TW201828961A - 生物活性貽貝組合物和/或萃取物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種源自貽貝的液體或乾燥組合物，其包含具有改良之生物可用性的高產率之生物活性組分。該等組合物具有至少兩相，包括：至少一個疏水相，包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物；以及一或多個親水相或水性相，具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分。該液體組合物具有類乳液結構且該乾燥組合物在復水時具有自乳化組合物之性質。該等組合物係天然穩定的且包含均勻分散的球形形狀的生物材料，其中大多數粒子大小在約100 nm-50,000 nm之間。該等組合物之結構提供了生物活性化合物之改良生物可用性及多種調配物選項。

Description

生物活性貽貝組合物和/或萃取物
本發明總體上係關於源自貽貝之組合物或萃取物，其包含具有改良之生物可用性的高產率之生物活性組分。
包括貽貝之貝介類長期以來一直是人類飲食之部分。已關於貽貝之健康益處及生物活性性質進行了大量研究。例如，紐西蘭綠唇貽貝(紐西蘭殼菜蛤(Perna canaliculus ))之獨特性質已被研究了超過40年。據觀察，紐西蘭沿海毛利人群體具有的關節炎發生率歷史上比內陸毛利人群體低。這是歸因於沿海毛利人群體對綠唇貽貝之高度消耗，從而暗示綠唇貽貝物種具有抗炎活性。臨床試驗已表明紐西蘭殼菜蛤之脂質萃取物確實具有抗炎活性且可用於管控關節炎(Halpern (2000) Anti-inflammatory effects of a stabilized lipid extract of Perna canaliculus (Lyprinol)；Brien等人(2008) Systematic review of the nutritional supplement Perna Canaliculus (green-lipped mussel) in the treatment of osteoarthritis Q J Med 2008；101:167-179)。各種類型之綠唇貽貝脂質萃取物已被商業化為用於緩解關節炎症狀，且研究通常一直集中在此領域。
諸如紐西蘭殼菜蛤之貽貝典型地含有高水平之ω-3脂肪酸且其等為包括下列之其他有益的生物活性組分之豐富來源：維生素、礦物質、牛磺酸、胺基酸、多酚、類胡蘿蔔素及糖胺聚醣(GAG或黏多醣)、膠原及肝醣之活性化合物，已表明其中一些具有積極的健康效應(Grienke等人(2014) Bioactive compounds from marine mussels and their effects on human health Food Chemistry 142 (2014) 48-60；Coulson 等人及Rainsford等人(2015) Novel Natural Products：Therapeutic Effects in Pain，Arthritis and Gastro-intestinal Diseases，Progress in Drug Research 70)。直至最近，對存在於整體貽貝組合物中之非脂質組分之潛在健康性質的關注或研究還很少。在回收脂質餾分之後，非脂質組分一般係予以丟棄或用作低價值副產物。
貽貝組合物或萃取物之結構及生物化學組成及/或性質受用於製得該等組合物或萃取物之加工方法的影響。自貽貝萃取有益的生物活性組分極具挑戰，因為可能難以打開貝殼以自貝殼內部以保存肉及其他生物材料中存在的生物活性組分之性質及數量的方式來移除或分離肉及其他生物材料。自貝殼內部移除材料的習知加工方法典型地涉及機械加工，諸如機器剝殼、壓碎、或研磨以打開貝殼或使貝殼破碎，或使用熱，此舉破壞生物活性組分。一旦貝殼被打開且可獲得或提取鮮肉，就使用機械技術來粉碎貽貝鮮肉，例如，將鮮肉均質化、摻合、研磨、切碎、碾磨、磨碎或離心。此舉通常繼之以低溫乾燥，諸如粉碎材料之冷凍乾燥。諸如該些的機械製程通常在生物材料未完全分解以釋放其功能組分時產生可溶性較差的萃取物。組合物為不穩定的且典型地具有擁有不均勻分佈的大的不規則形狀及尺寸化之粒子。需要將抗氧化劑及其他化學添加劑添加至組合物以穩定化該等組合物並維持可能存在於該等組合物中之任何生物活性。在該些製程中，貽貝起始材料通常由於可消除、毀壞或改變存在於原始貽貝材料中之生物活性化合物的加工步驟而顯著地變化，從而影響生物活性性質。
現存的整體貽貝粉末及貽貝脂質萃取物因為其大的粒子結構及其疏水性質而通常在水性介質(包括消化道)中可溶性較差。由此該等萃取物存在相當大的調配挑戰且常常在經口或經由需要跨膜吸收的其他途徑給予時遭受較差或不規則的生物可用性。
難以達成具有可靠及一致生物可用性之一致最終產物且因此難以達成生物活性化合物之功效。
此外，已知現存的整體貽貝組合物及脂質萃取物具有不良口味概況，這使得其等對於調配成一些產品形式而言為不合需要的且帶來進一步的調配挑戰。
發明目標
本發明之一目標係提供一種改良的生物活性貽貝組合物或萃取物，其改進了已知技術之一些缺點及限制，或至少為公眾提供有用的選擇。
