JP5660578B2 - サリドマイド標的因子を利用したスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
この新知見をさらに発展させれば、サリドマイド誘導体に限らず、すべての被験物質においてCRBNとの結合性を調べればその物質のサリドマイド様の催奇性の有無を予見することができる。
また、本発明者は、ヒト由来CRBNのN末端から339〜442番目のアミノ酸残基がサリドマイドの結合領域であること、およびN末端から384番目のチロシン及び386番目のトリプトファンをアラニンに置換したヒト由来のCRBNは、ユビキチンリガーゼ複合体の構成因子としての機能を保持しつつ、サリドマイドとの結合性が低下することも見出した。
〔1〕被験物質をセレブロンもしくはその断片と接触させ、被験物質のセレブロンもしくはその断片に対する結合性を評価し、セレブロンもしくはその断片と結合しない被験物質、又はセレブロンもしくはその断片との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特徴とする非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔2〕被験物質が医薬であることを特徴とする〔1〕に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔3〕被験物質が、一般式(1)
ただし、式(1)中、XがR5−R7で、YがR6−R8である場合を化合物(A)、XがR5で、YがR6−R8である場合を化合物(B)及びXがR5で、YがR8である場合を化合物(C)とし、
また、R1、R2、R3およびR4は−H;−OH;=O;直鎖および分枝アルカン、アルケン、アルキン;環式アルカン、アルケンおよびアルキン;環式ならびに非環式アルカン、アルケンおよびアルキンの組み合わせ;アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、または環式、非環式と組み合わせたエーテル部分、あるいは環式/非環式部分の組み合わせ;アザ;アミノ;−MOnまたは−O−MOn[式中、M=Nそしてn=2;M=Sそしてn=2または3;あるいはM=Pそしてn=1−3である];そしてハロゲンから選択することができ;R5、R6、R7およびR8はそれぞれ独立して式(2)
R9は式(3)、(4)、(5)、(6)または(7)
H,−CH3,−COOH,−CONH2,−CH2)n−COOH,−(CH2)nCONH2
から選択され、n=1−4を有する部分である。
〔4〕セレブロンの断片が、配列番号7に示すアミノ酸配列において、そのN末端から339〜442番目のアミノ酸配列を有し、それ以外のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失および/又は付加がなされたアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔5〕セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とする〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔6〕サリドマイド誘導体が、サリドマイド又は既知のサリドマイド誘導体のもつ薬理作用を持つものであることを特徴とする〔3〕に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
〔7〕被験物質をセレブロン又はその断片と接触させ、被験物質とセレブロン又はその断片の結合性を調べ、セレブロン又はその断片と結合する被験物質を選択する工程、及び前記工程で選択された被験物質の中から、i)催奇性、又はii)セレブロンを含むユビキチンリガーゼ複合体の活性阻害作用を軽減する物質を選択する工程とを含むことを特徴とする催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法。
〔8〕セレブロン又はその断片が、担体に固定されていることを特徴とする〔7〕に記載の催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法。
〔9〕以下の(a)及び/又は(b)のアミノ酸置換を有することを特徴とする変異型セレブロン;
(a)ヒト由来のセレブロンにおけるN末端から384番目のチロシン若しくはこれに相当するアミノ酸がアラニンに置換されたもの
(b)ヒト由来のセレブロンにおけるN末端から386番目のトリプトファン若しくはこれに相当するアミノ酸がアラニンに置換されたもの。
