más leve de este tipo de enanismos, causada en un 65% de los casos por la mutación N540K, en el dominio tirosina kinasa 1 del receptor (Winterpacht y cols., 2000; Bellus y cols., 1995 y Prinos y cols., 1995). La acondroplasia (ACH, OMIM 100800), debida en el 98% de los casos a la mutación G680R, en el dominio transmembrana del receptor, es la condrodisplasia más común en humanos (Naski y cols., 1998; Yamanaka y cols., 2003 y Wang y cols., 1999). La displasia tanatofórica presenta un fenotipo letal y se han descrito dos variedades según diagnóstico radiológico: de tipo I (TD I, OMIM 187600; Chen y cols., 1999 y 2001 y Legeai-Mallet y cols., 1998), y de tipo II (TD II, OMIM 187601; Iwata y cols., 2000 y 2001 y Li y cols., 1999). En todos los casos, el fenotipo de acortamiento de los huesos largos es debido a una desorganización y acortamiento de las columnas de condrocitos proliferativos, provocados por problemas en proliferación, y a la consecuente reducción de la zona de condrocitos hipertróficos, tanto en modelos animales como en humanos. Por el contrario, la inactivación de Fgfr3 en ratón, causa un crecimiento endocondral prolongado, con el resultado de un fenotipo de "huesos largos", que va acompañado de una extensión de la zona de condrocitos proliferativos en la placa de crecimiento (Deng y cols., 1996 y Colvin y cols., 1996). Todos estos datos dan al FGFR3 un importante papel como regulador negativo de la proliferación de los condrocitos. Este papel inhibidor de la proliferación por parte de la vía FGF es único de los condrocitos (Wang y cols., 2001), y está mediado por el factor de transcripción STAT1, que aumenta la expresión del inhibidor del ciclo celular p21, responsable final de la parada de proliferación inducida por esta vía de señalización. Sus niveles pueden considerarse reflejo de la activación de la vía de señalización mediada por el FGFR3 en la placa de crecimiento.
Cuando se clonó Snail de ratón (Nieto y cols., 1992) se observó que en día 12 del desarrollo embrionario del ratón, el sitio predominante de expresión de Snail era el pre-cartílago, incluyendo los correspondientes al esclerotomo de la cola, las pre-vértebras, las costillas, las extremidades y la cabeza. Sin embargo, a partir del día 14 de desarrollo, ya no hay expresión en el pre-cartílago en ninguno de estos sitios, excepto en las falanges distales de las extremidades posteriores, que son los únicos sitios en que sigue habiendo pre-cartílago en las patas a este estadio.
Recientemente se ha descrito a Snail1 como un represor directo del colágeno tipo II (Seki y cols., 2003), característico de condrocitos proliferativos, y que desaparece cuando éstos dejan de proliferar y diferencian a condrocitos hipertróficos, población celular que expresa colágeno tipo X. En un contexto completamente independiente, se observó que la presencia de Snail atenuaba la proliferación de células epiteliales en cultivo y cursaba con un aumento en los niveles de p21 (Vega y cols., 2004).
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En resumen, las condrodisplasias humanas (que cursan con retardo e irregularidad en la formación del cartílago) y los modelos murinos generados para su estudio, se han asociado con mutaciones que generan mayor actividad del FGFR3, que provoca una parada de la proliferación de las poblaciones condrocíticas patológica, impidiendo el correcto desarrollo óseo del individuo.
Las aproximaciones terapeúticas para estas condrodisplasias en humanos son varias. Una quirúrgica, muy invasiva y de larga duración (Noonan y cols., 1999), el tratamiento con hormona de crecimiento (Hertel y cols., 2005; Seino y cols., 2000) que resulta poco efectivo en la acondroplasia, agrava la desproporción entre el tronco y las extremidades y es muy costoso y la utilización del péptido natiurético CNP, inhibidor de la activación de las MAPKs mediada por los FGFs en la placa de crecimiento (Yasoda y cols., 2004) pero no rescata los defectos de proliferación de los
condrocitos.
Otras estrategias persiguen disminuir la actividad tirosina kinasa del receptor con agentes químicos o bloquear con anticuerpos la unión del ligando al FGFR3 (Aveizer y cols., 2003).
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Descripción de la invención Descripción breve
Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia de la invención, basado en la identificación de la presencia de Snail1 en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en una muestra biológica de origen óseo, y
b) comparación de la presencia de Snail1 observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de la existencia de condrodisplasia.
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Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1 útiles para el tratamiento de la condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención, que comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
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Otro objeto de la invención lo constituye un sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención, preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un primate no humano, donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular de dicho animal mamífero no humano de la presente invención lo constituye el ratón transgénico desarrollado en la invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo 2).
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad de la proteína Snail1, en adelante uso de un compuesto inhibidor de la presente invención, en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario.
Por tanto, otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de Snail1 en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail1 humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1.
Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de la proteína Snail1, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de condrodisplasia.
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Descripción detallada
La presente invención se basa en que los inventores han observado que el gen Snail1 transduce la señalización mediada por el receptor 3 de los FGF (FGFR3) responsable de condrodisplasias. Para determinar si el gen Snail1 puede ser responsable de esta vía de señalización, se estudiaron sus patrones de expresión relativos durante el desarrollo embrionario en ratones, cuando ocurren los distintos procesos en los que están implicados durante la formación del hueso maduro en ratones sanos (Ejemplo 1). Los datos muestran que los patrones de expresión son coincidentes en estadios embrionarios ya que el pico de expresión de Snail1 aparece en la población celular que expresa FGFR3. Estos datos son compatibles con que FGFR3 induce la expresión del gen de la Snail1 in vivo.
Además, se estudiaron los efectos de la activación patológica de Snail1 en el desarrollo óseo en ratones transgénicos con expresión inducible del gen Snail1 (Ejemplo 2). De esta forma se ha relacionado directamente la presencia de Snail1 con la parada de proliferación de condrocitos en ratones transgénicos en los que se ha activado Snail1 de manera artificial (ratón transgénico de la presente invención, ratón transgSnail1-ER), y al mismo tiempo se ha demostrado que la simple activación aberrante de Snail1 es suficiente para reproducir un fenotipo de condrodisplasia. El desarrollo y caracterización de este modelo animal, ratón transgSnail1-ER, permite la disponibilidad de modelos animales -este proceso de transgénesis puede ser trasladado por cualquier experto al desarrollo de otros animales mamíferos incluido primates, no humanos- en los que se pueden testar y caracterizar compuestos terapéuticos para el tratamiento de procesos condrodisplásicos veterinarios o humanos, y que hasta la fecha no existían.