包括本說明書中引用的任何專利或專利申請案的所有參考文獻據此以引用方式併入。不承認任何參考文獻構成先前技術。對參考文獻之論述陳述了其作者所斷定之內容，且申請人保留質詢所引用文件之準確性及相關性的權利。將清楚地理解，雖然本文涉及許多先前技術出版物，但此參考不構成對下列的承認：該些文件中的任何文件形成紐西蘭或任何其他國家的此項技術中的公知常識之部分。
應知道，術語『包含』可在變化的管轄權下被認為為具有排他性含義或包括性含義。出於本說明書之目的且除非另有說明，術語『包含』應具有包括性含義——亦即，將視為意指不僅包括其直接提及之所列組分，亦包括其他未指定的組分或元件。此理論基礎亦將在關於方法或製程中之一或多個步驟使用術語『包含(comprised)』或『包含(comprising)』時使用。
本發明之其他態樣及優點將自僅以舉例方式給出的後續描述而變得明顯。發明概要
在一個態樣中，本發明係關於一種整體貽貝組合物，其具有至少兩相，包括：至少一個疏水相，包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物；以及一或多個親水相或水性相，具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分。
較佳地，貽貝組合物呈液體組合物形式，該液體組合物包含類乳液結構，其中至少一個疏水相包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物，且該一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物係分散在該親水相或水性相中，且其中該親水相或水性相具有分散或懸浮在其中的一或多種親水性生物活性組分。
較佳地，親水性生物活性組分包括下列的一或多者：蛋白質、胜肽、胺基酸、碳水化合物、維生素、元素、肝醣、多醣、礦物質、牛磺酸、多酚、類胡蘿蔔素、糖胺聚醣及膠原。
較佳地，疏水相包含至少一些小滴或小球，該等小滴或小球具有圍繞或封裝該等小滴或小球的層，其中該等脂質或親脂性生物活性組分位於該等小滴或小球內部。
該等粒子或小球可為脂蛋白或類似物。
組合物亦可包含呈懸浮液的一些固體粒子。
較佳地，組合物包含具有在約100 nm – 100 μm之間的平均粒子大小分佈的粒子大小之混合物，該混合物包括一些微粒子及/或微小滴及/或一些奈米粒子及/或奈米小滴。
較佳地，組合物中之大多數粒子為具有在100-50,000 nm之間的範圍內之大小的微粒子。
較佳地，組合物包含在疏水相中之至少5%的脂質或親脂性組分，及在親水相中之至少75%的親水性組分。
較佳地，組合物包含在疏水相中之在約5-20%之間的脂質或親脂性組分。
較佳地，組合物包含用作乳化劑、表面活性劑及/或輔助表面活性劑的一或多種天然組分。
較佳地，組合物包含至少總共5%之一或多種表面活性劑或類表面活性劑、乳化劑或類乳化劑、輔助表面活性劑或類輔助表面活性劑的組分。
較佳地，用作乳化劑、表面活性劑及/或輔助表面活性劑的一或多種天然組分係分散在親水相中，及/或位於疏水相中之粒子或小球之表面上的蛋白質及/或胜肽。
較佳地，組合物係藉由酶水解產生的水解之貽貝組合物。
較佳地，在貽貝組合物中不包括額外的化學表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑。
較佳地，組合物係穩定的而無需添加任何抗氧化劑。
較佳地，組合物經乾燥以形成乾燥組合物。
較佳地，組合物係凍乾組合物。
較佳地，乾燥組合物在水或水性介質中復水時形成具有如本文描述的液體組合物之性質的液體組合物。
較佳地，乾燥組合物具有自乳化組合物之性質及/或特性。
較佳地，組合物具有類似天然自乳化藥物遞送系統(self-emulsifying drug delivery system；SEDDS)之結構或類似生物活性遞送系統之結構，該結構提供了存在於組合物中之生物活性組分之改良的生物可用性。
較佳地，組合物經調配成膳食補充劑組合物、營養製劑組合物、獸醫學組合物或醫藥組合物。
較佳地，組合物經調配成選自包含下列之群組的劑型：口服劑型，諸如錠劑、膠囊、乾粉形式、油劑、食物成分；用於外部使用的局部劑型，諸如乳劑、凝膠劑、潤滑劑、軟膏劑、洗劑、諸如硬膏劑及繃帶之敷料以及加藥敷料；以及其他內部劑型，包括可注射形式。
在本發明之另一態樣中，提供了一種源自貽貝之乾燥自乳化組合物及/或生物活性遞送系統，該組合物具有至少兩相，包括：至少一個疏水相，包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物；以及至少一個親水相或水性相，具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分，且具有一或多種天然組分，其用作表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑，使得該組合物在被添加至水性介質時形成類乳液結構。
較佳地，組合物係藉由酶水解產生的水解之貽貝組合物。
較佳地，用作表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑的一或多種天然組分係分散在親水相中、及/或位於疏水相中之粒子及/或小球之表面上的蛋白質及/或胜肽。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由萃取或分餾及回收如本文描述的液體或乾燥貽貝組合物之疏水相而由該貽貝組合物產生的脂質貽貝萃取物。
