KR101692297B1 - 탈리도마이드 표적 인자를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유용한 작용을 보유하면서, 최기성(催奇性)을 제거한 화합물을 개발하는 수단을 제공하는 것을 목적으로 하여, 피험물질을 세레블론 혹은 그 단편과 접촉시켜, 피험물질의 세레블론 혹은 그 단편에 대한 결합성을 평가하고, 세레블론 혹은 그 단편과 결합하지 않는 피험물질, 및 세레블론 혹은 그 단편과의 결합성이 탈리도마이드보다도 낮은 피험물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

탈리도마이드 표적 인자를 이용한 스크리닝 방법{SCREENING METHOD UTILIZING THALIDOMIDE-TARGETING FACTOR}

본 발명은, 탈리도마이드(thalidomide) 표적 인자인 세레블론(cereblon : CRBN으로 약기하는 것이 있다) 또는 그 단편을 이용한 비최기성(非催奇性) 물질, 예를 들면, 의약, 의약품 첨가물, 식품, 식품 첨가물, 특히, 비최기성 탈리도마이드 유도체의 스크리닝 방법 및 탈리도마이드의 안타고니스트(antagonist)의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 탈리도마이드와의 결합성은 낮지만, 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase) 복합체의 구성 인자로서의 기능은 보유하는 변이형 CRBN, 그것을 코딩하는 핵산, 및 그 핵산을 도입하고, 발현시킨 비인간 동물에 관한 것이다.

1950년대 후반부터 60년대 초반에 걸쳐서, 탈리도마이드는 진정제로서 40개국을 초과하는 나라에 판매되었고, 또 그것은 종종 임신 중의 여성의 입덧 방지를 위해 처방되었다. 탈리도마이드에 최기성이 있다는 것이 현저화되어, 그 사용이 정지될 때까지 사산을 포함하면 몇 천∼1만명을 초과하는 기형(형태 형성 장해)이 생겼다고 추정되고 있다(인용문헌 1-3). 임신 중 3-8주째의 여성이 탈리도마이드를 복용하면, 태아에 탈리도마이드 태아병이라고 불리는 사지, 귀, 심장, 그리고 소화기관에 있어서의 형태 형성 장해를 일으킨다(인용문헌 1-3). 그 중에서도 사지·귀의 빈도는 현저하다. 포코멜리아(phocomelia)로 알려진 사지의 이상은, 팔이나 다리가 짧아지는 것으로 특징 지워지며, 또한 귀의 이상에 대해서는 무이증, 소이증이나, 난청으로 대표된다. 그 원인 해명에 있어서 상당한 노력이 이루어지고 있는데도 불구하고, 이 발생 이상에 대해서 알려져 있는 것은 조금이다. 지금까지의 연구에 의해 탈리도마이드가 산화 스트레스 유도나 혈관 신생 저해 효과를 가지고 있다는 것이 알려져 있으며, 그것은 최기성의 원인일 수 있는 것이다(인용문헌 4-5). 그러나, 몇 가지 중요한 의문이 남겨져 있다. 즉, 어떤 분자가 직접의 표적이며, 그리고 어떻게 해서 그 표적 인자는 최기성을 담당하는지이다.

한편, 인간의 경도 정신지연의 원인 후보 인자로서 CRBN이라는 단백질이 알려져 있다(비특허문헌 1, 인용문헌 11). 이 단백질은, 손상된 DNA 결합 단백질 1(Damaged DNA Binding protein 1(DDB1))이라는 단백질과 결합하는 것도 보고되어 있지만(비특허문헌 2, 인용문헌 12), 탈리도마이드와의 관련성에 대해서는 아무런 보고도 없다.

J. J. Higgins, J. Pucilowska, R. Q. Lombardi, J. P. Rooney, Neurology 63, 1927 (2004). S. Angers et al., Nature 443, 590 (2006).

최근 들어, 탈리도마이드는 다발성 골수종이나 통증을 수반하는 한센병의 일종인 나성결절성 홍반의 치료에 있어서 사용되는 경우가 많아지고 있다(인용문헌 2, 3, 6, 7). 그 상세한 메커니즘은 불명확하지만, 탈리도마이드는 그들 질환에 대하여 양호한 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다. 그러나, 최기성이 여전히 있기 때문에, 탈리도마이드 사용은 엄격한 통제의 아래에서 행해질 수 밖에 없다(인용문헌 8). 탈리도마이드의 최기성 제거는, 이 유용한 효과를 보다 광범히 응용시키는데에 있어 지극히 요망되고 있는 점이다.

본 발명은, 이상과 같은 기술적 배경 하에 이루어진 것이며, 탈리도마이드의 유용한 약리 작용을 보유하면서, 최기성 없는 탈리도마이드의 대체약을 개발하는 수단을 제공하는 것을 목적의 하나로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 검토를 거듭한 결과, 탈리도마이드가 CRBN에 결합하여, CRBN을 구성 인자로 하는 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성을 저해함으로써 최기성이 생기는 것을 알아냈다. 상술한 바와 같이, CRBN이 인간의 경도 정신지연의 원인 후보 인자인 것이나 CRBN이 DDB1과 결합하는 것은 이미 알려져 있었지만, 탈리도마이드와의 관련성에 대해서는 전혀 알려져 있지 않았다. 따라서, 본원출원시에 있어서, CRBN이 탈리도마이드의 최기성에 있어서의 표적 인자인 것을, 전혀 예측할 수 없었던 것이다.

이상의 지견에서, 탈리도마이드 유도체를 세레블론과 접촉시켜, 세레블론과의 결합성을 조사함으로써 그 탈리도마이드 유도체의 최기성을 예견할 수 있다.

이 새로운 지견을 더욱 발전시키면, 탈리도마이드 유도체에 한하지 않고, 모든 피험(被驗)물질에 있어서 CRBN과의 결합성을 조사하면 그 물질의 탈리도마이드같은 최기성의 유무를 예견할 수 있다.

또한, 본 발명자는, 인간 유래 CRBN의 N말단으로부터 339∼442번째의 아미노산 잔기가 탈리도마이드의 결합 영역인 것, 및 N말단으로부터 384번째의 티로신 및 386번째의 트립토판을 알라닌으로 치환한 인간 유래 CRBN은, 유비퀴틴 리가아제 복합체의 구성 인자로서의 기능을 보유하면서, 탈리도마이드와의 결합성이 저하하는 것도 알아냈다.

본 발명은, 이상의 지견에 근거해 완성된 것이다.

즉, 본 발명은, 이하의 [1]∼[11]을 제공하는 것이다.

[1] 피험물질을 세레블론 혹은 그 단편과 접촉시켜, 피험물질의 세레블론 혹은 그 단편에 대한 결합성을 평가하고, 세레블론 혹은 그 단편과 결합하지 않는 피험물질, 또는 세레블론 혹은 그 단편과의 결합성이 탈리도마이드보다도 낮은 피험물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법.

[2] 피험물질이 의약인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재한 비최기성 물질의 스크리닝 방법.

[3] 피험물질이, 일반식 (1)

로 표시되는 탈리도마이드 유도체인 것을 특징으로 하는 [1] 또는 [2]에 기재한 비최기성 물질의 스크리닝 방법;

단, 식 (1) 중, X가 R₅-R₇이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(A), X가 R₅이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(B) 및 X가 R₅이고, Y가 R₈일 경우를 화합물(C)라 하고,

또한, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 -H; -OH; =O; 직쇄 및 분지 알칸, 알켄, 알킨; 환식 알칸, 알켄 및 알킨; 환식 및 비환식 알칸, 알켄 및 알킨의 조합; 알코올, 알데히드, 케톤, 카르복시산, 에스테르, 또는 환식, 비환식과 조합시킨 에테르 부분(moiety), 혹은 환식/비환식 부분(moiety)의 조합; 아자; 아미노; -MOn 또는 -O-MOn[식 중, M=N 그리고 n=2; M=S 그리고 n=2 또는 3; 혹은 M=P 그리고 n=1-3이다]; 그리고 할로겐에서 선택할 수 있으며; R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 독립하여 식 (2)

또는 -O-(식 중, Z는 임의이고, 그리고 상기 R₁의 정의와 같다)에서 선택되며; 그리고 R₁₀은 상기 R₁의 정의와 같거나, 또는 (Z가 없을 경우에는) R₁₀은 =O이며;

R₉는 식 (3), (4), (5), (6) 또는 (7)

식 중, 각각의 R₁₁-R₁₇은 (독립하여) 상기 R₅의 정의와 같고,

식 중, R₁₈, R₁₉ 및 R₂₀은 독립하여

H, -CH₃, -COOH, -CONH₂, -(CH₂)n-COOH, -(CH₂)nCONH₂

에서 선택되며, n=1-4를 가지는 부분이다.

[4] 세레블론의 단편이, 서열번호 7에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 그 N말단으로부터 339∼442번째의 아미노산 서열을 가지고, 그 이외의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재한 비최기성 물질의 스크리닝 방법.

[5] 세레블론 또는 그 단편이, 담체(擔體)에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재한 비최기성 물질의 스크리닝 방법.

[6] 탈리도마이드 유도체가, 탈리도마이드 또는 기지의 탈리도마이드 유도체가 가지는 약리 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 [3]에 기재한 비최기성 물질의 스크리닝 방법.

[7] 피험물질을 세레블론 또는 그 단편과 접촉시켜, 피험물질과 세레블론 또는 그 단편의 결합성을 조사하고, 세레블론 또는 그 단편과 결합하는 피험물질을 선택하는 공정, 및 상기 공정에서 선택된 피험물질 중에서, i)최기성, 또는 ii)세레블론을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성 저해 작용을 경감하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법.

[8] 세레블론 또는 그 단편이, 담체에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 [7]에 기재한 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법.

[9] 이하의 (a) 및/또는 (b)의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 변이형 세레블론;

(a) 인간 유래 세레블론에 있어서의 N말단으로부터 384번째의 티로신 또는 이것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환된 것

(b) 인간 유래 세레블론에 있어서의 N말단으로부터 386번째의 트립토판 또는 이것에 상당하는 아미노산이 알라닌으로 치환된 것.

[10] [9]에 기재한 변이형 세레블론을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.

[11] [10]에 기재한 핵산을 유전자로서 도입하고, 발현시킨 것을 특징으로 하는 탈리도마이드 최기성 내성 비인간 동물.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 비최기성 물질은, 탈리도마이드의 최기성의 유무를 예견할 수 있고, 비최기성 탈리도마이드 유도체는, 탈리도마이드의 대체약으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 탈리도마이드의 안타고니스트는, 탈리도마이드에 의한 최기성 리스크를 경감하는 기능이 있다.

본 발명의 변이형 CRBN을 코딩하는 핵산을 유전자로서 도입하고, 발현시킨 동물은, 탈리도마이드의 최기성에 내성을 보이므로, 탈리도마이드 약리효과의 평가 등에 유용하다.