Así, se observó que Snail1 reprime la proliferación celular in vivo, lo cual induce defectos morfológicos en la placa de crecimiento de estos huesos (huesos más cortos). Estos cambios aquí descritos son reminiscentes de los observados tras la inducción experimental de condrodisplasia en ratones modificados genéticamente que expresaban versiones mutadas de FGFR3 que suponen su activación constitutiva (Chen y cols., 1999; Li y cols., 1999; Wang y cols.,
1999).
Igualmente, se ha relacionado a Snail1 con la vía de señalización del FGFR3 mediante experimentos in vitro en cultivos primarios de condrocitos hipertróficos obtenidos a partir de hueso embrionario de ratón más tardíos, demostrando que la señalización mediada por el FGFR3 activa la expresión de Snail1 (Ejemplo 3).
Por otro lado, en muestras de pacientes con condrodisplasia, se estudió la activación del gen Snail1 (Ejemplo 4). En este sentido, en un no-nato con displasia tanatofórica se confirmó la mutación en FGFR3 responsable de esta enfermedad (forma grave de condrodisplasia y de curso siempre letal). Se observó que esta mutación en FGFR3, que produce su actividad constitutiva, provoca una activación aberrante del gen Snail1.
Finalmente, los experimentos de RNA de interferencia ("small interference", siRNA) realizados en cultivos primarios procedentes de hueso fetal de ratón, demostraron que impedir la función de Snail1 es suficiente para impedir la señalización mediada por el FGFR3 en condrocitos, revertiendo la parada de ciclo celular (medida por la expresión de p21), incluso en presencia del FGFR3 constitutivamente activo (Ejemplo 3). Por tanto Snail1 es el mediador de la parada de proliferación que se produce en respuesta a la señalización de FGFR3. Estos polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los mismos en las células de un paciente humano.
Si la sola actividad de Snail en el cartílago embrionario es capaz de inducir parada de ciclo celular y acondroplasia, la presencia de Snail1 en etapas donde normalmente está reprimido podría considerarse un marcador del fenotipo acondroplásico del tipo de las asociadas al FGFR3 - acondrodroplasia (ACH), displasia tanatofórica (TD) e hipocondroplasia (HCH) - y, por tanto, utilizar su expresión aberrante como diagnóstico de cualquier fenotipo provocado por la ganancia de función del FGFR3. Por otro lado, si la activación de Snail1 es suficiente para inducir todas las características de las acondroplasias relacionadas con mutaciones que generan un aumento de actividad del FGFR3, es decir, que existe una relación directa -no sólo una asociación temporal- entre la actividad del gen Snail1 y la etiopatogenia de esta enfermedad, su inhibición, por ejemplo su inhibición génica, se convertiría en una forma de terapia anti-displásica y Snail1 podría ser de gran utilidad en la identificación de nuevos fármacos anti-condrodisplásicos. Estas aproximaciones terapéuticas se basan en el uso de compuestos o agentes inhibidores de la actividad de dicha proteína Snail1. De hecho, podrían aparecer casos de condrodisplasia de este tipo aun en ausencia de mutaciones en el FGFR3 y por la sola activación patológica de Snail1 durante el desarrollo del sistema cartílago-hueso.
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La presencia aberrante de Snail1 en el cartílago embrionario (en un momento en el cual, en condiciones normales, ya no ocurre) induce acondroplasia, de forma independiente de la señal que haya inducido esta presencia patológica de Snail1. La inhibición de Snail1 por siRNA impide la parada de la proliferación de condrocitos aún en presencia de actividad constitutiva de FGFR3. Por lo tanto, la inhibición de Snail1 en la placa de crecimiento impedirá los efectos de la ganancia de función del FGFR3 inducidos por cualquier mecanismo o las acondroplasias generadas por la presencia aberrante de Snail1 independientes el FGFR3.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia de la invención, basado en la identificación de la presencia de Snail1 en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en una muestra biológica de origen óseo, y
b) comparación de la presencia de Snail1 observada en a) con su ausencia en una muestra control, y donde su presencia es indicativa de la existencia de condrodisplasia.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "proceso de condrodisplasia" se refiere a una enfermedad con fenotipo condrodisplásico, preferentemente humana, en la que la acción biológica de Snail1 sea la causa de dicha enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 - como por ejemplo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica(TD) e hipocondroplasia (HCH) - o no. Esta identificación de Snail1 en una muestra biológica de origen veterinario o médico de animales o sujetos humanos puede ser extraída de los mismos y posteriormente ex vivo identificar sobre la misma la presencia o no Snail1, que se correlacionaría con el diagnóstico de un proceso condrodisplásico en dicho sujeto, lo que permitiría la definición y la ejecución de una aproximación terapéutica, veterinaria o médica.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "gen Snail1" o "proteína Snail1" se refiere tanto al gen o proteína, de distinto origen animal, preferentemente humano, Snail1 (por ejemplo, Snail1 de ratón: SEQ ID NO1 y NO2, o humano: SEQ ID NO3, NO4, respectivamente) como al gen o proteína Snail2 (por ejemplo, Snail1 de ratón: SEQ ID NO5 y NO6, o humano: SEQ ID NO7, NO8, respectivamente), así como a cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aás.) análoga a éstas, respectivamente. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de nucleótidos o aminoácidos mostradas en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos o aminoácidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, la adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos o aminoácidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a la secuencia de Snail1 de la invención, es decir, sea capaz de inducir condrodisplasia. Ambas proteínas Snail, Snail1 y Snail2, presentan una actividad biológica similar en los distintos modelos estudiados (cáncer, fibrosis peritoneal y fibrosis renal) por lo que los resultados obtenidos en la presente invención sobre Snail1 pueden ser trasladados a Snail2.
En general, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
Un objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de la invención en el que la identificación de Snail1 de a) se refiere a la forma humana de Snail1 (hSnail1 y/o h/Snail2, ya sea la identificación en forma de un transcrito génico (RNAm) o de la forma proteica del gen; SEQ ID NO 3 y 4 y SEQ ID NO 7 y 8). La realización de estos análisis de identificación de los niveles de expresión de Snail1 puede ser llevado a cabo por un experto medio del área de la biomedicina gracias a la información descrita en la presente invención y en el estado de la técnica por distintas técnicas (Sambrook y cols., 1989; Lambolez y Rossier, 2000; Egger y cols., 2000; Folz y Nepluev, 2000 y Pfaffl, 2001).
Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que la identificación de Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos de la proteína Snail1, preferentemente hSnail1 y/o hSnail2. (Franci y cols., 2006). Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que la identificación de Snail1 se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de Snail1 (ver Figura 1).
Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia en el que la identificación de Snail1 se lleva a cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de Snail1 (Ejemplo 3, Figura 4). Este procedimiento está basado en la extracción de RNA polyA+ de una muestra biológica de origen óseo y de un tejido control y la amplificación de la secuencia codificante de Snail1 con adecuados oligonucleótidos cebadores (Boutet y cols., 2006).
Por otro lado, este procedimiento de diagnóstico de condrodisplasia puede realizarse utilizándose a Snail1 como único marcador o de forma conjunta con otros marcadores de condrodisplasia, por ejemplo formando parte de un microarray de expresión biológica, ya sea en forma génica - a partir de RNAm- o en forma de proteína.
Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1 útiles para el tratamiento de la condrodisplasia, en adelante procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención, que comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de identificación de compuestos de la invención donde el sistema biológico del punto a) es un animal transgénico donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular del procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención es aquella donde el animal transgénico es el ratón transgénico de la presente invención (Ejemplo 2, ratón transgSnail1-ER).
Otro objeto de la invención lo constituye un sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación de compuestos de la presente invención, preferentemente un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un primate no humano, donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia. Una realización particular de dicho animal mamífero no humano de la presente invención lo constituye el ratón transgénico desarrollado en la invención, el ratón transgSnail1-ER (Ejemplo 2).
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad de la proteína Snail1, en adelante uso de un compuesto inhibidor de la presente invención, en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "compuesto/agente inhibidor o antagonista" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con la proteína Snail1 (por ejemplo, SEQ ID NO2, SEQ ID NO4, SEQ ID NO6 y SEQ ID NO8), o con fragmentos funcionales de la misma, disminuye o elimina la intensidad o la duración de la actividad biológica de dicha proteína. En esta definición se incluye además aquellos compuestos que impiden o disminuyen la expresión del gen codificante de la proteína Snail (por ejemplo, SEQ ID NO1, SEQ ID NO3, SEQ ID NO5 y SEQ ID NO7), es decir, que impiden o diminuyen la transcripción del gen, la maduración del RNAm, la traducción del RNAm y la modificación post-traduccional. Un agente inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimine el efecto y/o la función de la proteína Snail1.
A modo ilustrativo, dicho polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica una secuencia de nucleótidos antisentido específica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1, o bien un polinucleótido que codifica una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1, o bien un polinucleótido que codifica un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1, bien polinucleótido que codifica un RNA de interferencia ("small interference RNA" o siRNA o un shRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1 o bien un microRNA (miRNA).
Estos polinucleótidos mencionados pueden ser utilizados en un proceso de terapia génica en el que mediante cualquier técnica o procedimiento se permita la integración de los mismos en las células de un paciente humano. Este objetivo puede conseguirse mediante la administración a estas células óseas o de cartílago de una construcción génica que comprende uno de los polinucleótidos mencionados con el fin de transformar dichas células permitiendo su expresión en el interior de las mismas de manera que se inhiba la expresión de la proteína Snail. Ventajosamente, dicha construcción génica puede estar incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo la vehiculación de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales (Pfeifer y Verma, 2001) y su administración puede ser preparada por un experto en la materia en función de las necesidades y especificidades de cada caso.
Por tanto, otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inhibidor de Snail1 en el que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail1 humana y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1.
Con anterioridad se han descrito e incluso protegido mediante patente oligonucleótidos antisentido (Patente
US20060003956; Kajita y cols., 2004) y siRNAs que inhiben la expresión de Snail1 (Peinado y cols., 2005; Tripathi y cols., 2005). Cualquiera de estas secuencias de nucleótidos descritas en el estado del arte como inhibidoras de la expresión de Snail1 se incorporan como realizaciones de la presente invención como potenciales compuestos terapéuticos útiles para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de un proceso condrodisplásico. Por otro lado, estas técnicas de inhibición génica, y más concretamente la vehiculización de los compuestos -oligonucleótidos antisentido, iRNA, ribozimas o aptámeros- puede llevarse a cabo mediante el uso de liposomas, nanopartículas u otros vehiculizantes que incrementan el éxito de dicha transferencia al interior de la célula, preferentemente al núcleo celular (Lu y Woodle, 2005; Hawker y Wooley, 2005). En principio, pueden utilizarse inhibidores de la traducción del RNAm de Snail1 que se unen tanto a su región codificante como a la no codificante, por ejemplo frente a la zona 3' no codificante.
Así, una realización particular de la invención lo constituye el uso de un siRNA de d) en el que el RNAi se une preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de la misma (Patente US20060003956; el uso de los siRNA descritos en esta patente americana se incorporan como realizaciones particulares dentro del alcance de la presente patente).
Otra realización particular de la invención lo constituye el uso de un RNAi de d) en el que el siRNA está constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
-
I : 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
-
II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
-
III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
Las parejas I y II se unen a la región codificante del RNAm de Snail1, mientras que la pareja III se une a la zona 3' no codificante). Las tres parejas de secuencias de siRNA que se indican fueron activas, siendo la imagen presentada de inhibición de los niveles de Snail1 y p21 representativa de los resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs (Figura 4h y 4j) ya sea por separado o en combinación.
Las secuencias de nucleótidos a)-e) mencionadas previamente impiden la expresión del gen en mRNA o del mRNA en la proteína Snail1, y, por tanto, anulan su función biológica, y pueden ser desarrolladas por un experto en el sector de ingeniería genética en función del conocimiento existente en el estado del arte sobre transgénesis y anulación de la expresión génica (Clarke, 2002; Patente US20020128220; Miyake y cols., 2000; Puerta-Ferández y cols., 2003; Kikuchi y cols., 2003; Reynolds y cols., 2004).
Por otro lado, el origen de estos compuestos inhibidores de la actividad de las proteínas Snail puede ser variado, de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo, de origen vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos eucariotas) o sintético.
Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o un medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o agente inhibidor de la proteína Snail1, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Una realización particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica en la que el compuesto inhibidor es un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail1 humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el inhibidor de Snail1 es un siRNA que se une preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail1 gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de la misma (Patente US20060003956; el uso de los siRNA descritos en esta patente americana se incorporan como realizaciones particulares dentro del alcance de la presente patente).
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el inhibidor de Snail es un RNAi constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
-
I : 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
-
II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
-
III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail1, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
En una realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en Faulí i Trillo, 1993.
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por un proceso condrodisplásico, en adelante uso de la composición farmacéutica de la presente invención, consistente en la administración de dicha composición terapéutica que inhibe el proceso de condrodisplasia.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en el que el proceso de condrodisplasia causado por la acción biológica de Snail1, se acompaña de una activación anómala del FGFR3, perteneciente a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
Finalmente, otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en el que el proceso de condrodisplasia causado por la acción biológica de Snail1 no se acompaña de una activación anómala del FGFR3.
