WO2007097109A1 - 抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法及び評価方法 - Google Patents

抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法及び評価方法 Download PDF

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WO2007097109A1
WO2007097109A1 PCT/JP2006/325845 JP2006325845W WO2007097109A1 WO 2007097109 A1 WO2007097109 A1 WO 2007097109A1 JP 2006325845 W JP2006325845 W JP 2006325845W WO 2007097109 A1 WO2007097109 A1 WO 2007097109A1
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WO
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test substance
rheumatoid arthritis
destruction
rsf
mmp
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PCT/JP2006/325845
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Hitoshi Kosaka
Nobuyuki Miyasaka
Original Assignee
National University Corporation Tokyo Medical And Dental University
Riken
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Publication date
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating anti-rheumatoid arthritis activity of a test substance and a method for screening a substance having anti-rheumatoid arthritis activity using the method.
  • rheumatoid arthritis is not yet clear, but it is a disease in which joint tissues are inflamed and swollen and painful due to genetic factors, infection, and other environmental factors. As the symptoms progress, cartilage and bones in the affected joints are destroyed, causing deformity and dysfunction of the limb joints.
  • inflammatory cells such as lymphocytes and macrophages infiltrate, and various inflammatory properties such as tumor necrosis factor (TNFa), interleukin (IL) 1, and IL 6 are infiltrated. A large amount of site power in is produced, causing inflammation.
  • synovial fibroblasts that form the synovial tissue of the joint, causing excessive proliferation.
  • the abnormally grown synovial fibroblasts form a granulomatous synovial tissue called pannus, leading to the destruction of cartilage and bone in the affected joint.
  • the abnormally proliferated synovial fibroblasts produce many joint destruction-related factors such as MMP-3, and the osteoclasts are activated to promote bone matrix resorption.
  • Non-patent Document 4 cyclin-dependent kinase inhibitors suppress inflammatory site force-in and the like without mediating cyclin-dependent kinase inhibition.
  • Non-patent literature l Taniguchi et al .; Nat Med. L999; 5: 760-767
  • Non-Patent Document 2 Nasu; J Immunol. 2000; 165: 7246-7252
  • Non-Patent Document 3 Nonomura; Int Immunol. 2001; 13: 723-731
  • Non-Patent Document 4 Nonomura et al .; J Immunol. 2003; 171 (9): 4913-4919 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in conventional rheumatoid arthritis treatment and achieve the following object. That is, the present invention relates to a method for efficiently evaluating the anti-rheumatoid arthritis activity of a test substance, and a substance having anti-rheumatoid arthritis activity using the method, especially for treating or preventing joint destruction in rheumatoid arthritis. It is an object of the present invention to provide a method for efficiently screening possible candidate substances for excellent rheumatoid arthritis therapeutics or preventives.
  • examples of various life phenomena that induce joint destruction include the proliferation of synovial fibroblasts and the gene expression of MMP-3. If a substance that does not inhibit the growth of membrane fibroblasts is selected, it has a therapeutic or preventive effect on joint destruction, but has a low risk of side effects such as stopping normal cell growth! / ⁇ , high safety! It becomes possible to select substances.
  • the present inventors have investigated the balance between the inhibitory action of the test substance on the action of cyclin-dependent kinase and the balance of the inhibitory action on various life phenomena that induce joint destruction.
  • the present inventors have found the possibility of efficiently screening for an excellent rheumatoid arthritis therapeutic drug or prophylactic drug candidate having a therapeutic or prophylactic effect, and completed the present invention.
  • the present invention is based on the above findings of the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is,
  • cyclin-dependent kinase is at least one of CDK4 and CDK6.
  • ⁇ 3> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the destruction of the joint tissue is destruction of the cartilage tissue.
  • ⁇ 4> The method according to ⁇ 3>, wherein the biological phenomenon that induces destruction of joint tissue is gene expression.
  • ⁇ 5> The method according to ⁇ 3>, wherein the vital phenomenon that induces destruction of joint tissue is MMP-3 gene expression in synovial fibroblasts.
  • ⁇ 6> The method according to ⁇ 3>, wherein the biological phenomenon that induces destruction of joint tissue is proliferation of synovial fibroblasts.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the destruction of joint tissue is destruction of bone tissue.
  • ⁇ 10> The method according to ⁇ 8>, wherein the vital phenomenon inducing joint tissue destruction is NFATcl gene expression in osteoclast precursor cells.
  • ⁇ 11> The method according to ⁇ 8>, wherein the biological phenomenon that induces destruction of joint tissue is the division from osteoclast precursor cells to osteoclasts.
  • a method for evaluating the anti-rheumatoid arthritis activity of a test substance comprising:
  • step (B) A step comprising: selecting a test substance evaluated as having anti-rheumatoid arthritis activity in step (A).
  • a method for solving the problems in the conventional rheumatoid arthritis treatment, achieving the object, and efficiently evaluating the anti-rheumatoid arthritis activity of a test substance and Using this method, a method for efficiently screening substances having anti-rheumatoid arthritis activity, in particular, excellent rheumatoid arthritis therapeutic or preventive drugs capable of treating or preventing joint destruction in rheumatoid arthritis is provided. can do.
  • FIG. 1A is a graph showing the results of examining the inhibitory effect of pl6 INK4a on RSF cell proliferation by -thymidine incorporation.
  • FIG. 1B is a table showing the results of investigating the inhibitory effect of pl6 INK4a on RSF cell proliferation by flow cytometry.
  • FIG. 1C is a graph showing the results of examining the inhibitory action of pl6 INK4a on MMP-3 and MCP-1 protein expression by ELISA.
  • Fig. ID is a graph showing the results of examining the inhibitory action of pl6 INK4a or ⁇ 21 ⁇ 1 on MIP-3 and IL-6 protein expression by ELISA.
  • FIG. 1E is a graph showing the results of examining the inhibitory action of pl6 INK4a , CDK4I, or activated Rb on MMP-3 mRNA expression by PCR.
  • FIG. 1F is a graph showing the results of examining the inhibitory action of pl6 INK4a , CDK4I, or activated Rb on MCP-lmRNA expression by PCR.
  • FIG. 1G is a graph showing the results of examining the inhibitory effect of pl6 INK4a or ⁇ 21 ⁇ 1 on IL-1RlmRNA expression by PCR.
  • FIG. 1H is a plot image showing the results of examining the binding of pl6 INK4a , pl8 INK4e or ⁇ 21 ⁇ 1 to JNK by immunoprecipitation and Western plotting.
  • FIG. 2A is a graph showing the results of examining the inhibitory effect of pl8 INK4e on RSF cell proliferation by -thymidine incorporation .
  • FIG. 2B is a table showing the results of investigating the inhibitory effect of pl8 INK4e on RSF cell proliferation by flow cytometry.
  • FIG. 2C is a graph showing the results of examining the inhibitory action of p18INK4e on MMP-3 and MCP-1 protein expression by ELISA.
  • FIG. 3A is a graph showing the results of examining the inhibitory effect of CDK4I on RSF cell proliferation by thymidine incorporation.
  • FIG. 3B is a table showing the results of investigating the inhibitory effect of CDK4I on RSF cell proliferation by flow cytometry.
  • FIG. 3C is a graph showing the results of examining the inhibitory action of CDK4I on MMP-3 and MCP-1 protein expression by ELISA.
  • FIG. 4A is a graph showing the results of examining the inhibitory action of activated Rb on RSF cell proliferation by incorporation of thymidine.
  • FIG. 4B is a table showing the results of investigating the inhibitory effect of active Rb on RSF cell proliferation by flow cytometry.
  • FIG. 4C is a graph showing the results of examining the inhibitory action of active Rb on the expression of MMP-3 and MCP-1 proteins by ELISA.
  • FIG. 5A is a diagram showing the results of histological observation of the inhibitory action of CDK4I on the differentiation of bone marrow cells into osteoclasts.
  • FIG. 5B is a graph showing the results of evaluating the inhibitory action of CDK4I on the differentiation of bone marrow cells into osteoclasts by measuring the number of cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of evaluating the inhibitory effect of CDK4I on cell proliferation in differentiation from bone marrow cells to osteoclasts by measuring the number of cells.
  • FIG. 7A is a diagram showing the results of histological observation of the inhibitory action of CDK4I on the differentiation of RAW264. 7 cells into osteoclasts.
  • FIG. 7B is a graph showing the results of evaluating the inhibitory action of CDK4I on the differentiation of RAW264. 7 cells into osteoclasts by measuring the number of cells.
  • FIG. 8A is a graph showing the results of examining the inhibitory action of CDK4I on NFATclmRNA expression by PCR.
  • FIG. 8B is a graph showing the results of examining the inhibitory action of CDK4I on TRAP mRNA expression by PCR.
  • FIG. 8C is a graph showing the results of examining the inhibitory effect of CDK4I on OSCAR mRNA expression by PCR.
  • FIG. 9A is a graph showing the results of examining the effect on RSF cell proliferation by co-introduction of cyclin D1 and CDK4 by 3 H-thymidine incorporation.
  • FIG. 9B is a table showing the results of investigating the effect on RSF cell proliferation by co-introduction of cyclin D1 and CDK4 by flow cytometry.
  • FIG. 9C is a graph showing the results of ELISA examining the effect on the expression of MMP-3 protein when cyclin D1 and CDK4 were co-introduced.
  • Fig. 10 is a pathway diagram showing a part of various control pathways of life phenomena related to joint destruction via CDK.
  • the method for evaluating the anti-rheumatoid arthritis activity of the test substance of the present invention comprises:
  • test substance any substance that can be evaluated for anti-rheumatoid arthritis activity can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation, and examples thereof include low molecular weight compounds, nuclear acids, and polypeptides. .
  • the low molecular weight compound, nucleic acid, polypeptide and the like may be extracted and purified from natural products, or may be artificially synthesized. Moreover, not only purified but also unpurified cell extract can be used as the test substance.
  • the test substance is preferably a low molecular compound.
  • the test substance is not limited to a novel substance, but may be a known substance or an improved product thereof.
  • anti-rheumatoid arthritis activity can be evaluated by the method of the present invention for existing therapeutics or preventives and their derivatives.
  • known cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKI) or improved versions thereof can be used.
  • the CDKI is a group of intracellular proteins that inhibit the kinase activity of cyclin-dependent kinases, and is known to specifically inhibit CDK4 and Z or CDK6, for example, pl5 INK4b and pl6 INK4a , Pl8 INK pl9 INK4d and other INK4 family proteins, known to inhibit all CDKs, Examples include CipZKip family 'proteins such as p27 Kipl and p57 Kip2 (see, for example, Sherrra et al .; Genes Dev. 1999; 13: 1501-1512).
  • step (a) the binding ability of the test substance to cyclin-dependent kinase is detected.
  • the cyclin-dependent kinase (hereinafter sometimes referred to as CDK) is not particularly limited as long as it can participate in a life phenomenon that induces destruction of joint tissue in rheumatoid arthritis.
  • CDK4 see SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, the same shall apply hereinafter; in SEQ ID NO: 1, where “n” is any of a, t, g, and c.
  • CDK6 see SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, see below are preferable.
  • the detection method of the binding ability of the test substance to the CDK can be appropriately selected according to the purpose of restriction, for example, whether or not the CDK and the test substance are directly bound.
  • Methods that can be investigated include: Biacore system (Biacore) method; QCM (Quarts Crystal Microbalance) method; Affinity chromatography method; Electrochemical measurement method ELISA method; mass analysis method; and the like.
  • the Biacore system is a system that can analyze the viewpoints of interactions between substances such as binding specificity, speed of interaction, and affinity. For example, a CDK is immobilized on the sensor surface. By using the system, the presence or absence of binding between the test substance and CDK can be determined.
  • the QCM can measure a very small amount of mass change by utilizing the property that the resonance frequency fluctuates (decreases) depending on the mass of a substance attached to the electrode surface of a crystal resonator.
  • the weight of the binding amount of the test substance to the CDK can be detected in real time by fixing the CDK on the electrode and using the sensor. The presence or absence of binding to CDK can be determined.
  • the affinity chromatography is an application of a chromatographic method used to separate molecules and the like.
  • CDK is immobilized on the surface of a carrier packed in a chromatography column, and a test substance is placed there.
  • the test substance that binds to CDK can be separated by utilizing the difference in binding of the test substance to CDK.
  • the presence or absence of binding between the test substance and CDK can be determined.
  • the electrochemical measurement is a method in which a ligand is immobilized on an electrode and detected by an electrochemical response of a redox species obtained by adding a substance bond separately.
  • a redox species obtained by adding a substance bond separately.
  • CDK is immobilized on an electrode. Use it by adding the test substance and redox species.
  • the test substance binds to C DK, the combined substance covers the electrode surface, so that the redox species cannot physically approach the electrode and the electrochemical response is lowered. It is possible to determine the presence or absence of coupling.
  • the binding ability of the test substance to the cyclin-dependent kinase is as described above. It is not limited to the method of directly examining the presence or absence of binding between the cyclin-dependent kinase and the test substance, but it is indirectly detected by a method of examining the suppression of the test substance against the phosphorylation of cyclin-dependent kinase. You can also
  • Cyclin-dependent kinases are activated by forming a complex with cyclin during cell cycle progression, and the retinoblastoma gene product (Rb; see SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 12, see below) and Phosphorylates other related proteins. It is known that the function of Rb, which inhibits the transcriptional activity of the E2F transcription factor, is inactivated by Rb phosphate, and the cell cycle proceeds.
  • the inhibitory effect of the test substance on the phosphorylation of cyclin-dependent kinase can be detected by examining the phosphate state of Rb, which is a substrate of cyclin-dependent kinase, and its mimic.
  • a synthetic peptide such as RPPTLSPIPHIPR (SEQ ID NO: 51), CDK4 and CDK6 proteins prepared using recombinant technology are mixed with Tris-HCl (pH7.4), 10mmol / L MgCl, 4.5mmol / L 2-mercaptoethanol, lmmol
  • test substance is the phosphate of the CDK substrate. It can be determined that the test substance has the ability to bind to CDK.
  • step (a) only one type or two or more types of methods for detecting the binding ability of the test substance to the CDK may be performed. When two or more methods are used, it is not always necessary to show the ability to bind to the test substance SCDK over all the selected methods. If the test substance has a binding ability to CDK, it can be determined that the test substance has a binding ability to CDK.
  • step (b) suppression of the test substance against a life phenomenon that induces destruction of joint tissue. Detect production.
  • the life phenomenon that induces the destruction of the joint tissue can be appropriately selected according to the purpose without any limitation as long as it is a phenomenon that can occur in the living body in connection with the destruction of the joint tissue. And any phenomenon related to the destruction of at least one of cartilage tissue and bone tissue.
  • the life phenomenon that induces the destruction of the joint tissue is divided into cartilage tissue and bone tissue for convenience, and the following is a force that will be explained in order.
  • the destruction of joint tissue proceeds as a whole, including cartilage and bone tissue. Therefore, in the step (b), the destruction of the joint tissue as a whole is induced by detecting the inhibitory action of the test substance against the life phenomenon that induces the destruction of at least one of the cartilage tissue and the bone tissue described later. It is possible to detect the inhibitory effect of the test substance on the life phenomenon that occurs.
  • the abnormally proliferated synovial fibroblasts are composed of matrix 'meta-mouth proteinase (MMP) 3 (see SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 20, the same applies hereinafter), monocyte chemotactic protein (MCP) — Produces factors related to joint destruction such as 1 (see SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 16, see below).
  • MMP matrix 'meta-mouth proteinase
  • MCP monocyte chemotactic protein
  • Matrix 'meta-oral proteinase (MMP) -3 is a tissue-degrading proteinase that degrades proteoglycan, gelatin, fibronectin, and collagen. MMP-3 also has a function of activating other MMPs, and is used in joints affected by rheumatoid arthritis.
  • MMP-3 also has a function of activating other MMPs, and is used in joints affected by rheumatoid arthritis.
  • the major proteinase in the weaving enzyme cascade eg, Ok ada; In Ruaay ⁇ ; TextbooK of Rheumatology. 6th.
  • MMP-3 is essential even in animal models of rheumatoid arthritis (see, for example, van Meurs et al .; Arthritis Rheum, 1999; 42: 2074-2084).
  • MMP inhibitors that inhibit proteinases activated by MMP-3 have been reported to prevent joint destruction in other rheumatoid arthritis models (eg, Hamada et al .; Br J Pharmacol, 2 000 131: 1513- 1520, Ishikawa3 ⁇ 4; Eur J Pharmacol, 2005; 508: 239-2 47. Epub 2005 Jan 2012 and Lewis et al .; Br J Pharmacol, 1997; 121: 5 40-546).
  • monocyte chemotactic protein (MCP) -1 is known to cause migration and activity of lymphocytes of rheumatoid synovial tissue (eg, Koch et al .; J Clin I nvest, 1992; 90: 772-779).
  • MCP-1 antagost has been reported to be effective in the treatment of rheumatoid arthritis animal models (eg, Gong et al .; J Exp
  • the biological phenomenon that induces the destruction of the cartilage tissue is not particularly limited.
  • tissue infiltration of inflammatory cells such as lymphocytes and macrophages
  • production of inflammatory site force in, synovial fibroblasts examples include proliferation, pannus formation, gene expression of joint destruction-related factors such as MMP-3 and MCP-1.
  • the detection method of the inhibitory effect of the test substance on the gene expression of factors related to joint destruction can be appropriately selected according to the purpose from known methods without particular limitations.
  • various PCR methods serum-quantitative PCR method, quantitative PCR method, real-time PCR method, etc.
  • Northern blot method in situ hybridization
  • gene expression refers to at least one of mRNA expression and protein expression.
  • the gene expression level at the mRNA level can be detected by various PCR methods, Northern blotting methods, in situ hybridization methods, and ELISA methods and Western blotting methods.
  • the amount of gene expression at the protein level can be detected.
  • test substance In order to perform the detection in the presence of a test substance, there is no particular limitation as long as the test substance is capable of acting on a target (here, synovial fibroblasts) at the time of the detection. It can be selected appropriately according to the purpose.
  • the test substance can act on synovial fibroblasts by adding the test substance to the culture solution of synovial fibroblasts.
  • the test substance can be introduced into synovial fibroblasts by incorporating the test substance gene into adenovirus and infecting the adenovirus with synovial fibroblasts.
  • the amount of the test substance used in the detection can be appropriately selected in consideration of the type of test substance, the type of detection method, the final purpose of use of the test substance, and the like, which are not particularly limited.
  • test substance in the presence of a test substance
  • the test substance When the inhibitory action of the test substance on the gene expression of joint destruction-related factors such as MMP-3 and MCP-1 as described above is detected, specifically, in the presence of the test substance. If the gene expression level of the joint destruction-related factor is lower than the gene expression level of the joint destruction-related factor in the absence of the test substance, the test substance It can be determined that it has an inhibitory action.
  • the method for detecting the inhibitory action of the test substance on the proliferation of the synovial fibroblasts can also be appropriately selected according to the purpose from known methods without particular limitations.
  • the culture can be performed in the presence of the test substance.
  • the degree of cell cycle progression from GOZG1 phase to S phase, 3 ⁇ 4-thymidine uptake, flow cytometry, etc. The method of examining by is mentioned.