[도 1] CRBN 및 DDB1에 대한 탈리도마이드(Thal)의 결합성에 관한 도면. (A) 탈리도마이드 고정화 비드(+) 혹은 컨트롤 비드(-)를 사용하고, HeLa세포 추출액으로부터 탈리도마이드 결합 단백질을 정제했다. 탈리도마이드 고정화 비드에 결합한 단백질은 탈리도마이드의 첨가에 의해 용출된다. 용출된 단백질은 전기영동 후, 은염색을 행했다(위 도면). 별표(*)는 비특이적으로 결합한 단백질이다. 결합한 단백질은 탠덤 질량 분석(tandem mass spectrometry), 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해, CRBN과 DDB1으로 동정(同定)되었다. 0.3mM의 탈리도마이드를 비드와 혼합하기 전의 추출액에 가해 둠으로써, 용출되는 CRBN과 DDB1은 감소했다. (B) 정제한 재조합 단백질인 CRBN-FLAG 및 DDB1-V5-His에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합했다. 탈리도마이드 고정화 비드에 결합하는 단백질이 CRBN 혹은 DDB1인가를 웨스턴 블롯팅에 의해 해석한 결과, 비드에 결합한 단백질은 CRBN이였다. (C) CRBN-FLAG, DDB1-V5-His를 동시에 혹은 단독으로 Sf9세포에 발현시켜, FLAG 항체를 사용해 면역 정제하였다. 정제된 단백질을 전기영동 후, 쿠마시(Coomassie)로 염색한 바, DDB1이 검출되었다.
[도 2] CRBN, DDB1, 및 Cullin 4A(Cul4A)에 의한 E3 복합체 형성에 관한 도면. (A) FH-CRBN 및 DDB1-V5-His를 HeLa세포에 공발현(共發現)시켜, 면역 염색했다. DAPI는 4’,6-diamidino-2-phenylindole이다. CRBN, DDB1은 주로 핵에 공국재(共局在)하고 있고, 세포질에서도 검출되었다. (B) FH-CRBN을 안정적으로 발현하는 293T세포 또는 컨트롤 세포(mock) 추출액을 FLAG 항체에 의해 면역 침강하고, 웨스턴 블롯팅을 행한 바, CRBN 복합체로서 DDB1, Cul4A, Roc1이 공침(共沈)했다. (C) 도면의 양(量)의 FH-CRBN과 DDB2 발현 벡터를 293T세포에 공도입(共導入)했다. Input, 및 FLAG 항체로 CRBN과 공침한 분자를 웨스턴 블롯팅에 의해 해석했다(IB). DDB2를 강발현시킴으로써, CRBN과 공침하는 DDB1량은 저하했다. (D) FH-CRBN을 안정적으로 발현하는 293T세포에, Cul4A siRNA 혹은 컨트롤 siRNA를 도입하고, MG132를 가했다. RIPA 버퍼에서 세포를 용해하고, FLAG 항체로 면역 침강 후, Ubquitin(Ub) 항체로 웨스턴 블롯팅을 행했다. MG132 처리에 의한 CRBN의 자기 유비퀴틴화는 Cul4A siRNA에 의해 억제되었다. (E) FH-CRBN(WT, 야생형) 혹은 DDB1과의 결합능을 결여한 CRBN 변이체(ΔMid, CRBN의 187∼260번째의 아미노산을 결손시킨 변이체)를 안정적으로 발현하는 293T세포에 MG132를 가해 D와 같은 조작을 행하였다. ΔMid의 발현 세포에서는 MG132 처리에 의한 CRBN 변이체의 자기 유비퀴틴화는 억제되었다.
[도 3] 탈리도마이드에 의한 CRBN 기능의 저해에 관한 도면. (A) CRBN(야생형) 및 CRBN 변이체의 도면. 별표는 알라닌 치환을 표시한다. (B) GST-CRBN 야생형 혹은 변이체 단백질에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합하고, 결합한 CRBN 변이체류를 은염색으로 검출했다. 야생형 및 CRBN의 C말단 측 104 아미노 잔기를 발현하는 변이체가 결합했다. 융합 단백질의 전장(全長)의 것을 화살촉(arrowhead)으로 표시했다. (C) FH-CRBN 야생형 혹은 변이체류를 과잉발현하는 293T세포 추출액에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합하고, 결합한 CRBN 변이체류를 웨스턴 블롯팅으로 검출했다. 야생형에 비교해 CRBN Y384A, W386A 변이체는 탈리도마이드 고정화 비드에의 결합이 약하고, 2점 변이체(YW/AA)에서는 더욱 결합이 저하했다. (D) CRBN-V5-His(야생형) 및 변이체 FH-CRBN YW/AA를 HeLa세포에 공도입하고, 면역 염색했다. DAPI는 4’,6-diamidino-2-pheynylindole이다. 야생형 및 변이체 CRBN YW/AA의 세포내 국재에 차이는 없었다. (E) FH-CRBN YW/AA를 발현하는 293T세포 추출액을 FLAG 항체로 면역 침강 후, 웨스턴 블롯팅를 행한 바, DDB1, Cul4A, Roc1이 YW/AA 변이 CRBN과 공침했다. (F 및 G) FH-CRBN(야생형) 혹은 FH-CRBN YW/AA를 발현시킨 293T세포에 있어서 도 2E에 나타낸 공정을 행했다. (G)에 있어서는 회수의 4시간 전에 탈리도마이드를 처리했다. MG132에 의한 CRBN의 자기 유비퀴틴화는 탈리도마이드 전처치(前處置)에 의해 억제되었지만, YW/AA 변이 CRBN에서는 탈리도마이드에 의한 억제는 보이지 않았다.
[도 4] 탈리도마이드 처리 및 CRBN 복합체의 억제에 의한 제브라피쉬(zebrafish)에 있어서의 발생 이상(異常)에 관한 도면. (A 및 B) 제브라피쉬 배(胚)를 도면의 농도의 탈리도마이드에 약욕시킨 상태에서 발달시켰다. 탈리도마이드의 처치에 의해, 가슴 지느러미, 이포(耳胞)의 발달이 저해되었다. (C∼F) zcrbn AMO(zcrbn antisense morpholino oligonucleotide)를 단독 혹은 zcrbn mRNA와 함께 1 세포기의 배에 주입했다. zcrbn AMO에 의해, 가슴 지느러미, 이포의 발달은 저해되었지만, zcrbn mRNA를 공도입함으로써 완화할 수 있었다. (G∼I) zcul4a AMO를 단독 혹은 zcul4a mRNA와 함께 1 세포기의 배에 주입했다. zcul4a AMO에 의해 가슴 지느러미, 이포의 발달은 저해되었지만, zcul4a mRNA를 공도입함으로써 완화할 수 있었다. (A 및 C) 75hpf의 배를 고정해 알시안 블루로 염색했다. 위 도면은 배의 배측도(背側圖)이다. 아래 도면은 가슴 지느러미의 확대도다. 가슴 지느러미는 화살촉으로 표시했다. (B, E 및 H) 30hpf에 있어서의 이포의 확대도다. (D 및 G) 48hpf의 배에 대하여 fgf8a(fibroblast growth factor 8a) 및 shh(sonic hedgehog) 프로브로 인 사이투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 행했다. 지느러미싹(fin bud)의 확대도를 나타냈다. zCrbn, zCul4a의 발현 억제에 의해 fgf8a의 발현 저하가 보이고, 각각의 mRNA를 공도입함으로써 완화되었다. shh 발현에는 거의 영향이 없었다. (F 및 I) 30hpf에 있어서의 이포의 사이즈를 미처리 실험체에 대한 비로서 그래프에 나타냈다(*** p<0.001, uninj, 비주입·미처리).
[도 5] 변이형 CRBN의 발현에 의한 탈리도마이드 최기성 억제에 관한 도면. 1 세포기의 배에 zcrbn mRNA(야생형) 혹은 zcrbn YW/AA의 mRNA를 주입하고, 탈리도마이드에 약욕시켰다. (A) 27hpf에 있어서의 이포의 확대 사진. (B) 30hpf에 있어서 이포의 사이즈를 미처리 검체에 대한 비로 그래프에 나타낸 것. *p<0.05, **p<0.01. zcrbn YW/AA를 과잉발현한 배에서는, 탈리도마이드는 이포의 발달에 영향을 미치지 않았다. (C 및 D) 48hpf에 있어서의 배를 fgf8 혹은 shh 프로브로 인 사이투 하이브리다이제이션을 행했다. 도면에는 지느러미싹의 확대 사진을 나타내고 있다. uninj, 미처리. zcrbn YW/AA를 발현시킨 배에서는, 탈리도마이드에 의한 fgf8a 발현의 감소가 완화했다.
[도 6] 탈리도마이드의 FG 비드에의 고정화 방법의 모식도. (A 및 B) 탈리도마이드 및 그 유도체인 FR259625의 구조. (C) 탈리도마이드 고정화 반응의 흐름.
[도 7] 여러 가지 세포종으로부터의 탈리도마이드 결합 인자의 정제에 관한 도면. 도면에 나타낸 바와 같은 세포종의 추출액에 탈리도마이드 고정화 비드를 첨가해 반응시켰다. 탈리도마이드에 의해 용출된 획분(畵分)의 DDB1 및 CRBN을 웨스턴 블롯팅으로 검출했다. 경합 저해는 0.3mM의 탈리도마이드를, 비드와 결합시키기 전의 추출액에 가하고 있다. 여러 가지 세포종에 있어서, 탈리도마이드 결합 단백질로서 CRBN 및 DDB1을 검출할 수 있었다.
[도 8] DDB1의 CRBN에 대한 결합성에 관한 도면. FH-CRBN을 안정적으로 발현하는 293T세포주 혹은 컨트롤 세포(mock) 추출액을 FLAG 항체에 의해 면역 침강을 행하고, SDS-PAGE 및 은염색을 행했다. DDB1은 CRBN과 공침했다.
[도 9] In vitro에서의 CRBN의 유비퀴틴화에 관한 도면. FH-CRBN을 안정적으로 발현하는 293T세포주로부터 정제한 FH-CRBN 복합체는 GST-유비퀴틴, Ubal(E1에 상당), UbcH5b(E2에 상당), ATP 존재 하 혹은 비존재 하에서 자기 유비퀴틴화 반응을 행했다. 반응 용액은 도면에 나타낸 항체를 사용해 웨스턴 블롯팅을 행했다. Mock는 컨트롤 세포로부터 FLAG 정제된 획분이다. CRBN 복합체 존재 하에서 자기 유비퀴틴화가 보였다.
[도 10] DDB1의 넉다운(nockdown)과 CRBN 단백질 양과의 관계를 나타낸 도면. DDB1 siRNA 혹은 컨트롤의 siRNA를 도입한 293T세포로부터 얻은 추출액과 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합하고, Input 중의 DDB1 혹은 β-actin, 및 비드에 결합한 CRBN을 웨스턴 블롯팅으로 해석했다. DDB1의 발현 저하에 따라 탈리도마이드에 결합하는 CRBN도 감소했다.
[도 11] CRBN 결손 변이체와 유비퀴틴 복합체 형성을 나타낸 도면. (A) CRBN(야생형) 및 CRBN 결손 변이체의 도면. (B) 293T세포에 FH-CRBN(야생형) 및 그 결손 변이체를 발현시켜, FLAG 항체에 있어서 면역 침강했다. CRBN 및 그 변이체, 및 결합한 내인성 DDB1을 웨스턴 블롯팅에 의해 해석했다. 그 결과, CRBN의 187∼260번째의 아미노산 결손에 의해 DDB1과의 결합이 소실하는 것이 판명되었다. (C) CRBN 및 187∼260번째의 아미노산을 결손시킨 변이체 ΔMid를 293T세포에 발현시켰다. FLAG 항체로 면역 침강 후, CRBN 혹은 ΔMid에 결합한 DDB1 및 Cul4A를 웨스턴 블롯팅에 의해 해석했다. Δ Mid는 DDB1, Cul4a와의 복합체 형성능이 소실되어 있었다.
[도 12] CRBN의 진화적 보존성에 관한 도면. 5종으로부터 CRBN 오르토로그(orthologs)의 아미노산을 비교한 것. 테두리로 둘러싸인 아미노산은, 5 종류 전부에서 보존되어 있는 아미노산이다. 화살표는 결손실험에서 판명된 탈리도마이드 결합 영역이며, 별표는 탈리도마이드 결합에 극히 중요한 아미노산을 나타낸다(Y384과 W386). 도 3 참조.
[도 13] 제브라피쉬 배에 있어서의 zcrbn 및 zcul4a의 발현을 나타낸 도면. 48hpf 배에 있어서의 zcrbn 및 zcul4a의 발현을 호울 마운트(whole-mount) 인 사이투 하이브리다이제이션으로 검증했다. (A) zcrbn은 두부 혈관(head vasculature, hv), 가슴 지느러미(pectoral fins, pf), 그리고 뇌에 있어서 고(高)발현이다. 측면도이며, 왼쪽이 전부(前部)이다. (B) 48hpf에서의 이포에서의 zcrbn 발현. (OV, 화살촉에서)배측도이며, 전부(前部)가 두부이다. (C) 48hpf 배에서의 가슴 지느러미에 있어서의 zcrbn 발현의 확대도다. 발현은 전위의 간충직(proximal mesenchyme, pm)에 고(高)레벨이며, 유주 간충직(migratory mesenchyme, mm)에 있어서 약하다. (D) zcul4a의 발현에 대해서. 48hpf 배에서 zcul4a는 전뇌, 중뇌 그리고 후뇌(hindbrain, hb), 가슴 지느러미(pf)에 있어서 높게 발현하고 있다. (E) 대조로서 48hpf 배에서의 fgf8의 발현이다. 중뇌·후뇌 경계부(mid-hindbrain boundary, MHB) 및 후뇌(hb)에 있어서 발현하고 있다. 스케일 바는 0.2mm이다.
[도 14] zCrbn의 생화학적 해석 결과에 관한 도면. (A) FH-zCrbn을 발현시킨 293T세포 추출액에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합해 반응시켰다. 결합 단백질을 탈리도마이드로 용출하고, 웨스턴 블롯팅에 의해 해석했다. zCrbn은 탈리도마이드에 결합했다. (B) FH-zCrbn을 발현시킨 293T세포 추출액을 FLAG 항체로 면역 침강을 행하고, DDB1의 결합을 웨스턴 블롯팅에 의해 검증했다. 인간의 내재성 DDB1이 결합하는 것을 알 수 있었다. (C) FLAG-zCrbn(야생형) 혹은 FLAG-zCrbn YW/AA를 발현시킨 293T세포 추출액에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합했다. input 및 탈리도마이드에 의한 용출획분에 대해서 다양한 양으로 웨스턴 블롯팅을 행했다. zCrbn YW/AA에 대한 탈리도마이드의 결합은 분명히 약했다.
[도 15] 탈리도마이드 최기성의 분자 메커니즘을 모식적으로 나타낸 도면. 정상시에는 CRBN은 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체의 서브유닛으로서 기능하고, 미지의 기질을 유비퀴틴화함으로써 사지나 이포의 형성과 같은 다양한 발생 프로세스를 제어한다(위 도면). 탈리도마이드가 CRBN과 결합하면, E3로서의 기능이 저해된다 (아래 도면). 기질의 이상한 축적이 짧은 사지나 작은 이포의 형성 등, 다양한 발생 이상을 초래한다. 부분적으로는 fgf8의 발현의 저하가 관여한다.
[도 16] 프탈이미드와 CRBN 및 DDB1과의 결합에 관한 도면. 293T세포 추출액을 탈리도마이드 고정화 비드와 혼합했다. 비드에 결합한 인자를 탈리도마이드 혹은, 등량의 프탈이미드로 용출하고, 용출획분 중의 CRBN 및 DDB1을 웨스턴 블롯팅으로 해석했다.
[도 17] CRBN과의 결합성을 조사한 탈리도마이드 유도체의 구조식을 나타낸 도면.
[도 18] 탈리도마이드 유도체와 CRBN과의 결합에 관한 도면. 도면 중의 비이클(Vehicle)은 DMSO를 나타낸다. HEK293T세포 추출액에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼화하고, 세정 후, 탈리도마이드 유도체에 의해 결합 단백질을 용출했다. 용출획분 중의 CRBN은 웨스턴 블롯팅을 행했다. 도면 중의 비이클은 DMSO를 나타낸다. SDS-Boil은 세정 후의 비드를 2% SDS를 포함하는 버퍼 중에서 98.5℃로 가열하여, 탈리도마이드 고정화 비드에 결합한 CRBN을 해리시킨 획분이다. CRBN은 탈리도마이드, 글루타르이미드(glutarimide)에 의해 용출했지만, 프탈이미드, 5-Hydroxy-(2,6-diisopropylphenyl)-1H-isoindole-1,3-dione(5HPP-33)의 첨가에서는 용출하지 않았다.
[도 19] 탈리도마이드 또는 5HPP-33 처리 후의 다발성 골수종세포 Kms12의 세포 수를 나타낸 도면. KMS-12세포에 최종농도가 100μM이 되도록 탈리도마이드 혹은 5HPP-33을 첨가했다. 37℃, 5% CO₂로 설정한 인큐베이터 내에서 48시간 배양했다. 세포 수의 측정을 위해, 생(生)세포 수 측정시약 SF(나칼라이 테스크사)를 첨가하고, 2시간 더 배양 후, 파장 450nm에서 흡광도를 측정했다. 5HPP-33은 KMS-12에 대하여 강한 증식 억제를 보였다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(1) 비최기성 물질의 스크리닝 방법

