DE69634666T2

DE69634666T2 - Lipid-extrakte mit entzündungshemmender aktivität

Info

Publication number: DE69634666T2
Application number: DE69634666T
Authority: DE
Inventors: Theodore Macrides; Nicolette Kalafatis
Original assignee: Pharmalink International Ltd
Current assignee: Pharmalink International Ltd
Priority date: 1995-09-11
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2016-09-11
Also published as: ZA967626B; EP0850068B1; PT850068E; DE69634666D1; EP0850068A1; US6346278B1; WO1997009992A1; CA2231803C; JP4101876B2; CA2231803A1; DK0850068T3; EP0850068A4; ATE293984T1; AUPN531195A0; US6083536A; JPH11512400A; ES2241001T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Präparat mit entzündungshemmender und insbesondere Arthritis bekämpfender Wirkung, die einem Lipidextrakt aus Muscheln, einschließlich der neuseeländischen Grünlippmuschel, Perna canaliculus, und der Miesmuschel, Mytilus edulis, eigen ist.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Zurzeit herrscht starker medizinischer Bedarf an neuen entzündungshemmenden und Arthritis bekämpfenden Arzneimitteln mit verringerten Nebenwirkungen und verlängerter in-vivo-Wirkung, insbesondere an Verbindungen, die den Verlauf der Arthropathien mildern. Pflanzen und andere lebende Zellen bieten einen unerschöpflichen Vorrat an Verbindungen, die pharmakologische Wirkungen beim Menschen haben. Naturprodukte sind häufig die Quelle wirksamer Arzneimittel, wobei seit kurzem ein erhöhtes Interesse an der Analyse dieser Naturprodukte besteht, insbesondere, wenn ein klinischer Vorteil behauptet wird. Marine Organismen enthalten Metaboliten, die als pharmakologische Mittel wirken und bei der Behandlung einer Entzündung helfen können.
Eine entzündungshemmende Wirkung von Perna canaliculus (neuseeländische Grünlippmuschel) war zuerst als Bestandteil einer pharmakologischen Studie über Leukämie beteiligt. Eine erste Beurteilung der entzündungshemmenden Wirkung von Perna canaliculus wurde zunächst unter Anwendung eines Polyarthritis-Rattenversuchs¹ versucht. Diesen Studien gelang es jedoch nicht, das Vorhandensein einer signifikanten entzündungshemmenden Wirkung des Muschelpräparats zu zeigen. Im Gegensatz dazu waren Miller und Ormrod² unter Anwendung eines Carrageenin-ausgelösten Pfotenödemversuchs³ in der Lage zu zeigen, dass Muschelpräparate, wenn sie intraperitoneal verabreicht werden, die Schwellung eines von Carrageenin ausgelösten Rattenpfotenödems deutlich abklingen lassen. Deshalb fraktionierten sie aus dem Muschelpräparat eine nicht dialysierbare, wasserlösliche Fraktion, die entzündungshemmende Wirkung besaß. Der wässrige Extrakt zeigte, wenn er intraperitoneal verabreicht wurde, eine dosisabhängige entzündungshemmende Wirkung, die nach oraler Verabreichung des Muschelpulvers nicht festgestellt werden konnte. Es wurde daher vermutet, dass die wasserlösliche Fraktion eine reizauslösende Komponente enthielt, die eine offensichtlich entzündungshemmende Wirkung besaß.
Rainsford und Whitehouse⁴ berichteten auch, dass gefriergetrocknete, pulverförmige Präparate aus ganzen Muscheln, die oral an Ratten verabreicht worden waren, eine mäßig entzündungshemmende Wirkung im Carrageeninausgelösten Pfotenödemversuch zeigten, und dieses Material die Magengeschwüre verursachende Aktivität einiger nichtsteroidaler entzündungshemmender Arzneimittel bei Ratten und Schweinen stark verringerte.
Die Verwendung des gesamten Muschelextrakts bei der Behandlung sowohl von rheumatoider Arthritis als auch Osteoarthritis bei menschlichen Patienten ist ebenfalls berichtet worden⁵.
Erste Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten und auf Lipidextrakten aus Perna-canaliculus-Pulver basierten, die unter Anwendung von Lösungsmittelextraktionsverfahren (im Gegensatz zu früheren Arbeiten über wässrige Fraktionen) hergestellt worden waren, wiesen nach, dass die Lipidfraktionen ein gewisses Maß an entzündungshemmender Wirkung zeigen, wenn sie in geeigneten Tierversuchen getestet werden. Durch das Verfahren der überkritischen Fluidextraktion (SFE) wurde eine zuverlässige Quelle für den Lipidextrakt aus Perna canaliculus und Mytilus edulis später zugänglich. Der Lipidextrakt wird als dunkelgelb-braunes viskoses Öl erhalten, das einen stark Ultraviolett absorbierenden Charakter zeigt, der mit physikalischen Daten für Lipidextrakte übereinstimmt, die mit früheren Lösungsmittelextraktionsverfahren gewonnen worden waren.
In WO 96/05164, eine Bezugnahme unter Regel 54(3) EPÜ, ist ein entzündungshemmendes Präparat beschrieben, das eine gereinigte, aktive Fraktion, die aus einem Lipidextrakt von Perna canaliculus oder Mytilus edulis isoliert worden ist, oder eine aktive Komponente davon umfasst.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Entsprechend einem Merkmal wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Lipidextrakts von Perna canaliculus oder Mytilus edulis, der reich an unpolaren Lipiden ist, worin dieser Lipidextrakt durch überkritische Fluidextraktion von Rohmuschelpulver hergestellt wird, zur Herstellung eines Medikaments zur entzündungshemmenden Behandlung eines menschlichen oder tierischen Patienten bereitgestellt.