  • the test substance when detection of the inhibitory effect of the test substance on the proliferation of the synovial fibroblasts is performed by the flow cytometry, specifically, in the presence of the test substance, after the S phase ( If the proportion of cells (including G2 and M2) is low relative to the same proportion in the absence of the test substance, the test substance has an inhibitory effect on the proliferation of synovial fibroblasts. Can be determined.
  • the present inventors have found that various life phenomena that induce joint destruction in rheumatoid arthritis are directly controlled by the action of cyclin-dependent kinases. We found the possibility that the phenomenon is controlled through various routes. Among others, the present inventors have shown that MMP-3 mRNA expression and synovial fibroblast proliferation are controlled by CDK through different pathways, as shown in Examples described later. I found the possibility.
  • CDK has a function of forming a complex with cyclin and phosphorylating the retinoblastoma gene product (Rb).
  • Rb retinoblastoma gene product
  • CDKI cyclin-dependent kinase inhibitor
  • MMP-3 mRNA is regulated by CDK through a pathway other than the pathway known through Rb, which is a conventionally known substrate for CDK. Since this pathway does not involve Rb, it is considered that only the expression level of MMP-3 can be reduced without suppressing the progression of the cell cycle in which Rb inactivation plays an important role.
  • step (b) in the evaluation method of the present invention is apparent from the above-described examples of MMP-3 expression and synovial fibroblast proliferation. As such, each can have independence. Therefore, in the step (b) in the evaluation method of the present invention, a plurality of life phenomena that induce destruction of joint tissue may be detected in combination as long as the essence of the technique is not violated.
  • the test substance when both MMP-3 expression and synovial fibroblast proliferation are detected, the test substance has an inhibitory effect on MMP-3 mRNA expression and synovial fibroblast proliferation. If the test results show that they do not have an inhibitory action, such a test substance can be expected to suppress joint destruction without suppressing cell proliferation. Therefore, it can be evaluated as a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis, which has a low risk of side effects and is highly safe if it suppresses even normal cell growth.
  • Such candidate substances are expected to be useful, for example, for the treatment of rheumatoid arthritis patients who are at high risk of causing side effects.
  • test substance when the test substance has an inhibitory effect on both MMP-3 mRNA expression and synovial fibroblast proliferation, such test substance has an excessive growth of synovial fibroblasts. It can be evaluated as a candidate for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis, which has a strong effect on induced joint destruction.
  • it is significant to examine the gene expression of MMP-3 when detecting the inhibitory action of a test substance on a vital phenomenon that induces destruction of cartilage tissue.
  • it is useful to examine the expression of MMP-3 mRNA, and it is also significant to examine the presence or absence of inhibition of synovial fibroblast proliferation together with the expression of MMP-3 mRNA.
  • the destruction of bone tissue in rheumatoid arthritis can be caused, for example, through a mechanism similar to that of cartilage tissue described above. That is, inflammatory cells such as lymphocytes and macrophages infiltrate in synovial tissues of joints where rheumatoid arthritis has progressed, and produce various inflammatory site forces. These inflammatory site forces activate the synovial fibroblasts that form synovial tissue and proliferate excessively. This abnormally proliferated synovial fibroblast force By forming a proliferative granulomatous synovial tissue called pannus, the bones of the affected joints are destroyed as well as the cartilage.
  • inflammatory cells such as lymphocytes and macrophages infiltrate in synovial tissues of joints where rheumatoid arthritis has progressed, and produce various inflammatory site forces. These inflammatory site forces activate the synovial fibroblasts that form synovial tissue and proliferate excessively. This abnormally proliferated synovial fibroblast force
  • osteoclast precursors such as bone marrow cells are excessively induced to differentiate into osteoclasts by the action of the osteoclast differentiation inducer (RANKL) produced by these abnormally grown synovial fibroblasts. .
  • RTKL osteoclast differentiation inducer
  • NFATcl activated T cell nuclear factor cl
  • osteoclast-specific factors include osteoclast-associated receptor (OSCAR) (SEQ ID NO: 39 to SEQ ID NO: 50, the same applies hereinafter), tartrate-resistant acid phosphatase.
  • the life phenomenon that induces destruction of the bone tissue is not particularly limited.
  • osteoclast precursors such as bone marrow cells.
  • Osteoclast precursor cells refer to all cells that can be differentiated into osteoclasts, and include bone marrow cells.
  • Method for detecting inhibitory action of test substance on gene expression of osteoclast-related factor As a method for detecting the inhibitory action of test substance on gene expression of osteoclast-related factor such as NFATcl, OSCAR, TRAP described above, etc.
  • it can be appropriately selected from publicly known methods with no restrictions according to the purpose.
  • various PCR methods stocufactuation PCR method, quantitative PCR method, real-time PCR method, etc.
  • Northern blot method examples include osteoclast precursor cells cultured in the presence of the test substance or methods for detecting the gene expression level of each factor in osteoclasts using in situ hybridization method, ELISA method, Western blot method, etc. .
  • the test substance When detecting the inhibitory effect of the test substance on the gene expression of the osteoclast-related factor by detecting the gene expression level, specifically, the osteoclast-related factor in the presence of the test substance is detected.
  • the gene expression level is lower than the gene expression level of the osteoclast-related factor in the absence of the test substance, the test substance suppresses the gene expression of the selected osteoclast-related factor. It can be determined that it has an action.
  • Method for detecting inhibitory action of test substance on proliferation of bone marrow cells is not particularly limited. It can be selected appropriately from known methods according to the purpose. For example, using Cell Counting Kit-8 (Cell Counting Kit 8; Dojin Chemical) using WST-8, For example, a method of measuring the number of bone marrow cells cultured in the presence thereof can be mentioned.
  • Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit 8; Dojin Chemical
  • the inhibitory effect of the test substance on the proliferation of the bone marrow cells is measured Specifically, when the number of bone marrow cells in the presence of the test substance is smaller than the number of bone marrow cells in the absence of the test substance, On the other hand, it can be determined that it has an inhibitory action.
  • the method for detecting the inhibitory action of the test substance on the differentiation from osteoclast precursor cells to osteoclasts can be appropriately selected according to the purpose from known methods without particular limitations. After culturing bone marrow cells in the presence of the test substance and further inducing differentiation into osteoclasts by adding an osteoclast differentiation-inducing factor, use a TRAP staining kit (Cell Garage) to And a method of measuring the number of cells differentiated into bone cells.
  • Cell Garage TRAP staining kit
  • the inhibitory effect of the test substance on the differentiation from osteoclast precursor cells to osteoclasts is assayed by measuring the number of cells differentiated into osteoclasts, specifically, the presence of the test substance When the number of osteoclasts below is less than the number of osteoclasts in the absence of the test substance, the test substance has an inhibitory effect on the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts. It can be determined that
  • the detection of the osteoclast-related factor gene expression (mRNA expression and Z or Among these, it is more preferable to examine gene expression of the NFATcl factor, which is a master molecule for differentiation from osteoclast precursor cells to osteoclasts.
  • the present inventors have found that, similarly to the case of the cartilage tissue, various life phenomena may be controlled by the CDK through different pathways. Among others, as shown in Examples described later, the present inventors have different pathways for the proliferation of bone marrow cells (osteoclast precursor cells) and the gene expression of osteoclast-related factors such as NFATcl. I found the possibility of being controlled.
  • test substance when a test substance has an inhibitory action on the gene expression of osteoclast-related factor and does not have an inhibitory action on bone marrow cell (osteoclast progenitor cell) proliferation, Since a test substance can be expected to suppress joint destruction without suppressing cell growth, it may inhibit normal cell growth! /, With less risk of side effects and safety It can be evaluated as a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis. Such candidate substances are expected to be useful, for example, for the treatment of rheumatoid arthritis patients who are at high risk of causing side effects.
  • test substance may cause excessive cell proliferation. It can also be evaluated as a candidate for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis, which has a strong effect on joint destruction caused by.
  • NFATcl the master molecule for differentiation from osteoclast precursors to osteoclasts.
  • the presence of an inhibitory effect on osteoclast precursor cell proliferation is detected. It is also preferable.
  • osteoclast-related factors and differentiation of osteoclast precursor cell force into osteoclasts are closely related events. Therefore, when detecting the inhibitory effect of the test substance on the life phenomenon that induces bone destruction, it is also useful to examine the distribution of osteoclast precursor cells to osteoclasts. In addition to osteoclast differentiation, it is also significant to examine the presence or absence of an inhibitory effect on osteoclast precursor cell proliferation.
  • step (b) only one of the methods for detecting the inhibitory action of the test substance on the life phenomenon that induces the destruction of joint tissue as described above may be performed. 2 types or more May be performed. When two or more detection methods are used, it is not always necessary for all selected detection methods to result in the inhibitory action of the test substance. If the test substance has an inhibitory action, it can be determined that the test substance has an inhibitory action on a life phenomenon that induces destruction of joint tissue. By appropriately selecting a combination of detection methods and results, the anti-rheumatoid arthritis activity of the test substance can be evaluated from various viewpoints.
  • test substance is determined to have the ability to bind to a cyclin-dependent kinase in the step (a), and the inhibitory action on the life phenomenon that induces the destruction of joint tissue in the step (b).
  • the test substance is evaluated as having anti-rheumatoid arthritis activity.
  • step (a) and the step (b) may be performed first or simultaneously.
  • the method for screening a substance having anti-rheumatoid arthritis activity comprises:
  • Step (A) includes a step of selecting a test substance evaluated to have anti-rheumatoid arthritis activity, and further includes other steps as necessary.
  • the step (A) is a step of performing the evaluation method, and can be performed in the same manner as the steps (a) and (b).
  • the step (B) is a step of selecting a test substance that has been evaluated to have anti-rheumatoid arthritis activity in the step (A).
  • the test substance selected here is a substance having anti-rheumatoid arthritis activity, and can be said to be a candidate substance for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis (hereinafter sometimes referred to as candidate substance).
  • candidate substance can be expected to have a therapeutic or preventive effect on rheumatoid arthritis, particularly joint destruction in rheumatoid arthritis.
  • test substance Selected by the screening method and evaluated to have anti-rheumatoid arthritis activity Whether or not the test substance (candidate substance) is actually effective for the treatment or prevention of rheumatoid arthritis can be confirmed, for example, by an administration experiment of the candidate substance to a rheumatoid arthritis model animal.
  • Examples of the rheumatoid arthritis model animal include collagen-induced arthritis mice (Chondrex), collagen-induced arthritis rats (Chondrex), and adjuvant arthritis rats.
  • the adjuvant arthritic rat is, for example, immunized in the ridge skin by suspending Lewis foot of 8 weeks old [l, M mg of butyricum (Difco Laboratories, Detroit, Micnigan) in 100 L mineral oil. Can be obtained.
  • an animal that can be a candidate for application of a candidate for a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis selected by the screening method there is no particular limitation as long as it is an animal that may be affected by rheumatoid arthritis. Examples include humans, dogs, cats, horses, bushes, hidges, pigs and mice.
  • the substance having anti-rheumatoid arthritis activity having anti-rheumatoid arthritis activity
  • an excellent rheumatoid arthritis therapeutic or preventive drug candidate substance capable of treating or preventing joint destruction in rheumatoid arthritis can be efficiently selected.
  • an excellent rheumatoid arthritis drug or prophylactic drug candidate having a desired balance of effects can be efficiently selected.
  • the desired balance between the suppression of abnormal cell growth in the joint and the suppression of production of factors related to joint destruction (including joint destruction-related factors, osteoclast-related factors, etc.)
  • factors related to joint destruction including joint destruction-related factors, osteoclast-related factors, etc.
  • excellent candidate drugs for rheumatoid arthritis or preventive drugs That is, for example, it is possible to select a substance with a low risk of side effects that can suppress only the production of factors related to joint destruction without inhibiting normal cell growth. of It is also possible to select a substance that can be expected to have a strong effect and can suppress both abnormal growth and production of factors related to joint destruction.
  • the evaluation method or screening method is useful in various scenes related to the treatment or prevention of rheumatoid arthritis. For example, it is particularly useful in the following applications (1) to (4). It is believed that there is.
  • the anti-rheumatoid arthritis activity of a newly developed therapeutic or preventive for rheumatoid arthritis can be efficiently evaluated.
  • a substance that can be used as a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis can be efficiently selected from known CDK inhibitors and drugs for other diseases.
  • a therapeutic or prophylactic drug having a desired effect can be appropriately selected according to the patient's symptoms.
  • the existing therapeutic or preventive agent for rheumatoid arthritis can be improved to efficiently obtain a therapeutic agent or prophylactic agent having a desired effect, such as a therapeutic agent or a preventive agent with fewer side effects.
  • rheumatoid arthritis For the cure of rheumatoid arthritis, it is considered effective to efficiently suppress both aspects of joint destruction and inflammation caused by the progression of rheumatoid arthritis. According to the evaluation method or screening method, a substance having anti-rheumatoid arthritis activity, particularly an excellent rheumatoid arthritis therapeutic or preventive drug capable of treating or preventing joint destruction can be obtained. In combination with existing inflammatory therapies, the development of radical treatment methods for rheumatoid arthritis can be expected.
  • pl6 INK4a (Example 1)
  • ⁇ 21 ⁇ 1 (Example 2)
  • pl8 INK4e (Example 3)
  • CDK4I selected as Example 4 is a synthetic compound that is a CDK4Z6 inhibitor that specifically inhibits CDK4 and CDK6, 2 bromo 12, 13 dihydro-5H-indolo [2,3-1] 3, 4—c] carbazole-5,7 (6H) —dione (2-bromo-12,13-dihydro-5H-indolo [2,3-l] pyrrolo [3,4—c] carbazole— 5, 7 ( 6H) —dione).
  • Pl8 dish 4c is a type of cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI), which is a group of intracellular proteins that inhibit the kinase activity of cyclin-dependent kinases.
  • CDKI cyclin-dependent kinase inhibitor
  • pl6 INK4a and PL8 INK4c are known to specifically inhibit CDK4 and CDK6, ⁇ 21 ⁇ 1 is known to inhibit all CDK.
  • Rb retinoblastoma gene product selected in Example 5 is known as a main substrate of CDK4 and CDK6.
  • Rb retinoblastoma gene product
  • the inhibitory effect on the cell proliferation of each test substance was evaluated as follows.
  • Synovial fibroblasts were isolated from the obtained human chorionic and congestive synovial tissue specimens and cultured by the method described in Tanigu chi et al .; Nat Med. L999; 5: 760-767. These were used in early passages (3-9 passages). [0063] Infection of test substance-introduced adenovirus
  • p 16 dishes 4 a (Example D, p21 eipl (Example 2), pl8 INK4e (Example 3), and active Rb (Example 5) should be converted to RSF using adenovirus. Introduced.
  • adenoviruses containing each test substance gene were purchased or prepared; adenoviruses containing human pl6 INK4a gene (AxCApl6) (see Terada et al .; J Am Soc Nephrol. 1997; 8: 51-60) Adenovirus containing human pl8 INK4c gene (Ad—RGD—pl8) (Blais et al .; Biochem Biophys Res Commun. 1998; 247: 146—153, Mizuguchi3 ⁇ 4tJ ⁇ Kay; Hum Gene Ther.1999; 10: 2013—2017, , Mizuguchl3 ⁇ 4tJ3 ⁇ 4: ay; Hum Gene Ther.
  • adenovirus containing human ⁇ 21 ⁇ 1 gene (AxCAp21) (Terada et al .; J Am Soc Nephrol. 1997; 8: 51-60), Non-phosphate type, adenovirus containing human Rb gene encoding constitutively active form (Ad—Rb) (Chang et al .; Science. 1995; 267: 518-522 and Terao et al .; Hepatology. 1998; see 28: 605-612;).
  • Ad-LacZ adenovirus containing a j8 galactosidase gene was prepared (see Chang et al .; Science. 1995; 267: 518-522 and Terao et al .; Hepatology. 1998; 28: 605-612).
  • control adenovirus Axlwl National Institute of Physical and Chemical Research, Tsukuba Research Institute, Neuroresource Center, Tsukuba, Japan
  • control console Ad5-RGD (Mizuguchi et al .; Gene Ther. 2001; 8: 730—Refer to 735).
  • RSF synovial fibroblasts
  • CDK4I (Example 4) was allowed to act on RSF by adding it to the culture medium.
  • CDK4I (2 bromo-12, 13 dihydro-5H-indolo [2, 3— 1] pyro [3, 4— c] force rubazole—5, 7 (6H) —dione)
  • DMSO 0.5%
  • RSF cell proliferation was assessed by thymidine incorporation.
  • adenovirus-infected RSF was seeded on microtiter wells with 8,000 cells Z-well and supplemented with 10% urchin fetal serum (FBS), IL-1 j8, TNFa, and indomethacin.
  • FBS urchin fetal serum
  • IL-1 j8, TNFa IL-1 j8, TNFa
  • indomethacin C. Cultured in DME M medium for 36 hours. In the last 24 hours of culture, 3 H-thymidine (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) was present and the incorporated radioactivity was counted. The relative viable cell count was measured by Cell Counting Kit-8 (Dojindo).
  • IL-1R1 interleukin 1 receptor
  • MMP matrix 'meta-oral proteinase
  • MMP-3 mRNA-specific primer see Elshaw et al .; Br J Pharmacol. 2004; 142: 1318-1324
  • MCP monocyte chemotactic protein
  • GPDH monocyte chemotactic protein
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)—
  • adenovirus-infected RSF was cultured for 60 hours and seeded in microwells at 1.0 0 5 cells / 1! 11 ⁇ . Twelve hours after seeding, the culture supernatant was replaced with fresh DMEM medium containing IL-1 j8, TNFa, indomethacin, and 10% FBS. After 24 hours of culture, the culture supernatant was collected.
  • MCP-1 Biosource International, Maliguchi, California
  • IL-6 Biosource International
  • MIP macrophage inflammatory protein
  • MIP macrophage inflammatory protein
  • JNK 1-3 was immunoprecipitated using mouse 3 ⁇ 4 [NK monoclonal antibody (Ab) (sc-7345; Santa Cruz Biotech) (see Patel et al .; J Cell Sci 1998; 111: 2247-2255) .
  • Cipl polyclonal antibodies sc-468, sc-9965, sc-387; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA
  • Western'plot Used as primary antibody in prayer.
  • Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG polyclonal antibody NA-934; Amersham Biosciences
  • anti-mouse IgG polyclonal antibody 6175-05; Southern Biotec, Birmingham, AL
  • Nuclear extracts were prepared using Nuclear Extract kit (Active Motif, Carlsbad, Calif.) To measure transcription factors and JNK activity in RSF. To quantify the DNA binding activity of AP-1 and NF- ⁇ transcription factors, AP-l / c-Jun, NF- ⁇ / ⁇ 50, and ⁇ 65 transcription factor assembly kits (Trans AM; Transcription Factor Assay kits) ( Active Motif) was used.
  • Nuclear Extract kit Active Motif
  • RSF derived from joints of patients suffering from rheumatoid arthritis was cultured in vitro by the method described above.
  • endogenous pl6 INK4a In the RSF sample, it was also expressed! /, !, indicating that it was! /, (Data not shown).