본 발명의 비최기성 물질의 스크리닝 방법은, 피험물질을 CRBN 혹은 그 단편과 접촉시켜, 피험물질의 CRBN 혹은 그 단편에 대한 결합성을 평가하고, CRBN 혹은 그 단편과 결합하지 않는 피험물질, 또는 CRBN 혹은 그 단편과의 결합성이 탈리도마이드보다도 낮은 피험물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 것이다.

CRBN 등과의 결합성이 탈리도마이드보다도 낮은 피험물질의 선택은, 예를 들면, 피험물질 대신에 탈리도마이드를 사용한 대조 실험을 행하여, 피험물질의 결합성과 탈리도마이드의 결합성을 비교함으로써 행할 수 있다.

CRBN은, 탈리도마이드의 최기성의 표적 인자라고 생각된다. 따라서, 이것과 결합하지 않는 물질이나 탈리도마이드보다도 결합성이 낮은 물질은, 탈리도마이드가 가지는 최기성을 가지지 않거나, 또는 최기성이 경감되어 있다고 생각된다.

피험물질은 특히 한정되지 않지만, 인간 또는 다른 동물에 투여, 섭식시키는 물질이 바람직하고, 예를 들면, 의약, 의약품 첨가물, 식품, 식품 첨가물, 또는 이것들에 포함되는 화학 물질 등을 들 수 있다.

의약 중에서는, 탈리도마이드 유도체가 중요하다.

탈리도마이드 유도체로서는, 예를 들면 다음 일반식 (1)에 나타내는 화합물을 들 수 있다.

단, 식 (1) 중, X가 R₅-R₇이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(A), X가 R₅이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(B) 및 X가 R₅이고, Y가 R₈일 경우를 화합물(C)라 하고,

또한, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 -H; -OH; =O; 직쇄 및 분지 알칸, 알켄, 알킨; 환식 알칸, 알켄 및 알킨; 환식 및 비환식 알칸, 알켄 및 알킨의 조합; 알코올, 알데히드, 케톤, 카르복시산, 에스테르, 또는 환식, 비환식으로 조합시킨 에테르 부분(moiety), 혹은 환식/비환식 부분(moiety)의 조합; 아자; 아미노; -MOn 또는 -O-MOn[식 중, M=N 그리고 n=2; M=S 그리고 n=2 또는 3; 혹은 M=P 그리고 n=1-3이다]; 그리고 할로겐에서 선택할 수 있으며; R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 독립하여 식 (2)

또는 -O-(식 중, Z는 임의이고, 그리고 상기 R₁의 정의와 같다)에서 선택되며; 그리고 R₁₀은 상기 R₁의 정의와 같거나, 또는 (Z가 없을 경우에는) R₁₀은 =O이며; R₉은 식 (3), (4), (5), (6) 또는 (7)

식 중, 각각의 R₁₁-R₁₇은 (독립하여) 상기 R₅의 정의와 같고,

식 중, R₁₈, R₁₉ 및 R₂₀은 독립하여

H, -CH₃, -COOH, -CONH₂, -(CH2)n-COOH, -(CH₂)nCONH₂

에서 선택되며, n=1-4를 가지는 부분이다.

탈리도마이드 유도체 중에서, 5-Hydroxy-(2,6-diisopropylphenyl)-1H-isoindole-1,3-dione(5HPP-33)은 인간 골수종세포의 증식 억제 등의 약리 작용을 가지고 있지만 세레블론과의 결합성은 상당히 낮은 것이 확인될 수 있었다.

탈리도마이드 유도체는, 탈리도마이드나 기지의 탈리도마이드 유도체가 가지는 약리 작용을 가지는 것이 바람직하다.

탈리도마이드의 약리 작용으로서는, (i) bFGF에 의해 유도되는 혈관 신생의 억제, (ii) LPS 자극한 인간 단구(單球)로부터의 TNF-α생산의 억제, 인간 골수종세포 등의 종양세포와 인간 골수 스트로마 세포와의 공배양에 의해 항진(亢進)하는 IL-6 생산의 억제, (iii) 다발성 골수종 환자의 말초 혈 중의 내츄럴 킬러 세포 수의 증가, T세포 수용체 자극 후의 IL-2 및 INF-γ 생산의 항진, 및 IL-2 의존적 T세포 증식의 촉진, (iv) 인간 골수종세포 등의 종양세포에 대하여 아포토시스 유도와 세포증식의 억제 등이 확인되어 있다.

그리고, 탈리도마이드의 질병에 대한 예방, 치료 효과로서는, 진정 작용, 한센병 치료 작용(구체적으로는, 나성결절성 홍반의 치료 작용), 이식병 치료 작용, 다발성 골수종 치료 작용, 고형암 치료 작용, 전신성 에리테마토데스(erythematodes) 치료 작용, 다발성 경화증 치료 작용, 베체트(Behcet)병 치료 작용, 염증성 장질환(클론병이나 궤양성 대장염) 치료 작용 등을 예시할 수 있다. 기지의 탈리도마이드 유도체의 약리 작용으로서는, 레날리도마이드(Lenalidomide)의 다발성 골수종 치료 작용, 골수종 이형성 증후군(MDS) 치료 작용, 포말리도마이드(Pomalidomide)의 다발성 골수종 치료 작용, 골수 섬유증의 치료 작용 등을 예시할 수 있다.

CRBN은 기지의 단백질이며, 그것을 코딩하는 유전자(CRBN 유전자)의 염기서열도 데이터베이스 상에 공개되어 있다. 예를 들면, 인간 유래 CRBN 유전자의 염기서열, 마우스 유래 CRBN 유전자의 염기서열, 래트(rat) 유래 CRBN 유전자의 염기서열, 및 제브라피쉬 유래 CRBN 유전자의 염기서열은, 각각 Gene ID:51185, Gene ID:58799, Gene ID:297498, 및 Gene ID:445491로 Entre Gene에 등록되어 있다. 사용하는 CRBN이나 CRBN 유전자는 천연의 것이어도 되지만, 천연의 CRBN의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수 개의 아미노산 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 활성을 갖는 유비퀴틴 리가아제 복합체를 형성할 수 있는 변이형 CRBN이나 그것을 코딩하는 유전자를 사용해도 된다.

본 발명자는, 인간 유래 CRBN에 있어서의 탈리도마이드 결합 영역을 특정하고 있다. 따라서, CRBN 대신에 탈리도마이드 결합 영역을 포함하는 CRBN의 단편을 사용해도, 결합성의 평가는 가능하다. 탈리도마이드 결합 영역으로서는, 인간 유래 CRBN의 C말단 측의 104 아미노산 영역을 예시할 수 있다. 인간 이외의 생물 유래 CRBN에 있어서는, 이 C말단 측의 104 아미노산 영역에 상당하는 영역(즉, 아미노산의 동일성에 기하여 정렬시켰을 때에, 인간 유래 CRBN의 C말단 측의 104 아미노산 영역과 일치하는 영역)을 탈리도마이드 결합 영역으로 할 수 있다.