較佳地，脂質貽貝萃取物係封裝之油劑。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由萃取或分餾及回收如本文描述的液體或乾燥貽貝組合物之親水相而由該貽貝組合物產生的非脂質貽貝萃取物。
根據本發明之另一態樣，提供了一種由貽貝製備如本文所描述的貽貝組合物之方法，其中該方法包含應用至未粉碎之貽貝材料的至少一個酶處理步驟。
較佳地，酶處理步驟係應用至整體新鮮貽貝。
較佳地，酶處理步驟包含： 將貽貝之貝殼開出缺口或至少部分地打開或以其他方式暴露貽貝之貝殼內部的至少一些材料； 將包含一或多種酶之酶調配物施加至貽貝，以及 (a) 使貽貝與該酶調配物接觸直至鮮肉及其他生物材料實質上與貽貝之貝殼分離，以及 (b) 藉由在相同的酶處理步驟中使用相同酶調配物，及/或藉由在相同的或一或多個後續酶處理步驟中應用不同的酶調配物來使鮮肉及其他生物材料液化。
較佳地，步驟(a)中之酶調配物包括至少一種蛋白水解酶。
較佳地，貽貝在開出缺口或打開步驟之點處或至多該點處為整體活貽貝。
較佳地，該酶處理步驟或每個酶處理步驟之持續時間小於120分鐘，更佳地小於90分鐘且甚至更佳地在15-40分鐘之範圍內。
較佳地，貽貝係選自以下物種：紐西蘭綠唇貽貝(紐西蘭殼菜蛤)、亞洲綠貽貝(綠殼菜蛤(Perna viridis ))、其他殼菜蛤物種；地中海藍貽貝(地中海殼菜蛤(Mytilus galloprovincialis ))、普通藍貽貝(食用殼菜蛤(Mytilus edulus ))、加州貽貝(加州殼菜蛤(Mytilus californianus ))、褐色貽貝(褐殼菜蛤(Perna perna ))、韓國貽貝(厚殼殼菜蛤(Mytilus coruscus ))、智利貽貝(智利殼菜蛤(Mytilus chilensis ))、海灣貽貝(油黑殼菜蛤(Mytilus trossulus ))、條紋貽貝(半皺殼菜蛤(Geukensia demi ssa))、海貽貝(石蟶(Lithophaga lithophaga ))、淡水斑馬貽貝(斑馬紋貽貝(Dreissena polymorpha ))；短齒蛤殼菜蛤(Brachidontes rodriguezii )；Perumytilus purpuratus ；阿特拉貽貝(Aulacomya ater )；合唱殼菜蛤(Choromytilus chorus )；及雲雀貝物種。
較佳地，乾燥組合物在水性介質中具有高溶解度且可經復水以形成穩定的類乳液液體組合物。
較佳地，液體及/或乾燥貝介類組合物包含高產率之生物活性組分或濃縮的活性成分。
本發明亦可概括地表述為存在於本申請案之說明書中個別地或共同地涉及或指示的部分、元素及特徵，及該等部分、元素或特徵中任何兩個或兩個以上之任何或所有組合，且在本文中提及具有已知當量的特定整數的情況下，此等當量係視為如同個別地闡述一般併入本文中。 定義
在本說明書中，除非上下文另外需要，否則以下術語應具有以下定義：
如本文結合貽貝所使用的「整體」意謂包括其貝殼的貽貝，該等貽貝為實質上整體且完整無缺的，且為實質上未經加工的。
如本文結合貽貝所使用的「新鮮」意謂貽貝是活的或在加工開始之前死亡小於12小時，但較佳地在加工開始之前死亡小於三小時。
「生物活性組分」及/或「生物活性化合物」(可互換地使用)意謂對活的生物體、組織或細胞或基因有影響的任何一或多種化學分子、元素或化合物，且包括有益於或可能有益於人類及其他動物之健康或良好狀態的任何分子（數種分子）、元素（數種元素）或化合物（數種化合物）或其組合。
本發明之上下文中的「類乳液組合物」意謂類似乳液或膠體之液體組合物，該液體組合物包含至少一個親水相或連續相及至少一個疏水相或分散相，且亦可包含呈溶液或懸浮液之一些固體粒子。該術語包括膠態懸浮液、膠態乳液及膠態分散液。
「乳液」包括所有類型之乳液，包括粗乳液、單乳液、雙乳液、多重乳液、微乳液、奈米乳液、膠態乳液及經乳化之懸浮液。
「酶調配物」意謂包含至少一種酶之調配物且包括包含一或多種酶之混合物的調配物、及包含一或多種酶及一或多種其他非酶物質之調配物。
如本文所使用的「自乳化」係指在添加至水性介質時自發地或僅在最少攪動下形成穩定乳液或分散液之組合物。
如本文結合本發明之類乳液組合物所使用的「穩定」係指液體組合物或經復水之乾燥組合物，其於室溫在無攪動的情況下保存一小時或更久時不呈現相分離。
如本文所使用的「靶(target)生物材料」或「靶基質」係指貽貝之貝殼上或貝殼中存在的任何所要生物材料，亦即貝殼內部的肉或鮮肉，而且亦包括貝殼上存在的諸如幾丁聚醣之其他材料、可存在於貝殼內部的生物材料之層(例如，存在於貽貝中之珍珠層、棱柱層及角質層(類似於皮膚))、韌帶、外展肌、牙齒、足絲(或觸鬚)、內臟及足部。
以下描述將關於本發明之較佳實施例來描述本發明，然而，本發明不以任何方式限於該些較佳實施例，因為該等較佳實施例純粹地僅例證本發明且設想可在不脫離本發明之範疇的情況下做出將為熟習此項技術者顯而易見的可能變化及修改。