  • Cultured RSF samples were infected with AxCAp 16 adenovirus introduced with the human P 16 1 NK4a gene or with control Axlwl adenovirus without the transgene. When the transgene expression level was the highest, cell proliferation and cell cycle progression were verified by 3 ⁇ 4-labeled thymidine incorporation and flow cytometry.
  • FIG. 1A and FIG. 1B will be specifically described below.
  • FIG. 1A and FIG. 1B show that p16 INK4a gene transfer inhibited RSF proliferation and induced cell cycle arrest in GOZG1 phase.
  • Fig. 1A shows RSF infected with an adenovirus carrying the pl6 INK4a gene (pl6 INK4a , black column) or a control adenovirus (control, white column) as described above.
  • 1 shows results of stimulation with ⁇ and tumor necrosis factor (TNF) a.
  • TNF tumor necrosis factor
  • FIG. 1B shows the results of flow 'cytometry analysis. Compared to control cells (control), the pl6 INK4a expression RSF (p l6 INK4a), was shown to increase cell cycle GOZG1 phase stop. The representative results for one of the three samples are shown.
  • pl6 INK4a When pl6 INK4a is expressed or expressed, it stimulates RSF into the site force, and the protein expression of MMP-3, MCP-1, ⁇ -3 ⁇ and IL-6 was verified by specific ELISA. It was. MMP-3, MCP-1, MIP-3 ⁇ and IL-6 are members of inflammatory mediators (joint destruction-related factors) that are known to be down-regulated by p21 Cipl gene transfer. (See Nonomura et al .; J Immunol. 2003; 171: 4913-4919). Both MMP-3 and MCP-1 production in the culture supernatant were suppressed by the expression of pl6 INK4a , but IL 6 and MIP-3 ⁇ production were not affected (see Figure 1C and Figure 1D). See). The production of these inflammatory mediators (joint destruction-related factors) Luz infection alone was not promoted (data not shown).
  • FIG. 1C and FIG. 1D will be specifically described below.
  • Fig. 1C and Fig. 1D show that pl6 INK4a gene transfer did not suppress the production of IL-6 and macrophage inflammatory protein (MIP) -3 ⁇ by suppressing the production of MMP-3 and MCP-1 proteins by RSF
  • FIG. RSF infected with pl6 INK4a adenovirus (pl6 INK4a , black column) or control adenovirus (control, white column) was stimulated for 24 hours with a combination of IL-1 j8 and TNFa.
  • MMP-3, MCP-1, ⁇ -3 ⁇ , and IL6 protein expression in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • MMP-3 production is regulated at the mRNA level by the action of CDK, but MCP-1 production is not regulated at the mRNA level.
  • FIG. 1E and FIG. 1F show MMP-3mRN A level is the force down-regulated by 16 dishes 43 and 01/011 (see below, Example 4) .MCP-lmRNA levels are not down-regulated, and both are activated by Rb (see below, Example 5). It is a figure which shows having worked without being influenced.
  • RSF was infected with pl6 INK4a (pl 6 INK4a , black column), Rb (Rb, black column), or control (control, white column) adenovirus.
  • RSF was treated with CDK4I (CDK4I, black column) or DMSO medium control (DMSO, white column) at a concentration of 1 ⁇ ⁇ .
  • RSFs were stimulated with IL-l j8 and TNFa as described above.
  • MMP-3 and MCP-1 mRNA were quantified by real-time PCR. These mRNA expression levels are shown in comparison with GAPDH. Columns and bars represent mean and standard deviation (SD), respectively. A representative result of 1 sample out of 2 was shown.
  • FIG. 1G shows that p21eipl does not down-regulate IL-lRlmRNA expression.
  • Pl6 INK4a does not down-regulate IL-lRlmRNA expression.
  • the mRNA expression of aldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) was verified by Northern blot analysis.
  • the present inventors and other groups have shown that it binds to ⁇ 21 ⁇ 1 ⁇ NK and decreases JNK enzyme activity (Nonomura et al .; J Immunol. 2003; 171: 4913-4). 919, Shim et al .; Nature. 1996; 381: 804-806 and Perlman et al .; J Immunol. 2003; 170: 838—845). Furthermore, the present inventors have further shown that p21 Cipl- expressing RSF has a decreased DNA binding activity of AP-1, and that AP-1 ⁇ exists downstream of the NK pathway. (See Nonomura et al .; J Immunol. 2003; 171: 4913-4919). Based on this, the binding activity to p16 INK4a ⁇ JNK was verified by immunoprecipitation of JNK. Moreover, the binding activity with p21 Cipl ⁇ JNK was confirmed.
  • Lysates of AxCAp 16 adenovirus infected RSF cells containing human p 16 INK4a gene or AxCAp21 adenovirus infected RSF cells containing human p2 l Cipl gene were immunoprecipitated using anti-16 ⁇ or anti- ⁇ 21 ⁇ 1 antibody. Subsequent immunoblotting revealed that ⁇ 21 ⁇ 1 binds to JNK but not pl6 INK4a (Fig. 1 ⁇ ). Unlike ⁇ 21 ⁇ 1 , ⁇ ⁇ 1 NK4a did not inhibit the DNA binding activity of AP-1 and NF- ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in RSF stimulated with site force for 30 minutes (data not shown). These data indicate that pi 6 INK4a does not rely on JNK pathway suppression or IL 1 R1 expression suppression to inhibit the production of inflammatory mediators.
  • FIG. 1H will be specifically described below.
  • Figure 1H shows ⁇ 21 ⁇ 1 is c Jun N-terminal kinase
  • p l6 INK4a or p l8 INK4e- expressing whole extract of RSF cells is immunoprecipitated with ⁇ antibody (Ab) -JNK) or control IgG (igG), and each CDKI specific antibody (anti-pl6 INK4a (a-p l6 ), Anti- p8 INK4c Ab (a-p8), anti-p21Cipl antibody p21)) and analyzed by Western 'plot. Shown are representative Western blot results for two separate samples.
  • pl8 INK4e was analyzed for binding to JNK in the same manner as in Examples 1 and 2, it did not bind to JNK in the same manner as ⁇ 1 NK4a (FIG. 1H).
  • FIGS. 2A to 2C will be described in detail.
  • FIGS. 2A and 2B show that pl8 INK4e gene transfer suppressed RSF growth and resulted in cell cycle arrest in the GOZG1 phase.
  • Figure 2A shows that RSF infected with adenovirus carrying pl8 INK4e gene (pl8 INK4c , black !, column) or control 'adenovirus (control, white column) was stimulated with IL-118 and TNFa , —The results of an evaluation of thymidine incorporation are shown. A representative result of 1 sample out of 3 was shown. Columns and bars represent the mean and standard deviation (SD) of 5 wells, respectively. The average reduction rate of 3 H-thymidine incorporation by pl8 INK4e was 43% (* * P 0. 01).
  • Fig. 2B shows the increase in GO / G1 phase cells by pl8 INK4e by cell cycle flow cytometry analysis. The representative results of 3 samples are shown.
  • FIG. 2C shows that pl8 INK4e gene transfer suppressed MMP-3 and MCP-1 protein production by RSF.
  • RSF infected with pl8 INK4e adenovirus pl8 INK4e , black column
  • Adenovirus control, white column
  • MMP-3 and MCP-1 in the culture supernatant were measured by ELISA.
  • the column and bar represent the mean and standard deviation (SD) of the three samples, respectively.
  • SD standard deviation
  • CDK4I As in Example 1, the effect of CDK4I on the expression level of MMP-3 and MCP-1 mRNA was examined. Like pl6 TM K4a , CDK4I decreased MMP-3 mRNA in RSF. However, MCP-lmRNA was not reduced (Fig. 1E and Fig. 1F).
  • FIG. 3A and 3B show that CDK4I inhibits RSF proliferation by inducing cell cycle arrest in the GOZG1 phase.
  • RSF was treated with an inhibitory concentration of CDK4Z6 specific inhibitor CDK4I for 12 hours and then stimulated with IL-1 ⁇ and TNFa.
  • FIG. 3A shows 3 H-labeled thymidine incorporation by treated RSF compared to untreated RSF.
  • FIG. 3B shows an increase in GOZG1 phase in cells treated with CDK4I at a concentration of 1 ⁇ M (CDK4I) compared to medium control (DMSO) in flow cytometry analysis. Two independent experiments are represented.
  • FIG. 3C shows that CDK4I inhibited MMP-3 and MCP-1 protein production by RSF.
  • RSF treated with 1 ⁇ CDK4I CDK4I, black column
  • control 0.5% DMSO medium control 0.5% DMSO medium
  • MMP-3 or MCP-1 in the culture supernatant was measured by ELISA. Columns and bars represent the mean and standard deviation (SD) of 5 samples, respectively.
  • SD standard deviation
  • ELISA analysis in the cell supernatant showed decreased protein production of both MMP-3 and MCP-1 in RSF expressing active Rb (FIG. 4C).
  • Real-time PCR analysis revealed that MMP-3 and MCP-lmRNA were maintained in active Rb-overexpressing RSF compared to control RSF (Fig. 1E and Fig. 1F). These results indicate that the transcriptional regulation of MM P-3 is Rb-independent.
  • FIGS. 4A to 4C will be described in detail.
  • FIG. 4A and FIG. 4B are diagrams showing that constitutively active Rb gene introduction suppressed the growth of RSF. Stimulate RSF infected with non-phosphate Rb-encoding adenovirus (Rb, black column) or control adenovirus (control, white, column) with IL-1 j8 and TNF o; Thymidine incorporation was evaluated.
  • Figure 4A is an evaluation result of the 3 H- thymidine incorporation. A representative result of 1 sample out of 2 samples is shown. Columns and bars represent the average of 5 wells and SD.
  • FIG. 4B shows an increase in the cell cycle GOZG1 phase in constitutively active Rb-expressing RSF in flow cytometry analysis. Two independent specimens were represented.
  • FIG. 4C shows that constitutively active Rb suppressed MMP-3 and MCP-1 protein production by RSF.
  • RSF infected with constitutively active Rb adenovirus (Rb, black column) or control adenovirus (control, white column) was stimulated for 24 hours with a combination of IL-1 ⁇ and TNFa.
  • MMP-3 and MCP-1 in the culture supernatant were measured by ELISA. Production of these molecules by stimulated RSF was shown relative to control RSF infected with control 'adenovirus. Column and bar are Each represents the mean and standard deviation (SD) of three samples.
  • SD standard deviation
  • p1 6 INK4a selected as a test substance according to Examples 1 to 5 Pl8 INK4e , CDK4I, and active Rb could each be evaluated as having anti-rheumatoid activity.
  • each test substance is related to joint destruction-related factors through various routes, and each has its own inhibitory effect on rheumatoid arthritis. The possibility was shown.
  • CDK4I CDK4 inhibitor; manufactured by Merck
  • CDK4 inhibitor CDK4 inhibitor; manufactured by Merck
  • the anti-rheumatoid arthritis activity of CDK4I was evaluated as follows from the viewpoint of an inhibitory action on a life phenomenon that induces destruction of bone tissue.
  • BMM bone marrow Z macrophage lineage cells
  • BMM is cultured in oc-MEM medium containing 20ngZml M—CSF and lOOngZml osteoclast differentiation inducing factor (RANKL: soluble receptor activator of NF— ⁇ ligand; peprotech), and osteoclasts (OC: Osteocla st) Differentiated.
  • RTKL soluble receptor activator of NF— ⁇ ligand; peprotech
  • OC osteoclasts
  • TRAP + MNC tartrate-resistant acid pnosphatase— positive multinucleated cells ( ⁇ d nuclei ⁇ cells)
  • RAW264.7 cells obtained from ATCC (1 x 10 3 cells Zwell; 96well plates), as in the case of BM, CDK4K 1 ⁇ ) in the presence or absence of RANKL ( 100 ⁇ gZml) and 5 days later, TRAP + MNC was counted.
  • BM bone marrow cells
  • M-CSF M-CSF
  • RANKL was added to the BMM, and total RNA was extracted from the cells 3 days later using the RNeasy Mini kit (Qiagen). 1 ⁇ g of total RNA was synthesized into cDNA using an Omniscript RT kit (HOminiscript RT kit; Qiagen). Quantitative PCR using Sybr Green, activated T cell nuclear factor cl (NFATcl: nuclear factor of activated T cells cl), osteoclast associated receptor (OSCAR: o steoclast-associated receptor) Each gene expression of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) was analyzed with a real-time PCR device ABI7900 (manufactured by Applied Biosystems) using GAPDH as an endogenous controller. Each gene expression was evaluated with a BM expression of 1.
  • CDK4 I when differentiation was induced from BMM to OC in the presence of M-CSF and RANKL was analyzed.
  • CDK4I markedly suppressed OC differentiation compared to control (DMSO) (FIGS. 5A and 5B).
  • CDK4I does not affect the action of M-CSF, but inhibits the action of RANKL. It was suggested that the OC component was suppressed. RANKL is known to induce the expression of NFATcl, a gene essential for osteoclast differentiation.
  • NFATcl a gene essential for osteoclast differentiation.
  • FIG. 8A When NFATcl mRNA expression was examined by quantitative PCR, CDK4I markedly suppressed NFATcl expression (FIG. 8A).
  • OSCAR and TRAP mRNA expression induced by NFATcl was also remarkably suppressed (FIGS. 8B and 8C). This suggests that CDK4I inhibits OC differentiation by inhibiting NFATcl expression.
  • CDK4I selected as a test substance according to Example 6 could be evaluated as having anti-rheumatoid arthritis activity.
  • CDK4Z6 activity in normal cells was controlled by the amount of cyclin D. Cyclone D gene transfer alone did not accelerate RSF cell cycle progression (data not shown). In order to promote the function of cyclin D, which binds to nuclear CDK4, it was moved into the nucleus by adding a minigene encoding a nuclear localization signal to the product of the cyclin D1 transgene (Tamamori-Adachi et al .; Biochem Biophys Res Commun. 2002; 296: 274-280).
  • CDK4Z6 kinase activity is also increased by co-introduction of cyclin D1 and CDK4.
  • the effect of RSF on the production of inflammatory mediators by RSF was examined. Due to the limited titer of the prepared adenovirus, only MMP-3 ELISA was performed on the culture supernatant. When stimulated with RSF overexpressing cyclin Dl-NLS and CDK4, more MMP-3 was produced than when stimulated with control 'virus-infected RSF ( Figure 9C). Therefore, MMP-3 expression level was directly correlated with CDK4 activity. Increased CDK4 activity has been shown to upregulate cell proliferation and MMP-3 expression in RSF.
  • FIGS. 9A to 9C will be described in detail.
  • FIG. 9A and FIG. 9B show that simultaneous gene transfer of cyclin D1-NLS and CDK4 enhanced RSF proliferation.
  • Adenoviruses encoding cyclins D1 and CDK4 with NLS (D1 + CDK4, black column) or control 'adenoviruses (control, white column) were infected with RSF.
  • the results of 3 H-thymidine incorporation are shown in FIG. 9A. Columns and bars represent mean and standard deviation (SD), respectively. The average rate of increase was 240%. The difference was statistically significant (* P ⁇ 0.01).
  • the results of flow cytometry analysis of the cell cycle are shown in FIG. 9B.
  • adenovirus-infected RSF control
  • RSF (D1 + CDK4) into which cyclin D1-NLS and CDK4 genes were introduced showed a decrease in GOZG1 phase cells. Two independent specimens
  • FIG. 9C is a diagram showing that MMP-3 protein production by cyclin D1-NLS and CDK4 gene transfer ability RSF was up-regulated.
  • MMP-3 in the culture supernatants of cytalin D1 and CDK4 (D1 + CDK4, black column) expressing RSF with NLS and control RSF (control panel, white column) was measured by ELISA.
  • the columns and bars show the mean and standard deviation (SD) of the three samples compared to the control RSF, respectively.
  • SD standard deviation
  • FIG. 10 shows rheumatoid arthritis synovial fibroblasts in Examples 1 to 5 and Reference Example.
  • CDK4Z6 kinase activity controls MMP-3 production in an Rb-independent manner.
  • This control is at the mRNA level.
  • Rb the substrate of CDK4Z6, can regulate MCP-1 expression at the post-transcriptional level, as in MMP-3, but CDK4Z6 activity acts upstream of this (Fig. 10).
  • the only known substrate of CDK4Z6 is Rb, which regulates the functional availability of E2F transcription factors for cell cycle progression.
  • the results of this example predict the presence of a binding molecule to CDK4Z6 other than Rb that regulates the production of MMP-3 mRNA.
  • mRNA expression of tissue degrading enzymes other than MMP-3 mRNA is also regulated in the same way, and is highly likely to occur!
  • inflammatory mediators that are down-regulated by inhibition of CDK4Z6 play an important role in rheumatoid inflammation. Nevertheless, pl6 INK4a did not completely abolish MMP-3 and MCP-1 production. P- 16INK4a- expressed RSF stimulated with IL-1 ⁇ and TNFa produces more inflammatory mediators than unstimulated RSF. The present inventors speculate that the anti-inflammatory action by CDK4Z6 inhibition may help the CDKI growth-suppressing action in CDKI gene therapy.
  • pl6 TM K4a interacts with NF- ⁇ B and inhibits its transcription (see Wolff and Naumann; Oncogene ⁇ 1999; 18: 2663-2666).
  • Our preliminary study suggests that pl6 INK4a of RSF can regulate other site force-in expression independently of CDK4Z6.
  • the present inventors have found that the pF6 INK4a overexpression ability AP-1 and NF- ⁇ B DNA binding activity in RSF is not suppressed (data not shown).
  • Ets-1 and Ets-2 which are Ets family transcription factors, up-regulate MMP-3 expression, and their repression may be a major cause of down-regulation of MMP-3 expression (Wasylyk et al .; EMBO J, 1991; 10: 1127-1134 and White et al .; Connect Tissue Res, 1997; 36: 321-335;).
  • CDK4I small molecule CDKI compound
  • CDK4I modulation of cyclin-CDK kinase activity with small molecule CDK inhibitors may be more feasible than gene transfer.
  • Many small molecule CDK inhibitors have already been developed and are being studied as antitumor agents (see Senderowicz; Oncogene, 2003; 22: 6609-6620). They will be useful for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • the evaluation method or screening method of the present invention since a substance having anti-rheumatoid arthritis activity can be efficiently selected, it is very useful for searching for a candidate drug for an excellent therapeutic or preventive drug for rheumatoid arthritis. .
  • the evaluation method or screening method is considered to be particularly useful in applications such as the following (1) to (4).
  • the anti-rheumatoid arthritis activity of a newly developed candidate for rheumatoid arthritis can be efficiently evaluated.
  • a substance that can be used as a therapeutic or preventive agent for rheumatoid arthritis can be efficiently selected from known CDK inhibitors and drugs for other diseases.
  • a therapeutic agent or prophylactic agent having a desired effect can be appropriately selected according to the patient's symptoms.