CRBN의 단편으로서는, 서열번호 7에 나타내는 인간 유래 CRBN의 아미노산 서열에 있어서, 그 N말단으로부터 339∼442번의 아미노산 서열을 가지고, 그 이외의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 것, 및 당해 인간 유래 CRBN의 단편에 상당하는 각종 생물 유래 CRBN의 단편 등을 들 수 있다. 또한, CRBN이나 그 단편은, 다른 단백질을 부가하여 융합 단백질로 해도 된다.

본 발명에 있어서 사용하는 CRBN 또는 그 단편은, 상기의 각종 생물 유래 CRBN이나 변이형 CRBN 또는 그것들의 단편 중 어느 것이어도 되지만, 본 발명은, 인간에 대하여 최기성을 가지지 않는 탈리도마이드 유도체를 얻는 것을 목적으로 하고 있으므로, 인간 유래 CRBN 또는 그 단편을 사용하는 것이 바람직하다.

CRBN이나 그 단편은, 담체에 고정해 두는 것이 바람직하다. 담체로서는, CRBN이나 그 단편을 고정할 수 있는 것이면 특히 한정되지 않지만, 입자상의 것이 바람직하고, 또한, 자성(磁性)을 가지는 것이 바람직하다. 바람직한 담체의 예로는, 유기 폴리머 피막을 가지는 자성 나노 비드를 들 수 있다. 유기 폴리머 피막을 가지는 자성 나노 비드의 입경은 특히 한정되지 않지만, 1-500nm가 바람직하고, 20-300nm가 보다 바람직하다. 유기 폴리머로서는, GMA, GMA와 스티렌의 공중합체, (폴리)메타크릴산, (폴리)아크릴산 등을 들 수 있다. 유기 폴리머 피막을 가지는 자성 나노 비드의 구체적인 예로서는, SG 비드(가와구치 외, Nucleic Acids Research 1989, 17:6229-6240), FG 비드(니시오 외, Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2008, 64:162-169), Dynabeads, Adembeads, nanomag 등을 들 수 있다.

CRBN에 대한 탈리도마이드 유도체의 결합성 평가는, 통상의 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, BIAcore에 의한 표면 플라스몬 공명, 등온 적정 칼로리메트리(ITC) 등에 의해 결합성을 평가할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 피험물질과 CRBN 또는 그 단편과의 결합성을 평가할 수 있으면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 이하의 방법과 같이 실시할 수 있다.

(A) FG 비드를 사용한 스크리닝 방법

우선 탈리도마이드를 고정화한 FG 비드를 작제(作製)한다. 그 고정화 비드를 CRBN이 발현한 세포 추출액, 혹은 재조합 단백질과 혼합하고, 1시간 이상, 회전기에서 5rpm, 4℃로 혼화(混和) 상태를 계속한다. 그리고 버퍼로 세정을 행한 후, 예를 들면, 피험물질로서 탈리도마이드 유도체를 혼합한 버퍼를 비드에 통과시킴으로써, CRBN의 용출이 생기는지 어떤지를 확인한다. 검출 방법으로서는, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, CBB염색, 은염색등을 들 수 있다. 그 때에는, 탈리도마이드나, 비결합이 확인된 프탈이미드가 대조 실험의 샘플로서 사용된다. 또한, 다마가와세이키가부시키가이샤의 FG 비드 스크리닝 장치, Target Angler 시리즈 등을 사용함으로써 대량의 샘플의 해석이 가능하다.

(B) BIAcore를 사용한 스크리닝

우선 아미노기 혹은 카르복시기 등의 관능기를 붙인 CRBN을 BIAcore 기반 칩에 고정시킨다. 그리고 그 고정화 칩을 장착시킨 BIAcore3000 등 BIAcore 계측 장치(GE Healthcare)에 있어서, 여러 가지 유도체를 유입시키고, 그 해리 정수를 계측한다. 탈리도마이드나 프탈이미드가 대조 실험으로서 사용된다.

(C) 등온 적정 칼로리메트리를 사용한 스크리닝

탈리도마이드 유도체를 포함하는 용액을 시료셀 중의 CRBN을 포함하는 용액에 몇 십회(예를 들면 18회)에 걸쳐 적하한다. 각 농도의 발생 열량을 셀 중에 있어서의 유도체와 CRBN의 몰비에 대하여 플로팅함으로써 상호 작용의 결합 등온선이 얻어진다. 이 결합 등온선으로부터 해리 정수를 산출한다. 탈리도마이드나 프탈이미드가 대조 실험으로서 사용된다.

(2) 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법

본 발명의 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법은, 피험물질을 CRBN 또는 그 단편을 혼합 등으로 접촉시켜, 피험물질이 CRBN 또는 그 단편과 결합하는지 아닌지를 평가하고, CRBN 또는 그 단편과 결합하는 피험물질을 선택하는 공정, 및 상기 공정에서 선택된 피험물질 중에서, i)최기성, 또는 ii)CRBN을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성 저해 작용을 경감하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

상기 방법으로 얻어지는 탈리도마이드 등의 최기성 물질의 안타고니스트는, 최기성 물질의 CRBN에의 결합을 저해한다. 따라서, 탈리도마이드나 그 유도체 등의 최기성 물질을 복용할 때에, 이 안타고니스트를 병용함으로써, 최기성의 리스크를 경감할 수 있다.

전반(前半)의 공정, 즉, 피험물질을 CRBN 또는 그 단편과 접촉시켜, 피험물질이 CRBN 또는 그 단편과 결합하는지 아닌지를 평가하고, CRBN 또는 그 단편과 결합하는 피험물질을 선택하는 공정은, (1)의 스크리닝 방법과 같이 행할 수 있다.

전반(前半)의 공정에서 선택된 물질이, 어고니스트(agonist)가 아니라, 안타고니스트이면, 그 물질은, 탈리도마이드 등의 최기성 물질이 가지는 작용을 경감하는 기능을 가질 것이다. 따라서, 최기성 또는 CRBN을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성 저해 작용을 경감하는지 아닌지를 평가함으로써, 최기성 물질의 안타고니스트를 선택할 수 있다.

탈리도마이드가 가지는 작용으로서는, 종래부터 알려져 있는 최기성 외에, 본 발명자에 의해 명백하게 된 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성 저해 작용을 들 수 있다.

탈리도마이드가 가지는 작용을 경감하는지 아닌지는, 피험물질의 존재 하와 비존재 하에서의 탈리도마이드의 작용을 비교함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 이하와 같이 실시할 수 있다.

우선 CRBN과의 결합의 유무를 확인한다. 결합의 유무를 확인하는 방법은, (1)의 스크리닝 방법과 같다. 여기서 유의(有意)하게 결합하는 것이 나타난 안타고니스트 후보에 대해서 이하의 방법으로 스크리닝한다.

(A) In vitro계에서 유비퀴틴화에 대한 영향

FH-CRBN을 발현하는 293T세포에 있어서, 안타고니스트 후보 및 탈리도마이드를 가한다. 그리고 그 세포 추출액에 있어서의 유비퀴틴화 단백질 양을 웨스턴 블롯팅으로 결정한다. 그 때에, 안타고니스트를 가함으로써, 탈리도마이드 단독의 경우보다 유비퀴틴화 단백질 양의 감소가 억제되면, 그것은 안타고니스트이다.

(B) 제브라피쉬를 사용한 스크리닝

제브라피쉬 배로부터 난각(卵殼)을 제거한 것에 대해, 탈리도마이드와 안타고니스트 후보를 약욕시킨다. 이포 및 지느러미 형성에 대하여, 탈리도마이드 단독과 비교하여 이상이 완화되어 있으면, 안타고니스트라고 할 수 있다.

(3) 변이형 CRBN

본 발명의 변이형 CRBN은, 이하 (a) 및/또는 (b)의 아미노산 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 것이다.

(a) 인간 유래 CRBN에 있어서의 N말단으로부터 384번째의 티로신 또는 이것에 상당하는 아미노산을 알라닌으로 치환한다.

(b) 인간 유래 CRBN에 있어서의 N말단으로부터 386번째의 트립토판 또는 이것에 상당하는 아미노산을 알라닌으로 치환한다.

본 발명에 있어서 「인간 유래 CRBN에 있어서의 N말단으로부터 384번째의 티로신에 상당하는 아미노산」이란, 도 12에 나타내는 바와 같이, 아미노산의 동일성에 기하여 정렬시켰을 때에, 인간 유래 CRBN의 N말단으로부터 384번째의 티로신과 일치하는 아미노산을 의미한다. 도 12에 나타내는 바와 같이, 마우스 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 361번째의 티로신, 제브라피쉬 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 374번째의 티로신, 노랑초파리 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 517번째의 티로신, 애기장대 유래 CRBN에서는 504번째의 티로신이, 이것에 해당한다. 마찬가지로, 본 발명에 있어서 「인간 유래 CRBN에 있어서의 N말단으로부터 386번째의 트립토판에 상당하는 아미노산」이란, 아미노산의 동일성에 기하여 정렬시켰을 때에, 인간 유래 CRBN의 N말단으로부터 386번째의 트립토판과 일치하는 아미노산을 의미한다. 도 12에 나타내는 바와 같이, 마우스 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 363번째의 트립토판, 제브라피쉬 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 376번째의 트립토판, 노랑초파리 유래 CRBN에서는 N말단으로부터 519번째의 트립토판, 애기장대 유래 CRBN에서는 506번째의 트립토판이, 이것에 해당한다.

변이형 CRBN을 코딩하는 핵산의 동물에의 도입 및 발현은, 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 변이형 CRBN을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 구축하고, 그것을 동물의 수정란 등에 도입하는 것 등에 의해 행할 수 있다. 핵산을 도입하는 동물로서는, 인간 이외의 동물이면 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 제브라피쉬, 닭, 마우스, 토끼 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 변이형 CRBN은, 유비퀴틴 리가아제 활성을 보유하지만, 탈리도마이드와 결합하지 않는다. 이 때문에, 이 변이형 CRBN을 코딩하는 핵산을 도입하고, 발현시킨 동물은, 탈리도마이드에 의한 최기성에 대하여 내성을 가지게 된다.

변이형 CRBN을 코딩하는 핵산을 도입, 발현시킨 동물은, 예를 들면, 최기성 이외의 약리 작용 해석 등의 용도에 이용할 수 있다. 변이형 CRBN을 도입한 토끼나 닭은 최기성 내성이 되기 때문에, 탈리도마이드나 그 유도체를 투여했을 때에 약리 작용을 나타낸다고 하면, 그것은 전부 최기성과 독립한 작용이다. 따라서, 최기성의 메커니즘과 독립한 탈리도마이드 작용을 해석하는 데에, 이 변이 CRBN을 도입한 동물은 극히 유용하다.