In einem weiteren Merkmal wird erfindungsgemäß eine entzündungshemmende Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Lipidextrakt aus Perna canaliculus oder Mytilus edulis als wirksamen Bestandteil zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
SPEZIELLE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Bezeichnungen "entzündungshemmende Behandlung" und "entzündungshemmende Zusammensetzung", wie sie hier benutzt werden, beziehen sich auf die Behandlung entzündlicher Zustände im Allgemeinen, einschließlich arthritischer Zustände wie Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis, sowie auf die Behandlung von Multipler Sklerose und verschiedenen Virusinfektionen oder Zusammensetzungen für diese Behandlungen. Die Wirkung einer Verbindung für die Verwendung in einer solchen Behandlung kann unter Anwendung von Standardversuchen, beispielsweise durch Anwendung eines Carrageeninausgelösten Pfotenödemversuchs oder durch das Vermögen, das Einsetzen oder den Verlauf einer experimentellen Polyarthritis, wie weiter unten näher beschrieben werden wird, vorteilhaft zu beschränken, gezeigt werden.
Vorzugsweise ist der Lipidextrakt, der für die erfindungsgemäße Behandlung oder Zusammensetzung verwendet wird, ein Extrakt, der durch überkritische Fluidextraktion (SFE) gefriergetrockneter pulverisierter Muscheln unter Verwendung eines kryogenen Fluids (wie das kryogene Fluid CO₂) als Extraktionsmittel hergestellt wird. Verglichen mit Lösungsmittelextraktionsverfahren ergibt die überkritische Fluidextraktion unter Verwendung von CO₂ als kryogenem Fluid einen Lipidextrakt, der reich an unpolaren Lipiden, insbesondere freien Fettsäuren, ist. Obwohl die genaue Zusammensetzung des Lipidextrakts noch nicht aufgeklärt worden ist, ist es bekannt, dass er nicht nur freie Fettsäuren (einschließlich ungesättigter Fettsäuren), sondern auch Triglyceride und Cholesterinester enthält.
Es steht eine Vielfalt von Verabreichungswegen zur Verfügung. Die ausgewählte spezielle Art und Weise hängt selbstverständlich von dem zu behandelnden bestimmten Zustand und der für den therapeutischen Effekt erforderlichen Dosierung ab. Dabei können ganz allgemein die erfindungsgemäßen Verfahren unter Anwendung eines beliebigen Verabreichungsweges angewendet werden, der medizinisch akzeptabel ist, was eine beliebige Art und Weise bedeutet, die therapeutische Gehalte des erfindungsgemäßen Wirkstoffs hervorbringt, ohne dabei klinisch inakzeptable Nebenwirkungen zu verursachen. Solche Verabreichungsarten umfassen orale, rektale, topische, nasale, transdermale oder parenterale (beispielsweise subkutane, intramuskuläre und intravenöse) Wege. Es ist festgestellt worden, dass der erfindungsgemäße Lipidextrakt besonders wirksam ist, wenn er oral, subkutan und transdermal verabreicht wird.
Dabei ist die transdermale Verabreichung des Lipidextrakts eine besonders bevorzugte Verabreichungsart, da festgestellt worden ist, dass der Lipidextrakt eine überraschend entzündungshemmende Wirkung besitzt, wenn er transdermal verabreicht wird.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können geeigneterweise in Dosiereinheitsform vorliegen und durch ein beliebiges der aus dem Stand der Technik der Pharmazeutik bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen die Stufe des In-Berührung-Bringens des Wirkstoffs mit einem Träger, der einen oder mehrere Zusatzbestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichmäßiges und inniges In-Berührung-Bringen des Wirkstoffs mit einem flüssigen Träger, einem fein zerteilten festen Träger oder beiden und anschließend erforderlichenfalls Formgebung des Erzeugnisses hergestellt.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten wie Kapseln, Dragees, Tabletten oder Pillen, wobei jede/s einen festgelegten Wirkstoffanteil enthält, in Liposomen, als Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit wie ein Sirup und ein Elixier oder als Emulsion vorliegen.
Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen bequemerweise eine sterile wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Diese wässrige Zubereitung kann entsprechend bekannter Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Eine injizierbare sterile Zubereitung kann als injizierbare sterile Lösung oder Suspension in einem nicht-toxischen, parenteral verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, beispielsweise als Lösung in Polyethylenglykol und Milchsäure, formuliert werden. Zu den verträglichen Trägern und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, zählen Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden üblicherweise sterile fette Öle als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Dazu kann ein beliebiges mildes fettes Öl, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride, verwendet werden. Zusätzlich finden Fettsäuren wie Ölsäure bei der Herstellung injizierbarer Flüssigkeiten Verwendung.