本發明係關於源自貽貝的液體或乾燥組合物，其包含高濃度或高產率之生物活性組分、及改良的生物可用性。本發明係特定地但不必唯一地關於源自整體新鮮或活的貽貝物種之加工的組合物，該等貽貝物種包括但不限於下列：所有貽貝物種，諸如紐西蘭綠唇貽貝(紐西蘭殼菜蛤)、亞洲綠貽貝(綠殼菜蛤)、其他殼菜蛤物種；地中海藍貽貝(地中海殼菜蛤)、普通藍貽貝(食用殼菜蛤)、加州貽貝(加州殼菜蛤)、褐色貽貝(褐殼菜蛤)、韓國貽貝(厚殼殼菜蛤)、智利貽貝(智利殼菜蛤)、海灣貽貝(油黑殼菜蛤)、條紋貽貝(半皺殼菜蛤)、海貽貝(石蟶)、淡水斑馬貽貝(斑馬紋貽貝)、短齒蛤殼菜蛤、Perumytilus purpuratus、阿特拉貽貝、合唱殼菜蛤、及雲雀貝物種。
組合物在呈液體形式時且在乾燥並利用水性介質復水時具有類乳液結構。組合物表現出具有自乳化組合物之性質。自乳化之性質允許此種組合物以濃縮形式投予，如例如以諸如錠劑及軟凝膠或硬殼膠囊之口服劑型來投予，預期精細乳液將在消化道中形成，使得在經口或藉由其他投藥方法給予時，存在生物活性化合物之改良吸收。當與習知乳液比較時，自乳化組合物在與水性介質結合時具有改良的物理穩定性。已對本發明之組合物進行獨立測試，其顯示組合物為穩定的且在長期保留時呈現很少的相分離。
組合物表現出在添加至水或其他水性介質時自發地自乳化。組合物之此令人驚奇且有益的性質使得生物活性組分能夠以歸因於所得類乳液組合物之穩定性及均質性而將提供良好及意外一致生物可用性之形式來遞送。
類乳液組合物為具有至少兩相之穩定組合物，該至少兩相即連續相及分散相，其中至少一相為疏水相且至少一相為親水相或水性相，且組合物亦可包含呈溶液及/或懸浮液之一些固體粒子。較佳地，組合物包含具有在100 nm-100 μm之間的平均粒子大小分佈的粒子大小之混合物，且該混合物包括一些微粒子及/或微小滴及/或一些奈米粒子及/或奈米小滴。已發現，本發明之組合物中之大多數粒子為具有在100-50,000 nm之間的範圍內之大小的微粒子。已發現，疏水相中之至少一些粒子具有封裝或圍繞粒子或小滴或小球之層，其中一或多種脂質或親脂性生物活性化合物位於粒子或小滴或小球內部且受保護。該等粒子或小球可為脂蛋白或類似物。疏水相係分散及/或懸浮在連續相或親水相或水性相中。連續相或親水相或水性相具有分散及/或懸浮在其中的一或多種生物活性組分，其可包括蛋白質、胜肽、胺基酸、碳水化合物、維生素、元素、肝醣、多醣、礦物質、牛磺酸、多酚、類胡蘿蔔素、糖胺聚醣及膠原。
呈液體形式或乾燥形式的類乳液組合物係穩定的，且該等組合物包含具有合理的均勻大小及形狀之均勻分佈的球形形狀的粒子、小滴及/或小球或生物分子(如下文關於實例1之第4圖及第5圖以及第11圖及第12圖中所示)。已表明組合物及由其生產的任何後續萃取物具有比現存的整體貽貝組合物產品更高之生物活性水平且因此其等可能具有增加的健康益處。不需要將抗氧化劑、表面活性劑、輔助表面活性劑、乳化劑或其他添加劑添加至組合物以便維持生物活性或以其他方式穩定化組合物。組合物由此為完全天然的。
本發明之組合物之關鍵優點之一在於：歸因於獨特的類乳液結構，生物活性組分更容易或輕易地被吸收至身體中(經由皮膚、組織、細胞及/或血流)，由此本發明之組合物將為遞送有益生物活性組分之有效手段，由於組合物之結構及性質允許改良的生物可用性。在不受理論約束的情況下，發明人相信組合物為自乳化的，因此存在於本發明之組合物中的生物活性組分將易於經由細胞之間的旁細胞吸收而被吸收至身體中。文獻暗示當經口給予時，自乳化調配物可在存在於組合物中之生物活性化合物之吸收的速率及程度以及所得血漿濃度概況之一致性兩方面提供改良。本發明之組合物之生物活性組分將由此得以有效地遞送。此外，自乳化之性質允許本發明之組合物以濃縮形式投予，如例如以封裝形式投予，預期精細乳液將在消化道中之任何靶位置中形成。
在不希望受理論約束的情況下，相信本發明之組合物包含天然地用作表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑且由此充當自乳化系統中之天然可溶性增強劑的生理化學組分。由此，存在於組合物之疏水相中的脂質或親脂性生物活性組分係以穩定及均質方式穿過連續相或親水相或水性相分散。已發現，疏水相中之至少一些粒子具有圍繞或封裝粒子或小滴或小球之層，其中一或多種脂質或親脂性生物活性組分位於小球內部且受周圍層保護。此等粒子或小球可能為脂蛋白或類似物。組合物之連續相或親水相具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分，且亦可包含呈溶液或懸浮液之一些固體粒子。
用作表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑的組分可能包含低分子量蛋白質及/或胜肽，由於該些組分表現出保持在穿過親水相分散之粒子或小球之表面上。該些物質可輔助形成結構化之粒子或小球，該等結構化之粒子或小球隨後彼此排斥且排斥力致使該等結構化之粒子或小球保持穩定地懸浮在親水相中。替代地或另外，該等物質可能改變組合物之黏度，這可有助於產生並維持疏水性粒子或小球於親水相中之懸浮液。 最佳方法之描述
本發明之組合物或萃取物可以許多不同的方式生產，但較佳地使用酶水解方法來生產。已發現，本發明之改良的組合物可藉由使新鮮或活的未受損傷或未加工貽貝材料（亦即，在酶之任何應用之前尚未處理或粉碎的貽貝材料）進行酶水解來製得。現將描述在提交本申請案之時發明人已知的製備本發明之組合物之最好方法之一。