Descripción de las figuras
Figura 1.- Snail1 se expresa durante el desarrollo embrionario del hueso en las poblaciones implicadas en el crecimiento longitudinal del mismo. Imágenes de secciones de huesos embrionarios en las que se ha detectado la presencia del RNAm de Snail1 de ratón mediante la técnica de hibridación in situ. En los paneles superiores (a-d) se muestra la expresión endógena del gen durante el desarrollo, primero en las condensaciones mesenquimáticas y posteriormente reducido a las poblaciones de condrocitos hipertróficos. En los paneles inferiores (e-i) se compara su patrón de expresión con el de moléculas marcadoras de poblaciones celulares, observando que Snail1 se expresa en el estadio de 18,5 días post-coito (dpc) en las poblaciones hipertróficas, el pericondrio y en los osteoblastos. (j, k) detalle de la placa de crecimiento de embriones de 18,5 dpc mostrando la expresión de Snail1 y de FGFR3. En esta y en las siguientes figuras, wt, ratón salvaje; tg, ratón transgénico con activación inducible de Snail1; -TAM, sin tamoxifeno; +TAM, con tamoxifeno.
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Figura 2.- Los huesos largos de los embriones que expresan Snail1 transgénico son más cortos. (a-d) tinción cartílago-hueso en la que se observa una reducción en la zona de cartílago (azul) a costa de las poblaciones de la placa de crecimiento en los huesos de los animales con activación de Snail1 inducida por la administración de Tamoxifeno. (e-h) secciones histológicas en las que se muestra que el acortamiento anteriormente descrito es a costa de poblaciones de condrocitos proliferativos.
Figura 3.- La presencia de Snail1 en la placa de crecimiento inhibe la proliferación celular. (a-d) inmunohistoquímica frente a PH3 para marcar células proliferando, dónde se puede observar una drástica disminución del número de células proliferativas en los ratones con expresión inducida de Snail1. (e-h) en estos mismos ratones, la inmunohistoquímica frente a STAT1 revela un aumento en su activación (presencia nuclear de la proteína), que viene acompañado de un aumento en los niveles de RNAm de p21 (m). También se puede observar un detalle de la co-expresión endógena de STAT1 y Snail1 en condiciones normales en el hueso de ratón (i-1).
Figura 4.- Snail1 es suficiente y necesario para la señalización del FGFR3 en el hueso. La activación de FGFR3 en cultivos primarios de condrocitos (a-d) de ratón induce la activación de Snail1 valorada mediante sus niveles de RNAm (e), que va acompañada de la activación de p21 (g). Este efecto se ve impedido por el tratamiento de dichos cultivos con siRNA de Snail1 (h y j). Mock, cultivos primarios transfectados con el vector vacío; wt, cultivos primarios transfectados con el FGFR3 humano normal; K644E, cultivos primarios transfectados con el FGFR3 humano con la mutación K644E, responsable de la mayoría de las displasias tanatofóricas humanas.
Figura 5.- La mutación del FGFR3 responsable de la displasia tanatofórica en humanos activa la expresión de Snail1. Los niveles de RNAm de Snail1 están aumentados en cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave de la acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético (a). El feto tanatóforo presenta la mutación descrita como constitutivamente activa de dicho receptor (b). N, muestra obtenida de un feto sin problemas óseos; T, muestra obtenida de un feto con displasia tanatofórica.
Ejemplos de realización de la invención Ejemplo 1 Snail1 se expresa durante el desarrollo embrionario del hueso en las poblaciones implicadas en el crecimiento longitudinal del mismo
Se procedió a la detección de la presencia del RNAm de Snail1 en huesos embrionarios de ratón mediante la técnica de hibridación in situ. Los embriones de ratón procedieron de la cepa C57xCBA y sus edades, establecidas en días post-coitum (dpc) se determinaron considerando el día en el cual se ve el tapón vaginal como el día 0,5. Los huesos se disecaron a estadios comprendidos entre 12,5 dpc y 18,5 dpc respectivamente, se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS/DEPC toda la noche. A continuación se embebieron en gelatina y cortaron con un vibratomo para obtener secciones de 50 \mum. Las ISH en secciones de gelatina se realizaron como se describe en Blanco y cols., 2002 utilizando las sondas de RNA marcadas con DIG-II-UTP. Después de la hibridación, las secciones se procesaron como se ha descrito en Cano y cols., 2000.
Así, se demostró que la expresión endógena del gen Snail1 tiene lugar durante el desarrollo, primero en las condensaciones mesenquimáticas y posteriormente reducido a las poblaciones de condrocitos hipertróficos, el pericondrio y en los osteoblastos (Figura 1).
Ejemplo 2 Ratones transgénicos de Snail1-ER presentan alteraciones del crecimiento óseo
Se utilizó el plásmido pcDNA3-Snail1 correspondiente a la secuencia completa del cDNA de Snail1 de ratón insertada en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen; Cano y cols., 2000). pcDNA3-Snail-ER corresponde a la secuencia codificante de Snail1 unida a una versión mutada del dominio de unión al agonista del receptor de estrógeno humano que reconoce el ligando sintético 4-OH-Tamoxifeno (Locascio y cols., 2002).
El transgén Snail1-ER fue diseñado como fue descrito anteriormente (Locascio y cols., 2002) y se generó un ratón transgénico (ratón transgSnail1-ER) para esta construcción según los procedimientos estándares (Hogan y cols., 1994). Para este estudio, se seleccionó una línea de animales cuya expresión de la proteína transgénica fue ubicua en el embrión. En este modelo, aunque la proteína Snail1-ER esté expresada constitutivamente, su función como factor de trascripción se desarrolla únicamente cuando se trasloca la proteína en el núcleo después del tratamiento con el tamoxifeno (Danielian y cols., 1998 y Feil y cols., 1996 y 1997). El transgén se detecta a partir del DNA procedente de la cola de los animales por PCR. La localización subcelular de la proteína fue analizada por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-receptor de estrógeno humano. El mismo anticuerpo sirvió para valorar la cantidad de la proteína Snail1-ER en los distintos tejidos obtenidos de los ratones transgénicos por Western Blot. El tamoxifeno (Sigma) fue disuelto primero en etanol (10% del volumen final) y luego en aceite de maíz (Sigma) para tener una concentración final de 30 mg/ml. Se realizan dos inyecciones intraperitoneales consecutivas de tamoxifeno a días 12,5 y 14,5 dpc a hembras gestantes. La dosis utilizada fue de 75 \mug/g peso de la hembra (Hayashi y McMahon, 2002).