Zusammensetzungen, die für die transdermale Verabreichung geeignet sind, umfassen bequemerweise den Wirkstoff in einer Salben- bzw. Lotiongrundlage oder einen -träger und können ein die Hautpenetration förderndes Mittel enthalten, um die Verabreichung des Wirkstoffs zu unterstützen. Geeignete Grundlagen oder Träger sind Öle wie Oliven- oder Emuöl, die allein oder mit einem die Hautpenetration fördernden Mittel wie Cineol oder Limonen verabreicht werden.
Weitere Abgabesysteme können solche mit verzögerter Freisetzung umfassen. Bevorzugte Abgabesysteme mit verzögerter Freisetzung sind solche, die für die verzögerte Freisetzung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs aus Kugeln oder Kapseln sorgen können. Es stehen viele Typen von Abgabesystemen mit verzögerter Freisetzung zur Verfügung. Diese umfassen beispielsweise a) Erosionssysteme, in welchen der Wirkstoff in einer Matrix enthalten ist, und b) Diffusionssysteme, in welchen der Wirkstoff mit kontrollierter Geschwindigkeit durch ein Polymer hindurch permeiert.
Die Formulierung solcher therapeutischer Zusammensetzungen ist dem Fachmann bekannt. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel umfassen ein/e/n und alle herkömmlichen Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Füllstoffe, festen Träger, wässrigen Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonischen und die Absorption verzögernden Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Stoffe ist aus dem Stand der Technik bekannt und beispielhaft in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben. Außer insofern, dass sich ein herkömmliches Medium oder Mittel nicht mit dem Wirkstoff verträgt, ist seine Verwendung in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorgesehen. Es können auch ergänzende Wirkstoffe in die Zusammensetzung eingebaut werden.
Wegen der Bequemlichkeit für den Patienten ist eine orale oder transdermale Verabreichung bei vielen Zuständen bevorzugt, obwohl eine lokalisierte verzögerte Abgabe für bestimmte Behandlungsregime erwünschter sein kann.
Der Wirkstoff wird in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Dabei bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge diejenige, die erforderlich ist, um die gewünschte Wirkung wenigstens teilweise zu erzielen, das Ausbrechen des zu behandelnden bestimmten Zustands zu verzögern, dessen Fortschritt zu hemmen oder dessen Einsetzen bzw. Fortschritt vollständig aufzuhalten. Dabei sind diese Mengen selbstverständlich von dem zu behandelnden speziellen Zustand, dessen Schwere und individuellen Patientenparametern, einschließlich Alter, Kondition, Größe, Gewicht und gleichzeitigen anderen Behandlungen, abhängig. Diese Faktoren sind dem Fachmann bekannt und können mit Routineuntersuchungen ermittelt werden. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, die Höchstdosis, d.h. die nach vernünftiger medizinischer Beurteilung höchste sichere Dosis, anzuwenden. Dabei ist es jedoch für den Fachmann selbstverständlich, dass aus medizinischen, psychologischen oder praktisch allen anderen Gründen eine niedrigere oder besser tolerierbare Dosis verabreicht werden kann.
Zur Vereinfachung der Verabreichung und Vereinheitlichung der Dosierung ist es besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen in Dosiereinheitsform zu formulieren. Dabei bedeutet die hier benutzte Dosiereinheitsform physikalisch diskrete Einheiten, die als Dosiseinheiten für die zu behandelnden menschlichen oder tierischen Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine festgelegte Wirkstoffmenge, die berechnet ist, die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die Spezifizierungen für die neuen erfindungsgemäßen Dosiereinheitsformen werden von a) den einzigartigen Merkmalen des Wirkstoffs und der zu erreichenden speziellen therapeutischen Wirkung und b) den Beschränkungen, die den Verfahren zum Vermischen eines solchen Wirkstoffs für die spezielle Behandlung eigen sind, bestimmt und sind direkt davon abhängig.
Im Allgemeinen beträgt die tägliche Wirkstoffdosis etwa 0,01 mg/kg pro Tag bis 1000 mg/kg pro Tag. Kleine Dosen (0,01 bis 1 mg) können anfänglich mit anschließend erhöhten Dosen bis zu etwa 1000 mg/kg pro Tag verabreicht werden. Im Falle, dass die Reaktion eines Lebewesens auf diese Dosen unzureichend ist, können noch höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen durch einen anderen, lokalisierteren Abgabeweg) bis zu dem Maße eingesetzt werden, bis zu welchem es die Toleranzgrenze des Patienten erlaubt. Mehrere Dosen pro Tag sind geeignet, um geeignete systemische Wirkstoffspiegel zu erhalten.