〔10〕〔9〕に記載の変異型セレブロンをコードすることを特徴とする核酸。
〔11〕〔10〕に記載の核酸を遺伝子として導入し、発現させたことを特徴とするサリドマイド催奇性耐性非ヒト動物。
本発明の非催奇性物質のスクリーニング方法は、被験物質をCRBNもしくはその断片と接触させ、被験物質のCRBNもしくはその断片に対する結合性を評価し、CRBNもしくはその断片と結合しない被験物質、又はCRBNもしくはその断片との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特徴とするものである。
CRBN等との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質の選択は、例えば、被験物質の代わりにサリドマイドを用いた対照実験を行い、被験物質の結合性とサイリドマイドの結合性とを比較することにより行うことができる。
医薬の中では、サリドマイド誘導体が重要である。
サリドマイド誘導体としては、例えば次の一般式(1)で示される化合物があげられる。
一般式(1)
また、R1、R2、R3およびR4は−H;−OH;=O;直鎖および分枝アルカン、アルケン、アルキン;環式アルカン、アルケンおよびアルキン;環式ならびに非環式アルカン、アルケンおよびアルキンの組み合わせ;アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、または環式、非環式と組み合わせたエーテル部分、あるいは環式/非環式部分の組み合わせ;アザ;アミノ;−MOnまたは−O−MOn[式中、M=Nそしてn=2;M=Sそしてn=2または3;あるいはM=Pそしてn=1−3である];そしてハロゲンから選択することができ;R5、R6、R7およびR8はそれぞれ独立して式(2)
R9は式(3)、(4)、(5)、(6)または(7)
H,−CH3,−COOH,−CONH2,−CH2)n−COOH,−(CH2)nCONH2
から選択され、n=1−4を有する部分である。
サリドマイド誘導体は、サリドマイドや既知のサリドマイド誘導体の持つ薬理作用を持つものが好ましい。
サリドマイドの薬理作用としては、(i)bFGFにより誘導される血管新生の抑制、(ii)LPS刺激したヒト単球からのTNF-α産生の抑制、ヒト骨髄腫細胞等の腫瘍細胞とヒト骨髄ストローマ細胞との共培養により亢進するIL-6産生の抑制、(iii)多発性骨髄腫患者の末梢血中のナチュラルキラー細胞数の増加、T細胞受容体刺激後のIL-2及びINF-γ産生の亢進、およびIL-2依存的にT細胞の増殖の促進、(iv)ヒト骨髄腫細胞などの腫瘍細胞に対してアポトーシス誘導と細胞増殖の抑制などが確認されている。
そして、サリドマイドの疾病に対する予防、治療効果としては、鎮静作用、ハンセン病治療作用(具体的には、らい性結節性紅斑の治療作用)、移植病治療作用、多発性骨髄腫治療作用、固形がん治療作用、全身性エリテマトーデス治療作用、多発性硬化症治療作用、ベーチェット病治療作用、炎症性腸疾患(クローン病や潰瘍性大腸炎)治療作用などを例示できる。既知のサリドマイド誘導体の薬理作用としては、レナリドマイド(Lenalidomide)の多発性骨髄腫治療作用、骨髄腫異形成症候群(MDS)治療作用、ポマリドマイド(Pomalidomide)の多発性骨髄腫治療作用、骨髄線維症の治療作用などを例示できる。
まずサリドマイドを固定化したFGビーズを作製する。その固定化ビーズをCRBNが発現する細胞抽出液、もしくは組み換えタンパク質と混合し、1時間以上、回転機にて5rpm、4℃で混和状態を続ける。そしてバッファーで洗浄を行った後、例えば、被験物質としてサリドマイド誘導体を混合したバッファーをビーズに通すことにより、CRBNの溶出が生じるかどうかを確認する。検出方法としては、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、CBB染色、銀染色などが挙げられる。その際には、サリドマイドや、非結合が確認済みのフタルイミドが対照実験のサンプルとして用いられる。また、多摩川精機株式会社のFGビーズスクリーニング装置Target Anglerシリーズなどを用いることにより大量のサンプルの解析が可能である。
まずアミノ基もしくはカルボキシル基などの官能基をつけたCRBNをBIAcore基盤チップに固定させる。そしてその固定化チップを装着させたBIAcore3000などBIAcore計測装置(GE Healthcare)において、様々な誘導体を流入させ、その解離定数を計測する。サリドマイドやフタルイミドが対照実験として用いられる。