실시예

[실시예 1] 탈리도마이드의 CRBN 및 DDB1에의 결합성

탈리도마이드 결합 인자를 정제하기 위해서, 본 발명자는 자성 미립자인 FG 비드를 사용한 어퍼니티(affinity) 정제를 실시했다(인용문헌 9). 카르복시기가 부가된 탈리도마이드 유도체인 FR259625을 FG 비드에 공유결합에 의해 고정화하고 (도 6), 인간 HeLa세포의 추출액과 혼합하여, 인큐베이트(incubate)했다. 그 후, 세정을 행하고, 결합 인자를 유리(遊離) 탈리도마이드를 사용함으로써 선택적 용출을 행했다. 그리고 용출획분을 SDS-PAGE 및 은염색으로 해석한 결과, 127kDa와 55kDa의 2개의 단백질이 특이적으로 용출되는 것을 알 수 있었다(도 1A, Lane 3). 비드와 혼합하기 전에 미리 유리 탈리도마이드를 추출액에 가해 두면, 어퍼니티 정제에 의해 얻어지는 이들 단백질의 수량(收量)이 현저하게 감소했다(도 1A, Lane 4). 즉, 이들 단백질은 탈리도마이드에 특이적으로 결합하는 것이 나타난 것이다. 이들, 127kDa 및 55kDa의 단백질은 질량분석계에 의해 해석되어, 각각 DDB1 및 CRBN인 것을 밝혀냈다(표1). 이들 단백질은 웨스턴 블롯팅(immunoblotting)에 의해서도 확인되고(도 1A), 또한 다양한 세포의 추출액으로부터도 정제되는 것을 알 수 있었다(도 7). 탈리도마이드와의 상호작용이 직접적인지 어떤지를 조사하기 위해서, 본 발명자는 이것들의 재조합 단백질을 정제했다. 탈리도마이드 고정화 비드에 CRBN-FLAG만이 결합하고, DDB1-V5-His는 결합하지 않았다(도 1B). 따라서, DDB1은 CRBN을 거쳐서 탈리도마이드에 간접적으로 결합하고 있는 것이 아닌가라고 생각했다. 결과적으로 탈리도마이드는 CRBN에 직접 결합하고 있어(도 1C), DDB1은 CRBN과의 상호작용을 거쳐서 탈리도마이드와 결합하고 있다는 결론이 얻어졌다.

[표1]

[실시예 2] CRBN, DDB1, 및 Cul4A에 의한 E3 복합체의 형성

인간의 CRBN 유전자는 원래는 상염색체성 열성 경도 정신지체의 원인 후보 인자로서 보고되고 있으며(인용문헌 11), 442개의 아미노산으로 이루어지는 단백질을 코딩하고 있다. 이 단백질은 진화적으로 잘 보존되어 있으며, 식물에서부터 인간에게까지 존재한다. 최근의 프로테오믹스(proteomics)해석에 의해 CRBN이 DDB1과 결합하는 것은 보고되어 있었지만(인용문헌 12), 기능적인 상관관계는 명백하게 되어있지 않아, CRBN의 생물적 기능은 거의 알려져 있지 않다.

우선 본 발명자는 CRBN 기능에의 탈리도마이드의 효과를 조사하기 위해서, 생화학적 해석을 행했다. 최초에 FH-CRBN을 안정적으로 발현시킨 293T세포주를 작제하고, 그 세포 추출액으로부터 FLAG 항체로 면역 어퍼니티 정제를 행함으로써 CRBN 결합 단백질을 밝히기로 했다. 정제물에 대하여 은염색을 행한 바 CRBN은 DDB1과 거의 1:1의 몰비로 결합하고 있는 것이 밝혀졌다(도 8). 면역 염색(도 2A)에 의하면 CRBN과 DDB1은 주로 핵에 존재하고 있었다. 이 결과는, 핵에 있어서 이것들이 중요한 기능을 담당하고 있는 것을 시사하는 것이다. DDB1은 Cul4(Cul4A 혹은 Cul4B), Regulator of Cullin 1(Roc1) 그리고 기질 리셉터와 함께 E3 유비퀴틴 리가아제를 형성하는 것이 보고되어 있다(인용문헌 13, 14). 기본적으로, E3 유비퀴틴 리가아제의 기능이란, 유비퀴틴 결합 효소(E2)와 특이적으로 상호작용함으로써 기질에 폴리유비퀴틴 쇄를 부가하는 것이다(인용문헌 15, 16). Cul4는 골격 단백질(scaffold protein)로서 기능하고, Roc1은 RING finger domain을 가지고 있어, E2와 상호작용할 수 있다. 기질 리셉터로는, DDB2, CSA, SV5-V, CDT2 그리고 AhR가 알려져 있고, 기질에 직접 결합하여 유비퀴틴화를 중개한다(인용문헌 13, 7-20).

본 발명자는 CRBN이 E3 복합체의 다른 구성 인자와 상호작용하는지 검증하고, DDB1, Cul4A 및 Roc1이 FH-CRBN과 복합체를 형성하는 것을 밝혔다(도 2B). 혹시 CRBN이 신규의 기질 리셉터라면, DDB1에의 결합에 대하여, CRBN은 DDB2과 같은 다른 기질 리셉터와 경합할 것이 기대된다. 실제로, DDB2의 발현량을 증가해감에 따라, CRBN과 공침하는 DDB1의 양은 감소했다(도 2C). 즉 CRBN은 DDB1-Cul4-Roc1 E3 유비퀴틴 리가아제의 기질 결합 서브유닛일지도 모른다는 결과가 얻어진 것이다.

그리고, 본 발명자는 실제로 CRBN 복합체에 E3 유비퀴틴 리가아제 활성이 있는지 어떤지를 검증하기로 했다. 기질 리셉터 및 Cul4는 in vitro에서 자기 유비퀴틴화되는 것이 알려져 있다. GST 태그 부착 유비퀴틴, Unal(E1), Ubal2(E2) 그리고 CRBN 복합체를 사용함으로써 in vitro에서 유비퀴틴화 어세이(assay)를 행한 결과, 확실히 CRBN 복합체에 의한 유비퀴틴화 활성이 검출되었다(도 9). 다음으로 본 발명자는 CRBN이 생세포 내에서도 유비퀴틴화되어 있는지 어떤지를 검증하기 위해서, FH-CRBN을 발현시킨 293T세포에 프로테아좀 저해제인 MG132를 처리했다. CRBN의 자기 유비퀴틴화는 MG132 존재하에서 검출되고, 또 그 유비퀴틴화는 Cul4A를 siRNA에 의해 발현 억제함으로써 감소하는 것을 알 수 있었다(도 2D). 대조적으로 DDB1의 siRNA에서는 CRBN의 발현량이 감소했으므로(도 10), DDB1 발현 억제에 의한 CRBN의 자기 유비퀴틴화에의 영향을 해석하는 것이 불가능했다. 그러나, 그것은 DDB1이 CRBN에 기능적으로 관계되어 있음을 시사하는 것이다.

다음으로, CRBN의 기능 발현에 있어서의 DDB1의 역할을 밝히기 위해서, 본 발명자는 DDB1과의 결합능을 결여한 CRBN 변이체를 작제했다. 결손 변이체를 사용한 해석에 의해 CRBN에 있어서의 187∼260번째의 아미노산 영역을 결손시킨 변이체는 DDB1과 결합하지 않는 것이 판명되었다(도 11, ΔMid). Δ Mid를 발현하는 293T세포에 있어서, MG132의 처리에 의한 자기 유비퀴틴화는 야생형 CRBN을 발현시킨 경우와 비교해 현저하게 저하하여 있었다. 이상의 결과에서, CRBN은 기능적으로 E3 유비퀴틴 리가아제의 서브유닛이며, Cul4A, DDB1 의존적 자기 유비퀴틴화를 받는 것이 시사되었다.

[실시예 3] 탈리도마이드에 의한 CRBN 기능의 저해

CRBN-탈리도마이드 간의 결합과 그 기능적 중요성의 기반을 밝히기 위해서, 본 발명자는 탈리도마이드 비결합성이면서 E3 복합체 형성능을 가지는 CRBN 점 변이체를 얻고 싶다고 생각했다. 우선 N말단 측 결손 변이체와 C말단 측 결손 변이체를 작제하고, 탈리도마이드 결합 영역을 조사한 결과, C말단의 104 아미노산 영역인 것이 판명되었다(도 3A 및 B). 애기장대로부터 인간에 이르기까지의 다수의 CRBN 호모로그(homologs)의 상동성 해석에서 C말단 측이 상당히 보존되어 있는 것을 알 수 있었다(도 12). 진화적으로 잘 보존된 아미노산이 탈리도마이드와의 결합에 중요한 것은 아닐까라고 생각하여, 몇 개의 점 변이체를 작제했다. 그리고 두 개의 아미노산, Y384 혹은 W386을 알라닌으로 치환한 변이체는 탈리도마이드 결합능이 저하하는 것을 알 수 있었다(도 3C). 또한, Y384A/W386A(CRBN YW/AA라고 부르는 2잔기를 동시에 치환한 변이체)는 탈리도마이드와의 결합능이 극히 낮은 것을 알 수 있었다(도 3C). 본 발명자는 이 CRBN YW/AA가 활성을 보유하고 있는 것인지 조사했다. 세포 내 국재는 야생형과 이 변이체에서 차이는 보이지 않았다. 본 발명자는 이 CRBN YW/AA에 있어서도 DDB1, Cul4A, Roc1이 면역 침강에 의해 정제되어, MG132 존재하에 있어서 자기 유비퀴틴화되는 것을 알아냈다(도 3E 및 F). 즉 CRBN YW/AA는 야생형 CRBN과 같이 E3 복합체를 형성하고, 기능도 보유하고 있는 것을 알 수 있었다.

이리하여 본 발명자는, CRBN을 포함하는 E3 복합체에 있어서 유비퀴틴화를 탈리도마이드가 저해하는지 어떤지를 검증했다. 293T세포에 FH-CRBN 혹은 FH-CRBN YW/AA를 안정적으로 발현시켜, MG132 및 약리학적으로 타당한 양의 탈리도마이드(10, 30, 100μM)로 처치했다. 야생형 CRBN의 자기 유비퀴틴화는 탈리도마이드에 의해 강력하게 저해되었지만, CRBN YW/AA의 자기 유비퀴틴화는 탈리도마이드에 의해 저해되지 않았다(도 3G). 따라서, 탈리도마이드는 CRBN과 결합함으로써 그 E3 기능을 저해하는 것이 시사되었다.

[실시예 4] 생체 내에서의 탈리도마이드의 표적으로서의 CRBN

다음으로 본 발명자는 동물모델을 사용하여 탈리도마이드 최기성에 있어서의 CRBN의 역할을 검증하기로 했다. 탈리도마이드는 마우스에 있어서는 최기성을 나타내지 않지만, 토끼나 닭에 있어서는 발휘한다(인용문헌 1-3). 본 연구에 있어서는, 본 발명자는 제브라피쉬(Danio rerio)를 이하에 나타낸 이유로 모델로서 채용하였다. (i) 발생이 빠르고 또한 몸이 투명하므로 관찰이 용이 (ii) 유전자 억제가 비교적 용이(인용문헌 21) (iii) 제브라피쉬는 약리독성과학에 있어서 적합하다(인용문헌 22). 종래, 탈리도마이드가 제브라피쉬에서도 최기성을 나타내는지 어떤지는 알려져 있지 않았지만, 최근 들어 탈리도마이드는 제브라피쉬에 있어서 혈관 신생 저해를 야기하는 것을 알았으므로(인용문헌 23), 본 발명자는 제브라피쉬에 있어서도 탈리도마이드가 최기성을 나타낸다고 생각했다.