In dieser Beschreibung ist, sofern der Kontext nichts anderes erfordert, der Begriff "umfassen" oder Konjugationen wie "umfasst" bzw. "umfassend" so zu verstehen, dass er eine genannte ganze Zahl oder Gruppe aus ganzen Zahlen umfasst, aber eine andere ganze Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen nicht ausschließt.
BEISPIEL 1
A HERSTELLUNG EINES LIPIDEXTRAKTS
A.1 Rohstoff
Die neuseeländische Grünlippmuschel (Perna canaliculus) wurde an der Südküste Neuseelands geerntet, zu welcher Zeit die gesamte Muschel mit Weinsäure stabilisiert wurde. Die Gefriertrocknung führte zu einem trockenen Pulver in pulverisierter Form.
A.2 Lipidextraktion
Zur Extraktion der biologisch wirksamen Lipide aus dem Rohmuschelpulver wurde das Verfahren der überkritischen Fluidextraktion (SFE) angewendet. Als Extraktionsmedium wurde CO₂ als kryogenes Fluid verwendet. Dieses wurde sich bis auf Atmosphärendruck ausdehnen gelassen, und der Extrakt lag als konzentriertes Öl vor. Das Pulver ergab 3 bis 3,5% Öl.
A.3 Profil des Rohöls
Das extrahierbare Öl hatte eine orange-bernsteingelbe Färbung und war bei Umgebungstemperatur eine viskose Flüssigkeit. Der Extrakt wurde bei unter 4 °C gelagert und in einer Stickstoffatmosphäre gehandhabt. Das Rohöl zeigte eine starke UV-Aktivität und wurde vor Licht geschützt, um die Polymerisation von Doppelbindungsbestandteilen zu minimieren.
B ÜBERKRITISCHE FLUIDEXTRAKTION IM PILOTMAßSTAB
Die Extraktion aller Lipide aus dem gefriergetrockneten Pulver der Muschel Perna canaliculus wurde am Food Research Institute (Department of Agriculture, Werribee, Vic., Australien) in einer SFE-Pilotanlage durchgeführt.
B.1 Ausrüstungen
Die Extraktionen wurden in einer Pilotextraktionsanlage durchgeführt, die aus fünf Basisuntereinheiten (Distillers MG Limited., England, UK) bestand. Die fünf Basiseinheiten umfassten: Kohlendioxidversorgungs-, Feststoffextraktions-, Haupttrennungs-, Verdampfungs- und Rückstandseinheit.
Die Kohlendioxidversorgungseinheit bestand aus zwei CO₂-Flaschen, die parallel angeschlossen und zum Nachfüllen, falls erforderlich, auf eine Waage gestellt worden waren. Die Extraktionseinheit kann mit flüssigem SC-CO₂ und mit SC-CO₂ versorgt werden. Dazu wurde die SFE-Einheit mit SC-CO₂ betrieben. Das feste Material wurde in die Extraktionssäule gefüllt, und die Haupttrenneinheit erleichterte die Abtrennung des extrahierten Materials durch Druckminderung (die dem Extrakt das Absetzen erlaubt), Adsorption oder Flüssigextraktion. Der fluide Extrakt wurde in die Verdampfungseinheit geleitet, um das CO₂ durch die Tätigkeit von inneren Heizrohren zu verdampfen. Dabei kann der Dampf flüchtige Bestandteile enthalten und wird deshalb anschließend in die Rückstandskolonne geleitet, um durch reines flüssiges CO₂ ausgewaschen zu werden. Die Rückstandseinheit nimmt das gasförmige CO₂ aus der Verdampfungseinheit auf und leitet die flüchtigen Komponenten in die Verdampfungseinheit zurück.
B.2 Extraktionsverfahren in der Pilotanlage
Muschelpulver (300 g) wurde in die Extraktionseinheit (Extraktionskolonne) gefüllt. SC-CO₂ wurde mit einem Durchfluss von 3,0 kg/h zwei Stunden lang je Extraktion eingeleitet. Die Extraktortemperatur wurde auf 40 °C und der Extraktordruck auf 310 bar (4500 psi) eingestellt. Die Verdampfertemperatur wurde auf 40 °C konstant gehalten. Die Muschellipidextrakte wurden unter Stickstoff bei –10 °C in bernsteinfarbenen abgedichteten Glasbehältern aufbewahrt.
BEISPIEL 2
Der durch SFE wie in Beispiel 1 hergestellte Lipidextrakt aus Perna canaliculus (im Folgenden als "PCO" bezeichnet) wurde in einem standardisierten Carrageenin-Rattenödemversuch auf seine akut entzündungshemmende Wirkung sowie auf seine eine bei Ratten experimentell ausgelöste Polyarthritis⁶ bekämpfende Wirkung (Messung der Wirkung bei Unterdrückung einer chronischen Entzündung) untersucht.
Vergleichsversuche wurden mit Seatone^TM, einem kommerziell erhältlichen gefriergetrockneten Pulverpräparat aus Perna canaliculus, durchgeführt.
A. VERFAHREN
PCO wurde auf –20 °C gehalten. Spuren von Hexan und dergleichen wurden vor der Verwendung nicht entfernt. Die Formulierungen wurden nicht länger als 24 Stunden bei 4 °C gealtert.
A.1 Versuch zur Entzündungshemmung
Wistar-Rattenweibchen (180 bis 220 g) wurden p.o. oder i.p. mit Testformulierungen vordosiert. 40 Minuten später wurden in jede Hinterpfote 0,1 ml Kochsalzlösung, die 0,6 mg Na-Carrageenin enthielt, injiziert. Das sich anschließende Pfotenödem wurde durch Messung der Vergrößerung der Pfotendicke nach ein und nach zwei Stunden mit einer Mikrometerschraube quantifiziert. In diesem akuten Versuch betrug die ED₅₀ für Aspirin etwa 150 mg/kg. (Das Ödem ging bei dieser Carrageenin-Dosis nach drei Stunden zurück.)
A.2 Versuch zur Arthritisbekämpfung
Obwohl zeitraubender, hat dieser Versuch mehr Wert als der (zuvor beschriebene) akute Versuch, da in ihm nicht nur I) die entzündungshemmenden Arzneimittel, die im akuten Versuch wirken (aber oftmals mit niedrigeren ED₅₀-Werten), sondern auch II) andere Mittel, beispielsweise Clobuzarit (Clozic^®) oder Lobenzarit (CCA), die offensichtlich einzigartige Arthritis bekämpfende Eigenschaften haben, aber im akuten Versuch nicht als ödembekämpfend/fiebersenkend oder sonst nachweisbar sind, nachgewiesen werden.