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Abstract

　本発明の目的は、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率的に評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することにある。 　即ち、本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、 （ａ）サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び （ｂ）関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、を含む方法、並びに該方法を利用したスクリーニング方法に関する。

Description

明 細 書
抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法及び評価方法 技術分野
[0001] 本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法、及び、該方法を利用 して、抗関節リウマチ活性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。
背景技術
[0002] 関節リウマチは、その原因は未だ明らかではないが、遺伝因子や、感染、その他の 環境因子などが契機となって、関節の組織に炎症が起こり、関節が腫れて痛む疾患 である。その症状が進行すると、罹患関節の軟骨や硬骨は破壊され、手足の関節の 変形や機能障害を引き起こす。この関節リウマチに罹患した関節の滑膜組織では、リ ンパ球やマクロファージなどの炎症細胞が浸潤し、腫瘍壊死因子 (TNF a )やインタ 一ロイキン (IL) 1、 IL 6などの様々な炎症性サイト力インが大量に産生されて、炎 症が起こる。そして、これらの炎症性サイト力インにより、更に、関節の滑膜組織を形 成する滑膜線維芽細胞 (RSF)が活性化され、過度の増殖が引き起こされる。この異 常増殖した滑膜線維芽細胞により、パンヌスと呼ばれる肉芽腫性滑膜組織が形成さ れ、罹患関節の軟骨や硬骨の破壊が導かれる。また、この異常増殖した滑膜線維芽 細胞により、 MMP— 3などの多くの関節破壊関連因子が産生され、また、破骨細胞 が活性化されて、骨基質の吸収が促進される。これらの様々な事象により、罹患関節 の軟骨及び硬骨の破壊力あたらされる。
[0003] 従来より、関節リウマチ治療薬としては、例えば、メトトレキサート、ブシラミン、金製 剤や、インフリキシマブ、エタネルセプト等のサイト力イン阻害薬などが知られている。 これらの治療薬は、関節リウマチの治療において有効に使用されてきている。
[0004] し力しながら、これらの従来の治療薬は、そのほとんどが関節リウマチにおける炎症 症状の改善を対象としたものであり、効果が充分得られないことも多ぐ対象とした炎 症因子の抑制が他の炎症因子の活性化を促すことにより治療効果が不完全となった り、治療効果が長続きしないなどという欠点も有しており、全ての患者において十分 な、関節リウマチの根治的な治療薬であるとは言 ヽ難 、ものであった。 [0005] そこで、近年、滑膜線維芽細胞の増殖を抑制することによって、関節リウマチにお ける軟骨や硬骨の破壊を治療又は予防する試みがなされている。例えば、サイクリン 依存性キナーゼインヒビター (CDKI)の一種である pl6INK4a又は ρ21αρ1を滑膜組織 に強制発現させ、 CDK4のリン酸ィ匕活性を阻害したところ、滑膜線維芽細胞の増殖 が抑制され、これが関節リウマチ動物モデルの治療に有効であったことが報告されて いる（例えば、非特許文献 1〜3参照)。
ところが、この報告後、サイクリン依存性キナーゼインヒビターがサイクリン依存性キ ナーゼ抑制を介さずに炎症性サイト力インなどを抑制することが報告された (非特許 文献 4)。
このため、抗関節リウマチ活性において、実際は、サイクリン依存性キナーゼの抑 制が有効であるの力、それともサイクリン依存性キナーゼインヒビターによる直接の炎 症抑制作用が有効であるの力が、依然として不明であった。
[0006] 非特許文献 l :Taniguchiら； Nat Med.l999 ; 5 : 760— 767
非特許文献 2： Nasu； J Immunol.2000 ; 165 : 7246 - 7252
非特許文献 3： Nonomura； Int Immunol.2001 ; 13 : 723- 731
非特許文献 4:Nonomuraら; J Immunol. 2003 ; 171 (9) :4913— 4919 発明の開示
[0007] 本発明は、従来の関節リウマチ治療における前記諸問題を解決し、以下の目的を 達成することを課題とする。即ち、本発明は、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率 的に評価する方法、及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中 でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治 療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することを 目的とする。
[0008] 前記課題を解決するため、本発明者らは、関節リウマチにおける関節破壊に着目し 、鋭意検討を重ねた結果、以下のような知見を得た。即ち、抗関節リウマチ活性にお いて、サイクリン依存性キナーゼインヒビターによる直接の炎症抑制作用のみならず 、サイクリン依存性キナーゼの抑制が有効であるという知見である。この知見により、 関節リウマチにおける関節破壊を誘導する様々な生命現象が、サイクリン依存性キナ ーゼの働きによって直接的に制御されて ヽることが明らかとなり、サイクリン依存性キ ナーゼの働きを抑制し、かつ、関節破壊を誘導する生命現象を抑制することのできる 物質を探索することによって、関節リウマチの優れた治療薬又は予防薬となり得る物 質をより効率的にスクリーニングすることが可能となった。
[0009] 更に、関節破壊を誘導する様々な生命現象は、必ずしも同一の経路によらず、そ れぞれが互いに異なる経路を介してサイクリン依存性キナーゼによる制御を受けてお り、このような制御経路の異なりを利用して、関節破壊を誘導する様々な生命現象の うち、所望の生命現象を所望の度合いで抑制することのできる物質を探索することに よって、関節リウマチに対して所望の治療又は予防効果を有する物質をより効率的に スクリーニングし得るという知見である。
例えば、関節破壊を誘導する様々な生命現象の一例として、滑膜線維芽細胞の増 殖や MMP— 3の遺伝子発現などが挙げられる力 これらのうち、 MMP— 3の遺伝子 発現は抑制するが滑膜線維芽細胞の増殖は抑制しないような物質を選択すれば、 関節破壊に対して治療又は予防効果を有する一方で、正常な細胞増殖まで停止さ せてしまうなどの副作用の危険性の少な!/ゝ、安全性の高!、物質を選択することが可 能となる。
一方、 MMP— 3の遺伝子発現及び滑膜線維芽細胞の増殖の双方を抑制するよう な物質を選択すれば、滑膜線維芽細胞の異常増殖が原因となる関節破壊に対して 、より強い治療又は予防効果が期待できる物質を選択することが可能となる。
[0010] 本発明者らは、被験物質が有する、サイクリン依存性キナーゼの働きに対する抑制 作用と、関節破壊を誘導する様々な生命現象に対する抑制作用のバランスとを様々 に検討することによって、所望の治療又は予防効果を有する、優れた関節リウマチ治 療薬又は予防薬の候補物質を、効率的にスクリーニングできる可能性を見出し、本 発明の完成に至った。
[0011] 本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための 手段としては、以下の通りである。即ち、
< 1 > 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び (b)関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する 工程、を含むことを特徴とする方法である。
< 2> サイクリン依存性キナーゼが CDK4及び CDK6の少なくともいずれかである < 1 >に記載の方法である。
< 3 > 関節組織の破壊が軟骨組織の破壊である < 1 >から < 2 >のいずれかに記 載の方法である。
< 4 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である < 3 >に記載の 方法である。
< 5 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞における MMP— 3 の遺伝子発現である < 3 >に記載の方法である。
< 6 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞の増殖であるく 3 >に記載の方法である。
< 7> 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
(b)滑膜線維芽細胞における MMP— 3の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作 用を検出する工程、及び
(c)滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法である。
< 8 > 関節組織の破壊が硬骨組織の破壊である < 1 >から < 2 >のいずれかに記 載の方法である。
< 9 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である < 8 >に記載の 方法である。
< 10 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞における NFATcl の遺伝子発現である < 8 >に記載の方法である。
< 11 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞から破骨細胞への 分ィ匕であるく 8 >に記載の方法である。
く 12 > 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞の増殖であるく 8 > に記載の方法である。 く 13 > 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
(b)破骨前駆細胞における NFATclの遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を 検出する工程、及び
(c)破骨前駆細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法である。
< 14 > 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
(b)破骨前駆細胞の増殖及び破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用を 検出する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
< 15 > 抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法であって、
(A)く 1 >からく 14>のいずれかに記載の方法により、被験物質の抗関節リウマチ 活性を評価する工程、及び
(B)工程 (A)において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択す る工程、を含むことを特徴とする方法である。
[0012] 本発明によれば、前記従来の関節リウマチ治療における諸問題を解決し、前記目 的を達成することができ、被験物質の抗関節リウマチ活性を効率的に評価する方法、 及び、該方法を利用して、抗関節リウマチ活性を有する物質、中でも、関節リウマチ における関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬 の候補物質を、効率的にスクリーニングする方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1A]図 1Aは、 pl6INK4aの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、 —チミジン取り 込みにより調べた結果を示すグラフである。
[図 1B]図 1Bは、 pl6INK4aの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリー により調べた結果を示す表である。
[図 1C]図 1Cは、 pl6INK4aの MMP— 3及び MCP—1タンパク質発現に対する抑制作 用を、 ELISAにより調べた結果を示すグラフである。 [図 ID]図 IDは、 pl6INK4a又は ρ21αρ1の MIP— 3及び IL— 6タンパク質発現に対す る抑制作用を、 ELISAにより調べた結果を示すグラフである。
[図 1E]図 1Eは、 pl6INK4a、 CDK4I、又は活性型 Rbの、 MMP— 3mRNA発現に対 する抑制作用を、 PCRにより調べた結果を示すグラフである。
[図 1F]図 1Fは、 pl6INK4a、 CDK4I、又は活性型 Rbの、 MCP— lmRNA発現に対 する抑制作用を、 PCRにより調べた結果を示すグラフである。
[図 1G]図 1Gは、 pl6INK4a又は ρ21αρ1の、 IL— lRlmRNA発現に対する抑制作用 を、 PCRにより調べた結果を示すグラフである。
[図 1H]図 1Hは、 pl6INK4a、 pl8INK4e又は ρ21αρ1の、 JNKに対する結合を、免疫沈降 及びウェスタンプロットにより調べた結果を示すプロット像である。
[図 2A]図 2Aは、 pl8INK4eの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、 —チミジン取り 込みにより調べた結果を示すグラフである。
圆 2B]図 2Bは、 pl8INK4eの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリー により調べた結果を示す表である。
[図 2C]図 2Cは、 p 18INK4eの MMP— 3及び MCP— 1タンパク質発現に対する抑制作 用を、 ELISAにより調べた結果を示すグラフである。
[図 3A]図 3Aは、 CDK4Iの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、 チミジン取り込 みにより調べた結果を示すグラフである。
[図 3B]図 3Bは、 CDK4Iの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリー により調べた結果を示す表である。
[図 3C]図 3Cは、 CDK4Iの MMP— 3及び MCP— 1タンパク質発現に対する抑制作 用を、 ELISAにより調べた結果を示すグラフである。
[図 4A]図 4Aは、活性型 Rbの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、 ¾—チミジン取り 込みにより調べた結果を示すグラフである。
[図 4B]図 4Bは、活性型 Rbの RSF細胞増殖に対する抑制作用を、フローサイトメトリ 一により調べた結果を示す表である。
[図 4C]図 4Cは、活性型 Rbの MMP— 3及び MCP— 1タンパク質発現に対する抑制 作用を、 ELISAにより調べた結果を示すグラフである。 [図 5A]図 5Aは、 CDK4Iの、骨髄細胞から破骨細胞への分ィ匕に対する抑制作用を、 組織学的に観察した結果を示す図である。
[図 5B]図 5Bは、 CDK4Iの、骨髄細胞から破骨細胞への分ィ匕に対する抑制作用を、 細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
[図 6]図 6は、 CDK4Iの、骨髄細胞から破骨細胞への分化における細胞増殖に対す る抑制作用を、細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
[図 7A]図 7Aは、 CDK4Iの、 RAW264. 7細胞から破骨細胞への分化に対する抑制 作用を、組織学的に観察した結果を示す図である。
[図 7B]図 7Bは、 CDK4Iの、 RAW264. 7細胞から破骨細胞への分化に対する抑制 作用を、細胞数測定により評価した結果を示すグラフである。
[図 8A]図 8Aは、 CDK4Iの NFATclmRNA発現に対する抑制作用を、 PCRにより 調べた結果を示すグラフである。
[図 8B]図 8Bは、 CDK4Iの TRAPmRNA発現に対する抑制作用を、 PCRにより調 ベた結果を示すグラフである。
[図 8C]図 8Cは、 CDK4Iの OSCARmRNA発現に対する抑制作用を、 PCRにより 調べた結果を示すグラフである。
[図 9A]図 9Aは、サイクリン D1及び CDK4を共導入した場合の、 RSF細胞増殖に対 する作用を、 3H -チミジン取り込みにより調べた結果を示すグラフである。
[図 9B]図 9Bは、サイクリン D1及び CDK4を共導入した場合の、 RSF細胞増殖に対 する作用を、フローサイトメトリーにより調べた結果を示す表である。
[図 9C]図 9Cは、サイクリン D1及び CDK4を共導入した場合の、 MMP— 3タンパク 質発現に対する作用を、 ELIS Aにより調べた結果を示すグラフである。
[図 10]図 10は、 CDKを介した関節破壊に関連する生命現象の多様な制御経路の 一部を表す経路図である。
発明を実施するための最良の形態
(評価方法）
本発明の、被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法は、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び (b)関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する 工程、を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
[0015] <被験物質 >
前記被験物質としては、抗関節リウマチ活性の評価対象となり得る物質であれば、 特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、低分子化合物、核 酸、ポリペプチドなどが挙げられる。前記低分子化合物、核酸、ポリペプチドなどは、 天然物から抽出及び精製されたものであってもよぐ人工的に合成されたものであつ てもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液などであつ ても、前記被験物質として使用することができる。本発明では、これらの中でも、前記 被験物質を、関節リウマチの治療薬又は予防薬として適用することを考慮した場合、 前記被験物質は低分子化合物であることが好ましい。前記被験物質としては、新規 な物質に限らず、公知の物質やその改良物であってもよい。例えば、新規な抗関節リ ゥマチ治療薬や予防薬の開発のため、既存の治療薬又は予防薬やその誘導体につ き、本発明の方法により、抗関節リウマチ活性を評価することができる。また、既知の サイクリン依存性キナーゼインヒビター（CDKI)や、それらを改良したものなどを使用 することもできる。ここで、前記 CDKIとは、サイクリン依存性キナーゼのキナーゼ活性 を阻害する細胞内タンパク質群であり、例えば、 CDK4及び Z又は CDK6を特異的 に阻害することが知られている、 pl5INK4b、 pl6INK4a、 pl8INK pl9INK4d等の INK4 ファミリー ·タンパク質、全ての CDKを阻害することが知られている、
Figure imgf000009_0001
p27Kipl 、 p57Kip2等の CipZKipファミリー 'タンパク質などが挙げられる（例えば、 Sherrraら； Genes Dev. 1999； 13： 1501— 1512参照）。
[0016] < (a)工程 >
前記 (a)工程では、サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検 出する。
[0017] 前記サイクリン依存性キナーゼ（以下、 CDKと称することがある）としては、関節リウ マチにおける関節組織の破壊を誘導する生命現象に関与し得るものであれば、特に 制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、 CDK4 (配列番号： 1〜配列番号: 4参照、以下同様;なお、配列番号： 1中、「n」は a、 t、 g、及び cのいず れかを表す）、 CDK6 (配列番号： 5〜配列番号: 8参照、以下同様)などが好ましい。
[0018] 前記 CDKに対する被験物質の結合能力の検出方法としては、特に制限はなぐ目 的に応じて適宜選択することができ、例えば、直接的に前記 CDKと被験物質との結 合の有無を調べることができる方法として、 Biacoreシステム（Biacore社）を用いた 方法； QCM (Quarts Crystal Microbalance :水晶振動子)を用いた方法；ァフィ 二ティークロマトグラフィーを用いた方法；電気化学測定を用いた方法； ELISA法；質 量分析法；などが挙げられる。
[0019] 前記 Biacoreシステム（Biacore社）とは、物質間の相互作用を、結合特異性、相互 作用の速度、ァフィユティーなどの観点力 解析できるシステムであり、例えば、セン サー表面に CDKを固定ィ匕して該システムを使用することにより、被験物質と CDKと の結合の有無を判断することができる。