サリドマイド誘導体を含む溶液を試料セル中のCRBNを含む溶液へ数十回(たとえば18回)にわたって滴下する。各濃度の発生熱量をセル中における誘導体とCRBNのモル比に対してプロットすることにより相互作用の結合等温線が得られる。この結合等温線から解離定数を算出する。サリドマイドやフタルイミドが対照実験として用いられる。
本発明の催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法は、被験物質をCRBN又はその断片を混合などで接触させ、被験物質がCRBN又はその断片と結合するか否かを評価し、CRBN又はその断片と結合する被験物質を選択する工程、及び前記工程で選択された被験物質の中から、i)催奇性、又はii)CRBNを含むユビキチンリガーゼ複合体の活性阻害作用を軽減する物質を選択する工程とを含むことを特徴とするものである。
FH-CRBNを発現する293T細胞において、アンタゴニスト候補およびサリドマイドを加える。そしてその細胞抽出液におけるユビキチン化タンパク量をウェスタンブロッティングで決定する。その際に、アンタゴニストを加えることで、サリドマイド単独の場合よりユビキチン化タンパク量の減少が抑制されれば、それはアンタゴニストである。
ゼブラフィッシュ胚から卵殻を除去したものに対し、サリドマイドとアンタゴニスト候補を薬浴させる。耳胞およびヒレ形成に対して、サリドマイド単独と比べ異常が緩和されていれば、アンタゴニストといえる。
本発明の変異型CRBNは、以下の(a)及び/又は(b)のアミノ酸置換を有することを特徴とするものである。
(b)ヒト由来のCRBNにおけるN末端から386番目のトリプトファン若しくはこれに相当するアミノ酸をアラニンに置換する。
本発明において「ヒト由来のCRBNにおけるN末端から384番目のチロシンに相当するアミノ酸」とは、図12に示すように、アミノ酸の同一性に基づいて整列させた際に、ヒト由来のCRBNのN末端から384番目のチロシンと一致するアミノ酸を意味する。図12に示すように、マウス由来のCRBNではN末端から361番目のチロシン、ゼブラフィッシュ由来のCRBNではN末端から374番目のチロシン、キイロショウジョウバエ由来のCRBNではN末端から517番目のチロシン、シロイヌナズナ由来のCRBNでは504番目のチロシンが、これに該当する。同様に、本発明において「ヒト由来のCRBNにおけるN末端から386番目のトリプトファンに相当するアミノ酸」とは、アミノ酸の同一性に基づいて整列させた際に、ヒト由来のCRBNのN末端から386番目のトリプトファンと一致するアミノ酸を意味する。図12に示すように、マウス由来のCRBNではN末端から363番目のトリプトファン、ゼブラフィッシュ由来のCRBNではN末端から376番目のトリプトファン、キイロショウジョウバエ由来のCRBNではN末端から519番目のトリプトファン、シロイヌナズナ由来のCRBNでは506番目のトリプトファンが、これに該当する。
サリドマイド結合因子を精製するために、本発明者は磁性微粒子であるFGビーズを用いたアフィニティ精製を行った(引用文献9)。カルボキシル基が付加されたサリドマイド誘導体であるFR259625をFGビーズに共有結合により固定化し(図6)、ヒトHeLa細胞の抽出液と混合し、インキュベートした。その後、洗浄を行い、結合因子を遊離サリドマイドを用いることで選択的溶出を行った。そして溶出画分をSDS-PAGEおよび銀染色で解析した結果、127kDaと55kDaの二つのタンパク質が特異的に溶出されることがわかった(図1A, Lane 3)。ビーズと混合する前にあらかじめ遊離サリドマイドを抽出液に加えておくと、アフィニティ精製により得られるこれらタンパク質の収量が著しく減少した(図1A, Lane 4)。つまり、これらのタンパク質はサリドマイドに特異的に結合することが示されたのである。これら127kDaおよび55kDaのタンパク質は質量分析計により解析され、それぞれDDB1及びCRBNであることを突き止めた(表1)。これらタンパク質はウェスタンブロッティング(immunoblotting)によっても確認され(図1A)、さらに様々な細胞の抽出液からも精製されることが分かった(図7)。サリドマイドとの相互作用が直接的かどうかを調べるために、本発明者はこれらの組み換えタンパク質を精製した。サリドマイド固定化ビーズにCRBN-FLAGのみが結合し、DDB1-V5-Hisは結合しなかった(図1B)。よって、DDB1はCRBNを介してサリドマイドに間接的に結合しているのでないかと考えた。結果としてサリドマイドはCRBNに直接結合しており(図1C)、DDB1はCRBNとの相互作用を介してサリドマイドと結合しているという結論が得られた。