제브라피쉬 발생에 있어서의 탈리도마이드의 영향을 밝히기 위해서, 난각을 제거한 배를 다양한 농도의 탈리도마이드를 포함한 배지에 옮겼다. 탈리도마이드는 2hpf(hours post fertilizaition, 수정 후 시간)에 가해, 3일간, 발생 프로세스를 관찰했다. 탈리도마이드에 약욕시킨 배에 있어서는 가슴 지느러미 및 이포의 발생이 저해되어 있는 것을 알 수 있었다(도 4A 및 B). 그러나 다른 부위에 있어서는 특별한 이상을 검출할 수 없었다. 보다 특이적으로는 75hpf에 있어서 엔도스켈레탈 디스크(Endoskeletal disc)의 가슴 지느러미 형성이 저해되고(도 4A), 30hpf에 있어서의 이포의 사이즈가 감소하고 있었다(도 4B). 가슴 지느러미 발생의 지연에 대해서는 탈리도마이드에 약욕시킨 48hpf의 배에 있어서도 검출할 수 있었다(도 5C 및 D). 최근의 연구에 의하면, 경골어(teleost, 제브라피쉬를 포함한다)에 있어서의 가슴 지느러미와 이포의 발생은, 사지동물(tetrapod)에 있어서의 사지와 귀의 발생과 같은 분자 메커니즘을 공유하는 것이 보고되어 있다(인용문헌 24-26). 이렇게 하여, 탈리도마이드에 의해 유도된 제브라피쉬에 있어서의 발생 이상은, 임신 초기의 여성이 탈리도마이드를 복용함으로써 생기는 발생 이상과 극히 유사하여, 탈리도마이드 최기성은 척추동물에 있어서 종간(種間)을 초월해 보존되어 있는 것이 시사되었다.

제브라피쉬에 있어서도 CRBN의 오르토로그(상당하는 것)가 있으며, zcrbn이라고 부른다. 이 유전자 산물은 인간에 있어서의 CRBN과 70% 정도의 보존성이 있다. 본 발명자는 우선, zcrbn mRNA의 발현 패턴을 해석하고, 48hpf에 있어서 zcrbn이 뇌, 두부 혈관, 귀, 그리고 가슴 지느러미에 있어서 발현하고 있음을 밝혔다(도 13). zCrbn은 탈리도마이드에도, 인간의 DDB1에도 결합했다(도 14). 즉 제브라피쉬에 있어서도 인간 세포계에 있어서의 해석 결과는 유효하다고 생각된다. 다음으로, 제브라피쉬 초기 발생에 있어서의 zCrbn의 영향을 해석했다. 탈리도마이드와 같이, zcrbn 안티센스 모르폴리노 올리고(antisense morpholino oligo, AMO)를 주입한 배에 있어서는 지느러미 및 귀의 발생에 이상이 보여(도 4C∼F), 탈리도마이드로 처치한 경우와 표현형이 유사했다. 예를 들면 27hpf에 있어서 zcrbn AMO를 주입한 배에 있어서는 야생형과 비교해 이포의 사이즈는 40%나 저하하여 있었다(도 4F). 그리고 이 결과는 zcrbn의 mRNA를 AMO와 공도입함으로써 사라졌다(도 4C∼F).

이들의 결과로 인해, 탈리도마이드에 의한 최기 작용은 zCrbn의 기능을 저해함으로써 야기된 것이 아닐까라는 가능성이 극히 농후해졌다. 만약 그렇다면, 탈리도마이드와 결합하지 않지만 기능은 보유된 zCrbn을 발현시킴으로써, 그 최기성이 완화될 것이다. 이 아이디어를 검증하기 위해서, 본 발명자는 Y374 및 W376을 알라닌으로 치환한 변이체(인간에 있어서의 YW/AA 즉 Y384A/W386A에 상당한다)를 작제했다. zCrbn YW/AA는 탈리도마이드에 대한 결합능이 극히 낮다. 탈리도마이드 비존재 하, 야생형 zCrbn 및 zCrbn YW/AA를 과잉발현시킨 개체에 있어서 지느러미 및 이포의 발생에 무처치 개체와 차이가 나타나지 않았다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, 400μM의 탈리도마이드 처치에 의해, 이포의 사이즈는 유의하게 감소했다 (컨트롤과 비교해 64.5%. 도 5A 및 B). 야생형 zCrbn을 과잉발현시킨 배에 있어서도 탈리도마이드에 의해, 이포의 사이즈가 컨트롤과 비교해 66%정도로 감소했다. 그러나, 중요한 점은 zCrbn YW/AA를 과잉발현시킨 배에 있어서는 탈리도마이드의 처치는 이포의 사이즈에 영향을 미치지 않았다는 것이다(p=0.347). 탈리도마이드에 의한 지느러미의 축퇴(縮退)도, zCrbn YW/AA의 과잉발현에 의해 사라졌다. 이들의 결과는, 탈리도마이드가 CRBN과 결합하고, 그 기능을 저해함으로써 최기성을 야기함을 나타내는 것이다.

[실시예 5] 탈리도마이드 최기성의 분자 메커니즘

탈리도마이드와 CRBN의 관련성에 대해서는 판명되었으므로, 본 발명자는 CRBN을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체가 최기성에 관련되는지 어떤지를, zCul4A를 발현 억제함으로써, 검증했다. zcul4a mRNA는 뇌나 지느러미에서 강하게 발현하고 있다(도 13). 예상대로, zcul4a AMO에 의해 이포 및 지느러미의 이상이 생겼다(도 4G - I). 27hpf에 있어서 zCul4a를 발현 억제한 배에서는 이포 사이즈가 현저하게 감소하여 있었고(컨트롤 사이즈의 40%), zcul4a의 mRNA 도입에 의해 부분적으로도 구제(rescue)되었다. 구제가 부분적이었던 것은, zcul4a AMO의 효력이 지나치게 강했기 때문일지도 모른다. 이들의 경우에서, 적어도, 유비퀴틴 리가아제 복합체가 귀와 지느러미의 발생에 필요하고, 탈리도마이드의 표적인 것이 시사되었다.

이상의 결과로부터, CRBN을 포함하는 E3 복합체에 의해 일정의 단백질이 유비퀴틴화되는 것은 귀나 지느러미의 발생에 있어서 중요한 것을 알 수 있고, 또는 탈리도마이드에 의한 발생 이상은 CRBN을 포함하는 E3 복합체의 기능 부전이 관계하고 있는 것이 시사되었다. CRBN 및 탈리도마이드의 하류 시그널 전달의 단서를 얻기 위해서, 지느러미 발생의 열쇠가 되는 잘 알려진 분자를 해석하기로 했다. 소닉 헷지호그(Sonic hedgehog, Shh)는 극활성영역(ZPA, zone of polarizing activity)에 발현하는 인자이며, 사지·지느러미의 전후축을 규정한다(인용문헌 27). 또한 Fgf8은 사지·지느러미에 있어서의 AER(apical ectodermal ridge)에 발현하는 인자이며, 원근축에 따른 사지·지느러미의 신장에 필수이다. 탈리도마이드를 투여한 48hpf의 배에 있어서는 fgf8a의 발현이 저하 혹은 소실했지만(도 5C), shh의 발현의 변화는 보이지 않았다 (도 5D). 이에 더하여 탈리도마이드에 의한 fgf8a 발현의 저하는, zCrbn YW/AA의 도입에 의해 구제되었다. zCrbn 및 zCul4A에 대하여 AMO를 도입한 배에 있어서도 fgf8a 발현이 저하했지만, shh 발현은 차이가 보이지 않았다. 따라서, FGF8 생산을 저해하는 인자가 탈리도마이드나 CRBN을 포함하는 E3 복합체의 하류의 표적일지도 모른다.

[실시예 6] CRBN 및 DDB1에 대한 프탈이미드의 결합성

기지의 비최기성 탈리도마이드 유도체인 프탈이미드의 CRBN 및 DDB1에 대한 결합성을 이하와 같이 조사했다.

293T세포 추출액을 탈리도마이드 고정화 비드와 혼합한 후, 세정을 행했다. 탈리도마이드 또는 프탈이미드를 사용하여 탈리도마이드에 결합한 인자를 용출시켰다. 용출획분 중의 CRBN 및 DDB1을 웨스턴 블롯팅으로 해석했다. 탈리도마이드의 용출획분에서는 CRBN 및 DDB1이 검출되었지만, 프탈이미드(Phthal)의 용출획분에서는 이들 단백질이 검출되지 않았다(도 16).

[실시예 7] 탈리도마이드 유도체와 CRBN의 결합 검토

293T세포 추출액을 탈리도마이드 고정화 비드와 혼합하고, 2시간 반응시켰다. 그 후, 0.5% NP-40 라이시스 버퍼(lysis buffer)(Tris-HCl pH 8, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)로 3회 세정하고, 0.1-1mM의 탈리도마이드, 프탈이미드, 글루타르이미드, 혹은 5HPP-33(각 화합물의 구조식을 도 17에 나타낸다)을 포함하는 0.5% NP-40 라이시스 버퍼로 1시간 혼합함으로써 CRBN의 용출을 행했다. 얻어진 용출획분은, SDS-PAGE 후, CRBN 항체에 대한 웨스턴 블롯팅을 행하고, 해석하였다. 이 결과를 도 18에 나타낸다.

도면에 나타내는 바와 같이, 프탈이미드 또는 5HPP-33을 포함하는 버퍼를 사용했을 경우에는, CRBN은 거의 용출되지 않았다. 이것으로부터, 프탈이미드 및 5HPP-33은 CRBN에 대한 결합성이 낮다고 생각된다.

[실시예 8] 다발성 골수종세포에 대한 증식 억제 시험

탈리도마이드 및 5HPP-33의 다발성 골수종세포 Kms12에 대한 증식 억제 작용을 조사했다.

다발성 골수종세포 Kms12의 배양에는 RPMI Medium 1640(10% FBS)을 사용했다. 각 약제처리를 행하는 경우에는 Kms12를 1ml 당 2×10⁵ 세포로 조정하고, 2ml 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 2ml씩 분주(分注)했다. 첨가하는 약제(탈리도마이드 혹은 5HPP-33)는 디메틸설폭시드(DMSO)를 용매로 하여 최종농도의 1000배 농도의 스톡 용액을 작제하고, 2ml의 세포 현탁액에 대하여 2μl의 스톡 용액을 가해, 부드럽게 충분히 전도(轉倒) 혼화시켰다. 처리 후, 96 웰 플레이트(well plate)에 1웰 당 100μl 분주한 것을 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 48시간 배양했다. 처리 후 48시간에서의 세포 수의 측정에는 생세포 수 측정시약 SF(나칼라이 테스크사)를 1웰 당 10μl 가해 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터에서 2시간 배양했다. 세포 수에 비례하는 450nm 흡광도의 측정에는 GloMax-Multi+ Detection System(promega)을 사용했다. 검량선의 작제에는 1ml 당 1×10⁶, 3×10⁵, 1×10⁵ 세포의 Kms12를 사용했다. 용매 처치 시의 세포 수를 100으로 하여, 약물 첨가 시의 세포 수를 상대값으로 나타냈다. 48시간 배양 후의 세포 수의 상대값을 도 19에 나타냈다.

도면에 나타낸 바와 같이, 5HPP-33은, 다발성 골수종세포 Kms12에 대하여 강한 증식 억제 작용을 나타냈다. 실시예 7에 나타낸 바와 같이 5HPP-33의 CRBN에 대한 결합성은 낮다. 따라서, 5HPP-33의 증식 억제 작용은, CRBN과의 결합과 무관계한 것으로 생각된다.

[고찰]

CRBN의 기능이 DDB1-Cul4A-Roc1 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체에 있어서의 기질 리셉터인 것은 지지된다. CRBN과 잘 알려진 기질 리셉터인 DDB2은 DDB1과 경합적으로 결합한다. 두 번째로, CRBN은 다른 기질 리셉터와 마찬가지로 자기 유비퀴틴화된다. DDB2을 포함하는 많은 기질 리셉터가 WDXR 구조(motif)를 가진다(인용문헌 11, 19). 반면, 소수의 기질 리셉터에는 그것이 결여되어 있다(인용문헌 13, 18). CRBN에는 명확한 WDXR 모티브가 발견되지 않으므로, 아마도 후자의 타입일 것이다. 상기의 생각을 지지하는 결과로서, CRBN 및 Cul4A의 제브라피쉬에서의 발현 억제가 유사한 결과를 가져왔다는 점을 들 수 있다. 단, CRBN의 발현 억제에 비해, Cul4A의 발현 억제는 형질에 미치는 영향이 보다 심각했다. 이 관찰 결과는 그다지 놀랄 것까지는 없다. 왜냐하면, CRBN을 가지는 DDB1-Cul4A 유비퀴틴 리가아제는 그저 소량에 밖에 존재하지 않아, CRBN은 DDB1-Cul4A의 그저 소수 복합체에밖에 영향을 주지 않는 반면, Cul4A의 억제는 모든 복합체에 영향을 주게 되기 때문이다.