[0020] 前記 QCMとは、水晶振動子の電極表面に物質が付着すると、その質量に応じて 共振周波数が変動する（下がる)性質を利用した、極めて微量な質量変化を計測す ることの可能な質量センサーであり、例えば、 CDKを電極上に固定ィ匕して該センサ 一を使用することにより、被験物質の CDKに対する結合量の重さを、リアルタイムに 検出することができ、被験物質と CDKとの結合の有無を判断することができる。
[0021] 前記ァフィ二ティークロマトグラフィーは、分子等の分離に使用されるクロマトグラフ ィ一法の応用であり、例えば、クロマトグラフィーのカラムに詰める担体表面に CDKを 固定化し、そこに被験物質を流すことにより、被験物質の CDKに対する結合性の差 を利用して、 CDKに結合する被験物質を分離することができる。これにより、被験物 質と CDKとの結合の有無を判断することができる。
[0022] 前記電気化学測定は、リガンドを電極上に固定ィ匕して、物質の結合を別に加えた 酸化還元種の電機化学応答によって検出する方法であり、例えば、 CDKを電極上 に固定ィ匕して、被験物質と、酸化還元種を加えることにより使用する。被験物質が C DKと結合する場合は、それらの結合物が電極表面を覆うため、酸化還元種が電極 に物理的に近づくことができず、電気化学応答が下がることから、被験物質と CDKと の結合の有無を判断することができる。
[0023] また、前記サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力は、前記したよ うなサイクリン依存性キナーゼと被験物質との結合の有無を直接的に調べる方法の みに制限されず、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化作用に対する被験物質の抑 制作用を調べる方法によって、間接的に検出することもできる。
サイクリン依存性キナーゼは、細胞周期の進行にあたり、サイクリンと複合体を形成 することによって活性ィ匕し、網膜芽細胞腫遺伝子産物 (Rb；配列番号： 9〜配列番号 : 12参照、以下同様)や他の関連するタンパク質をリン酸化する。 Rbのリン酸ィ匕により 、 E2F転写因子の転写活性を阻害している Rbの機能は不活化されて、細胞周期が 進行することが知られて 、る。
したがって、サイクリン依存性キナーゼのリン酸化作用に対する被験物質の抑制作 用は、サイクリン依存性キナーゼの基質である Rbや、そのミミックなどのリン酸ィ匕状態 を調べることにより検出することができる。
[0024] CDKの基質である Rbやそのミミックなどのリン酸ィ匕状態を調べる方法としては、例 えば、被験物物質の存在下で、 RPPTLSPIPHIPR (配列番号： 51)などの合成べ プチドと、組換え技術を用いて作成した CDK4や CDK6タンパクとを、 Tris— HCl(p H7. 4)、 10mmol/L MgCl、 4. 5mmol/L 2—メルカプトエタノール、 lmmol
2
/L EGTA、 50 μ mol/L ATP、及び、 1 μ Ci(37kBq) y— 33P ATPとともに 反応させること、などが挙げられる。被験物質の非存在下と比較して、被験物質の存 在下では、前記合成ペプチドのリン酸ィ匕が抑制されるという結果が得られた場合、被 験物質は CDKの基質のリン酸ィ匕に対して抑制能力を有していると判断することがで き、即ち、被験物質が CDKに対して結合能力を有すると判定することができる。
[0025] 前記 (a)工程においては、前記 CDKに対する被験物質の結合能力を検出する方 法のうち、 1種のみを行ってもよいし、 2種以上を行ってもよい。なお、 2種以上の方法 を行う場合、必ずしも選択した全ての方法にぉ ヽて被験物質力 SCDKに対する結合 能力を示す結果となる必要はなぐ選択した中で、少なくとも 1種の方法において被 験物質が CDKに対する結合能力を有すると 、う結果であれば、前記被験物質は C DKに対する結合能力を有すると判定することができる。
[0026] く（b)工程〉
前記 (b)工程では、関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑 制作用を検出する。
[0027] 一関節組織の破壊を誘導する生命現象
前記関節組織の破壊を誘導する生命現象としては、関節組織の破壊に関連して生 体内で起こり得る現象であれば、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することが でき、例えば以下に示すような、軟骨組織及び硬骨組織の少なくともいずれかの破 壊に関連する任意の現象が挙げられる。
なお、前記関節組織の破壊を誘導する生命現象を、便宜的に軟骨組織及び硬骨 組織の場合に分け、以下、順に説明をする力 生体内において互いの生命現象は 複雑に関連し合っており、関節組織の破壊は、軟骨組織及び硬骨組織を含む、全体 として進行する。したがって、前記 (b)工程においては、後述する軟骨組織及び硬骨 組織の少なくともいずれかの破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作 用を検出することによって、全体としての関節組織の破壊を誘導する生命現象に対 する被験物質の抑制作用を検出することができる。
[0028] ——軟骨組織の破壊を誘導する生命現象——
関節リウマチにおける軟骨組織の破壊は、例えば、以下のようにして引き起こされる ことが知られている。関節リウマチが進行した関節の滑膜組織では、リンパ球やマクロ ファージなどの炎症細胞が浸潤し、様々な炎症性サイト力インを産生する。これらの 炎症性サイト力インにより、滑膜組織を形成する滑膜線維芽細胞 (RSF)は活性化さ れ、過剰に増殖する。この異常増殖した滑膜線維芽細胞が、パンヌスと呼ばれる増 殖性肉芽腫性滑膜組織を形成することにより、罹患関節の軟骨の破壊が引き起こさ れる。また、この異常増殖した滑膜線維芽細胞は、マトリクス 'メタ口プロティナ一ゼ（ MMP) 3 (配列番号： 17〜配列番号： 20参照、以下同様）、単球走化性タンパク 質 (MCP)— 1 (配列番号： 13〜配列番号： 16参照、以下同様)などの関節破壊関連 因子を産生する。これらの関節破壊関連因子の働きによっても、罹患関節の軟骨組 織の破壊は促進される。
[0029] マトリクス 'メタ口プロティナーゼ（MMP)—3とは、プロテオグリカン、ゲラチン、フィ ブロネクチン、及びコラーゲンを分解する組織分解プロティナーゼである。 MMP- 3 は、他の MMPを活性ィ匕する機能も有しており、関節リウマチに罹患した関節での組 織分解酵素カスケードにおける主要プロティナーゼとして知られている（例えば、 Ok ada;In Ruaay Ό； TextbooK of Rheumatology.6th. Philadelphia： W. B. ¾ aunders;2001.55— 72、 Tolboomら； Ann Rheum Dis, 2002;61:975-98 0、及び、 Nagase;Biol Chem、 1997;378: 151— 160参照）。更に、 MMP— 3 は関節リウマチ動物モデルにぉ ヽてもその発現が必須である（例えば、 van Meurs ら； Arthritis Rheum, 1999 ;42 :2074— 2084参照）。 MMP— 3により活'性ィ匕さ れたプロティナーゼを抑制する MMPインヒビターは、他の関節リウマチモデルの関 節破壊を予防することが報告されている（例えば、 Hamadaら； Br J Pharmacol, 2 000; 131 :1513- 1520, Ishikawa¾;Eur J Pharmacol, 2005； 508 :239-2 47. Epub 2005 Jan 2012、及び、 Lewisら； Br J Pharmacol, 1997; 121 :5 40— 546参照）。
また、単球走ィ匕性タンパク質 (MCP)—1は、リウマチ性滑膜組織のリンパ球ゃマク 口ファージの遊走や活性ィ匕を起こすことが知られている（例えば、 Kochら; J Clin I nvest、 1992 ;90 :772— 779参照）。 MCP— 1アンタゴ-ストの投与は、関節リウマ チ動物モデルの治療に有効であったことが報告されて 、る（例えば、 Gongら； J Exp
Med、 1997;186:131-137参照）。
即ち、これら MMP— 3、 MCP— 1などの関節破壊関連因子は、関節リウマチにお いて重要な役割を果たす。
[0030] したがって、前記軟骨組織の破壊を誘導する生命現象としては、特に制限はなぐ 例えば、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞の組織浸潤、炎症性サイト力イン の産生、滑膜線維芽細胞の増殖、パンヌスの形成、 MMP— 3、 MCP— 1等の関節 破壊関連因子の遺伝子発現、などが挙げられる。
[0031] 関節破壊関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出方法
MMP— 3や MCP— 1などの関節破壊関連因子の遺伝子発現に対する、被験物 質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなぐ公知の方法の中から目的に応 じて適宜選択することができ、例えば、各種 PCR法（半定量的 PCR法、定量的 PCR 法、リアルタイム PCR法など）、ノーザンブロット法、 in situ ハイブリダィゼーシヨン 法、 ELISA法、ウェスタンプロット法等を用いて、被験物質の存在下で培養した滑膜 線維芽細胞における、関節破壊関連因子の遺伝子発現量を検出する方法、などが 挙げられる。
なお、遺伝子発現とは、 mRNA発現及びタンパク質発現の少なくともいずれかを指 すものとする。例えば、前記した方法の中では、各種 PCR法、ノーザンブロット法、 in situ ハイブリダィゼーシヨン法により、 mRNAレベルでの遺伝子発現量を検出す ることができ、 ELISA法、ウェスタンブロット法により、タンパク質レベルでの遺伝子発 現量を検出することができる。
[0032] なお、前記検出を「被験物質の存在下」で行うには、前記検出時に、被験物質が標 的 (ここでは、滑膜線維芽細胞）に作用し得る状態にあれば特に制限はなぐ目的に 応じて適宜選択することができる。例えば、滑膜線維芽細胞の培養液中に被験物質 を添加することにより、被験物質を滑膜線維芽細胞に作用させることができる。また、 被験物質遺伝子をアデノウイルスに組み込み、該アデノウイルスを滑膜線維芽細胞 に感染させることによって、被験物質を滑膜線維芽細胞に導入することもできる。 また、前記検出における被験物質の使用量としては、特に制限はなぐ被験物質の 種類、検出方法の種類、被験物質の最終的な使用目的などを考慮して、適宜選択 することができる。
本明細書中にぉ 、て、「被験物質の存在下」 t 、う場合は上記と同義である。
[0033] 前記したような、 MMP— 3や MCP— 1などの関節破壊関連因子の遺伝子発現に 対する被験物質の抑制作用の検出を行った場合、具体的には、被験物質の存在下 での関節破壊関連因子の遺伝子発現量が、被験物質の非存在下での関節破壊関 連因子の遺伝子発現量に対して低ければ、被験物質が、選択された関節破壊関連 因子の遺伝子発現に対して抑制作用を有すると判定することができる。
[0034] 滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法
前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法としても、 特に制限はなぐ公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば 、被験物質の存在下で培養した滑膜線維芽細胞について、 GOZG1期から S期への 細胞周期の進行度合いを、 ¾—チミジン取り込み量の測定、フローサイトメトリー等 によって調べる方法などが挙げられる。
前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を、前記3 H—チミジン 取り込み量の測定により調べた場合、具体的には、被験物質の存在下での3 H—チミ ジン取り込み量力 被験物質での非存在下での3 H—チミジン取り込み量に対して低 ければ、被験物質が、滑膜線維芽細胞の増殖に対して抑制作用を有していると判定 することができる。
また、前記滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出を、前記 フローサイトメトリーにより行った場合、具体的には、被験物質の存在下での、全細胞 中における S期以降 (G2期、 M期を含む)の細胞の割合が、被験物質の非存在下で の同割合に対して低ければ、被験物質が、滑膜線維芽細胞の増殖に対して抑制作 用を有していると判定することができる。
[0035] 軟骨組織における有用な検出態様
軟骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場 合、前記した方法の中でも、関節破壊関連因子の遺伝子発現 (mRNA発現及び Z 又はタンパク質発現)を調べることが好ましぐ中でも、以下の点から、 MMP— 3の遺 伝子発現を調べることがより好ま ヽ。
[0036] 本発明者らは、関節リウマチにおける関節破壊を誘導する様々な生命現象がサイ クリン依存性キナーゼの働きによって直接的に制御されていることを見出し、更に、こ れらの様々な生命現象が、様々な経路を介して制御されている可能性を見出した。 中でも、本発明者らは、後述の実施例においても示される通り、 MMP— 3の mRNA 発現と、滑膜線維芽細胞の増殖とは、それぞれ異なる経路を介して、 CDKによる制 御をうけている可能性を見出した。
CDKは、サイクリンと複合体を形成して、網膜芽細胞腫遺伝子産物 (Rb)をリン酸 化する働きを有する。 Rbがリン酸化され、不活性化されると、細胞周期の進行に働く E2F転写因子の抑制は解除され、細胞周期が進行する。すなわち、 Rbが活性化す れば、細胞周期の進行は抑制される。
本発明者らの実験にぉ ヽて、この Rbの活性型である非リン酸化 Rbを滑膜線維芽 細胞において過剰発現させたところ、細胞周期の進行は抑制され、かつ、 MMP— 3 のタンパク質発現量は低下した力 MMP— 3の mRNA発現量は変化しない、という 結果が得られた。
一方、サイクリン依存性キナーゼインヒビター (CDKI)を滑膜線維芽細胞に導入し 、 CDKの働きを阻害させたところ、 MMP— 3のタンパク質発現量が低下した点にお いては Rbの過剰発現の場合と同様であった力 MMP— 3の mRNA発現量も低下 するという点において、 Rbの過剰発現の場合とは異なる結果が得られた。
これらの結果から、 MMP— 3の mRNA発現は、従来知られている CDKの基質で ある Rbを介した経路以外の経路により、 CDKによる発現制御を受けていることが見 出された。この経路は Rbを介さないため、 Rbの不活性化が重要な役割を果たす細 胞周期の進行を抑制することなしに、 MMP— 3の発現量のみを低下させることがで きると考えられる。
このように、本発明の評価方法における工程 (b)の「関節組織の破壊を誘導する様 々な生命現象」は、上記 MMP— 3の発現と滑膜線維芽細胞の増殖の例から明らか なように、それぞれ独立性を有しうるものである。したがって、本発明の評価方法にお ける工程 (b)においては、技術の本質に反しない限り、関節組織の破壊を誘導する 様々な生命現象のうち、複数を組み合わせて検出してもよい。
例えば、 MMP— 3の発現と滑膜線維芽細胞の増殖の双方を検出した場合におい て、被験物質が、 MMP— 3の mRNA発現に対しては抑制作用を有し、滑膜線維芽 細胞増殖に対しては抑制作用を有しな 、と 、う結果が得られた場合、このような被験 物質は、細胞増殖を抑制することなしに、関節の破壊を抑制する効果が期待できる。 このため、正常な細胞増殖まで抑制してしまうなどと!/、つた副作用の危険性の少な ヽ 、安全性の高い、関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質として評価することが できる。このような候補物質は、例えば、副作用を引き起こすリスクの高い関節リウマ チ患者の治療に対して、有用であることが期待される。
一方、被験物質が、 MMP— 3の mRNA発現に対しても、滑膜線維芽細胞増殖に 対しても抑制作用を有する場合、このような被験物質は、滑膜線維芽細胞の過剰増 殖が引き起こす関節破壊に対しても、強い効果を有する、関節リウマチ治療薬又は 予防薬の候補物質であるとして、評価することができる。 [0038] このようなことから、軟骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制 作用を検出する場合において、 MMP— 3の遺伝子発現を調べることは有意である。 中でも、 MMP— 3の mRNA発現を調べることは有用であり、 MMP— 3のmRNA発 現と併せ、滑膜線維芽細胞増殖の抑制の有無を調べることもまた、有意である。
[0039] また、 MMP— 3に限らず、他の組織分解プロティナーゼも、 MMP— 3と同様な経 路 (Rb非依存的経路)を介して制御されている可能性が高い。一方、後述する実施 例にも示されるように、 MCP— 1は Rbを介した経路 (Rb依存的経路）により制御され ていることが示されており、このようなことからも、関節破壊を誘導する様々な生命現 象は、それぞれが互いに多様な経路により CDKによる制御を受けていることがわか る。
[0040] ——硬骨組織の破壊を誘導する生命現象——
関節リウマチにおける硬骨組織の破壊は、例えば、前記した軟骨組織の破壊と同 様なメカニズムを経て、引き起こされ得る。即ち、関節リウマチが進行した関節の滑膜 組織においては、リンパ球やマクロファージなどの炎症細胞が浸潤し、様々な炎症性 サイト力インを産生する。これらの炎症性サイト力インにより、滑膜組織を形成する滑 膜線維芽細胞は活性化され、過剰に増殖する。この異常増殖した滑膜線維芽細胞 力 パンヌスと呼ばれる増殖性肉芽腫性滑膜組織を形成することによって、前記軟骨 と同様に、罹患関節の硬骨も破壊される。また、これらの異常増殖した滑膜線維芽細 胞が産生する破骨細胞分化誘導因子 (RANKL)の作用により、骨髄細胞などの破 骨前駆細胞は、過度に破骨細胞へと分化誘導される。この破骨細胞の活性化により 、硬骨組織の破壊は促進される。この破骨前駆細胞から破骨細胞への分ィ匕には、活 性化T細胞核内因子cl (NFATcl : nuclear factor of activated T cells cl ) (配列番号: 21〜配列番号 : 34参照、以下同様)がマスター分子として機能している ことが知られている。また、破骨細胞に特異的な因子として、例えば、破骨細胞関連 受容体（OSCAR: osteoclast— associated receptor) (配列番号： 39〜配列番 号： 50参照、以下同様）、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP : tartrate— resist ant acid phosphatase) (配列番号： 35〜配列番号： 38参照、以下同様）などが 知られている。 [0041] したがって、前記硬骨組織の破壊を誘導する生命現象としては、特に制限されるも のではないが、例えば、前記軟骨組織の場合と同様の生命現象の他、骨髄細胞など の破骨前駆細胞の増殖、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化、 NFATcl、 OSCA R、 TRAP等の破骨細胞関連因子の遺伝子発現、などが挙げられる。
なお、破骨前駆細胞とは、破骨細胞へと分化し得る可能性のある細胞全てを指す ものとし、骨髄細胞も含まれるものとする。
[0042] 破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出方法 前記した NFATcl、 OSCAR, TRAP等の破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対 する被験物質の抑制作用の検出方法としては、特に制限はなぐ公知の方法の中か ら目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種 PCR法（半定量的 PCR法、 定量的 PCR法、リアルタイム PCR法など）、ノーザンブロット法、 in situ ハイブリダ ィゼーシヨン法、 ELISA法、ウェスタンブロット法等を用いて、被験物質の存在下で 培養された破骨前駆細胞又は破骨細胞における各因子の遺伝子発現量を検出する 方法、などが挙げられる。
前記破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用の検出を、遺 伝子発現量の検出により行った場合、具体的には、被験物質の存在下での破骨細 胞関連因子の遺伝子発現量が、被験物質の非存在下での破骨細胞関連因子の遺 伝子発現量に対して低いとき、被験物質が、選択された破骨細胞関連因子の遺伝子 発現に対して、抑制作用を有すると判定することができる。
[0043] 骨髄細胞 (破骨前駆細胞)の増殖に対する被験物質の抑制作用の検出方法 前記骨髄細胞 (破骨前駆細胞)の増殖に対する、被験物質の抑制作用の検出方法 としては、特に制限はなぐ公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することがで き、例えば、 WST— 8を利用した、セルカウンティングキット— 8 (Cell Counting K it 8；同仁化学)等を用いて、被験物質の存在下で培養された骨髄細胞の細胞数 を測定する方法などが挙げられる。
前記骨髄細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を、骨髄細胞の細胞数を測定 する方法により検定する場合、具体的には、被験物質の存在下での骨髄細胞数が、 被験物質の非存在下での骨髄細胞数に対して少な 、とき、被験物質が骨髄細胞の 増殖に対して抑制作用を有していると判定することができる。
[0044] 破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用の検出 方法