ヒトのCRBN遺伝子は元々は常染色体性劣性軽度精神遅滞の原因候補因子として報告されており(引用文献11)、442個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。このタンパク質は進化的に良く保存されており、植物からヒトまで存在する。近年のプロテオミクス解析によりCRBNはDDB1と結合することは報告されていたが(引用文献12)、機能的な関わり合いは明らかにされておらず、CRBNの生物的機能はほとんどわかっていない。
まず本発明者はCRBN機能へのサリドマイドの効果を調べるために、生化学的な解析を行った。最初にFH-CRBNを安定的に発現させた293T細胞株を作製し、その細胞抽出液からFLAG抗体にて免疫アフィニティ精製を行うことによりCRBN結合タンパク質を明らかにすることにした。精製物に対し銀染色を行ったところCRBNはDDB1とほぼ1:1のモル比で結合していることが明らかになった(図8)。免疫染色(図2A)によるとCRBNとDDB1は主に核において存在していた。この結果は、核においてこれらが重要な機能を担っていることを示唆するものである。DDB1はCul4(Cul4AもしくはCul4B)、Regulator of Cullin 1(Roc1)そして基質レセプターとともにE3ユビキチンリガーゼを形成することが報告されている(引用文献13、14)。基本的に、E3ユビキチンリガーゼの機能とは、ユビキチン結合酵素(E2)と特異的に相互作用することにより基質にポリユビキチン鎖を付加するというものである(引用文献15,16)。Cul4は足場タンパク質として働き、Roc1はRING finger domainを持っており、E2と相互作用することが可能である。基質レセプターとしては、DDB2, CSA, SV5-V, CDT2そしてAhRが知られており、基質に直接結合してユビキチン化を仲介する(引用文献13, 7-20)。
本発明者はCRBNがE3複合体の他の構成因子と相互作用するか検証し、DDB1、Cul4A及びRoc1がFH-CRBNと複合体を形成することを明らかにした(図2B)。もしCRBNが新規の基質レセプターであるならば、DDB1への結合に対して、CRBNはDDB2といった他の基質レセプターと競い合うことが期待される。実際、DDB2の発現量を増やしていくにつれて、CRBNと共沈するDDB1の量は減少した(図2C)。つまりCRBNはDDB1-Cul4-Roc1 E3ユビキチンリガーゼの基質結合サブユニットであるかもしれないという結果が得られたのである。
CRBN-サリドマイド間の結合とその機能的重要性の基盤を明らかにするために、本発明者はサリドマイド非結合性でありながらE3複合体形成能を有するCRBN点変異体を得たいと考えた。まずN末端側欠損変異体とC末端側欠損変異体を作製し、サリドマイド結合領域を調べた結果、C末の104アミノ酸領域であることが判明した(図3A及びB)。シロイヌナズナからヒトに至るまでの多数のCRBNホモログの相同性解析からC末端側が極めて保存されていることが分かった(図12)。進化的によく保存されたアミノ酸がサリドマイドとの結合に重要なのではないかと考え、いくつかの点変異体を作製した。そして二つのアミノ酸、Y384あるいはW386をアラニンに置換した変異体はサリドマイド結合能が低下することが分かった(図3C)。さらに、Y384A/W386A (CRBN YW/AAと呼ぶ二残基同時に置換した変異体)は極めてサリドマイドとの結合能が低いことが分かった(図3C)。本発明者はこのCRBN YW/AAが活性を保持しているのか調べた。細胞内局在は野生型とこの変異体で差異は見られなかった。本発明者はこのCRBN YW/AAにおいてもDDB1、Cul4A、Roc1が免疫沈降により精製され、MG132存在下において自己ユビキチン化されることを見出した(図3E及びF)。つまりCRBN YW/AAは野生型CRBNと同様にE3複合体を形成し、機能も保持していることが分かった。
YW/AAを安定的に発現させ、MG132および薬理学的に妥当な量のサリドマイド(10,30,100μM)で処置した。野生型CRBNの自己ユビキチン化はサリドマイドにより強力に阻害されたが、CRBN YW/AAの自己ユビキチン化はサリドマイドにより阻害されなかった(図3G)。よって、サリドマイドはCRBNと結合することによりそのE3機能を阻害することが示唆された。