Posteriormente, y para llevar a cabo los experimentos de tinción de cartílago-hueso los embriones disecados y los ratones post-natales del ratón transgénico transgSnail1-ER se fijaron en formalina tamponada al 10% a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 días. Se evisceraron y se les quitó la piel. Se lavaron en agua entre 2 horas y 2 días, dependiendo del tamaño del ejemplar. Se tiñeron en una solución de azul alcian (Sigma A5268) durante 12-48 horas, para teñir los cartílagos. Después de lavar los especimenes en Etanol absoluto durante al menos dos días, se rehidrataron y se incubaron en tripsina (Sigma T4799) hasta la completa maceración del tejido. Se transfirieron a una solución de alizarina roja S (Sigma A5533) en KOH 0,5% hasta que los huesos aparecieron teñidos de rojo. Se lavaron los ejemplares en soluciones consecutivas de KOH 0,5%/glicerina 3:1, 1:1 y 1:3, y se conservaron en glicerina pura.
El estudio de los huesos de embriones de los ratones transgénicos transgSnail1-ER permitió observar que éstos eran más cortos que los no sobre-expresaban Snail1 (Figura 2), debido a una reducción en la zona de cartílago a costa de las poblaciones de condrocitos proliferativos. Además, la expresión de Snail1 se asoció a una inhibición de la proliferación de los condrocitos proliferativos y se acompañó de un aumento de la expresión de STAT1 y de p21 (Figura 3).
Para la realización de los ensayos de inmunohistoquímica se analizaron secciones de hueso. En detalle, las secciones fueron obtenidas por cortes en microtomo, se trataron durante 30 minutos en EDTA 1 mM a 100ºC, con el fin de desenmascarar el antígeno. Después de retirar los restos de parafina e hidratar, se permeabilizaron durante 30 minutos en 0,5% Tritón X-100 en PBS a temperatura ambiente y, posteriormente, se bloquearon durante 1 hora en 0,1% Tween, 10% FCS en PBS. Las preparaciones se incubaron con los anticuerpos primarios en 0,1% Tween-20, 1% FCS en PBS durante 16 horas a 4ºC y con los anticuerpos secundarios en 0,1% Tween-20, 1% FCS en PBS, 2 horas a temperatura ambiente. Las preparaciones se montaron con Mowiol y se conservaron protegidas de la luz a 4ºC hasta su visualización en un microscopio.
Los niveles de de RNAm de p21 se analizaron mediante RT-PCR. En este sentido y en el resto de análisis de RNAm de la presente invención la PCR cuantitativa se realizó con una máquina de PCR cuantitativa ABI PRISM® 7000 siguiendo el método Syber Greenº. Los niveles de expresión se calcularon según el método de la Ct, usando GAPDH como normalizador y los niveles del ratón salvaje sin ningún tratamiento ni transfección como calibrador. Para estos estudios se utilizaron las secuencias de cebadores (todas 5'-3'): mGapdh, CTGAGCAAGAGAGGCCCTATCC (SEQ ID NO9) y CTCCCTAGGCCCCTCCTGTT (SEQ ID NO10); mP21, AGGAGCCAGGCCAAGATGGT (SEQ ID NO11) y GCTTTGACACCCACGGTATTCA (SEQ ID NO12); mSnail1, CCACACTGGTGAGAAGCCATTC (SEQ ID NO13) y TCTTCACATCCGAGTGGGTTTG (SEQ ID NO14).
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Ejemplo 3 Snail1 es suficiente y necesario para la señalización del FGFR3 en condrocitos
Los cultivos primarios de condrocitos se obtuvieron a partir de hueso de las patas traseras de embriones de 14,5 dpc de animales C57 que se disecaron en medio de cultivo (a-MEM, 1% BSA, 0,1% L-Glutamina, 0,1% penicilina/estreptomicina. Al día siguiente se tripsinizaron y se trataron con colagenasa en DMEM y 10% de suero. Se cultivaron en medio (50% F-12, 50% DMEM, 10% FCS, 0,1% L-Glutamina, 0,1% penicilina/estreptomicina una densidad celular de 1,5.106 células/P100 (Woods and Beier, 2006). Después de cinco días en cultivo, se empezó la diferenciación con BMP-2 (Figura 4).
La activación de FGFR3 en cultivos primarios de condrocitos de ratón con FGF indujo la activación de Snail1 valorada mediante el incremento de sus niveles de RNAm (Figura 4e), que fue acompañada de la activación de p21 (Figura 4g). Como ejemplo de procedimiento de control de los niveles de Snail1 -y de modelo de tratamiento de un proceso condrodisplásico- se realizó un ensayo de regulación de la expresión de Snail1 mediante siRNA específicos, observándose que dichos siRNAs impidieron la expresión de Snail1 y p21 (Figura 4h y 4j). Se utilizaron tres siRNAs diferentes, dos frente a secuencias de la zona codificante y uno frente a zona 3' no codificante, a fin de asegurarnos de la especificidad de los resultados. Las secuencias de estos siRNAs son:
-
I (codificante): 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
-
II (codificante): 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
-
III (zona 3' no codificante): 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
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Las tres parejas de secuencias de siRNA que se han indicado fueron activas, siendo la imagen presentada de inhibición de los niveles de Snail1 y p21 representativa de los resultados obtenidos por cualquiera de las tres parejas de siRNAs (Figura 4h y 4j) ya sea por separado o en combinación.
Ejemplo 4 La mutación del FGFR3 responsable de la displasia tanatofórica en humanos activa la expresión de Snail1
Los niveles de RNAm de Snail1 están aumentados en cartílago procedente de un feto humano tanatóforo (forma grave de la acondroplasia relacionada con al activación constitutiva del FGFR3) con respecto a uno sin problemas de desarrollo esquelético (Figura 5a). El feto tanatóforo presenta la mutación descrita como constitutivamente activa de dicho receptor (Figura 5b).
Materiales y Métodos
Tinción histológica. Las secciones se sumergieron en Hematoxilina (Harris Hematoxylin solution modified, Sigma HHS-16), durante 1 minuto, lavaron en agua del grifo, y posteriormente se sumergieron en Eosina (Eosin Y Counteratain Solution, 0,5% Aqueous, Sigma HT110-2-32), durante 30 segundos. Tras lavar en agua se deshidrataron de nuevo, se pasaron por Histoclear y se montaron con Depex (BDH Laboratoires) para ser analizadas en el microscopio óptico.
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Referencias
- Avizier D, Golembo M and Yayon A (2003) FGFR3 as a therapeutic target for achondroplasia genetic short limbed dwarfism. Curr. Drug Targets 4(5):353-365.
- Bellus GA, Mcintosh I, Smith EA, Aylsworth AS, Kaitila I, Horton WA, Greenhaw GA, Hecht JT and Francomano CA (1995) A recurrent mutation in the tyrosine kinase domain of FGFR3 causes hypochondroplasia. Nat. Genet. 10: 357-359.