前記破骨前駆細胞から破骨細胞への分ィ匕に対する、被験物質の抑制作用の検出 方法としては、特に制限はなぐ公知の方法の中から目的に応じて適宜選択すること ができ、例えば、被験物質の存在下で骨髄細胞を培養し、更に破骨細胞分化誘導 因子の添カ卩により破骨細胞への分ィ匕を誘導した後、 TRAP染色キット (セルガレージ )等を用いて、破骨細胞に分化された細胞数を測定する方法、などが挙げられる。 前記破骨前駆細胞から破骨細胞への分ィ匕に対する被験物質の抑制作用を、破骨 細胞に分化された細胞数を測定することにより検定する場合、具体的には、被験物 質の存在下での破骨細胞数が、被験物質の非存在下での破骨細胞数に対して少な いとき、被験物質が、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化に対して抑制作用を有し ていると判定することができる。
[0045] 硬骨組織における有用な検出態様
硬骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する場 合、前記した方法の中でも、検出が容易である点で、破骨細胞関連因子の遺伝子発 現 (mRNA発現及び Z又はタンパク質発現)を調べることが好ましぐ中でも、破骨前 駆細胞から破骨細胞への分化のマスター分子である NFATcl因子の遺伝子発現を 調べることが、より好まし 、。
[0046] 本発明者らは、硬骨組織に関しても、前記軟骨組織の場合と同様に、様々な生命 現象が、それぞれ異なる経路を介して、 CDKによる制御を受けている可能性を見出 した。中でも、本発明者らは、後述する実施例にも示されるとおり、骨髄細胞 (破骨前 駆細胞）の増殖と、 NFATclなどの破骨細胞関連因子の遺伝子発現とが、互いに異 なる経路により制御されている可能性を見出した。
[0047] 例えば、ある被験物質が、破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対しては抑制作用を 有し、骨髄細胞 (破骨前駆細胞)増殖に対しては抑制作用を有しない場合、このよう な被験物質は、細胞増殖を抑制することなしに関節破壊を抑制する効果が期待でき ることから、正常な細胞増殖まで阻害してしまうなどと!/、つた副作用の危険性の少な い、安全性の高い、関節リウマチの治療薬又は予防薬の候補物質として評価するこ とができる。このような候補物質は、例えば、副作用を引き起こすリスクの高い関節リウ マチ患者の治療に対して、有用であることが期待される。
一方、被験物質が、破骨細胞関連因子の遺伝子発現に対しても、骨髄細胞 (破骨 前駆細胞)増殖に対しても抑制作用を有する場合、このような被験物質は、細胞の過 剰増殖により引き起こされる関節破壊に対しても、強い効果を有する、関節リウマチ の治療薬又は予防薬の候補物質であると評価することができる。
したがって、硬骨の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出 する場合、破骨細胞関連因子の遺伝子発現を調べることは有意であり、破骨細胞関 連因子の遺伝子発現と併せ、破骨前駆細胞増殖の抑制作用の有無を調べることもま た、有意である。中でも、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化のマスター分子であ る NFATclの遺伝子発現を調べることが好ましぐ NFATclの遺伝子発現と併せ、 破骨前駆細胞増殖の抑制作用の有無を検出することもまた、好ましい。
[0048] また、破骨細胞関連因子の遺伝子発現と、破骨前駆細胞力も破骨細胞への分化と は、互いに密接に関連した事象である。したがって、硬骨の破壊を誘導する生命現 象に対する被験物質の抑制作用を検出する場合、破骨前駆細胞から破骨細胞への 分ィ匕を調べることもまた、有用であり、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の分化と併せ 、破骨細胞前駆細胞増殖の抑制作用の有無を調べることもまた、有意である。
[0049] 前記したような例に限らず、関節破壊を誘導する様々な生命現象は、それぞれが 多様な経路を介して、サイクリン依存性キナーゼによる制御をうけている可能性が高 ぐこのような制御経路の違いを利用することにより、被験物質の抗関節リウマチ活性 を、様々な視点力も評価することが可能となる。即ち、例えば、関節リウマチの治療に あたり、個々の患者の症状に応じた、より適切な治療薬又は予防薬を選択することな ども可能となると考えられる。
[0050] 前記 (b)工程にお ヽては、前記したような関節組織の破壊を誘導する生命現象に 対する被験物質の抑制作用の検出方法のうち、 1種のみを行ってもよいし、 2種以上 を行ってもよい。 2種以上の検出方法を行う場合、必ずしも選択した全ての検出方法 において、被験物質が抑制作用を有する結果となる必要性はなぐ選択した検出方 法の中で、少なくとも 1種の検出方法に対して被験物質が抑制作用を有する結果とな れば、被験物質は関節組織の破壊を誘導する生命現象に対して抑制作用を有する と判定することができる。検出方法及び結果の組み合わせを適宜選択することにより 、被験物質の抗関節リウマチ活性を、様々な視点から評価することが可能となる。
[0051] <評価 >
以上のように、被験物質が、前記 (a)工程においてサイクリン依存性キナーゼに対 する結合能力を有すると判定され、かつ、前記 (b)工程において関節組織の破壊を 誘導する生命現象に対する抑制作用を有すると判定された場合に、前記被験物質 は、抗関節リウマチ活性を有すると評価される。
なお、前記 (a)工程及び前記 (b)工程は、いずれを先に行ってもよいし、同時に行 つてもよい。
[0052] (スクリーニング方法）
本発明の抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法は、
(A)前記評価方法を実施する工程、及び
(B)工程 (A)において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択す る工程、を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
[0053] 前記 (A)工程は、前記評価方法を実施する工程であり、前記 (a)及び (b)工程と同 様に実施することができる。
前記 (B)工程は、前記 (A)工程により、抗関節リウマチ活性を有すると評価された 被験物質を選択する工程である。ここで選択された被験物質は、抗関節リウマチ活性 を有する物質であり、関節リウマチに対する治療薬又は予防薬の候補物質 (以下、候 補物質と称する場合がある)であるということができる。前記候補物質は、関節リウマ チ、特に、関節リウマチにおける関節破壊に対して、治療又は予防効果が期待できる
[0054] (確認方法）
前記スクリーニング方法により選択された、抗関節リウマチ活性を有すると評価され た被験物質 (候補物質)が、実際に関節リウマチの治療又は予防に有効であるかどう かは、例えば、関節リウマチモデル動物への、候補物質の投与実験などにより確認 することができる。
前記関節リウマチモデル動物としては、例えば、コラーゲン誘導性関節炎マウス (C hondrex社)、コラーゲン誘導性関節炎ラット (Chondrex社)、アジュバント関節炎ラ ットなどが使用できる。前記アジュバント関節炎ラットは、例えば、 8週齢程度の Lewis フット【こ、 lmgの M.butyricum死菌 (Difco Laboratories, Detroit, Micnigan) を 100 Lのミネラルオイルに懸濁して、尾根部皮内に免疫することにより得ることが できる。
[0055] 候補物質が投与された前記関節リウマチモデル動物の、関節リウマチの症状の緩 和度合いを観察することによって、前記スクリーニング方法により選択された関節リウ マチ治療薬又は予防薬の候補物質の効果を確認することができる。
[0056] なお、前記スクリーニング方法により選択された関節リウマチ治療薬又は予防薬の 候補物質の適用対象となり得る動物としては、関節リウマチに罹患する可能性のある 動物であれば特に制限はなぐ例えば、ヒト、ィヌ、ネコ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、ブタ、マ ウスなどが挙げられる。
[0057] (効果）
前記評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する物質
、中でも、関節リウマチにおける関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマ チの治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的に選択することができる。
より具体的には、前記評価方法又はスクリーニング方法によれば、所望の効果のバ ランスを有する、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候補物質を、効率的に選 択することができる。例えば、関節における細胞の異常増殖の抑制と、関節の破壊に 関連する因子 (前記した関節破壊関連因子、破骨細胞関連因子などを含む)の産生 抑制という 2種類の効果が、所望のバランスで奏される、優れた関節リウマチ治療薬 又は予防薬の候補物質を選択することが可能となる。即ち、例えば、正常な細胞の 増殖は阻害することなぐ関節の破壊に関連する因子の産生のみを抑制することの できる、副作用の危険性の少ない物質を選択することも可能となり、一方で、細胞の 異常増殖と関節の破壊に関連する因子の産生とを共に抑制することのできる、強い 効果の期待できる物質を選択することも可能となる。
[0058] したがって、前記評価方法又はスクリーニング方法は、関節リウマチの治療又は予 防に関する様々な場面において有用であり、例えば、以下（1)〜(4)のような用途に おいて、特に有用であると考えられる。
(1)新たに開発された関節リウマチの治療薬又は予防薬の、抗関節リウマチ活性を 効率的に評価することができる。
(2)公知の CDK阻害剤、他疾患対象の薬剤などの中から、関節リウマチの治療薬又 は予防薬として使用可能な物質を、効率的に選択することができる。
(3)既存の関節リウマチの治療薬又は予防薬の中から、例えば、患者の症状に応じ て所望の効果を有する治療薬又は予防薬を、適切に選択することができる。
(4)既存の関節リウマチの治療薬又は予防薬に改良を加え、より副作用の少ない治 療薬又は予防薬など、所望の効果に優れた治療薬又は予防薬を効率的に得ること ができる。
[0059] 関節リウマチの根治には、関節リウマチの進行により引き起こされる、関節破壊と炎 症という 2つの側面を、それぞれ効率的に抑制することが有効であると考えられる。前 記評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する物質、中 でも、関節破壊を治療又は予防可能な、優れた関節リウマチ治療薬又は予防薬の候 補物質を得ることができることから、既存の炎症療法などと併用することによって、関 節リウマチの根治的な治療方法の開発が期待できる。
実施例
[0060] 以下に本発明の実施例について説明する力 本発明は、これらの実施例に何ら限 定されるものではない。
[0061] (実施例 1〜5：軟骨における評価）
被験物質として、 pl6INK4a (実施例 1)、 ρ21αρ1 (実施例 2)、 pl8INK4e (実施例 3)、 C
DK4I (実施例 4)、活性型 Rb (実施例 5)を選択し、各々の抗関節リウマチ活性を、軟 骨組織の破壊を誘導する生命現象に対する抑制作用の観点から、以下のようにして 評価した。 ここで、実施例 4として選択した CDK4Iとは、 CDK4及び CDK6を特異的に阻害す る CDK4Z6インヒビターである合成化合物、 2 ブロモ 12, 13 ジヒドロ一 5H— インドロ [2, 3— 1]ピロ口 [3, 4— c]カルバゾールー 5, 7 (6H)—ジオン（2—bromo - 12, 13- dihydro - 5H - indolo [2, 3- l]pyrrolo [3, 4— c]carbazole— 5, 7 (6H)—dione)である。
なお、実施例 1〜3で選択した pl6皿4 a、
Figure imgf000024_0001
pl8皿4 cは、それぞれサイクリン 依存性キナーゼのキナーゼ活性を阻害する細胞内タンパク質群であるサイクリン依 存性キナーゼインヒビター（CDKI)の一種である。 pl6INK4a及び pl8INK4cは、 CDK4 及び CDK6を特異的に阻害することが知られており、 ρ21αρ1は全ての CDKを阻害 することが知られている。
また、実施例 5で選択した Rb (網膜芽細胞腫遺伝子産物）は、 CDK4及び CDK6 の主な基質として知られており、 Rbがリン酸ィ匕されて不活性ィ匕されることにより、細胞 周期の進行に働く E2F転写因子の抑制が解除され、細胞周期が進行することが知ら れている。即ち、実施例 5において使用する活性型 Rbは、細胞周期の進行の抑制に 寄与する。
<細胞増殖の評価 >
各被験物質の細胞増殖に対する抑制作用は、以下のようにして評価した。
滑膜線維芽細胞 (RSF)培養
滑膜組織を、抗リウマチ薬への反応が悪ぐ東京医科歯科大学病院、東京都立墨 東病院、国立療養所下志津病院で、関節置換術及び Z又は滑膜切除術を受けたリ ゥマチ患者力も採取した。滑膜組織を採取した全患者が、関節リウマチ (RA)分類に ついての、米国リウマチ学会、関節リウマチ診断基準（Arnettら； Arthritis Rheum . 1988 ; 31 : 315— 324参照）を満たしていた。滑膜組織を採取した患者らは、本実 施例 1〜5における全処置に合意しており、また、本実施例 1〜5における全処置は、 東京医科歯科大学及び理ィ匕学研究所の倫理委員会により承認されている。得られ たヒト絨毛性、鬱血性滑膜組織検体から、滑膜線維芽細胞 (RSF)を分離し、 Tanigu chiら； Nat Med.l999 ; 5 : 760— 767に記載の方法で培養した。これらを早期継代 (3〜9継代)で使用した。 [0063] 被験物質導入アデノウイルスの感染
p16皿4 a (実施例 D、 p21eipl(実施例 2)、 pl8INK4e (実施例 3)、及び活性型 Rb (実 施例 5)の各被験物質は、アデノウイルスを利用して RSFに導入した。
以下の、各被験物質遺伝子を含む組み換え型アデノウイルスを、購入又は調製し た；ヒト pl6INK4a遺伝子を含むアデノウイルス（AxCApl6) (Teradaら; J Am Soc Nephrol.1997;8:51— 60参照）、ヒト pl8INK4c遺伝子を含むアデノウイルス（Ad— RGD— pl8) (Blaisら； Biochem Biophys Res Commun.1998;247: 146— 153, Mizuguchi¾tJ^Kay;Hum Gene Ther.1999;10:2013— 2017、並び 、Mizuguchl¾tJ¾:ay;Hum Gene Ther.1998;9:2577— 2583参照）、ヒト ρ21αρ1遺伝子を含むアデノウイルス（AxCAp21) (Teradaら; J Am Soc Nephr ol.1997;8:51-60参照）、非リン酸ィ匕型で、構成的活性型をコードするヒト Rb遺 伝子を含むアデノウイルス（Ad— Rb) (Changら； Science.1995;267:518-522 、及び、 Teraoら； Hepatology.1998 ;28 :605— 612参照;)。
また、 j8ガラクトシダーゼ遺伝子を含むアデノウイルス (Ad-LacZ)を準備した (Ch angら； Science.1995;267:518— 522、及び、 Teraoら； Hepatology.1998;2 8:605— 612参照）。
また、挿入遺伝子を持たないコントロール 'アデノウイルス Axlwl (独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 ノ ィオリソースセンター、 日本、つくば巿)及びコント口 ール Ad5— RGD(Mizuguchiら； Gene Ther.2001 ;8 :730— 735参照）を準備 した。
[0064] 準備したアデノウイルスのうち一種を、 100%の感染効率を保証する最低限の多重 感染率 (MOI) (通常、 50〜200MOI)で、得られた滑膜線維芽細胞 (RSF)に感染 させた。
アデノウイルス感染から 3日後、導入遺伝子の発現レベルが最高に達した時点で、 RSFの増殖を検証、又は、 RSFをサイト力イン刺激した。サイト力イン刺激は、 5ng/ mL TNFa (Genzyme社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、 5ng/mL IL— 1 j8 (Peprotech社、ニュージャージー州ロッキーヒル）、及び 25 μ Μインドメタシン（Sig ma社、ミズーリ州セントルイス）を用いて行い、 12時間にわたり、炎症メディエーター（ 関節破壊関連因子)の産生を刺激した。なお、予備実験は、 RSF刺激時の各サイト 力インの最適濃度力 5ngZmLであることを示して 、た。
[0065] — CDK4Iの添カロ一
CDK4I (実施例 4)は、培養液中に添加することにより、 RSFに作用させた。 CDK4I (2 ブロモ 12, 13 ジヒドロ一 5H—インドロ [2, 3— 1]ピロ口 [3, 4— c ]力ルバゾール—5, 7 (6H)—ジオン）（2— bromo— 12, 13— dihydro— 5H— ind olo [2, 3 - l] pyrrolo [3, 4— c] carbazole— 5, 7 (6H) - dione) (Merck社、ニュ 一ジャージー州ホワイトハウス 'ステーション）（Zhuら; J Med Chem. 2003 ; 46 : 2 027— 2030参照）は DMSOに溶解させ、 RSF培養液に添カ卩した。培養液中の DM SOの最終濃度は 0. 5% (vZv)とした。 CDK4Iを添カ卩した状態で、 RSFを 6時間、 前培養した。次に、細胞及び培養上清を回収するまでの 36時間、又は RNAを抽出 するまでの 12時間、前記アデノウイルス感染の場合と同様に、 RSFをサイト力イン刺 激した。
[0066] 3 H チミジン取り込み
RSF細胞増殖を、 —チミジン取り込みにより評価した。アデノウイルス感染から 3 日後、アデノウイルス感染 RSFを 8, 000細胞 Zゥエルでマイクロタイタ一'ゥエルに播 種し、 10%ゥシ胎仔血清（FBS)、 IL— 1 j8、 TNF a、及びインドメタシン添カ卩 DME M培地で、 36時間培養した。最後 24時間の培養で、 3H—チミジン (Amersham Bi ◦sciences社、英国バッキンガムシャ一州）を存在させ、取り込まれた放射活性をカウ ントした。相対的生細胞数は、セルカウンティングキット— 8 (Cell Counting Kit— 8 ;同仁化学）により測定した。
[0067] —フロ一.サイトメトリ
アデノウイルス感染から 3日後、 RSFを回収し、 PBSで洗浄した。洗浄後、 RSFを 0 . 15% (vZv) TritonX含有 PBSで、 10分間固定した。固定後、 RSFを、 50 /z gZ mLのヨウ化プロピジゥム（Propidium iodide) (Sigma社、ミズーリ州セントルイス）、 及び 5 μ gZmLの RNaseAとともにインキュベートした。データを、フローサイトメータ 一 (FACS Calibur； BD Biosciences社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて 十し 7 。 [0068] <遺伝子発現の評価 >
各被験物質の遺伝子発現に対する抑制作用は、以下のようにして評価した。
ノーザンブロット解析及びリアルタイム PCR—
ノーザンブロット解析及びリアルタイム PCRでは、全 RNAを単離するために、 RNe asy キット（RNeasy kit : Qiagen社、カリフォルニア州ヴアレンシァ）を使用した。 I 型インターロイキン 1受容体 (IL- 1R1)及びマトリクス 'メタ口プロティナーゼ（MMP) — 3mRNA検出のためのノーザンブロット解析を、 Nonomuraら: J. Immunol. 200 3 ; 171 : 4913— 4919に記載の方法で実施した。リアルタイム PCRでは、スーパース クリフ。ト II fe "酵素 superscript II reverse transcriptase： Invitrogen社、 カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、 cDNAを合成した。リアルタイム PCRは、 iQ サイバーグリーンスーパーミックス（iQ SYBER green supermix : Bio— Rad 社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、及び、 MMP— 3mRNA特異的プライマ^ ~ ·セ ット（Elshawら； Br J Pharmacol. 2004 ; 142 : 1318— 1324参照）又は単球走ィ匕 性タンパク質（MCP) - lmRNA特異的プライマ^ ~ ·セット（Piererら； J Immunol. 2004 ; 172 : 1256 - 1265参照）を用 V、て実施した。ヒト ·グリセノレァノレデヒド 3 リ ン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH) mRNAを、サイクル閾値法での標準化のために用 いた（Zhong及び Simons ; Biochem Biophys Res Commun. 1999 ; 259 : 52 3— 526参照）。
[0069] 酵素免疫吸着測定法 (ELISA)—