탈리도마이드의 작용 메커니즘은 다면적 또한 다각적이어서 완전하게는 알고 있지 않다. 탈리도마이드의 면역 조절 작용이나 혈관 신생 저해 작용이, 나성결절성 홍반, 다발성 골수종에 대한 치료 효과 혹은 최기성에 관여하고 있는 것으로 여겨지고 있다(인용문헌 2, 3). 또한, 탈리도마이드가, TNF-alpha나 VEGF등의 복수의 사이토카인(cytokine)의 생산을 억제하는 것(인용문헌 30, 31), 및 아포토시스 유도, 활성산소종(ROS) 생산 등의 작용이 있는 것(인용문헌 3, 4, 32)이 보고되어 있다. 이들 데이터가 축적하고 있음에도 불구하고, 탈리도마이드의 직접의 표적은 불분명했다. 여기에서 본 발명자는 CRBN이 탈리도마이드의 최기성의 주요한 표적 인자라는 몇몇 증거를 얻었다. 첫째, 탈리도마이드는 직접적으로 CRBN에 결합하여, CRBN의 자기 유비퀴틴화를 저해한다. 이것은 형성하고 있는 유비퀴틴 리가아제의 저해가 원인이며, 다른 유비퀴틴 리가아제에 있어서도 유사한 현상이 보인다(인용문헌33). 둘째, 탈리도마이드에 의한 제브라피쉬의 발생 이상은, CRBN을 발현 억제한 경우와 유사하며, 탈리도마이드 비결합의 CRBN 변이체를 과잉발현시킴으로써 완화된다는 것이다. 셋째로서, 사지·지느러미의 신장에 필수인 FGF8이 탈리도마이드 및 CRBN 복합체의 하류에 있는 표적이라는 것이다(도 4D, 4G, 5C). 이들 결과는 과거의 보고와도 모순 없이 일치하고 있으며, 탈리도마이드에 의한 fgf8의 발현 억제는 토끼를 사용한 실험에서 이미 나타나 있다(인용문헌 34). 또한, 발생 중의 닭의 지아(肢芽)에 있어서, 탈리도마이드는 BMP(bone morphogenetic protein)의 발현을 상승시키고, 아포토시스를 일으키는 것이 보고되어 있다(인용문헌 32). 마우스 BMP는 AER에 있어서 FGF8의 발현을 억제하고, 아포토시스를 일으키는 것이 보고되어 있다(인용문헌 35). 즉 CRBN은, 지금까지 불분명했던 탈리도마이드와 이들 발생 제어 인자 간의 잃어버린 고리(missing link)를 메울 수 있는 인자이다.

상기 실시예의 결과는 탈리도마이드가 일으키는 최기성이 CRBN의 결합 및 그것에 따르는 유비퀴틴 리가아제 활성의 저해에 의해 야기되는 것을 시사하고 있다 (도 15). 본 발명자는 탈리도마이드 및 CRBN에 의해 야기되는 유비퀴틴 의존성 단백질 분해의 제어가, BMP나 FGF8 경로가 정상 발생 메커니즘의 이상을 초래했다고 추측된다. 다른 발생 인자도 영향을 받고 있을지도 모른다. 그러나, 아직 많은 의문이 남겨져 있다. 예를 들면, CRBN을 포함하는 E3 복합체의 표적 기질은 무엇인지, 어떻게 해서 탈리도마이드는 CRBN의 유비퀴틴화를 저해하는 것인지 등의 문제에 대처하는 것이 필요할 것이다.

[실험 방법과 재료]

(1) 약제

탈리도마이드(Tocris Cookson)의 최종농도가 400mM이 되도록 디메틸설폭사이드(DMSO)를 가하고, 65℃로 가열하여 용해하여, 즉시 사용했다. MG132는 최종농도 10mM이 되도록 DMSO를 가하여 용해했다. 실험에 있어서는 음성대조(컨트롤)로서 동등량의 DMSO를 사용하였다.

(2) 탈리도마이드 고정화 비드의 작제

탈리도마이드 고정화 비드의 작제에 관한 도면을 도 6에 나타냈다. 자성 FG 비드(5mg, 인용문헌 10)에 대하여 10mM의 1-hydroxybenzotriazole, 10mM 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide HCl, 그리고 2mM의 FR259625(carboxyl thalidomide derivative)를, 용매인 N,N-dimethylformamide(DMF) 중에서 4시간 실온에서 반응시킴으로써, 탈리도마이드를 고정화했다. 또한 FG 비드에 있어서의 미반응 아미노기는 20%의 무수아세트산이 포함된 DMF 중에서 반응시킴으로써 보호했다. 완성한 비드는 4℃에서 보존했다.

(3) 탈리도마이드 고정화 비드를 이용한 어퍼니티 정제

탈리도마이드 고정화 비드(0.5mg)는 0.5% NP-40 라이시스 버퍼(50mM Tris HCl pH 8, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)에 의해 평형화를 행했다. 세포 추출액은 HeLa, Jutkat, THP-1, U266, HUVEC, LP101, SH-SY5Y, 293T 유래로 여러가지에 걸치지만, 그것들의 추출법은 문헌대로이다(인용문헌 36). 이것들의 추출액에 비드를 혼합하고, 2시간 반응시켰다. 0.5% NP-40 라이시스 버퍼로 비드를 3회 세정한 후, 1mM 탈리도마이드로 용출했다. 몇 가지 실험에서는, 0.3mM의 탈리도마이드를 비드와 혼합 전에 추출액에 가했다. 프탈이미드가 결합하는지 여부에 대해서는, 유리 탈리도마이드 1mM로 용출하는 과정에서, 대신에 1mM의 프탈이미드로 용출했다.

(4) 플라스미드

CRBN이나 DDB2 cDNA는 RT-PCR에 의해 HeLa total RNA로부터 얻었다. CRBN의 변이체는 표준적인 PCR법에 의해 작제했다. DDB1 cDNA에 대해서는 마츠나가(Matsunaga) 박사로부터 제공받았다. zCrbn 그리고 zCul4a cDNA는 24hpf에 있어서의 제브라피쉬 배의 total RNA로부터 RT-PCR로 얻었다. 본 연구에서는 이하의 벡터를 사용했다. pcDNA3.1-FH-N, pcDNA6/V5-His(Invitrogen), pFastBac1(Invitrogen), pLenti6(Invitrogen), pFASTBAC1(Invitrogen), pLenti6(Invitrogen), pCS2(+), 그리고 pGEX6P-1(GE Healthcare). pcDNA3.1-FH-N은 pcDNA3.1의 파생물이며, pcDNA3.1에 FLAG-HA 서열을 도입한 것이다.

(5) 항체

CRBN 항체는 인간 CRBN(65-76)을 항원으로 하여 토끼로부터 작제한 것이다. FLAG(M2, Sigma), HA(3F10, Roche), V5(V5-10, Sigma), GST(Sigma), DDB1(Abcam) 그리고 Roc1(Zymed)은 구입했다. Cul4A 및 DDB2은 양도된 것이며, 각각 Raychaudhuri 박사, 마츠나가 박사의 후의에 의한 것이다.

(6) 탈리도마이드 고정화 비드를 이용한 시험관 내 결합 시험

재조합 CRBN-FLAG 및 DDB1-V5-His 단백질은 곤충 Sf9세포에 있어서 Bac-to-bac(Invitrogen) 바큘로바이러스 시스템에 의해 발현시켜, 각각 항FLAG M2 아가로스 비드(Sigma), Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen)에 의해 정제했다. 정제한 CRBN-FLAG 및/또는 DDB1-V5-His에 탈리도마이드 고정화 비드를 혼합하고, 결합 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 용출했다. CRBN 결손 변이체 해석에 있어서는, GST 융합 CRBN 및 그 변이체를 대장균인 BL21에 발현시켜, 글루타티온 세파로스 비드(GE helthcare)로 정제했다. CRBN 변이체는 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 293T세포에 도입하여 과잉발현시켰다. 그 후의 결합 시험은 상술과 같다.

(7) 면역 공침강(共沈降)

CRBN과 DDB1 간의 상호작용을 해석하기 위해, CRBN-FLAG 및 DDB1-V5-His를 Sf9세포 내에 공발현시켰다. 세포 추출액에 항FLAG 아가로스 비드를 혼합하여, 결합 인자를 FLAG 펩티드로 선택적으로 용출했다. CRBN 복합체를 정제하기 위해서 CRBN 및 그 변이체를 발현하는 293T세포를 작제하고, 상술의 방법으로 FLAG 면역 정제를 행했다.

(8) 면역 염색

HA 태그나 V5 태그 융합을 사용한 CRBN이나 DDB1을 과잉발현하는 HeLa세포를 고정한 후, 항HA 항체나 V5 항체와 혼합시켜, Alexa Fluor 594 혹은 488(Invitrogen) 표지 2차 항체와 반응시켰다.

(9) 시험관 내 유비퀴틴화 시험

유비퀴틴화 시험은 인용문헌 37을 참고로 하여 행했다. FH-CRBN 복합체(200ng), Uba 1(500ng, Biomol), UbcH5b(500ng, Biomol), GST-Ubiquitin(4000ng, Calbiochem), 4mM ATP를 30℃에서 2시간, 15μl 스케일로 반응시켰다. 반응은, SDS를 가하여, 98℃에서 5분간 가열하여 정지시켰다.

(10) 생세포에 있어서의 자기 유비퀴틴화

이 시험은 인용문헌 38을 참고로 하여 행했다. FH-CRBN 혹은 그 변이체를 안정적으로 발현시킨 293T세포에 10μM의 MG132 혹은 DMSO 단독(vehicle)을 가하여, 3시간 반응시켰다. 세포는 25μM의 MG132 및 10mM의 N-ethylmaleimide를 포함하는 RIPA 버퍼에서 용해했다. FH-CRBN을 상술의 방법으로 면역 침강하여, 해석했다. 각 농도의 탈리도마이드는, MG132를 처리하기 1시간 전에 가했다.

(11) RNAi

이하에 나타낸 Stealth RNAi oligonucleotide(Invitrogen)를 사용했다.

DDB1 #1: 5’-CAUACCUUGAUAAUGGUGUUGUGUU-3’(서열번호 1)

DDB1 #2: 5’-CAGUAAUGAACAAGGCUCCUAUGUA-3’(서열번호 2)

Cul4A #1: 5’-GCAAAGCAUGUGGAUUCAAAGUUAA-3’(서열번호 3)

Cul4A #2: 5’-GAAUCUCUGAUAGACAGAGACUAUA-3’(서열번호 4)

센스 쇄만 나타냈다. 컨트롤로서는 Stealth RNAi negative control of low GC content(Invitrogen)를 사용했다. Lipofectamine RNAiMAX를 사용하여 293T세포에 40nM의 올리고뉴클레오티드를 도입하여 72시간 후에 세포를 회수했다.

(12) 제브라피쉬

물고기는 28.5℃에 있어서 14시간 가시광 명기, 10시간 암기의 사이클로 사육한다.