Die angewendete Versuchsvorschrift bestand darin, die Krankheit durch Injektion des Arthritigens am Tag 0 auszulösen, die ersten Anzeichen einer Entzündung der Pfoten (üblicherweise an den Tagen 10 bis 12 manifest) zu überwachen und anschließend die Tiere vier Tage lang mit den Testmaterialien zu dosieren. Innerhalb dieses Zeitraums breitete sich die Pfotenentzündung in den unbehandelten Kontrolltieren schnell aus, um am 14. Tag ein nahes Maximum zu erreichen. Arzneimittel, die innerhalb dieses Zeitraums wirken, um die Pfotenschwellung zu unterdrücken, sind sicher antisymptomatisch, aber selten krankheitsbekämpfend. Nach Beendigung der Behandlung kehren die Symptome üblicherweise zurück. Das ist jedoch ein positives Merkmal dieses Versuchs, da es deutlich zeigt, dass a) das Arzneimittel eine begrenzte Wirkung hat, aber eine Vorstellung von seiner Wirksamkeitsdauer durch die Schnelligkeit (oder auf andere Weise) des Rückfalls vermittelt, und b) die Tiere mit minimalen Krankheitssymptomen am 14. Tag eher einen positiven Arzneimitteleffekt als eine fehlende Reaktion auf das ursprüngliche Arthritigen (d.h. falsch negativ) widerspiegeln. Eine genaue Beschreibung dieses Versuchs ist "späte Prophylaxe". Offensichtlich kann durch ein Hinauszögern der Behandlung bis nach dem 14. Tag nach einer "therapeutischen Wirkung" gesucht werden, da jedoch Veränderungen innerhalb von vier Tagen langsam oder vernachlässigbar sein können (selbst mit einigen starken NSAIDs), ist die Sammlung adäquater Daten schwierig.
Einzelheiten der angewendeten Versuchsvorschrift sind: Injektion des Arthritigens in die Schwanzwurzel von Wistar-Rattenweibchen (160 bis 200 g) = 800 μg hitzeabgetötetes Mycobact tuberculosis, suspendiert in 0,1 ml Squalan, in einer solchen Weise, dass Blutgefäße vermieden werden und ein optimaler Abfluss in die Lymphbahnen verstärkt wird. Nach zehn Tagen wurden die Tiere gewogen, die Dicke von Hinterpfoten und Schwanz wurde gemessen und Anzeichen einer Entzündung in den Vorderpfoten auf einer Skala von 0 bis 4+ bewertet. Nach Dosierung mit den Testverbindungen einmal täglich vier Tage lang (d.h. am 10. bis 13. Tag nach dem Arthritigen) wurden die Messungen am 14. und 18. Tag wiederholt (d.h. nach Beendigung der Behandlung und wieder nach vier Tagen Rückfall), um die Entwicklung der Arthritis zu überwachen. Für eine transdermale Verabreichung der Testformulierungen wurden die Tiere im Nacken unter leichter Anästhesie (Forthane) am 10. Tag rasiert, um eine ca. 6 cm² große Hautfläche freizulegen. Die Formulierungen wurden einmal täglich unter bis zu drei Minuten langem Reiben mit einem Volumen = 2,5 ml/kg (d.h. etwa 0,5 ml/Ratte) verabreicht. Die erste Verabreichung wurde sechs Stunden nach dem Rasieren gegeben, um sicher zu sein, dass vor der Behandlung keine Hautabschürfungen aufgetreten waren.
Fiebersenkungsversuch
Junge Ratten (unter 160 g) wurden mit 2 g/kg getrockneter Bierhefe, suspendiert in Kochsalzlösung, 23:00 Uhr geimpft. 8:00 Uhr wurde ihre rektale Temperatur gemessen. Diese zeigte ein stabiles Fieber (Temperatur höher als 39,2 °C) um 9:00 Uhr, als sie mit den Testverbindungen dosiert wurden. Zum Vergleich wurden 150 mg/kg Paracetamol verabreicht.
B. ERGEBNISSE
Akute entzündungshemmende Wirkung (Tabelle 1) Tabelle 1 zeigt, dass weder Seatone noch PCO im Kurzzeitversuch eine ödembekämpfende Wirkung aufwiesen. Eine Co-Verabreichung mit einem Synergisten hatte keinen Effekt, während derjenige von Ibuprofen verstärkt wurde.
Anti-Arthritis-Versuch (Tabelle 2)
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der ersten zwei Versuche mit PCO gezeigt, der arthritischen Ratten entweder oral (p.o.), subkutan (s.c.) oder transdermal (t.d.) mit einer Dosis von 50 mg/kg vier Tage hintereinander verabreicht wurde.
Eine Verdünnung des PCO in raffiniertem handelsüblichem Olivenöl (Vetta) erlaubte es, dieselbe Vorratslösung in allen drei Verabreichungsmodi (p.o./s.c./t.d.) zu testen. Die Olivenöl-(OO-)Grundlage schließt Sauerstoff weitgehend aus und enthält wenig Metallkatalysator, weshalb es die Eigenschaften von vielen instabilen (ungesättigten) Verbindungen "erhält".
Die transdermalen Formulierungen wurden aus der OO-Vorratslösung unter Zugabe von die Hautpenetration verstärkenden Mitteln (PE) mit dem relativ hohen Anteil von 20 % Vol./Vol. hergestellt. Die verwendeten PEs waren Cineol (= Eucalyptol), Methylsalicylat (= Wintergrünöl) oder Isopropanol (= Einreibealkohol). Die PCO-Salicylatgruppe war vielleicht der letzte Verantwortliche, der eine (negative) Wechselwirkung zwischen diesem Salicylat und dem/den Wirkstoff/en des PCO anzeigen könnte.
TABELLE 1: Entzündungshemmende Wirkung auf das akute Carrageenin-Pfotenödem