ELISAでは、アデノウイルス感染 RSFを 60時間培養し、 1. 0 105細胞/1!11^で、 マイクロウェルに播種した。播種から 12時間後、培養上清を、 IL— 1 j8、 TNF a、ィ ンドメタシンと、 10%FBSを含む新しい DMEM培地と交換した。 24時間の培養後、 培養上清を回収した。 MCP- l (Biosource International社、カリフォルニア州力 マリ口）、 IL— 6 (Biosource International社）、マクロファージ炎症性タンパク質（ MIP) - 3 a (R&D Systems社、ミネソタ州マッキンレー）、 MMP— 3 (富士化学、 日本、富山）に対する各 ELISAキットを使用し、培養上清中の各タンパク質濃度を定 量した。
[0070] <その他の評価 > 免疫沈降及びウェスタン'プロット解析
免疫沈降では、アデノウイルス感染から 3日後に、 RSF細胞の全溶解物を調製した (Taniguchiら； Nat Med. 1999 ; 5： 760— 767、及び、 NonomuraJ Immunol . 2003 ; 171 :4913-4919参照）。 JNK 1—3を、マウス ¾[NKモノクローナル抗 体 (Ab) (sc— 7345 ; Santa Cruz Biotech社）を用いて、免疫沈降させた（Patel ら; J Cell Sci 1998 ; 111 : 2247— 2255参照）。ゥサギ抗ヒト pl6INK4a、マウス抗ヒ ト pl8腿4 c、及び p21Ciplポリクローナル抗体（各 sc— 468、 sc— 9965、 sc- 387 ; Sa nta Cruz Biotech社、カリフォルニア州サンタクルーズ）を、ウェスタン'プロット解 祈での一次抗体として使用した。ホースラデイシュ ·ペルォキシダーゼ結合抗ゥサギ I gGポリクローナル抗体（NA— 934； Amersham Biosciences社）又は抗マウス IgG ポリクローナル抗体（6175— 05 ; Southern Biotec社、アラバマ州バーミングハム） を、二次抗体として使用した。結合抗体を、 ECL (Amersham Biosciences社）で 可視化させた。
[0071] マルチウエル比色転写因子アツセィー
RSFにおける転写因子及び JNK活性を測定するために、核抽出キット (Nuclear Extract kit ; Active Motif社、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して核抽 出物を調製した。 AP— 1及び NF— κ Β転写因子の DNA結合活性を定量するため に、 AP- l/c-Jun, NF- κ Β/ρ50,及び ρ65 転写因子アツセィキット（Trans AM ; Transcription Factor Assay kits) (Active Motif社）を使用した。
[0072] <統計解析 >
前記3 H チミジン取り込み、リアルタイム PCRにおける強度比、及び RSF上清に おけるタンパク質濃度は、スタツトビユー (StatView)—5. 0Jソフトウェア (SAS Inst itute Inc.社、ノースカロライナ州カリー）を使用し、対応のあるスチューデント t—検 定により比較した。
[0073] <評価結果:実施例 1 (pl6INK4a)及び実施例 2 (ρ21αρ1) >
細胞増殖の評価結果
関節リウマチを患う患者の関節由来 RSFを、前記の方法によりインビトロで培養した 。特異抗体を用いたウェスタン'プロット解析では、内在性 pl6INK4aが、いずれの培養 RSF試料にお!、ても発現して!/、な!/、ことを示して!/、た（データは図示せず)。ヒト P 161 NK4a遺伝子が導入された AxCAp 16アデノウイルス、又は、導入遺伝子を有さないコ ントロール Axlwlアデノウイルスを、培養 RSF試料に感染させた。導入遺伝子の発 現レベルが最高の場合に、 ¾—標識チミジン取り込み及びフローサイトメトリーにより 、細胞増殖及び細胞周期進行を検証した。 p l6INK4a発現 RSFによる3 H 標識チミジ ン取り込みは、コントロール 'ウィルス感染 RSFによる取り込みと比較して、大幅に抑 制された。これは、細胞周期の GOZG1期率の上昇を伴った（図 1A及び図 1B)。
[0074] 以下に、図 1A及び図 1Bを具体的に説明する。図 1A及び図 1Bは、 p l6INK4a遺伝 子導入が、 RSFの増殖を阻害し、 GOZG1期における細胞周期停止を誘導したこと を示す図である。
図 1Aは、 pl6INK4a遺伝子 (p l6INK4a、黒いカラム)を有するアデノウイルス、又は、コ ントロールアデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させた RSFを、前記のよう にして、インターロイキン (IL) 1 β及び腫瘍壊死因子 (TNF) aで刺激した結果を 示す。 RSFによる3 H—チミジン取り込みを、アデノウイルス感染から 3日後にカウント した。カラムとバーは、 5個のゥヱルでの平均値と標準偏差 (SD)を表している。 pi 6™ K4aによる3 H チミジン取り込みの平均低下率は 83%であった（* *Pく 0. 01)。
図 1Bは、フロ一'サイトメトリー解析の結果を示す。コントロール細胞（コントロール） と比較し、 pl6INK4a発現 RSF (p l6INK4a)では、細胞周期 GOZG1期停止の増加を示 した。 3検体中 1検体での代表結果を示している。
[0075] 遺伝子発現 (タンパク質発現 ZmRNA発現)の評価結果
pl6INK4aが発現して 、る又は発現して 、な 、RSFをサイト力イン刺激し、 MMP - 3 、 MCP—1、 ΜΙΡ— 3 α及び IL— 6のタンパク質発現を、特異的 ELISAにより検証し た。なお、 MMP— 3、 MCP—1、 MIP— 3 α及び IL— 6は、 p21Ciplの遺伝子導入に よりダウンレギュレートされることが知られている、炎症メディエーター（関節破壊関連 因子）の一員である（Nonomuraら; J Immunol. 2003 ; 171 : 4913— 4919参照） 。培養上清中の MMP— 3及び MCP—1産生は、いずれも pl6INK4aの発現により抑 制されたが、 IL 6及び MIP— 3 α産生は、影響を受けなかった（図 1C及び図 1D参 照)。なお、これらの炎症メディエーター（関節破壊関連因子）の産生は、アデノウィ ルス感染のみでは促進されなかった (データは図示せず)。
[0076] 以下に、図 1C及び図 1Dを具体的に説明する。図 1C及び図 1Dは、 pl6INK4a遺伝 子導入は、 RSFによる MMP— 3及び MCP—1のタンパク質産生を抑制した力 IL 6及びマクロファージ炎症性タンパク質（MIP) - 3 αの産生は抑制しなかったこと を示す図である。 pl6INK4aアデノウイルス (pl6INK4a、黒いカラム)又はコントロール .ァ デノウィルス（コントロール、白いカラム）を感染させた RSFを 24時間、 IL— 1 j8及び T NF aの併用で刺激した。培養上清中の MMP— 3、 MCP— 1、 ΜΙΡ— 3 α、及び IL 6タンパク質発現を、 ELISAで測定した。刺激された RSFでの、これらの分子の産 生を、コントロール 'ウィルスを感染させたコントロール RSFのものと比較して示してい る。過去の一連の実験（Nonomuraら; J Immunol. 2003 ; 171 : 4913— 4919参 照）において、 ρ21αρ1アデノウイルス (p21eipl、灰色のカラム）を用いて研究された M IP— 3ひ及び IL— 6での増殖に対する p21eiplの作用を、同形式で示した。カラムと バーはそれぞれ、 3検体での平均値と標準偏差 (SD)を表している。 pl6INK4aによる MMP— 3及び MCP— 1産生の平均低下率は、それぞれ 78%、 91%であった（*P < 0. 05)。 ρ21αρ1による MIP— 3 α及び IL—6産生の平均低下率は、それぞれ 69 %、 67%であった。 ρ21αρ1とは異なり、 RSFでの ΜΙΡ— 3 α及び IL— 6の産生は、 ρ 16INK4aにより影響を受けな力つた。
[0077] また、前記タンパク質発現を測定した場合と同様に、アデノウイルス感染後サイト力 イン刺激した RSFにお!/、て、 MMP— 3及び MCP— 1の mRNA発現レベルを検証し た。ノーザンブロット解析では、 pl6INK4a発現 RSFにおいて MMP— 3mRNAレベル の低下を示した力 MCP— lmRNAレベルに有意な変化は観察されなかった（デー タは図示せず)。この結果をリアルタイム PCR解析により確認したところ、 pl6INK4a発 現 RSFでは MMP— 3mRNAの有意な低下を示したが、 MCP— lmRNAは小幅な 低下しか示さなかったことが確認された（図 1E及び図 1F)。したがって、 MCP—lm RNAレベルの変化では、タンパク質の減少を説明できなカゝつた。
これらの結果から、 MMP— 3産生は、 CDKの働きにより、 mRNAレベルで調節さ れるが、 MCP— 1産出は mRNAレベルで調節されないことが示された。
[0078] 以下、図 1E及び図 1Fを具体的に説明する。図 1E及び図 1Fは、 MMP— 3mRN Aレベルは、 16皿43及びじ01¾1 (後述、実施例 4)によりダウンレギュレートされた 力 MCP—lmRNAレベルはダウンレギュレートされず、また、両方とも活性型 Rb ( 後述、実施例 5)により影響を受けな力つたことを示す図である。 RSFを pl6INK4a(pl 6INK4a、黒いカラム）、 Rb (Rb、黒いカラム）、又はコントロール (コントロール、白いカラ ム）アデノウイルスに感染させた。また、濃度 1 μ Μの CDK4I (CDK4I、黒いカラム） 又は DMSO培地コントロール（DMSO、白いカラム）で、 RSFを処理した。これらの R SFを、前記のようにして、 IL—l j8及び TNF aで刺激した。 MMP— 3及び MCP— 1の mRNAを、リアルタイム PCRで定量した。これらの mRNA発現量を、 GAPDHと 比較して示している。カラムとバーはそれぞれ、平均値と標準偏差 (SD)を表している 。 2検体中 1検体の代表結果を示した。
[0079] また、 ρ21αρ1による炎症メディエーター（関節破壊関連因子)の分泌抑制は、少なく とも部分的には IL— 1R1発現のダウンレギュレーションに起因するはずである（Non omuraら; J Immunol. 2003 ; 171 : 4913—4919参照）。しカし、 161>¾43発現 RSFにおいて、 IL— lRlmRNA発現は、コントロール 'アデノウイルスを感染させた ものと比較して低下して 、な力つた（図 1G)。
[0080] 以下、図 1Gを具体的に説明する。図 1Gは、 p21eiplは IL—lRlmRNA発現をダ ゥンレギュレートする力 pl6INK4aは IL— lRlmRNA発現をダウンレギュレートしない ことを示す図である。コントロール 'ウィルス感染 RSF (コントロール、白いカラム）及び 16皿4 デノゥィルス感染1^? (1) 16皿43、黒いカラム）の RNAについて、 I型イン ターロイキン 1受容体（IL 1R1)及びグリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナ ーゼ（GAPDH)の mRNA発現をノーザンブロット解析により検証した。 IL— lRlmR NA発現に対する ρ21αρ1アデノウイルス (ρ21αρ1、灰色のカラム）の作用も、同様に 図示した。カラムとバーはそれぞれ、 3検体の平均値と標準偏差 (SD)を表している。 ρ21αρ1による IL— lRlmRNA発現の平均低下率は 71%であった（*Pく 0. 05)。 p 21αρ1とは異なり、 pl6INK4aは、 IL— lRlmRNA発現に影響を与えな力つた。
[0081] また、本発明者らや他のグループにより、 ρ21αρ1〖お NKと結合して JNK酵素活性を 低下させることが示されている（Nonomuraら; J Immunol. 2003 ; 171 :4913— 4 919、 Shimら； Nature. 1996 ; 381 : 804— 806、及び、 Perlmanら; J Immunol. 2003 ; 170 : 838— 845参照）。本発明者ら ίま、更に、 p21Cipl発現 RSFにお!/、て、 A P— 1の DNA結合活性の低下を示しており、 AP— 1〖お NK経路の下流に存在する ことを示している（Nonomuraら; J Immunol. 2003 ; 171 : 4913— 4919参照）。こ のことから、 JNKの免疫沈降により、 p l6INK4a^JNKとの結合活性を検証した。また、 p 21Cipl^JNKとの結合活性を確認した。
ヒト p 16INK4a遺伝子を含む AxCAp 16アデノウイルス感染 RSF細胞又はヒト p2 lCipl 遺伝子を含む AxCAp21アデノウイルス感染 RSF細胞の溶解物を、抗 16^^又は抗 ρ21αρ1抗体を用いて免疫沈降させた。続く免疫ブロッテイングでは、 pl6INK4aではな ぐ ρ21αρ1が JNKと結合することが明らかになった（図 1Η)。 ρ21αρ1とは異なり、 ρ ΐθ1 NK4aは、 30分間にわたりサイト力イン刺激された RSFにおいて、 AP— 1および NF— κ Βの DNA結合活性を阻害しな力つた (データは図示せず)。これらのデータは、 p i 6INK4aは、炎症メディエーターの産生を阻害するために、 JNK経路抑制または IL 1 R1発現抑制に依存しな 、ことを示して 、る。
[0082] 以下、図 1Hを具体的に説明する。図 1Hは、 ρ21αρ1は c Jun N 末端キナーゼ
CiNK)と共に免疫沈降されたが、 p l6INK4a及び p l8INK4e (後述、実施例 3)タンパク質 は、 c Jun N 末端キナーゼ (JNK)と共に免疫沈降されなカゝつたことを示す図で ある。 p l6INK4a又は p l8INK4e発現 RSF細胞の全抽出物を ΝΚ抗体 (Ab) -JN K)又はコントロール IgG (igG)と免疫沈降させ、各 CDKI特異的抗体 (抗— pl6INK4a ( a— p l6)、抗— p l8INK4cAb ( a— p l8)、抗— p21Cipl抗体 p21) )を用い て、ウェスタン'プロットにより解析した。別々の 2検体の、ウェスタンブロットの代表結 果を示している。
[0083] <評価結果:実施例 3 (p l8INK4e) >
pl8INK4eは、前記実施例 1及び 2と同様にして JNKとの結合を解析したところ、 ρ ΐθ1 NK4aと同様に、 JNKとは結合しな力 た（図 1H)。
また、ヒト pl8INK4c遺伝子を含む Ad— RGD— p l8アデノウイルス、及びコントロー ル'アデノウイルスを感染させた培養 RSFを用いて、実施例 1及び 2と同様に、細胞 増殖の評価及び遺伝子発現の評価を行った。 RSFが p l8INK4eを発現した場合、コン トロールと比較して、 3H—標識チミジンの取り込みが減少した（図 2A)。また、フロー' サイトメトリー解析によって、 pl81NK4e発現 RSFにおいて、細胞周期進行力GOZG1 期で阻害されることが明らかになった（図 2B)。培養上清を用いた ELISAでは、 P181 NK4c遺伝子導入が、 RSFによる MMP— 3及び MCP— 1タンパク質産生をダウンレギ ュレートさせることを示した（図 2C)。これらの3 H—標識チミジン取り込み、フローサイ トメトリー解析、及び ELISAにおける pl8皿4 cの結果は、 pl6皿4 aと類似しており、 pi 6INK4a及び pl8INK4eが同様の作用を有することが示唆された。
[0084] 以下に、図 2A〜Cを具体的に説明する。
図 2A及び Bは、 pl8INK4e遺伝子導入は RSFの増殖を抑制し、 GOZG1期における 細胞周期停止をもたらしたことを示す図である。図 2Aに、 pl8INK4e遺伝子を有するァ デノウィルス（pl8INK4c、黒!、カラム）又はコントロール 'アデノウイルス（コントロール、 白いカラム）を感染させた RSFを、 IL— 1 18及び TNF aで刺激して、 —チミジン取 り込みを評価した結果を示した。 3検体中 1検体の代表結果を示した。カラムとバーは それぞれ、 5個のゥエルの平均値と標準偏差 (SD)を表している。 pl8INK4eによる3 H —チミジン取り込みの平均低下率は 43%であった（* *Pく 0. 01)。図 2Bに、細胞周 期のフロー.サイトメトリー解析による、 pl8INK4eによる GO/G1期細胞の増加を示し た。 3検体の代表結果を示した。
図 2Cは、 pl8INK4e遺伝子導入は、 RSFによる MMP— 3及び MCP—1タンパク質 産生を抑制したことを示す図である。 pl8INK4eアデノウイルス (pl8INK4e、黒いカラム） 及びコントロール.アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させた RSFを、 IL —1 β及び TNF aの併用で刺激した。培養上清中の MMP— 3及び MCP— 1を EL ISAで測定した。カラムとバーはそれぞれ、 3検体の平均値と標準偏差 (SD)を現し ている。 18^4<：による MMP— 3及び MCP—1産生の平均低下率は、それぞれ 48 %、 71%であった。差は統計的に有意であった（*P< 0. 05, * *P< 0. 01)。
[0085] <評価結果：実施例 4 (CDK4I) >
被験物質として、 CDK4Z6キナーゼを特異的に阻害する合成化合物である CDK 41 (2 ブロモ 12, 13 ジヒドロ一 5H—インドロ [2, 3— 1]ピロ口 [3, 4— c]力ルバ ゾール—5, 7 (6H)—ジオン）（2— bromo— 12, 13 - dihydro - 5H - indolo [2, 3 - l]pyrrolo [3, 4— c] carbazole— 5, 7 (6H)— dione)を使用した。実施例 1と 同様に、 CDK4Iの RSFにおける影響を検証した。この化合物は、サイト力イン刺激さ れた RSFによる3 H チミジン取り込みを用量依存的に阻害した。検証された最高濃 度でさえ、細胞の生存に影響を及ぼすことなぐ細胞周期進行における GOZG1期 の割合を増加させた（図 3A及び図 3B)。 CDK4Iで処理された RSFは、コントロール である DMSO処理された RSFよりも、 MMP— 3及び MCP— 1のタンパク質産生量 が有意に減少した（図 3C)。
また、実施例 1と同様にして、 CDK4Iの MMP— 3及び MCP—1の mRNA発現量 に及ぼす影響を検証したところ、 p l6™K4aと同様に、 CDK4Iは RSFにおける MMP — 3mRNAを低下させたが、 MCP—lmRNAは低下させなかった（図 1E及び図 1F
) o
[0086] 以下に、図 3A〜Cを具体的に説明する。
図 3A及び図 3Bは、 CDK4Iは、 GOZG1期における細胞周期停止を誘導すること により、 RSFの増殖を阻害することを示す図である。 RSFを、阻害濃度の CDK4Z6 特異的インヒビター CDK4Iで 12時間処理し、次!、で IL— 1 β及び TNF aで刺激し た。図 3Aには、処理済み RSFによる3 H標識 チミジン取り込みを、未処理 RSFと比 較して示した。図 3Bには、フロ一'サイトメトリー解析において、培地コントロール（D MSO)と比較し、濃度 1 μ Μの CDK4Iで処理した細胞（CDK4I)での、 GOZG1期 の増加を示した。 2つの独立した実験の代表を示した。
図 3Cは、 CDK4Iは、 RSFによる MMP— 3及び MCP— 1タンパク質産生を抑制し たことを示す図である。 1 μ Μの CDK4I (CDK4I、黒いカラム）又はコントロールであ る 0. 5%DMSO培地（コントロール、白いカラム）で処理した RSFを、 IL—l jS及び T NF aで刺激した。培養上清の MMP— 3又は MCP—1を ELISAで測定した。カラ ムとバーはそれぞれ、 5検体の平均値と標準偏差 (SD)を表している。 CDK4Iによる MMP— 3及び MCP— 1産生の平均低下率は、それぞれ 57%と 64%であった（*P < 0. 05)。
[0087] <評価結果：実施例 5 (活性型 Rb) >
活性型、つまり非リン酸化型 Rb導入は、リウマチ様炎症に関与する組織分解酵素 の 1種である MMP— 1の産生を転写後レベルで抑制することが報告されている（Bra dleyら； Arthritis Rheum. 2004 ; 50 : 78— 87参照）。被験物質として、リン酸 化部位に置換変異を有する変異 Rb遺伝子を利用した。この遺伝子をアデノウイルス 導入することで、活性な非リン酸ィ匕型 Rbを増カロさせ、これによつて Rbの CDK依存性 リン酸化の抑制を模倣させた（Changら； Science. 1995； 267： 518— 522参照）。 実施例 1と同様に、活性型 Rbの、 RSFにおける影響を検証した。活性型 Rbの RSF が活性型 Rbを過剰発現した場合、コントロール RSFと比較し、 3H—チミジン取り込み が減少した（図 4A)。細胞周期のフロー ·サイトメトリー解析は、活性型 Rbが細胞周期 を GOZG1期に停止させることを示した（図 4B)。
細胞上清での ELISA解析は、活性型 Rbを発現する RSFにおける MMP— 3及び MCP— 1双方のタンパク質産生低下を示した（図 4C)。リアルタイム PCR解析は、コ ントロール RSFと比較し、活性型 Rb過剰発現 RSFにお!/、て MMP— 3及び MCP— lmRNAが維持されることを明らかにした（図 1E及び図 1F)。これらのことから、 MM P— 3の転写制御は、 Rb非依存的であることが示された。
以下に、図 4A〜Cを具体的に説明する。