- Boutet A, De Frutos CA, Maxwell PH, Mayol MJ, Romero J and Nieto MA (2006) Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney. EMBO J. 25:5603-5613.
- Blanco MJ, Moreno-Bueno G, Sarrio D, Locascio A, Cano A, Palacios J and Nieto MA (2002) Correlation of Snail expression with histological grade and lymph node status in breast carcinomas. Oncogene, 21:3241-3246.
- Cano A, Perez-Moreno MA, Rodrigo I, Locascio A, Blanco MJ, del Barrio MG, Portillo and Nieto MA (2000) The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol., 2:76-83.
- Caplan, AI (1987) Bone development and repair. Bioessays, 6, 171-5.
- Chen L, Adar R, Yang X, Monsonego EO, Li C, Hauschka PV, Yayon A and Deng CX (1999) Gly369Cys mutation in mouse FGFR3 causes achondroplasia by affecting both chondrogenesis and osteogenesis. J. Clin. Invest. 104(11): 1517-1525.
- Chen L, Li C, Qiao W, Xu X, Deng C (2001) A Ser(365)- - >Cys mutation of fibroblast growth factor receptor 3 in mouse downregulates Ihh/PTHrP signals and causes severe achondroplasia. Hum Mol Genet 10, 457-65.
- Clarke, AR (2002) Transgenesis Techniques. Principles and Protocols, 2ª Ed. Humana Press, Cardiff University.
- Colvin JS, Bohne BA, Harding GW, McEwen DG, Ornitz DM. (1996) Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nat Genet., 12:390-397.
- Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH, Michael SK, McMahon AP (1998) Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8(24), 1323-6.
- Deng C, Wynshaw-Boris A, Zhou F, Kuo A, Leder P (1996) Fibroblast growth factor receptor 3 is a negative regulator of bone growth. Cell 84, 911-21.
- Eggert A, Brodeur GM, Ikegaki N (2000) Relative quantitative RT-PCR protocol for TrkB expression in neuroblastoma using GAPD as an internal control. Biotechniques; 28:681-682, 686, 688-691.
- Faulí i Trillo C (1993) "Tratado de Farmacia Galénica", Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
- Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, D DM, Chambon P (1996) Ligand-activated site-especific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10887-10890.
- Feil R, Wagner J, Metzger D, Chambon P (1997) Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem. Bioph. Res. Comm. 237, 752-757.
- Franci C, Takkunen M, Dave N, Alameda F, Gomez S, Rodriguez R et al (2006) Expression of Snail protein in tumor-stroma interface. Oncogene, 25:5134-5144.
- Folz RJ and Nepluev I (2000) Poly(A) cDNA-specific (PACS) RT-PCR: a quantitative method for the measurement of any poly(A)-containing mRNA not affected by contaminating genomic DNA. Biotechniques, 29, 762, 764-5, 766-8.
- Hawker CJ and Wooley KL (2005) Science 19 (309): 1200-5.
- Hayashi S and McMahon AP (2002) Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev Biol, 244, 305-18.
- Hertel NT et al (2005) Groth hormone treatment in 35 prepubertal children with achondroplasia: a five-year dose-response trial. Acta Paediatr. 94(10):1402-1410.
- Heuertz S, Le Merrer M, Zabel B, Wright M, Legeai-Mallet L, Cormier-Daire V, Gibbs L and Bonaventure J (2006) Novel FGFR3 mutations creating Cys residues in the extracellular domain of the receptor cause achondroplasia or severe forms of hypochondroplasia. Eur. J. Hum. Genet. 14(12):1240-1247.
- Hogan B, Beddington R, Constantini F, Lacy E (1994) "Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual". (Cold Spring Harbor Laboratory Press)
- Horton WA (1997) FGFR3 and the human chondrodisplasias. Curr. Opin. Pediatr. 9(4):437-442.
- Horton WA (2006) Recent milestones in achondroplasia research. Am. J. Medic. Res. 140A:166-169.
- Iwata T, Chen L, Li C, Ovchinnikov DA, Behringer RR, Francomano CA, Deng CX (2000) A neonatal lethal mutation in FGFR3 uncouples proliferation and differentiation of growth plate chondrocytes in embryos. Hum Mol Genet 9, 1603-13.
- Iwata T, Li C, Deng CX and Francomano CA (2001) Highly activated Fgfr3 with the K644M mutation causes prolonged survival in severe dwarf mice. Human. Mol. Genet. (10) 12:1255-1264.
- Kajita M, McClinic KN, Wade PA (2004) Aberrant expression of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Mol Cell Biol. 24(17): 7559-66.
- Karsenty, G. and Wagner, E. F. 2002. Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development. Dev. Cell, 2, 389-406.
- Kikuchi K, Umehara T, Fukuda K, Hwang J, Kuno A, Hasegawa T and Nishikawa S (2003) RNA aptamers targeted to domain II of Hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop region. J. Biochem. 133, 263-270.
- Lambolez B and Rossier J (2000) Quantitative RT-PCR. Nat Biotechnol, 18, 5.
- Legeai-Mallet L, Benoist-Lasselin C, Delezoide AL, Munnich A and Bonaventure J (1998) FGFR3 mutations promote apoptosis but do not alter chondrocyte proliferation in TD. JBC 273, 13007-13014.
- Li C, Chen L, Iwata T, Kitagawa M, Fu XY, Deng CX (1999) A Lys644Glu substitution in fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) causes dwarfism in mice by activation of STATs and ink4 cell cycle inhibitors. Hum Mol Genet 8, 35-44.
- Locascio A, Vega S, de Frutos CA, Manzanares M, Nieto MA (2002) Biological potential of a functional human SNAIL retrogene. J Biol Chem 277, 38803-9.
- Lu PV and Woodle MC. In vivo application of RNA interference: from functional genomics to therapeutics. (2005) Adv Genet 54: 117-42.
- Miyake H, Chi and Gleave ME (2000) Antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides chemosensitize human androgen-independent PC-3 prostate cancer cells both in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 6, 1655-63.
- Naski MC, Colvin JS, Coffin JD, Ornitz DM (1998) Repression of hedgehog signaling and BMP4 expression in growth plate cartilage by fibroblast growth factor receptor 3. Development, 125:4977-88.
- Noonan KJ, Leyes M, Forriol F, Canadell J. (1998) Distraction osteogenesis of the lower extremity with use of monolateral external fixation. A study of two hundred and sixty-one femora and tibiae. J Bone Joint Surg Am. 80:793-806.