如第1圖所示，本發明之液體組合物可由整體的新鮮(較佳地活的)貽貝起始材料產生。該方法包含將包含一或多種酶之至少一種酶調配物應用至貽貝之至少一部分且使貽貝與酶調配物接觸達充分時間段以從貽貝之貝殼分離靶基質（數種靶基質）及/或靶生物材料且實質上使靶生物材料及/或靶基質（數種靶基質）液化。酶調配物首先從貽貝之貝殼分離肉或鮮肉及其他生物材料，且其次溫和且逐漸地將生物材料分解成較小粒子，從而釋放包括養分、機能分子及生物活性化合物之生物活性組分。可隨後從所得的液體組合物移除任何殘餘的非靶材料或基質，亦即諸如貝殼及/或其碎片之固體。較佳地，該方法包括升溫步驟，用以達成將貽貝貝殼(若其為活的)打開或開出缺口且活化酶調配物以加速製程之雙重目的。液體組合物可隨後經乾燥以生產乾燥組合物。
整體的新鮮(較佳地活的)貽貝較佳地在收穫之後儘快地清潔並加工，且新鮮地加工及較佳活加工，或至少在死亡後在12小時內，且較佳在三小時內加工。若不可能在收穫之後快速地加工貝介類，則貽貝可經清潔且在加工之前冷藏儲存(在約4-9℃下，理想地在7℃下)多達48小時。在一些情況下冷藏可為較佳的，因為海水自然地排出，這有助於減少含水量以用於組合物之稍後乾燥。
進行至少一個酶處理步驟(10)，其經設計以從貽貝之貝殼移除或分離靶生物材料（例如存在於貽貝之貝殼中或上的肉及/或其他生物材料），且同時溫和地液化靶生物材料或減小該靶生物材料之大小以生產液體類乳液組合物(11)。酶處理步驟涉及使貽貝之一或多種靶生物材料或靶基質暴露於酶調配物，該酶調配物包含一或多種適於作用於靶基質（數種靶基質）之酶。
若使用整體貽貝，則必須將貽貝打開或開出缺口，或以某種方式刺穿或穿透貝殼之至少一部分以便使貝殼內部含有肉及其他生物材料之至少一部分暴露於酶調配物。此舉較佳地藉由如上所述應用溫和加熱來完成，或可藉由HPP製程或諸如定位至外展肌以觸發開出缺口或打開的雷射打開方法之其他製程來完成。若使用其他刺穿或開裂方法，則該些方法較佳地為對貝殼內部的生物材料造成最少擾動的溫和方法。若使用整體活的貽貝，則較佳地藉由升溫步驟將貽貝打開或開出缺口，且較佳地在開出缺口或打開步驟之點處或直至該點的貽貝皆為活的。一旦藉由升溫步驟將其等開出缺口或部分地打開，包含經選擇以作用於作為靶基質之外展肌的一或多種酶之酶調配物即可用於促進雙殼貝類之完全打開。
升溫步驟可藉由此項技術中已知的任何手段（例如，藉由將熱源直接地或間接地應用於貝介類）來進行。較佳地，升溫步驟係藉由以下方式來進行：應用在約90-100℃之溫度下的蒸汽(例如，閃蒸蒸汽注入或浸漬(infusion))以在貝介類中或周圍快速地達成約35-55℃之溫度。替代地，升溫步驟可藉由使用熱夾套或其他熱構件將貝介類加熱至最佳溫度來進行，然而，此舉將為較慢製程。
該酶調配物或每種酶調配物可包含一或多種類型的源自動物、植物或微生物起源的酶，或一或多種酶與一或多種酸或鹼之組合。酶之選擇需要考慮待加工的貽貝之物種、待受作用的靶基質、所要組合物之形式、所使用的加工設備及將影響及/或促進酶活性之因素。
可用於酶調配物中的酶之實例包括但不限於下列：脂肪酶、磷脂酶、磷酸酶、肝醣磷酸化酶、葡萄糖基轉移酶、葡萄醣苷酶、蛋白酶、膠原酶、肝醣去分支酶、葡萄糖磷酸變位酶、纖維素酶、殼質酶、多醣酶、雙醣酶、褐藻酸酶、澱粉酶、麥芽糖酶、胜肽酶、胃蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶、a-澱粉酶(來自發芽的穀類)、β-澱粉酶(來自甘藷或發芽的穀類)、獼猴桃蛋白酶(來自奇異果)、無花果蛋白酶(來自無花果)、鳳梨蛋白酶(來自鳳梨)、木瓜蛋白酶(來自番木瓜)、及來源於下列微生物之酶：解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、嗜酸普魯蘭芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus halodurans)、蜂蜜麯黴(Aspergillus melleus)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、黑麯黴(Aspergillus niger)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、繩狀青黴菌(Penicillium funiculosum)、里氏木黴菌(Trichoderma reesei)、綠木黴菌(Trichoderma viride)、大腸桿菌(Escherichia coli)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)、浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)、細麗毛殼菌(Chaetomium gracile)、淡紫青黴菌(Penicillium lilacinum)、啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、馬克思克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)、哈茨木黴菌(Trichoderma