図 4A及び図 4Bは、構成的活性型 Rbの遺伝子導入は、 RSFの増殖を抑制したこ とを示す図である。非リン酸ィ匕型 Rbをコードするアデノウイルス (Rb、黒いカラム）又 はコントロール ·アデノウイルス（コントロール、白 、カラム）を感染させた RSFを IL - 1 j8及び TNF o;で刺激し、 —チミジン取り込みを評価した。図 4Aは3 H—チミジン 取り込みの評価結果である。 2検体中 1検体の代表結果を示している。カラムとバー は 5個のゥエルの平均値と SDを表している。図 4Bには、フロ一'サイトメトリー解析に おける、構成的活性型 Rb発現 RSFにおける細胞周期 GOZG1期の増加を示した。 独立した 2検体の代表を示した。
図 4Cは、構成的活性型 Rbは、 RSFによる MMP— 3及び MCP— 1タンパク質産 生を抑制したことを示す図である。構成的活性型 Rbアデノウイルス (Rb、黒いカラム） 又はコントロール.アデノウイルス（コントロール、白いカラム）を感染させた RSFを、 IL —1 β及び TNF aの併用で、 24時間刺激した。培養上清中の MMP— 3及び MCP — 1を、 ELISAで測定した。刺激された RSFによるこれらの分子の産生を、コントロー ル'アデノウイルスを感染させたコントロール RSFと比較して示した。カラムとバーはそ れぞれ、 3検体の平均値と標準偏差（SD)を表している。 Rbによる MMP— 3及び M CP— 1産生の平均低下率は、それぞれ 48%、 36%であった（*P< 0. 05)。
[0089] 以上、実施例 1〜5により、被験物質として選択した p l6INK4a、
Figure imgf000036_0001
pl8INK4e、 C DK4I、活性型 Rbは、それぞれが抗関節リウマチ活性を有すると評価することができ た。また、被験物質の種類により各項目の評価結果が異なることから、各被験物質は 、多様な経路で関節破壊関連因子と関係しており、それぞれが独自の、関節リウマチ に対する抑制効果を有して 、る可能性が示された。
[0090] (実施例 6 :硬骨における評価）
被験物質として、 CDK4I (CDK4インヒビター； Merck社製）を選択し、硬骨組織の 破壊を誘導する生命現象に対する抑制作用の観点から、 CDK4Iの抗関節リウマチ 活性を以下のようにして評価した。
[0091] <破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化の評価 >
DBAZUマウス (オリエンタル酵母工業 (株)製)の大腿骨より採取した骨髄細胞 (B M)を、 2. 5 X 104細胞 Zゥエル（48ゥエルプレート）でまき、 10%ゥシ胎仔血清（FB S : fetal bovine serum ; Hyclone社)、 20ngZmlマクロファージコ口-一束 [J激因 子 (M—し si7： macrophage colony— stimulating factor； peprotech社) ¾r¾' ん 7こ α— MEM培地 ( a― minimum essential medium； Invitrogen社)で 2日 間培養した。 2日後、付着した細胞を骨髄 Zマクロファージ系統細胞 (BMM : bone marrow macrophages)とした。 BMMを、 20ngZml M— CSF、 lOOngZml 破骨細胞分化誘導因子（RANKL : soluble receptor activator of NF— κ Β ligand； peprotech)を含んだ oc - MEM培地で培養し、破骨細胞（OC： Osteocla st)に分化させた。 OC分化に及ぼす CDK4Iの作用を検討するため、 CDK4I (CDK 4inhibitor ; Calbiochem社）を、 RANKL添カ卩と同時に、図 5Bに示す各濃度で細 胞に加えた。 3日後、 TRAP染色キット（セルガレージ)で細胞を染色し、 TRAP陽性 多核（核が 3つ以上認められる）細胞（TRAP + MNC： tartrate -resistant acid pnosphatase— positive multinucleated ( ^ d nuclei^ cells)をカウントした。 また、 RAW264. 7細胞（ATCCより入手）（1 X 103細胞 Zゥエル； 96ゥエルプレー ト）は、前記 BMと同様に、 CDK4K 1 μ Μ)存在、又は非存在下で、 RANKL ( 100η gZml)で刺激し、 5日後、 TRAP + MNCをカウントした。
[0092] <細胞増殖の評価 >
CDK4Iによる細胞増殖への作用を検討するため、前記と同様に骨髄細胞 (BM)を 1. 25 X 104細胞（96ゥエルプレート）まき、 M— CSF存在下で 2日間培養した後、 M — CSF、 RANKL、及び、 CDK4I (1 μ Μ)の存在又は非存在下で、 3日間培養した 。細胞増殖は、セルカウンティングキット— 8 (Cell Counting Kit— 8 ;同仁化学） で評価した。
[0093] <遺伝子発現の評価 >
一定量的 PCR—
BMMに RANKLをカ卩えて、 3日後の細胞から RNeasy ミニキット（RNeasy Mini kit;Qiagen社）にて全 RNAを抽出した。 1 μ gの全 RNAを、ォムニスクリプト RTキ ッ HOminiscript RT kit;Qiagen社）にて cDNAに合成した。サイバーグリーン（ Sybr Green)を用いた定量的 PCR法で、活性化 T細胞核内因子 cl (NFATcl :n uclear factor of activated T cells cl)、破骨細胞会合受容体（OSCAR: o steoclast - associated receptor)、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（TRAP : tart rate— resistant acid phosphatase)の各遺伝子発現を、内 '性コントローノレとし て GAPDHを用い、リアルタイム PCR装置 ABI7900 (アプライドバイオシステム社製 )にて解析した。 BMの発現を 1として、各遺伝子発現を評価した。
[0094] <評価結果 >
M— CSF及び RANKL存在下で、 BMMから OCに分化誘導されるときの、 CDK4 Iの作用を解析した。 CDK4Iはコントロール（DMSO)と比べて、著しく OC分化を抑 制した（図 5A及び図 5B)。
細胞増殖に影響を与えな 、CDK4I ( 1 M)の濃度においても、（図 6)、破骨細胞の 分ィ匕抑制が認められることから（図 5B)、 CDK4Iは細胞増殖抑制に依存せずに、破 骨細胞分ィ匕を抑制することが考えられた。
また、 RAW264. 7でも破骨細胞分ィ匕の抑制が認められたことから（図 7A及び図 7 B)、 CDK4Iは M— CSFの作用には影響を与えず、 RANKLによる作用を阻害する ことで、 OC分ィ匕を抑制して 、ることが示唆された。 RANKLは、破骨細胞の分化に必須な遺伝子である NFATclの発現を誘導する ことが知られている。 NFATclの mRNA発現を定量的 PCR法で検討したところ、 C DK4Iは NFATclの発現を著明に抑制した（図 8A)。更に、 NFATclによって発現 誘導される OSCARや TRAPの mRNA発現も顕著に抑制された（図 8B及び図 8C) 。このこと力ら、 CDK4Iは NFATclの発現を阻害することで、 OCの分化を抑制して いることが示唆された。
[0095] 以上、実施例 6により、被験物質として選択した CDK4Iは、抗関節リウマチ活性を 有すると評価することができた。
[0096] (参考例： CDK4及びサイタリン D 1の共導入）
なお、参考例として、 RSFへの、 CDK4及びサイクリン D1の共導入の影響を調べ た。
核局在化シグナルを有するヒト 'サイクリン D1を導入したアデノウイルス (Ad— D1N LS)、及びヒト CDK4遺伝子を導入したアデノウイルス (Ad— CDK4)を準備した (Ta mamori— Adachiら； Biochem Biophys Res Commun. 2002 ; 296 : 274- 2 80、及び、 Tamamori— Adachら； Circ Res. 2003 ; 92 : el2— 19参照）。実施例 1と同様にして、 RSFにおける CDK4及びサイクリン Dlの共導入の影響を検証した。 結果を以下に示す。
[0097] 正常細胞での CDK4Z6活性はサイクリン D量によって制御される力 サイクリン D 遺伝子導入のみでは RSFの細胞周期進行を加速させな力つた (データは図示せず） 。核内 CDK4と結合するサイクリン Dの機能を促進させるために、サイクリン D1導入 遺伝子の産物に核局在化シグナルをコードするミニ遺伝子を付加することで核内へ 移動 せた (Tamamori— Adachiら； Biochem Biophys Res Commun. 2002 ; 296 : 274— 280参照）。アデノウイルスにより、 RSFにサイクリン Dl— NLS遺伝子 コンストラクトと CDK4遺伝子を共導入することで、 Rbがリン酸ィ匕された、つまり、 Rb が不活化された（Tamamori— Adachiら； Circ Res. 2003 ; 92 : el2— 19)。これ は、培養 RSFでの3 H—チミジン取り込みをアップレギュレートさせ、 G0ZG1期の細 胞を減少させた（図 9A及び図 9B)。
また、サイクリン D1と CDK4とを共導入することで、 CDK4Z6キナーゼ活性を上昇 させた場合の、 RSFでの炎症メディエーターの産生（間接破壊関連因子）に対する 影響を調べた。調製されたアデノウイルスの力価には限度があるため、培養上清に ついては MMP— 3の ELISAのみ行った。サイクリン Dl—NLSと CDK4を過剰発現 する RSFを刺激した場合、コントロール 'ウィルス感染 RSFを刺激した場合よりも多量 の MMP— 3を産生した（図 9C)。したがって、 MMP— 3発現レベルは CDK4活性と 直接相関していた。 CDK4活性の上昇は、細胞増殖及び RSFでの MMP— 3発現を アップレギュレートさせることが示された。
[0098] 以下に、図 9A〜Cを具体的に説明する。
図 9A及び図 9Bは、サイクリン Dl—NLS及び CDK4の同時遺伝子導入は RSFの 増殖を高めたことを示す図である。 NLSを有するサイクリン D1及び CDK4をコードす るアデノウイルス（D1 + CDK4、黒いカラム）、又はコントロール 'アデノウイルス（コン トロール、白いカラム）を、 RSFに感染させた。感染から 60時間後、 RSFによる3 H— チミジン取り込みをカウントした。 3H—チミジン取り込みの結果を、図 9Aに示している 。カラムとバーはそれぞれ、平均値と標準偏差 (SD)を表している。平均増加率は 24 0%であった。差は統計的に有意であった（* P< 0. 01)。また、細胞周期のフロー · サイトメトリー解析の結果を、図 9Bに示している。コントロールであるアデノウイルス感 染 RSF (コントロール）と比較し、サイクリン D1— NLS及び CDK4の遺伝子を導入し た RSF (D1 +CDK4)においては、 GOZG1期の細胞の減少が示された。独立した 2検体の代表を示した。
図 9Cは、サイクリン D1—NLS及び CDK4の遺伝子導入力 RSFによる MMP— 3 タンパク質産生をアップレギュレートさせたことを示す図である。 NLSを有するサイタリ ン D1及び CDK4 (D1 + CDK4、黒いカラム）発現 RSFと、コントロール RSF (コント口 ール、白いカラム）との培養上清における MMP— 3を、 ELISAにより測定した。カラ ムとバーはそれぞれ、コントロール RSFと比較した、 3検体の平均値と標準偏差 (SD) を示している。平均増加率は 490%であった（* *Pく 0. 01)。
[0099] なお、図 10には、本実施例 1〜5及び参考例で関節リウマチ性の滑膜線維芽細胞
(RSF)について示された、 CDKを介した関節破壊に関連する生命現象の多様な調 節を、経路図として表した。 pl6INK4a、 pl8INK4c、又は小分子 CDK4インヒビター（CDK4I)によるサイクリン D— CDK4Z6阻害は、 RSFでの MMP— 3及び MCP— 1タンパク質産生を抑制した。 また、この CDK4Z6阻害は MMP— 3mRNAを抑制した力 MCP—lmRNAは抑 制しなかった。活性型 Rbは、転写後調節により MMP— 3及び MCP— 1タンパク質 発現を低下させた。 ρ21αρ1は CDK— Rb経路以外で抗炎症作用を発揮できることが 報告されており、本実施例においても同様に確認された。サイクリン依存性キナーゼ 4Z6は、網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb)依存的及び非依存的経路により、種々の関 節炎メディエーター（関節破壊関連因子)の発現を直接的に制御することが示唆され た。
また、本実施例における結果から、以下のようなことが実証又は推測される。
本実施例にお 、て、 CDK4Z6キナーゼ活性が Rb非依存的に MMP— 3産生を制 御することが明らかにされた。この制御は mRNAレベルである。 CDK4Z6の基質で ある Rbは、 MMP— 3と同様に、 MCP—1の発現を転写後レベルで調節可能である が、 CDK4Z6活性はこれよりも上流で作用している（図 10)。現在、知られている唯 一の CDK4Z6の基質は Rbであり、これは細胞周期進行のための E2F転写因子の 機能的可用性を調節する。本実施例の結果は、 MMP— 3mRNAの産生を調節す る、 Rb以外の、 CDK4Z6への結合分子の存在を予測している。また、 MMP— 3m RNA以外の組織分解酵素の mRNA発現も、同様に調節されて 、る可能性が高!、。
Bradleyらは、 Rbのリン酸ィ匕状態と MMP— 1及び IL 6産生との相関関係を報告 した（Bradleyら； Arthritis Rheum, 2004 ; 50 : 78— 87参照）。彼らは、非リン酸 化 Rbによる転写後レベルでの MMP— 1発現抑制を示し、この抑制が p38キナーゼ 阻害を介することを示唆した。本発明者らは、同様の調節が MMP— 3及び MCP— 1の翻訳において作用することを見出した。しかし、本発明において明らかにされた R b非依存的制御は、 MMP— 3産生調節の中心にあると考えられる。これは、 Rb依存 性制御よりも上流にある。また、 CDK阻害分子が、活性型 Rbと同程度の効率で MM P 3産生を抑制することも指摘されて 、る。
本発明者らは、 p21eiplが CDK非依存的に炎症メディエーターを調節可能であるこ とを報告した。本実施例において、本発明者らは、 CDKとその基質である Rbは個別 にそれらを調節可能であることを示している。したがって、細胞周期タンパク質は、多 様な経路において炎症分子の発現と密接に関連している。恐らぐ未知なる進化上 の選択が、細胞周期調節因子による炎症の安全制御をもたらしたのであろう。
また、 CDK4Z6の阻害によりダウンレギュレートされる炎症メディエーター（関節破 壊関連因子）は、リウマチ様炎症において重要な役割を果たす。それにもかかわらず 、 pl6INK4aは、 MMP— 3及び MCP—1の産生を完全には消失させなかった。 IL—1 β及び TNF aで刺激された P 16INK4a発現 RSFは、未刺激の RSFよりも多量の炎症 メディエーターを産生する。 CDK4Z6阻害による抗炎症作用は、 CDKI遺伝子治療 における CDKIの増殖抑制作用を助ける可能性があると、本発明者らは推測してい る。
ヒーラ細胞において、 p l6™K4aは NF— κ Bと相互作用し、その転写を阻害する (W olff及び Naumann ; Oncogeneゝ 1999 ; 18 : 2663— 2666参照）。本発明者らの予 備試験では、 RSFの pl6INK4aが、 CDK4Z6非依存的に他のサイト力イン発現を調 節可能であることを示唆している。しかし、 RSFでの p l6INK4a過剰発現力 AP— 1及 び NF— κ Bの DNA結合活性を抑制しないことを本発明者らは見出した (データは 図示せず）。 Etsファミリー転写因子である Ets—1、 Ets— 2は、 MMP— 3発現をアツ プレギュレートさせるため、それらの抑制が MMP— 3発現のダウンレギュレーション の主な原因となる可能性がある（Wasylykら； EMBO J、 1991； 10 : 1127— 1134、 及び、 Whiteら； Connect Tissue Res、 1997 ; 36 : 321— 335参照；)。
pl6皿4 a、 pl8INK4 及び Ρ21αρ1遺伝子導入が、 CDK4/6活性の阻害により RS Fでの炎症メディエーターやプロテア一ゼの産生を抑制可能であることを本発明者ら は示した。小分子 CDKI化合物（CDK4I)も、これらの分子の発現をダウンレギユレ ートさせた。臨床応用のためには、遺伝子導入よりも、小分子 CDKインヒビターによ るサイクリン— CDKキナーゼ活性調節の方がより実現可能であると考えられる。多く の小分子 CDKインヒビターが既に開発されており、抗腫瘍薬として治験が実施され ている（Senderowicz ; Oncogene, 2003 ; 22 : 6609— 6620参照）。それらは関節 リウマチ治療に有用であろう。炎症分子の阻害は Rb非依存的であるため、異なるイン ヒビターが、増殖抑制及び抗炎症作用の異なるバランスを有する可能性がある。した がって、小分子 CDKインヒビターを用いて実際にリウマチ患者を治療する場合、 2つ の共同作用を最適化する必要があるだろう。その最適化においても、本発明の評価 方法及びスクリーニング方法は、非常に有用であると考えられる。
産業上の利用可能性
本発明の評価方法又はスクリーニング方法によれば、抗関節リウマチ活性を有する 物質を効率的に選択することができることから、優れた関節リウマチ治療薬又は予防 薬の候補物質の探索に非常に有用である。
前記評価方法又はスクリーニング方法は、例えば、以下（1)〜(4)のような用途に おいて、特に有用であると考えられる。
(1)新たに開発された関節リウマチ候補薬の、抗関節リウマチ活性を効率的に評価 することができる。
(2)公知の CDK阻害剤、他疾患対象の薬剤などの中から、関節リウマチ治療薬又は 予防薬として使用可能な物質を、効率的に選択することができる。
(3)既存の関節リウマチ治療薬又は予防薬の中から、例えば、患者の症状に応じて 所望の効果を有する治療薬又は予防薬を適切に選択することができる。
(4)既存の関節リウマチ治療薬又は予防薬に改良を加え、より副作用の少ない治療 薬又は予防薬など、所望の効果に優れた治療薬又は予防薬を効率的に得ることが できる。

Claims

請求の範囲
[I] 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
(b)関節組織の破壊を誘導する生命現象に対する被験物質の抑制作用を検出する 工程、を含むことを特徴とする方法。
[2] サイクリン依存性キナーゼが CDK4及び CDK6の少なくとも 、ずれかである請求項 1に記載の方法。
[3] 関節組織の破壊が軟骨組織の破壊である請求項 1から 2の 、ずれかに記載の方法
[4] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である請求項 3に記載の方法
[5] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞における MMP— 3の遺 伝子発現である請求項 3に記載の方法。
[6] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が滑膜線維芽細胞の増殖である請求項 3〖こ 記載の方法。
[7] 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
(b)滑膜線維芽細胞における MMP— 3の遺伝子発現に対する被験物質の抑制作 用を検出する工程、及び
(c)滑膜線維芽細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法。
[8] 関節組織の破壊が硬骨組織の破壊である請求項 1から 2の 、ずれかに記載の方法
[9] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が遺伝子発現である請求項 8に記載の方法
[10] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞における NFATclの遺伝 子発現である請求項 8に記載の方法。
[II] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞から破骨細胞への分化であ る請求項 8に記載の方法。
[12] 関節組織の破壊を誘導する生命現象が破骨前駆細胞の増殖である請求項 8に記 載の方法。
[13] 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、
(b)破骨前駆細胞における NFATclの遺伝子発現に対する被験物質の抑制作用を 検出する工程、及び
(c)破骨前駆細胞の増殖に対する被験物質の抑制作用を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法。
[14] 被験物質の抗関節リウマチ活性を評価する方法であって、
(a)サイクリン依存性キナーゼに対する被験物質の結合能力を検出する工程、及び
(b)破骨前駆細胞の増殖及び破骨細胞への分化に対する被験物質の抑制作用を 検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
[15] 抗関節リウマチ活性を有する物質のスクリーニング方法であって、
(A)請求項 1から 14のいずれかに記載の方法により、被験物質の抗関節リウマチ活 性を評価する工程、及び
(B)工程 (A)において抗関節リウマチ活性を有すると評価された被験物質を選択す る工程、を含むことを特徴とする方法。
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