\newpage
- Peinado H, Del Carmen Iglesias-de la Cruz M, Olmeda D, Csiszar K, Fong KS, Vega S, Nieto MA, Cano A, Portillo F (2005) A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progression. EMBO J. 24(19): 3446-58.
- Pfaffl MW (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucle Acids Res. 29, e45.
- Pfeifer A, Verma IM (2001) Gene therapy: promises and problems. Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 177-211.
- Puerta-Ferández E et al. (2003) Ribozymes: recent advances in the development of RNA tools. FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97.
- Prinos P, Costa T, Sommer A, Kilpatric MW and Tsipouras P (1995) A common FGFR3 gene mutation in hypochondroplasia. Hum. Mol. Genet. 4(11):2097-2101.
- Ramaswami U, Hindmarsh PC and Brook CG (1999) Growth hormone in hypochondroplasia. Acta Paediatr. Suppl. 88:116-117.
- Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS and Khvorova A (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology 22 (3): 326-330.
- Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y
- Seino Y, Yamanaka Y, Shinohara M, Ikegami S, Koike M, Miyazawa M, Inoue M, Morizake T and Tanaka H (2000) Growth hormone therapy in achondroplasia. Horm. Res. 53 Suppl 3:53-56.
- Seki, K., Fujimori, T., Savagner, P., Hata, A., Aikawa, T., Ogata, N., Nabeshima, Y. and Kaechoong, L. 2003. Mouse Snail family transcription repressors regulate chondrocyte, extracellular matrix, type II collagen, and aggrecan. J Biol Chem, 278, 41862-70.
- St-Jacques B, Hammerschmidt M, McMahon AP (1999) Indian hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of chondrocytes and is essential for bone formation. Genes Dev 13, 2072-86.
- Tripathi MK, Misra S, Chaudhuri G (2005) Negative regulation of the expressions of cytokeratins 8 and 19 by SLUG repressor protein in human breast cells. Biochem Biophys Res Commun. 329(2): 508-15.
- Vega S, Morales AV, Ocaña O, Valdés F, Fabregat I and Nieto MA. (2004) Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death. Genes Dev. 118:1131-1143.
- Wang Y, Spatz MK, Kannan K, Hayk H, Avivi A, Gorivodsky M, Pines M, Yayon A, Lonai P and Givol D (1999) A mouse model for acondroplasia produced by targeting FGFR3. PNAS 96(8):4455-4460.
- Winterpacht A, Hilbert K, Stelzer C, Schweikardt T, Decaer H, Segerer H, Spranger J and Zabel B (2000) Physiol. Genomics 2(1):9-12.
- Yamanaka Y, Ueda K, Seino Y and Tanaka H (2003) Molecular basis for the treatment of achondroplasia. Horm. Res. 60 Suppl 3: 60-64.
- Yasoda A, Komatsu Y, Chusho H, Miyazawa T, Ozasa A, Miura M, Kurihara T, Rogi T, Tanaka S, Suda M, Tamura N, Ogawa Y and Nakao K. (2004) Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia thorugh a MAPK-dependent pathway. Nat Med. 10 (1):80-86.
- Patente US20020128220, Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ
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<120> USO DE LOS COMPUESTOS INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE SNAIL1 EN LA ELABORACIÓN DE COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE CONDRODISPLASIAS, PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS INHIBIDORES, DICHAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE CONDRODISPLASIAS Y SUS APLICACIONES
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<130> SnailCondrod
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<220>
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<223> siRNA_I_Bcomplem
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 25
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<212> RNA
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<210> 18
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<211> 25
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> siRNA_II_Bcomplem
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<400> 18
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aucucuucac auccgagugg guuug 
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25 
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<210> 19
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<211> 25
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> siRNA_III_A
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<400> 19
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cagcugcuuc gagccauaga acuaa 
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25 
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<210> 20
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<211> 25
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> siRNA_III_Bcomplem
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<400> 20
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uuaguucuau ggcucgaagc agcug 
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25 
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<210> 21
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> RNAm_snail
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<400> 21
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gatgcacatc cgaagccac 
\hfill
19

Claims (27)

1. Procedimiento de identificación de un proceso de condrodisplasia caracterizado porque se basa en la identificación de la sobreexpresión de Snail1 en una muestra biológica y porque comprende las siguientes etapas:
a) identificación de la presencia de Snail1, en una muestra biológica de origen óseo de un mamífero, preferentemente un ser humano, y
b) comparación de la cantidad de Snail1 observada en a) con la cantidad en una muestra control, y donde su incremento es indicativo de la existencia de condrodisplasia.
2. Procedimiento de identificación según la reivindicación 1 caracterizado porque el proceso de condrodisplasia es una enfermedad con fenotipo condrodisplasico en la que la acción biológica de Snail1 sea la causa de dicha enfermedad, ya se acompañe de una activación anómala del FGFR3 o no.
3. Procedimiento de identificación según la reivindicación 2 caracterizado porque la enfermedad pertenece al siguiente grupo: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
4. Procedimiento de identificación según la reivindicación 1 caracterizado porque la identificación de Snail1 se refiere tanto al gen o proteína, de distinto origen animal, preferentemente humano, Snail1 y Snail2.
5. Procedimiento de identificación según la reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o proteína Snail1 de ratón de secuencia SEQ ID NO1 y NO2, respectivamente.
6. Procedimiento de identificación según la reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o proteína Snail1 humana de secuencia SEQ ID NO3 y NO4, respectivamente.
7. Procedimiento de identificación según la reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o proteína Snail2 de ratón de secuencia NO5 y NO 6, respectivamente.
8. Procedimiento de identificación según la reivindicación 4 caracterizado porque Snail1 es el gen o proteína Snai12 humana de secuencia SEQ ID NO7 y NO8, respectivamente.
9. Procedimiento de identificación según la reivindicación 4 caracterizado porque la identificación de Snail1 de a) se refiere a la forma humana de Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, ya sea la identificación en forma de un transcrito génico (RNAm) o de la forma proteica del gen, de secuencias SEQ ID NO 3 y 4 y SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente.
10. Procedimiento de identificación según la reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos específicos, ya sean monoclonales o policlonales, de la proteína hSnail1 y/o hSnail2.
11. Procedimiento de identificación según la reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de dichos genes.
12. Procedimiento de identificación según la reivindicación 9 caracterizado porque la identificación de Snail1, ya sea hSnail1 y/o hSnail2, se lleva a cabo mediante RT-PCR de un precursor génico de dichos genes.
13. Procedimiento de identificación y evaluación de la actividad de compuestos inhibidores de la proteína Snail1 útiles para el tratamiento de la condrodisplasia caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) Puesta en contacto de un sistema biológico donde exista una expresión de Snail1 que produzca condrodisplasia con el compuesto candidato objeto de este procedimiento, e incubación en las condiciones adecuadas,
b) determinación de un parámetro indicativo del proceso de condrodisplasia, e
c) identificación de un compuesto inhibidor de la actividad de la proteína Snail1 cuando se observa una disminución de dicho parámetro de condrodisplasia.