n = 2 Ratten/Gruppe
MPL = Misoprostal, 0,5 mg/kg p.o. als Synergist.

* (negative Werte) = > Kontrollen

Schlussfolgerungen:

I) Sowohl PCO als auch Seatone waren wirkungslos, selbst mit Synergist.
II) Der Versuch entspricht einem Standard-NSAID und diesem speziellen Synergisten.

TABELLE 2: Entzündungshemmende Wirkung bei arthritischen Ratten

n = 4 Ratten/Gruppe

Testverbindungen in 4 aufeinander folgenden täglichen Dosen verabreicht.
A – Orale (p.o.) oder subkutane (s.c) Verabreichung:

* 10. bis 14. Tag
** 14. bis 18. Tag

B = Transdermale Verabreichung:

Träger = Olivenöl, 4 Vol.: Penetrationsverstärkungsmittel, 1 Vol.

Schlussfolgerungen:

I) PCO mit 50 mg/kg in 6 verschiedenen Verabreichungsmodi wirksam.
II) Träger-Kontrollen (Olivenöl allein/mit Cineol) hatten eine unbedeutende Wirkung auf die Arthritis.

BEISPIEL 3
In diesem Beispiel werden die Ergebnisse weiterer Versuche zu der Arthritis bekämpfenden und akut entzündungshemmenden Wirkung des Lipidextrakts aus Perna canaliculus (PCO) beschrieben, die ihn wirksam bis hinunter zu 10 mg/kg und möglicherweise sogar bis zu 2,5 mg/kg zeigen, unabhängig davon, ob er oral oder transdermal in einem Olivenölträger verabreicht wurde.
Arthritis bekämpfende Wirkung
Es wurden zwei Versuche durchgeführt, um PCO bei niedrigeren Dosen als den 50 mg/kg zu untersuchen, die als entzündungshemmende Wirkung bei arthritischen Ratten, p.o. oder t.d. verabreicht (siehe Beispiel 2), festgestellt worden waren.
Im erstem Versuch (Teil A, Tabelle 3) zeigte die Olivenölformulierung, oral gegeben bis hinunter zu 2,5 mg/kg, Wirkung. In den folgenden vier Tagen nach Beendigung der Dosierung gab es einen deutlichen Rückfall in allen drei Behandlungsgruppen.
Im zweiten Versuch (Teil B, Tabelle 3) unter Anwendung einer transdermalen Verabreichung zeigte die mit 20 Cineol (Vol./Vol.) "verdünnte" Olivenölformulierung eine gute Wirkung bis hinunter zu 10 mg/kg. Das Ergebnis bei 2,5 mg/kg ist nur ein provisorisches, da noch nicht klar ist, ob es einen vollständigen "Rückfall" gab (möglicherweise anzeigend, dass einige Tiere "falsch positiv" = schwache Reaktoren auf das ursprüngliche Arthritogen waren).
Alternative dermale Formulierungen, die auf Olivenöl mit 20 % D-Limonen oder einem nicht öligen Träger basierten (Isopropanol mit 20 % Vol./Vol. Propylenglykol – dieses war zugesetzt worden, um die Hautdehydratation zu minimieren), waren deutlich weniger zufrieden stellend als das originale Olivenöl-mit-Cineol-Abgabesystem. Der alkoholische Träger hat wahrscheinlich im Gegensatz zu dem Olivenöl die Zersetzung des PCO erleichtert.
Entzündungshemmende Wirkung
Es wurde ein Kaolin-ausgelöstes Pfotenödem als möglicher Versuch für PCO untersucht, da diese Entzündung sich langsamer entwickelt als diejenige, die von Carrageenin ausgelöst wird (und nach drei Stunden wieder zurückgeht). Die Versuchsvorschrift umfasst die Injektion von 5 mg Kaolin, suspendiert in Wasser (nicht Kochsalzlösung, in welcher es aggregiert), in jede Hinterpfote 40 Minuten nach Dosierung der Ratten mit PCO, der sowohl p.o. als auch i.p. als Dispersion, hergestellt mit 0,02 % Tween in entweder Wasser (p.o.) oder Kochsalzlösung (i.p.), verabreicht wurde. Die Pfotenschwellung wurde dann zwei Stunden und fünf Stunden nach der Kaolininjektion gemessen.
Die Ergebnisse aus einem Versuch (Tabelle 4) mit nur zwei Ratten pro Gruppe waren mehrdeutig: Die orale Verabreichung konnte eine gewisse Ödem-bekämpfende Wirkung ausgelöst haben. Die i.p. PCO/Kochsalzlösung-Emulsion war physikalisch weniger zufrieden stellend und schien inaktiv gewesen zu sein.
TABELLE 3: Weitere Studien zu der entzündungshemmenden Wirkung von PCO in arthritischen Ratten

N = 4 Ratten/Gruppe

A. Orale Verabreichung
B. Dermale Verabreichung

* = 4 : 1 Vol./Vol., 2,5 ml/kg
** = 4 Vol. Isopropanol mit 1 Vol. Propylenglycol.