harzianum)、兩型孢側孢菌(Disporotrichum dimorphosporum)、孤獨腐質黴(Humicola insolens)、愛默生籃狀菌(Talaromyces emersonii)、德列馬根黴(Rhizopus delemar)、米根黴(Rhizopus oryzae)、雪白根黴(Rhizopus niveus)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、卡門伯特青黴菌(Penicillium camembertii)、皺褶念珠菌(Candida rugosa)、爪哇毛黴(Mucor javanicus)、洛克菲特青黴菌(Penicillium roquefortii)、少根根黴(Rhizopus arrhizus)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、紫紅鏈黴菌(Streptomyces violaceoruber)、克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、茂源鏈黴菌(Streptomyces mobaraensis)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、游動放線菌(Actinoplanes missouriensis)、樹狀微桿菌(Microbacterium arborescens)、橄欖色鏈黴菌(Streptomyces olivaceus)、橄欖產色鏈黴菌(Streptomyces olivochromogenes)、鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)、鏽赤黴鏈黴菌(Streptomyces rubiginosus)及溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)。
酶調配物可進一步包括一或多種酸或鹼，諸如磷酸、硫酸、單寧酸、檸檬酸、酒石酸、氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鎂、氫氧化鉀。
該酶調配物或每種酶調配物可經預混合並應用至貽貝，或該酶調配物或每種酶調配物之每種組分可在酶處理步驟（數個步驟）期間分別地同時或順序地應用至貽貝。
所使用的該酶調配物或每種酶調配物之量取決於所加工的貽貝之類型以及由使用者設定的操作參數(例如，溫度、pH、時間及終點)、及所要的產品規格。所使用的該酶調配物或每種酶調配物中包括的每種酶之量應基於待受作用的該靶基質或每種靶基質之量來計算，該靶基質或每種靶基質之該量可基於整體新鮮貝介類原材料之重量來估計。例如，在一批10 kg的貽貝中，將有大致5 kg之鮮肉或肉及水(其餘5 kg為貝殼)。5 kg貽貝中存在大致12%之蛋白質，因此為了有效地使蛋白質組分或基於蛋白質的基質液化，該酶調配物或每種酶調配物中包括的該蛋白水解酶或每種蛋白水解酶之量將基於所估計的12%之蛋白質基質來計算，而非基於起始貝介類材料之質量來計算。較佳地，該酶調配物或每種酶調配物中包括的該酶或每種酶之量在基於待在該酶處理步驟或每個酶處理步驟中處理的該靶基質或每種靶基質之估計量所計算的0.1-10%的範圍內。
許多市售的酶已經測試且為有效的。酶之選擇通常係在所使用的特定操作參數下在酶調配物之成本與總效率之間的平衡，並且考慮所要的最終產物規格。
已發現在綠唇貽貝之加工中特別有效的酶及/或酶之組合包括一或多種選自包含下列之群組的酶：源自產生枯草桿菌蛋白酶之細菌菌株(包括解澱粉芽孢桿菌)的酶；源自地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黑麯黴及米麯黴之酶；半胱胺酸蛋白酶；醣酶、蔗糖酶、澱粉酶、脂肪酶、磷脂酶、磷酸酶、酯酶、及過氧化氫酶。
在一個較佳方法中，酶調配物包含至少兩種選自包含下列之群組的酶之組合：源自解澱粉芽孢桿菌之酶、源自地衣芽孢桿菌之酶、半胱胺酸蛋白酶、及源自米麯黴之酶，其中該等酶中之至少一種為蛋白水解酶。
儘管一些酶可在較低pH下作用，用於加工貽貝之最佳pH係在pH 2-9之範圍內，較佳為約pH 4至8。pH可按需要且在必要時在製程期間藉由添加適合的酸或鹼來調節。
一或多個酶處理步驟較佳地在溫度受控條件下進行且歷時指定時間段。反應溫度較佳地不大於60℃，且較佳地在約20-60℃之範圍內。總反應時間較佳地小於120分鐘、更佳地小於90分鐘且更佳地在15-40分鐘之範圍內。反應溫度及持續時間應基於所要之最終產物規格來計算。反應時間通常係基於達成所要之最終產物規格所需的最少時間來設定。
已發現，針對每個酶處理步驟在約15-40分鐘之間的持續時間內足以達成顯著的水解程度。
已發現，若酶水解過程極短且起始材料儘可能地新鮮且較佳地為活的，則可獲得改良的組合物。