次に本発明者は動物モデルを用いてサリドマイド催奇性におけるCRBNの役割を検証することにした。サリドマイドはマウスにおいては催奇性を呈しないが、ウサギやニワトリにおいては発揮する(引用文献1-3)。本研究においては、本発明者はゼブラフィッシュ(Danio rerio)を以下に示す理由でモデルとして採用した。(i)発生が早くまた体が透明なことから観察が容易(ii)遺伝子抑制が比較的容易(引用文献21)(iii)ゼブラフィッシュは薬理毒性科学において適している(引用文献22)。従来、サリドマイドがゼブラフィッシュにおいても催奇性を示すかどうかは知られていなかったが、近年になりサリドマイドはゼブラフィッシュにおいて血管新生阻害を引き起こすことが分かったので(引用文献23)、本発明者はゼブラフィッシュにおいてもサリドマイドが催奇性を示すと考えた。
サリドマイドとCRBNの関連性については判明したので、本発明者はCRBNを含むユビキチンリガーゼ複合体が催奇性に関わるのかどうかを、zCul4Aを発現抑制することで、検証した。zcul4a mRNAは脳やヒレで強く発現している(図13)。予想通り、zcul4a AMOにより耳胞及びヒレの異常が生じた(図4G-I)。27hpfにおいてzCul4aを発現抑制した胚では耳胞サイズが著しく減少しており(コントロールサイズの40%)、zcul4aのmRNA導入により部分的にも救済(rescue)された。救済が部分的だったのは、zcul4a AMOの効き目が強すぎたためかもしれない。これらのことより、少なくとも、ユビキチンリガーゼ複合体が耳とヒレの発生に必要であリ、サリドマイドの標的であることが示唆された。
既知の非催奇性サリドマイド誘導体であるフタルイミドのCRBN及びDDB1に対する結合性を以下のようにして調べた。
293T細胞抽出液をサリドマイド固定化ビーズと混合し、2時間反応させた。その後、0.5%NP-40 lysis buffer
(Tris-HCl pH8, 150 mM NaCl, 0.5%NP-40)で3回洗浄し、0.1-1 mMのサリドマイド、フタルイミド、グルタルイミド、もしくは5HPP-33(各化合物の構造式を図17に示す。)を含む0.5% NP-40 lysis bufferで1時間混合することでCRBNの溶出を行った。得られた溶出画分は、SDS-PAGEの後、CRBN抗体に対するウェスタンブロッティングを行い、解析した。この結果を図18に示す。
サリドマイド及び5HPP-33の多発性骨髄腫細胞Kms12に対する増殖抑制作用を調べた。
多発性骨髄腫細胞Kms12の培養にはRPMI Medium 1640 (10% FBS) を用いた。各薬剤処理を行う場合にはKms12を1 mlあたり2 x 105細胞に調整し、2 ml eppendorf tubeに2 mlずつ分注した。添加する薬剤(サリドマイドもしくは5HPP-33)はジメチルスルホキシド(DMSO)を溶媒として最終濃度の1000倍濃度のストック溶液を作製し、2 mlの細胞懸濁液に対し2μlのストック溶液を加え、穏やかかつ十分に転倒混和させた。処理後、96 well plateに1well あたり100 μl分注したものを37℃, 5%CO2のインキュベーターで48時間培養した。処理後48時間での細胞数の測定には生細胞数測定試薬SF(nacalai tesque)を1 wellあたり10 μl加え37℃, 5%CO2のインキュベーターで2時間培養した。細胞数に比例する450 nm吸光度の測定にはGloMax-Multi+ Detection System(promega)を用いた。検量線の作製には1 mlあたり1 x 106, 3 x105,1 x 105細胞のKms12を用いた。溶媒処置時の細胞数を100とし、薬物添加時の細胞数を相対値で表した。48時間培養後の細胞数の相対値を図19に示す。
CRBNの機能がDDB1-Cul4A-Roc1 E3ユビキチンリガーゼ複合体における基質レセプターであることは支持される。CRBNと良く知られた基質レセプターであるDDB2はDDB1と競合的に結合する。第二に、CRBNは他の基質レセプターと同様に自己ユビキチン化される。DDB2を含む多くの基質レセプターがWDXR構造(motif)を有する(引用文献11,19)。一方で、少数のいくつかの基質レセプターにはそれが欠けている(引用文献13,18)。CRBNには明確なWDXRモチーフが見当たらないことから、どうも後者のタイプのようである。上記の考えを支持する結果として、CRBNおよびCul4Aのゼブラフィッシュによる発現抑制が似たような結果をもたらしたことが挙げられる。ただし、CRBNの発現抑制に比し、Cul4Aの発現抑制は形質に及ぼす影響がより深刻であった。この観察結果はそれほど驚くにはあたらない。なぜならば、CRBNを有するDDB1-Cul4Aユビキチンリガーゼはほんの少量にしか存在せず、CRBNはDDB1-Cul4Aのほんの少数の複合体にしか影響を与えられない一方で、Cul4Aの抑制はすべての複合体に影響を与えることになるからである。
(1)薬剤