Schlussfolgerungen:

I) PCO wirksam bei 10 mg/kg p.o. oder t.d.
II) PCO kann selbst bei 2,5 mg/kg wirksam sein
III) Cineol > Limonen für t.d. Verwendung mit PCO
IV) Nichtöliger Träger scheint für die t.d. Abgabe von PCO ungeeignet zu sein.

TABELLE 4: Kaolin-ausgelöstes Pfotenödem in Wistar-Rattenweibchen

N = nur 2 Ratten/Gruppe
SYN = Synergist, Misoprostol^® 1 mg/kg p.o.

Schlussfolgerungen:

I) PCO, p.o. kann in diesem Versuch zur Entzündungshemmung eine verzögerte Wirkung zeigen.
II) PCO, i.p. tat dies nicht.

BEISPIEL 4
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung des Lipidextrakts aus Perna canaliculus (PCO) und verschiedener anderer Öle, die im Einzelhandel für gesundheitsfördernde Lebensmittel erhältlich sind, wenn sie prophylaktisch Wistar-Rattenweibchen verabreicht werden, die eine Zusatzstoff ausgelöste Polyarthritis entwickeln (siehe Beispiel 2). Die Behandlung wurde in sechs Gruppen (n = 5 Ratten pro Gruppe) wie folgt durchgeführt:

A: Unbehandelte Kontrollgruppe
B: Flachsöl (Barleaus), 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag
C: Nachtkerzenöl (Efamol), 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag
D: Norwegisches Lachsöl (J.R. Carlson), 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag
E: MAXEPA (Solgar), 2000 mg/kg Körpergewicht/Tag
F: PCO, 20 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt, in welcher das Anschwellen der arthritischen Pfoten als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollgruppe A angegeben ist. Die Ergebnisse zeigen, dass PCO 200mal wirksamer als EPA und 350mal wirksamer als Nachtkerzenöl ist.
TABELLE 5
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel zeigt die therapeutische Behandlung einer arthritischen Entzündung bei Ratten unter Verwendung von PCO, nicht stabilisiertem vollständigem Muschelextrakt (GL Mussel NZ), stabilisiertem ganzem Muschelextrakt (GL Mussel Aust), Selleriesamenöl und Indomethacin. Ratten mit den ersten Anzeichen einer Arthritis 10 Tage nach Impfung mit dem mycobakteriellen Arthritogen wurden oral nur 4 Tage lang mit den Testmaterialien behandelt. Die Wirksamkeit der Testmaterialien wurde als vergrößerte Dicke der Hinterpfote am 14. Tag, verglichen mit der Kontrollgruppe H, gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt und weisen nach, dass PCO in diesem Tierversuch effizienter als Indomethacin war.
TABELLE 6