攪動步驟較佳地在升溫步驟及/或酶處理步驟期間及/或之後使用，這使得貝介類能夠持續地移動且由此更均勻地暴露至增加的溫度及/或酶調配物。在酶處理步驟（數個步驟）(10)之後，所得組合物係呈類似於乳液或膠體之液體組合物的形式(典型地具有類漿料稠度) (11)。液體組合物隨後經受至少一個分離步驟(12)以從該組合物移除任何貝殼、貝殼碎片、或其他大的非靶固體生物材料。分離步驟可藉由此項技術中已知的任何手段來進行，例如，藉由使用篩網、過濾器或篩子、或其組合來進行。一系列分離步驟可進行以獲得具有所要粒子大小或特定乳液結構的液體組合物或用於某些生物活性組分之較好回收。較佳地，此液體組合物隨後經虹吸或瀝乾或以其他方式回收，且將剩餘材料再循環回到製程中，且在一或多個後續酶處理步驟(14)中利用一或多種包含相同或不同酶之酶調配物重新處理，使得將較大粒子進一步減小、分解或轉化成較小粒子直至就除貝殼之外的實質上所有貽貝起始材料而言達成生物活性組分之所要粒子大小或特定乳液結構或某種水平。此舉意謂浪費程度最小且產率損失最小。
在一個較佳方法中，如第2圖所示，製程之主要步驟係在單個處理容器或腔室中進行。處理腔室(20)較佳地為圓柱形狀的容器，其可經密封及加壓。對分批加工而言，任何量(例如，數公斤或數公噸)之整體新鮮貝介類可自漏斗或其他儲存容器置放或運送至處理腔室(20)中。處理腔室可具有內建稱重元，使得每批之大小可得以控制並監測。對連續或半連續加工方法而言，這可能不是必要的。在處理腔室中在任一時間加工的貝介類之量將取決於處理腔室之內部大小及容積。在已添加貝介類之後，處理腔室內將需要一些空隙空間來保持熱/蒸汽且留出移動空間。
較佳地，處理腔室經水平定向而非垂直定向，或該處理腔室在傾斜位置中定向。此舉避免了對機械壓碎步驟的需要，且亦避免了對向處理腔室添加水以供加工的需要。若蒸汽注入用作加熱手段，則可能以此方式加工貽貝而無需向處理腔室添加任何其他的水。
處理腔室(20)可包括至少以下特徵及組件：可密封開口(21)；加熱構件(22)；用於酶調配物之給料系統(23)；及攪動構件(24)。
可密封開口(21)可用於將貝介類引入處理腔室中，及用於在酶處理步驟（數個步驟）之後將所得液體組合物排出。
加熱構件(22)可為位於處理腔室內部的蒸汽加熱裝置，諸如閃蒸蒸汽注入器或浸漬器。較佳地，蒸汽注入器或浸漬器位於腔室內部之一位置中以使得能夠將蒸汽遞送至腔室之中心部分中。在另一選項中，加熱構件可包括位於處理腔室之壁之至少一個上或附近的加熱元件或熱夾套或熱交換器(25)，該加熱構件替代蒸汽注入器或浸漬器或與之結合。加熱構件較佳地經操作以將處理腔室之內部溫度升高至約35-60℃之間，以便藉由使處理腔室達到活化酶調配物之最佳溫度而針對酶處理步驟調節貝介類，並且在整體活貽貝的狀況下將貽貝部分地打開或開出缺口，使得酶調配物可在貝殼內部分配。若閃蒸蒸汽注入或浸漬用作加熱手段，則較佳地蒸汽係在約90-100℃之溫度下注入達預定時間段(通常極短，例如在約90-120秒之間)以便將處理腔室之內部溫度快速但溫和地升高至最佳溫度。蒸汽注入或浸漬時間取決於進料原材料溫度、處理腔室之大小、設備類型(例如，無論是否亦使用諸如加熱夾套之另一熱源且若是，則無論此設備是開啟還是關閉)、攪動之效率、蒸汽注入器或浸漬器之噴嘴大小及所注入蒸汽之體積。
給料系統(23)可包括自動分配裝置，可向該自動分配裝置添加酶調配物（數種酶調配物），該自動分配裝置連接至位於處理腔室內部的給料構件(26)，使得給料可為受控的。較佳地，酶調配物係藉由給料構件(26)之方式傾倒或噴灑至貝介類上，該給料構件可具有或包含例如噴灑噴嘴以促進酶調配物至貝介類上之分佈。較佳地，給料構件(26)係以使得能夠將酶調配物實質上均勻地分佈至貝介類上的方式定位。酶調配物可在升溫步驟開始之前、同時、或之後添加。
較佳地，處理腔室(20)或處理腔室之內容物能夠被連續地或半連續地旋轉或攪動。此舉提供了熱在處理腔室中之更有效分佈，且提供了酶調配物至處理腔室之內容物的更有效分佈。
處理腔室亦可包括再循環系統(27)，藉以容器之內容物可得以再循環。例如，酶調配物可再循環及再使用，或液體貝介類材料可在酶處理步驟（數個步驟）期間再循環或再循環以用於待在虹吸出或移除一些液體組合物之後進行的後續酶處理步驟(使用包含相同或不同的酶之酶調配物)。再循環系統可係管道或循環管，其從在處理腔室之底座處或附近的出口(29)延伸且提供了返回至給料構件(26)或可位於處理腔室之頂部處或附近的其他適合的入口埠之流體路徑。
處理腔室之內部溫度可藉由外部溫度計或類似物(連接至內部溫度探針)來監測，使得溫度維持在理想加工溫度(小於60℃，較佳在55-60℃之間)下達酶處理步驟（數個步驟）之持續時間。溫度係藉由將熱源(25)設定在所要溫度下達反應時間之持續時間而得以維持，或藉由穿過蒸汽注入器或浸漬器按需要且在必要時應用進一步直接閃蒸蒸汽來維持最佳內部溫度而得以維持。第一酶處理步驟之持續時間係藉由從貽貝之貝殼實質上移除或分離靶生物材料及/或靶基質（數種靶基質）以及利用選定之酶調配物使靶生物材料及/或靶基質（數種靶基質）實質上液化所花費的時間量所決定。通常，酶處理步驟/液化製程將總共花費少於120分鐘，且更佳地總共花費少於90分鐘，然而，為了達成一些生物活性組分之完全釋放或分解，可能需要較長的時間段。儘管如此，較佳地，該酶處理步驟或每個酶處理步驟之持續時間係在約15-40分鐘之間。處理腔室可包含排氣系統(28)，其在酶處理步驟結束時（亦即，處理腔室停止或停用時）啟動，且打開排氣口以排出處理腔室內的熱或蒸汽及壓力。