サリドマイド(Tocris Cookson)の最終濃度が400mMになるようにジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、65℃に加熱して溶解し、直ちに使用した。MG132は最終濃度10mMになるようにDMSOを加えて溶かした。実験においては陰性対照(コントロール)として同等量のDMSOを用いた。
サリドマイド固定化ビーズの作製に関する図を図6に示した。磁性FGビーズ(5mg,引用文献10)に対して10mMの1-hydroxybenzotriazole, 10mM 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide HCl,そして2mMのFR259625(carboxyl thalidomide derivative)を、溶媒であるN,N-dimethylformamide (DMF)中で4時間室温で反応させることにより、サリドマイドを固定化した。またFGビーズにおける未反応のアミノ基は20%の無水酢酸が含まれたDMF中反応させることにより保護した。完成したビーズは4℃で保存した。
サリドマイド固定化ビーズ(0.5mg)は0.5%NP-40
lysis buffer (50mM Tris HCl pH8, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)により平衡化を行った。細胞抽出液はHeLa, Jutkat, THP-1, U266, HUVEC, LP101, SH-SY5Y, 293T由来と多岐にわたるが、それらの抽出法は文献の通りである(引用文献36)。これらの抽出液にビーズを混合し、2時間反応させた。0.5% NP-40 lysis bufferでビーズを3回洗浄した後、1mMサリドマイドによって溶出した。いくつかの実験では、0.3mMのサリドマイドをビーズとの混合前に抽出液に加えた。フタルイミドが結合するか否かについては、遊離サリドマイド1mMで溶出する過程で、代わりに1mMのフタルイミドで溶出した。
CRBNやDDB2 cDNAはRT-PCRによりHeLa total RNAから得た。CRBNの変異体は標準的なPCR法により作製した。DDB1 cDNAについてはMatsunaga博士から提供を受けた。zCrbnそしてzCul4a cDNAは24hpfにおけるゼブラフィッシュ胚のtotal RNAよりRT-PCRで得た。本研究では以下のベクターを用いた。pcDNA3.1-FH-N, pcDNA6/V5-His (Invitrogen), pFastBac1 (Invitrogen),pLenti6 (Invitrogen), pFASTBAC1 (Invitrogen), pLenti6 (Invitrogen), pCS2 (+), そしてpGEX6P-1 (GE Healthcare)。pcDNA3.1-FH-NはpcDNA3.1の派生物であり、pcDNA3.1にFLAG-HA配列を導入したものである。
CRBN抗体はヒトCRBN(65-76)を抗原としてウサギから作製したものである。FLAG (M2, Sigma), HA (3F10, Roche), V5 (V5-10, Sigma), GST (Sigma),
DDB1 (Abcam)そしてRoc1 (Zymed)は購入した。Cul4AおよびDDB2は譲渡されたものであり、それぞれRaychaudhuri博士、Matsunaga博士のご厚意による。
組み換えCRBN-FLAGおよびDDB1-V5-Hisタンパク質は昆虫Sf9細胞においてBac-to-bac (Invitrogen)バキュロウイルスシステムによって発現させ、それぞれ抗FLAG M2アガロースビーズ(Sigma)、Ni-NTAアガロースビーズ (Qiagen)により精製した。精製したCRBN-FLAG and/or DDB1-V5-Hisにサリドマイド固定化ビーズを混合し、結合タンパク質をSDS sample bufferで溶出した。CRBN欠損変異体解析においては、GST融合CRBNおよびその変異体を大腸菌であるBL21で発現させ、グルタチオンセファロースビーズ(GE helthcare)で精製した。CRBN変異体はLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて293T細胞に導入し過剰発現させた。そのあとの結合試験は上述と同じである。
CRBNとDDB1の間の相互作用を解析するために、CRBN-FLAGおよびDDB1-V5-HisをSf9細胞内に共発現させた。細胞抽出液に抗FLAGアガロースビーズを混合し、結合因子をFLAGペプチドで選択的に溶出した。CRBN複合体を精製するためCRBNおよびその変異体を発現する293T細胞を作製し、上述の方法でFLAG免疫精製を行った。