** Bei dieser Dosis toxisch.

BEISPIEL 6
Dieses Beispiel liefert weitere Daten, mit welchen die Wirksamkeit des Lipidextraktes aus Perna canaliculus (PCO) mit der von gefriergetrocknetem ganzem Muschelpulver (Seatone^TM) und Ibuprofen (Nurofen^TM) verglichen wird, getestet gegen eine Collagen-II-ausgelöste autoallergische Arthritis bei Ratten. Mit diesen Testmaterialien wurde auch ein Magentoxizitätsversuch durchgeführt.
Arthritis bekämpfender Versuch
Eine durch Collagen (Typ II) induzierte Polyarthritis wurde bei Wistar-Rattenweibchen durch Injektion von Collagen (II) mit einem nicht arthritogenen Zusatzstoff, um die Versuchstiere zu sensibilisieren, ausgelöst.
In Tabelle 7 sind die Ergebnisse gezeigt, die bei der therapeutischen (d.h. verzögerten) Behandlung mit den Testmaterialien erhalten wurden. Die Behandlung wurde bis zum 8. Tag nach den ersten Anzeichen der Arthritis hinausgezögert, anschließend bis zum 14. Tag (d.h. 7 Tagesdosen), wobei die Arthritis am 15. Tag bewertet wurde, und wieder am 18. Tag fortgesetzt, wobei dieser einen Rückfall durch Unterbrechung der Verabreichung anzeigte. PCO wurde oral nach Verdünnung in Olivenöl (8 mg/ml) und mit 2,5 ml/kg/Tag verabreicht, um 20 mg/kg zu ergeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass PCO mit 20 mg/kg in der Therapie so wirksam ist wie 300 mg/kg stabilisierter Muschelextrakt (Seatone) und 50 mg/kg Ibuprofen (Nurofen).
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse gezeigt, die sowohl bei der prophylaktischen als auch der therapeutischen Behandlung mit den Versuchsmaterialien erhalten wurden. Die prophylaktische Behandlung ging vom 1. bis zum 13. Tag (d.h. insgesamt 15 Dosen) oral (p.o.). Die therapeutische Behandlung ging vom 9. bis 13. Tag (d.h. insgesamt 5 Dosen) transdermal (t.d.). PCO war verdünnt in Olivenöl (6 mg/ml) für die p.o. Verabreichung mit 2,5 ml/kg/Tag, um 15 mg/kg zu ergeben, und verdünnt in Olivenöl-Cineol (17,3 Vol./Vol.) (10 mg/ml) für eine t.d. Verabreichung mit 2 ml/kg/Tag, um 20 mg/kg zu ergeben.
Dieser Versuch umfasst auch Natriumaurothiomalat (ATM = Mycocrysin^®), gegeben als Referenz-Antiarthritikum, verabreicht jeden zweiten Tag (insgesamt 8 Dosen), subkutan in Kochsalzlösung mit 6,3 mg/kg (höhere Dosen wären toxisch). Die relativ hohe Gewichtszunahme der mit ATM behandelten Versuchstiere kann irreführend sein, vielleicht ein Zeichen einer beginnenden Nierenschädigung (verschlechtertes Wasserlassen), anstatt einer vorteilhaften Verringerung des mit einer chronischen Entzündung einhergehenden normalen Gewichtsverlusts.
Seatone^TM wurde p.o. mit 300 mg/kg, Nurofen^TM wurde p.o. mit 50 mg/kg und Na-Aurothiomalat (ATM) wurde in 8 Dosen zu 6,3 mg/kg subkutan (s.c.) verabreicht.
Die Ergebnisse zeigen, dass PCO besonders wirksam ist, wenn es transdermal mit 20 mg/kg verabreicht wird, und PCO bei 15 mg/kg p.o. so wirksam wie Seatone mit 300 mg/kg und Nurofen mit 50 mg/kg ist.
Magentoxizitätsversuch
Es wurden Magentoxizitätsstudien an Wistar-Rattenweibchen mit etablierter Arthritis, die mit Collagen (Typ II) ausgelöst worden war, und welche keine Arzneimitteltherapie hatten, durchgeführt. Nachdem die Versuchstiere über Nacht gefastet hatten, wurden Aspirin und PCO mit 0,04 % Tween-20 für eine orale Dosierung suspendiert. Die verabreichte Dosis betrug 30 mg/kg.
In Tabelle 9 ist gezeigt, dass PCO für den Magen tatsächlich unschädlich war, selbst wenn er mit dem 20fachem der effektiven Dosis verabreicht worden war. Diese hohe Dosis (300 mg/kg) war jedoch die effektive Dosis für Aspirin im Standard-Anti-Arthritis-Versuch (durch Zusatzstoff ausgelöste Rattenpolyarthritis), bei welcher Dosis Aspirin eine beträchtliche Magenschädigung verursachen kann.
TABELLE 7

* Die rechte Pfote war vorentzündet aus der ersten sensibilisierenden Injektion von Collagen (II) in Freundschem Adjuvans.
Bemerkung: deutlicher Rückfall in den Gruppen III) und IV) nach Beendigung der Verabreichung.

TABELLE 8

* Entzündet durch Injektion von Collagen (II) mit einem nicht-arthritogenen Zusatzstoff, um die Versuchstiere zu sensibilisieren.
** Bemerkung: Starker Rückfall.

TABELLE 9

* HCl wurde oral co-verabreicht, um die Säuresekretion unter Stress zu stimulieren.

LITERATURVERZEICHNIS:

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Claims

Entzündungshemmende Zusammensetzung, umfassend einen Lipidextrakt aus Perna canaliculus oder Mytilus edulis, der reich an unpolaren Lipiden als deren wirksamer Bestandteil ist, worin dieser Lipidextrakt durch überkritische Fluidextraktion von Rohmuschelpulver hergestellt wird, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin kryogenes fluides CO₂ in der überkritischen Fluidextraktion verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Zusammensetzung zur oralen oder subkutanen Verabreichung des wirksamen Bestandteils formuliert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zusammensetzung zur transdermalen Verabreichung des wirksamen Bestandteils formuliert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, umfassend eine Salbe auf der Grundlage einer Lotion oder eines Trägers und gegebenenfalls ein die Hautpenetration förderndes Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Grundlage oder der Träger ein Öl, wie Olivenöl oder Emuöl, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, die ein die Hautpenetration förderndes Mittel, wie Cineol oder Limonen, einschließt.
Verwendung eines Lipidextrakts von Perna canaliculus oder Mytilus edulis, der reich an unpolaren Lipiden ist, worin dieser Lipidextrakt durch überkritische Fluidextraktion von Rohmuschelpulver hergestellt wird, zur Herstellung eines Medikaments zur entzündungshemmenden Behandlung eines menschlichen oder tierischen Patienten.
Verwendung nach Anspruch 8, worin kryogenes fluides CO₂ bei der überkritischen Fluidextraktion verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, worin die Verabreichung eine orale oder subkutane Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die Verabreichung eine transdermale Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin die entzündungshemmende Behandlung die Behandlung von Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis ist.