배는 자연교배로 얻고 있다(인용문헌 35). 알시안 블루 염색이나 마이크로인젝션(microinjection), 인 사이투 하이브리다이제이션은 이하의 항에 나타내고 있다. 제브라피쉬에 있어서의 CRBN 및 Cul4A(zcrbn and zcul4a)는 제브라피쉬 명명법 위원회의 가이드를 따랐다.

(13) 제브라피쉬의 탈리도마이드 처리

탈리도마이드는 DMSO에 용해했다. 그리고 미리 65℃로 가열해 둔 E3 배지에 400μM이 되도록 가했다. 제브라피쉬 배는 탈난각(脫卵殼)하고, 이하에 나타낸 바와 같이 탈리도마이드에 약욕시켰다. 2hpf에 있어서 배를 2mg/ml의 프로테아제 타입14(Sigma)에 3분간 반응시켜, 5회 배지로 세정했다. 그 과정에서 탈난각되지만, 즉시 탈리도마이드 함유 배지에 교환하여, 3일간 관찰했다. 탈리도마이드 함유 배지는 12시간 마다 교환했다.

(14) 알시안 블루 염색

콘드로사이트(condrocytes)의 외부 매트릭스는, 알시안 블루로 염색된다(인용문헌 40). 제브라피쉬 배는 3.7%의 중성 포름알데히드에 의해 밤새 고정했다. 다음날, 100% 에탄올로 세정 후, PBS로 재수화(再水和)시켰다. 다음으로, 0.05% 트립신을 포함하는 포화 4붕산나트륨 용액에서 1-3시간 반응시켰다. 3%의 과산화수소와 1%의 KOH용액에 의해 물고기의 반점을 제거하고, 70% 글리세롤 함유 PBS 용액에서 보존했다.

(15) 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 및 mRNA의 마이크로인젝션

1 세포기에 있어서의 마이크로인젝션에 대해서는 인용문헌 39에 따라 행했다. 우리들은 질소가스 압력 마이크로인젝터(IM 300, Narishige)를 주입에 사용하였다. 캡이 붙은 mRNA는 in vitro에 있어서 mMESSAGE mMACHINE in vitro transcription kit(Ambion)로 작제했다.

RNA는 사용 직전에 뉴클레아제 제거수(除去水)로 600ng/μl의 농도가 되도록 조제했다. 안티센스 올리고뉴클레오티드(Gene Tools)는 이하와 같다.

zCrbn AMO: 5’-AGAGCTGTAGCTGGTTCCCCATTTC-3’(서열번호 5)

zCul4A AMO: 5’-CTGGTGCTGAACATCTTCTGCCATC-3’(서열번호 6)

이들 올리고는 뉴클레아제 제거수로 700μM의 농도로 조제하여 사용했다.

(16) 호울 마운트 in situ 하이브리다이제이션

이 실험은 인용문헌 41에 따라 행했다. zcrbn mRNA의 안티센스 프로브는 5’-코드 영역의 513bp를 사용했다. zcul4a에 대해서는 3’UTR(3’비코드 영역)의 590bp를 사용하였다. shh 및 fgf8에 대응하는 프로브는 각각 Krauss 박사 및 Thisse 박사의 후의에 의한다. 프로브의 침투성을 증대시키기 위해서, 배는 0.1% Tween-20 및 10mg/ml의 프로테이나아제 K을 포함한 PBS에 있어서 2분간 상온에서 반응시켰다.

(17) 이포 사이즈 계측

48hpf에 있어서의 제브라피쉬 배에 1% 메틸셀룰로오스 및 0.003%의 3-amino benzoic acid ethyl ester(Sigma)를 사용하여 마취를 시키고, 슬라이드 글라스에 올렸다. 그리고 10 개의 개체를 각 샘플로부터 랜덤으로 선택하여, 이포를 촬영했다. 사이즈는 NIH image J 소프트웨어를 사용하여 계측하고, 컨트롤 이포의 사이즈와 비교했다. 평균치 및 표준편차를 계산하고, p치는 Mann-Whitney, U 검정을 사용하여 산출했다.

[인용문헌 일람]

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본 발명은, 피험물질이 탈리도마이드의 최기성을 가지는지 어떤지 판정하는데 이용할 수 있고, 탈리도마이드의 대체약이나 탈리도마이드의 최기성(催奇性)을 억제하는 의약 등의 개발에 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Tokyo Institute of Technology Fujimoto Pharmaceutical Corporation <120> SCREENING METHOD UTILIZING THALIDOMIDE-TARGETING FACTOR <130> FP-149PCT <150> JP 2009/241290 <151> 2009-10-20 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 1 cauaccuuga uaaugguguu guguu 25 <210> 2 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 2 caguaaugaa caaggcuccu augua 25 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 3 gcaaagcaug uggauucaaa guuaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 4 gaaucucuga uagacagaga cuaua 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 5 agagctgtag ctggttcccc atttc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 6 ctggtgctga acatcttctg ccatc 25 <210> 7 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ala Gly Glu Gly Asp Gln Gln Asp Ala Ala His Asn Met Gly Asn 1 5 10 15 His Leu Pro Leu Leu Pro Ala Glu Ser Glu Glu Glu Asp Glu Met Glu 20 25 30 Val Glu Asp Gln Asp Ser Lys Glu Ala Lys Lys Pro Asn Ile Ile Asn 35 40 45 Phe Asp Thr Ser Leu Pro Thr Ser His Thr Tyr Leu Gly Ala Asp Met 50 55 60 Glu Glu Phe His Gly Arg Thr Leu His Asp Asp Asp Ser Cys Gln Val 65 70 75 80 Ile Pro Val Leu Pro Gln Val Met Met Ile Leu Ile Pro Gly Gln Thr 85 90 95 Leu Pro Leu Gln Leu Phe His Pro Gln Glu Val Ser Met Val Arg Asn 100 105 110 Leu Ile Gln Lys Asp Arg Thr Phe Ala Val Leu Ala Tyr Ser Asn Val 115 120 125 Gln Glu Arg Glu Ala Gln Phe Gly Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr 130 135 140 Arg Glu Glu Gln Asp Phe Gly Ile Glu Ile Val Lys Val Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Phe Lys Val Leu Glu Leu Arg Thr Gln Ser Asp Gly 165 170 175 Ile Gln Gln Ala Lys Val Gln Ile Leu Pro Glu Cys Val Leu Pro Ser 180 185 190 Thr Met Ser Ala Val Gln Leu Glu Ser Leu Asn Lys Cys Gln Ile Phe 195 200 205 Pro Ser Lys Pro Val Ser Arg Glu Asp Gln Cys Ser Tyr Lys Trp Trp 210 215 220 Gln Lys Tyr Gln Lys Arg Lys Phe His Cys Ala Asn Leu Thr Ser Trp 225 230 235 240 Pro Arg Trp Leu Tyr Ser Leu Tyr Asp Ala Glu Thr Leu Met Asp Arg 245 250 255 Ile Lys Lys Gln Leu Arg Glu Trp Asp Glu Asn Leu Lys Asp Asp Ser 260 265 270 Leu Pro Ser Asn Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Val Ala Ala Cys Leu 275 280 285 Pro Ile Asp Asp Val Leu Arg Ile Gln Leu Leu Lys Ile Gly Ser Ala 290 295 300 Ile Gln Arg Leu Arg Cys Glu Leu Asp Ile Met Asn Lys Cys Thr Ser 305 310 315 320 Leu Cys Cys Lys Gln Cys Gln Glu Thr Glu Ile Thr Thr Lys Asn Glu 325 330 335 Ile Phe Ser Leu Ser Leu Cys Gly Pro Met Ala Ala Tyr Val Asn Pro 340 345 350 His Gly Tyr Val His Glu Thr Leu Thr Val Tyr Lys Ala Cys Asn Leu 355 360 365 Asn Leu Ile Gly Arg Pro Ser Thr Glu His Ser Trp Phe Pro Gly Tyr 370 375 380 Ala Trp Thr Val Ala Gln Cys Lys Ile Cys Ala Ser His Ile Gly Trp 385 390 395 400 Lys Phe Thr Ala Thr Lys Lys Asp Met Ser Pro Gln Lys Phe Trp Gly 405 410 415 Leu Thr Arg Ser Ala Leu Leu Pro Thr Ile Pro Asp Thr Glu Asp Glu 420 425 430 Ile Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Cys Leu 435 440

Claims (11)

1. 피험물질을 세레블론 혹은 그 단편과 접촉시켜, 피험물질의 세레블론 혹은 그 단편에 대한 결합성을 평가하고, 세레블론 혹은 그 단편과 결합하지 않는 피험물질, 또는 세레블론 혹은 그 단편과의 결합성이 탈리도마이드보다도 낮은 피험물질을 선택하는 것을 특징으로 하는 비최기성(非催寄性) 물질의 스크리닝 방법.
2. 제1항에 있어서,
   피험물질이 의약인 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   피험물질이, 일반식 (1)
   

   

   
   로 표시되는 탈리도마이드 유도체인 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법;
   단, 식 (1) 중, X가 R₅-R₇이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(A), X가 R₅이고, Y가 R₆-R₈일 경우를 화합물(B) 및 X가 R₅이고, Y가 R₈일 경우를 화합물(C)라 하며
   또한, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 -H; -OH; =O; 직쇄 및 분지 알칸, 알켄, 알킨; 환식 알칸, 알켄 및 알킨; 환식 및 비환식 알칸, 알켄 및 알킨의 조합; 알코올, 알데히드, 케톤, 카르복시산, 에스테르, 또는 환식, 비환식과 조합한 에테르 부분(moiety), 혹은 환식/비환식 부분(moiety)의 조합; 아자; 아미노; -MOn 또는 -O- MOn[식 중, M=N 그리고 n=2; M=S 그리고 n=2 또는 3; 혹은 M=P 그리고 n=1-3이다]; 그리고 할로겐에서 선택할 수 있으며; R₅, R₆, R₇ 및 R₈은 각각 독립하여 식 (2)
   

   

   
   또는 -O-(식 중, Z는 임의이고, 그리고 상기 R₁의 정의와 같다)에서 선택되며; 그리고 R₁₀은 상기 R₁의 정의와 같거나, 또는 (Z가 없을 경우에는) R₁₀은 =O이며;
   R₉는 식 (3), (4), (5), (6) 또는 (7)
   

   

   
   

   

   
   

   

   

   
   식 중, 각각의 R₁₁-R₁₇은 (독립하여) 상기 R₅의 정의와 같고,
   

   

   
   식 중, R₁₈, R₁₉, 및 R₂₀은 독립하여
   H, -CH₃, -COOH, -CONH₂, -(CH₂)n-COOH, -(CH₂)nCONH₂
   에서 선택되며, n=1-4를 가지는 부분이다.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   세레블론의 단편이, 서열번호 7에 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 그 N말단으로부터 339∼442번째의 아미노산 서열을 가지고, 그 이외의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가가 이루어진 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   세레블론 또는 그 단편은, 담체(擔體)에 고정되는 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법.
6. 제3항에 있어서,
   탈리도마이드 유도체가, 탈리도마이드 또는 기지의 탈리도마이드 유도체가 가지는 약리 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 비최기성 물질의 스크리닝 방법.
7. 피험물질을 세레블론 또는 그 단편과 접촉시켜, 피험물질과 세레블론 또는 그 단편의 결합성을 조사하고, 세레블론 또는 그 단편과 결합하는 피험물질을 선택하는 공정, 및 상기 공정에서 선택된 피험물질 중에서, i)최기성, 또는 ii)세레블론을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체의 활성 저해 작용을 경감하는 물질을 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 최기성 물질의 안타고니스트(antagonist)의 스크리닝 방법.
8. 제7항에 있어서,
   세레블론 또는 그 단편이, 담체에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 최기성 물질의 안타고니스트의 스크리닝 방법.
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10. 삭제
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