HAタグやV5タグ融合を用いたCRBNやDDB1を過剰発現するHeLa細胞を固定した後、抗HA抗体やV5抗体と混合させ、Alexa Fluor 594もしくは488 (Invitrogen)標識二次抗体と反応させた。
ユビキチン化試験は引用文献37を参考にして行った。FH-CRBN複合体(200ng)、Uba 1(500ng, Biomol)、UbcH5b(500ng, Biomol)、GST-Ubiquitin(4000ng,Calbiochem), 4mM ATPを30℃で2時間、15μlスケールで反応させた。反応は、SDSを加え、98℃で5分間加熱して停止させた。
この試験は引用文献38を参考にして行った。FH-CRBNもしくはその変異体を安定的に発現させた293T細胞に10μMのMG132もしくはDMSO単独(vehicle)を加え、3時間反応させた。細胞は25μMのMG132および10mMのN-ethylmaleimideを含むRIPAバッファーで溶解した。FH-CRBNを上述の方法で免疫沈降し、解析した。各濃度のサリドマイドは、MG132を処理する1時間前に加えた。
以下に示すようなStealth RNAi oligonucleotide(Invitrogen)を使用した。
DDB1 #2: 5’-CAGUAAUGAACAAGGCUCCUAUGUA-3’(配列番号2)
Cul4A #1: 5’-GCAAAGCAUGUGGAUUCAAAGUUAA-3’(配列番号3)
Cul4A #2: 5’-GAAUCUCUGAUAGACAGAGACUAUA-3’(配列番号4)
センス鎖のみ示した。コントロールとしてはStealth RNAi negative control of low GC content(Invitrogen)を用いた。Lipofectamine RNAiMAXを用いて293T細胞に40nMのオリゴヌクレオチドを導入し72時間後に細胞を回収した。
魚は28.5℃において14時間可視光明期、10時間暗期のサイクルで飼育した。
サリドマイドはDMSOに溶かした。そしてあらかじめ65℃に加熱しておいたE3培地に400μMになるように加えた。ゼブラフィッシュ胚は脱卵殻し、以下に示すようにサリドマイドに薬浴させた。2hpfにおいて胚を2mg/mlのプロテアーゼタイプ14(Sigma)に3分間反応させ、5回培地で洗浄した。その過程で脱卵殻されるが、直ちにサリドマイド含有培地に交換し、3日間観察した。サリドマイド含有培地は12時間毎に交換した。
コンドロサイトの外部マトリックスは、アルシアンブルーで染色される(引用文献40)。ゼブラフィッシュ胚は3.7%の中性ホルムアルデヒドにより一晩固定した。翌日、100%エタノールで洗浄後、PBSで再水和させた。次いで、0.05%トリプシンを含む飽和四ホウ酸ナトリウム溶液にて1-3時間反応させた。3%の過酸化水素と1%のKOH溶液により魚の斑点を除去し、70%グリセロール含有PBS溶液にて保存した。
1細胞期におけるマイクロインジェクションについては引用文献39に従って行った。我々は窒素ガス圧力マイクロインジェクター(IM 300, Narishige)を注入に使用した。CapのついたmRNAはin vitroにおいてmMESSAGE
mMACHINE in vitro transcription kit(Ambion)で作製した。
zCul4A AMO: 5’-CTGGTGCTGAACATCTTCTGCCATC-3’(配列番号6)
これらのオリゴはヌクレアーゼ除去水で700μMの濃度に調製して使用した。
この実験は引用文献41に従って行った。zcrbn mRNAのアンチセンスプローブは5’-コード領域の513bpを用いた。zcul4aについては3’UTR(3’非コード領域)の590bpを用いた。shhおよびfgf8に対応するプローブはそれぞれKrauss博士およびThisse博士のご厚意による。プローブの浸透性を増すために、胚は0.1% Tween-20および10mg/mlのproteinase Kを含んだPBSにおいて2分間常温で反応させた。
48hpfにおけるゼブラフィッシュ胚に1%メチルセルロースおよび0.003%の3-amino benzoic acid ethyl ester(Sigma)を用いて麻酔を施し、スライドグラスに乗せた。そして10個の個体を各サンプルからランダムに選び、耳胞を撮影した。サイズはNIH image Jソフトウェアを用いて計測し、コントロールの耳胞のサイズと比較した。平均値および標準偏差を計算し、p値はMann-Whitney, U検定を用いて算出した。