14. Procedimiento de identificación y evaluación según la reivindicación 13 caracterizado porque el sistema biológico de a) es un animal transgénico, preferentemente un mamífero, y, más preferentemente, un primate no humano, donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia.
15. Procedimiento de identificación y evaluación según la reivindicación 14 caracterizado porque el animal transgénico utilizado es el ratón transgénico transgSnail1-ER.
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16. Sistema biológico necesario para llevar a cabo el procedimiento de identificación y evaluación según las reivindicaciones 13 a la 15 caracterizado porque es un animal transgénico preferentemente un mamífero, y, más preferentemente, un primate no humano, donde la expresión de la proteína Snail1 es inducible, de forma constante o condicionada, y donde su expresión provoca condrodisplasia.
17. Sistema biológico según la reivindicación 16 caracterizado porque dicho animal mamífero no humano lo constituye el ratón transgénico transgSnail1-ER.
18. Uso de un compuesto o agente inhibidor de la actividad de la proteína Snail1 en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico, preferentemente humano o veterinario, caracterizado porque es un ácido nucleico o polinucleótido y que incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (siRNA o shRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1.
19. Uso de un compuesto según la reivindicación 18 caracterizado porque el siRNA de d) es un RNAi que se une preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de la misma.
20. Uso de un compuesto según la reivindicación 18 caracterizado porque el RNAi de d) es un siRNA constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
-
I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
-
II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
-
III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
21. Composición farmacéutica o medicamento útil para el tratamiento de un proceso condrodisplásico caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico o polinucleótido que impide o disminuye la expresión del gen codificante de la proteína Snail humana y que incluye, al menos, una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos antisentido especifica de la secuencia del gen o del mRNA de la proteína Snail1,
b) una ribozima específica del mRNA de la proteína Snail1,
c) un aptámero específico del mRNA de la proteína Snail1,
d) un RNA de interferencia (iRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1, y
e) un microRNA (miRNA) específico del mRNA de la proteína Snail1,
junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) se une preferentemente a la secuencia fragmento del RNAm de Snail gatgcacatccgaagccac (SEQ ID NO21) o a otra secuencia que comprenda a ésta o a un fragmento más corto de la misma.
23. Composición farmacéutica según la reivindicación 21 caracterizada porque el siRNA de d) es un RNAi constituido por una pareja de secuencias de nucleótidos, o una mezcla de las mismas, perteneciente al siguiente grupo:
-
I: 5'-CGG AAG AUC UUC AAC UGC AAA UAU U-3' (SEQ ID NO15), complementaria: 5'-AAU AUU UGC AGU UGA AGA UCU UCC G-3' (SEQ ID NO16),
-
II: 5'-CAA ACC CAC UCG GAU GUG AAG AGA U-3' (SEQ ID NO17), complementaria: 5'-AUC UCU UCA CAU CCG AGU GGG UUU G-3' (SEQ ID NO18), y
-
III: 5'-CAG CUG CUU CGA GCC AUA GAA CUA A-3' (SEQ ID NO19), complementaria 5'-UUA GUU CUA UGG CUC GAA GCA GCU G-3' (SEQ ID NO20).
24. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un proceso condrodisplásico en un mamífero.
25. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 24 en la que el mamífero es un humano.
26. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 en el que el proceso condrodisplásico causado por la acción biológica de Snail1 se acompaña de una activación anómala del FGFR3, y se selecciona de la lista que comprende: acondrodroplasia (ACH), tanatoforia displásica (TD) e hipocondroplasia (HCH).
27. Uso de la composición farmacéutica según la cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 caracterizado porque el proceso condrodisplásico causado por la acción biológica de Snail1 no se acompaña de una activación anómala del FGFR3.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586482A (zh) * 2012-02-27 2012-07-18 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 高致病性猪繁殖与呼吸征病毒nasba-elisa检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065602A1 (es) * 2003-01-17 2004-08-05 Universidad Autónoma de Madrid Procedimiento para identificar la transición epitelio-mesenquimal de células mesoteliales (temcm) e identificar compuestos moduladores de temcm, composiciones farmacéuticas y su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con temcm
US20060003956A1 (en) * 2004-03-03 2006-01-05 Casadome David O Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter
WO2007012970A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Oncostem Pharma, S.L. Graded expression of snail as marker of cancer development and dna damage-based diseases

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1163254B1 (en) 1999-02-26 2008-01-30 The University of British Columbia Trpm-2 antisense therapy
WO2005028678A2 (en) * 2003-06-06 2005-03-31 Wyeth Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
EP1759203A2 (en) * 2004-06-21 2007-03-07 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
WO2006006477A1 (ja) * 2004-07-09 2006-01-19 Shionogi & Co., Ltd. 骨疾患又は関節疾患に関与するポリペプチド及びそのｄｎａ
ES2310434B1 (es) * 2006-01-19 2009-11-12 Consejo Superior Investig. Cientificas Un pmto de identificacion de un proceso de fibrosis renal, pmto de identificacion de compuestos inhibidores, uso de los compuestos inhibidores de la expresion del gen del factor de transcripcion snail en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, dichas composiciones.....

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065602A1 (es) * 2003-01-17 2004-08-05 Universidad Autónoma de Madrid Procedimiento para identificar la transición epitelio-mesenquimal de células mesoteliales (temcm) e identificar compuestos moduladores de temcm, composiciones farmacéuticas y su uso en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con temcm
US20060003956A1 (en) * 2004-03-03 2006-01-05 Casadome David O Materials and methods for the derepression of the E-cadherin promoter
WO2007012970A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Oncostem Pharma, S.L. Graded expression of snail as marker of cancer development and dna damage-based diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUTET A et al. "Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney". The EMBO Journal. 2006. Vol. 25, Nº 23, páginas 5603-5613. Especialmente, página 5603, resumen, columna 2, párrafo 3; página 5611, columna 2, párrafo 2; página 5612, columna 2, párrafo 2. *
SEKI K. et al. "Mouse Snail Family Transcriptions Repressors Regulate Chondrocyte, Extracellular Matrix, Type II Collagen, and Aggrecan". The Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 274, Nº 43, páginas 41862-41870. Especialmente, página 41862, resumen, columna 2, párrafos 3-4; página 41864, columna 1, párrafo 2; columna 2, párrafo 2; página 41865, figura 2; página 41866, columna 1, párrafo 4; página 41867, figura 3; página 41867, figura 4. *

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