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Claims (11)
- 被験物質をセレブロンもしくはセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片と接触させ、被験物質のセレブロンもしくは前記断片に対する結合性を評価し、セレブロンもしくは前記断片と結合しない被験物質、又はセレブロンもしくは前記断片との結合性がサリドマイドよりも低い被験物質を選択することを特徴とする非催奇性物質のスクリーニング方法。
- 被験物質が、医薬であることを特徴とする請求項1に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
- セレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片が、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、又はシロイヌナズナ由来のセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片であることを特徴とする請求項1又は2に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
- セレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片が、配列番号7に示すアミノ酸配列において、そのN末端から339〜442番目のアミノ酸配列を有し、それ以外のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失および/又は付加がなされたアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項1又は2に記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
- セレブロン又はセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片が、担体に固定されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の非催奇性物質のスクリーニング方法。
- 被験物質をセレブロン又はセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片と接触させ、被験物質とセレブロン又は前記断片の結合性を調べ、セレブロン又は前記断片と結合する被験物質を選択する工程、及び前記工程で選択された被験物質の中から、i)催奇性、又はii)セレブロンを含むユビキチンリガーゼ複合体の活性阻害作用を軽減する物質を選択する工程とを含むことを特徴とする催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法。
- セレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片が、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、又はシロイヌナズナ由来のセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片であることを特徴とする請求項6に記載の催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法。
- セレブロン又はセレブロンにおけるサリドマイド結合領域を含む断片が、担体に固定されていることを特徴とする請求項6又は7に記載の催奇性物質のアンタゴニストのスクリーニング方法。
- 以下の(a)及び(b)のアミノ酸置換を有することを特徴とする変異型セレブロン;
(a)ヒト由来のセレブロンにおけるN末端から384番目のチロシン若しくはこれに相当するアミノ酸がアラニンに置換されたもの
(b)ヒト由来のセレブロンにおけるN末端から386番目のトリプトファン若しくはこれに相当するアミノ酸がアラニンに置換されたもの。 - アミノ酸置換を有するヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、又はシロイヌナズナ由来のセレブロンをコードする核酸であって、請求項9に記載の変異型セレブロンをコードすることを特徴とする核酸。
- 請求項10に記載の核酸を遺伝子として導入し、発現させたことを特徴とするサリドマイド催奇性耐性非ヒト動物。
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