在完成第一酶處理步驟之後，貝介類起始材料之靶生物材料及/或靶基質將已減少到主要為液體組合物及包含例如足絲(若不需要)的非靶基質之其他固體生物材料，該液體組合物呈類乳液組合物或膠體(典型地具有類漿料稠度)的形式、包含諸如貝殼及貝殼碎片之一些固體材料。液體組合物從處理腔室排出(經由可密封開口或其他排出埠)且經受至少一個分離步驟(12)。進行第一分離步驟以從液體組合物移除殘餘貝殼及/或貝殼碎片、及任何其他大的固體非靶材料。可在篩子或其他過濾裝置中收集乾淨貝殼且藉由運送機丟棄或移除至容器中。殘餘貝殼及其他固體廢物材料(例如足絲，若不需要)可在需要時經進一步加工成其他商品(例如，用作寵物食物或用於動物飼料中的液體或乾燥產品，或用於工業用途的須毛/貝殼產品)。替代地，若意欲從分離之固體材料中之一些釋放某些生物活性組分，則此材料可在一或多個後續酶處理步驟中利用一或多種不同的酶調配物重新處理。
在分離步驟之後，可進行一系列過濾步驟(13)來藉由此項技術中已知的手段，例如，藉由使用一或多個篩網、過濾器或篩子(其具有直徑逐漸減小的開口)逐漸地減少液體組合物之粒子大小。較佳地，至少一個過濾步驟在分離步驟之後進行以便在已移除殘餘貝殼之後從液體組合物移除大的粒子。較佳地，液體組合物能夠在分離步驟之後的一個過濾步驟中經過濾至小於200 μm之粒子大小。若噴霧乾燥用於乾燥組合物，則小於200 μm之粒子大小尤其重要。
在分離步驟之後及/或在第一過濾步驟之後剩餘的材料(亦即，包含非靶基質之非靶生物材料) (包括任何剩餘的活性酶調配物)可添加回處理腔室中(藉由再循環系統或以其他方式)且經受一或多個進一步的酶處理步驟(典型地使用不同的酶調配物)以使剩餘材料中之其他基質逐漸地液化及乳化，以便釋放進一步的生物活性組分。
液體組合物可在分離或過濾步驟（數個步驟）(若進行)之前或之後穩定化(15)，以便去活化酶（數種酶）且巴氏消毒或滅菌液體組合物以滿足食品安全要求。酶（數種酶）之去活化可藉由此項技術中已知的許多手段來達成，例如藉由應用閃速熱處理(諸如UHT、HTST、PEF)，或藉由將液體組合物之pH變為酶（數種酶）變得去活化的pH (亦即pH＜4或pH＞10)，例如，藉由添加酒石酸或其他酸來達成。因為pH穩定劑可不利地影響液體組合物中之一些生物活性組分或導致一些組分之分離/變性，較佳的穩定化方法為快速熱處理。例如，熱交換器可用以將組合物之溫度快速地增加至高於80℃達短時間段(例如，高達85℃達5-15分鐘)。替代地，進一步的蒸汽注入或浸漬(藉由溫度探針控制)可在酶處理步驟結束時應用來在啟動排氣口之前將處理腔室之內部溫度增加至此水平。可使用不涉及熱處理的其他穩定化方法，諸如微過濾或超過濾方法。
在穩定化及過濾之後，液體組合物可原樣使用，或液體組合物可經分配至容器中且在低溫下儲存以供稍後使用，或液體組合物可經立即冷凍以供稍後使用。若液體組合物經立即冷凍，則可能不需要穩定化步驟，然而，一旦組合物經解凍以供稍後使用，則該組合物將很可能需要以某種方式穩定化。
在第1圖中，乾燥步驟(16)係在分離步驟(12)之後進行以便生產乾燥組合物。液體組合物可使用此項技術中的任何已知乾燥方法來乾燥。較佳地，乾燥係藉由諸如冷凍乾燥的低溫(＜80℃)乾燥手段，或藉由諸如噴霧乾燥、真空乾燥或帶式乾燥的閃速乾燥手段來進行。在乾燥之後，乾燥組合物可藉由此項技術中已知的方法研磨或碾磨成粉末(17)。液體或乾燥組合物可藉由一或多個分離、分餾或萃取步驟來進一步加工以生產如下文進一步論述的其他產品形式(18)。
第3圖提供了最佳方法之更詳細的示意性表示，該方法包括使用如第2圖所示的處理腔室且包括後續可能的加工步驟。
本發明之液體組合物之特定優點在於，相較於現存的整體貽貝組合物產品而言，該等液體組合物包含高百分比的具有小粒子大小之材料。例如，在一個研究中，發明人發現，相較於具有大多數在300-1200 μm範圍內之粒子大小的先前技術的整體貽貝組合物而言，本發明之綠唇貽貝組合物具有約60%之40-50 μm大小的粒子。相較於先前技術產品而言，本發明之組合物之水性相中亦存在濃度高得多之粒子或小球。研究已表明，本發明之組合物中之大多數粒子為具有在約100-50,000 nm範圍內之大小的微粒子。
第11圖顯示了相較於藉由機械加工方法生產的現存產品而言，自FEI Nova NanoSEM 450、高解析度、場發射槍掃描電子顯微鏡(field emission gun scanning electron microscope；FEG-SEM)獲得的本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之微觀結構的影像。影像顯示了粒子形狀及大小之清晰區別。本發明之組合物具有小得多的球形形狀的粒子及更均勻的粒子結構及大小。第12圖顯示了利用水復原的本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之類乳液結構的典型影像。復水組合物在水性懸浮液中為穩定的且形成獨特的微觀結構，該微觀結構包含結構化的球形生物材料，該生物材料包含脂質及蛋白質兩者，該等脂質及蛋白質可為包含脂質雙層或類似物的脂蛋白或粒子。影像顯示：組合物包含具有變化大小之材料之混合物，該材料混合物包括一些奈米粒子或奈米小滴及一些微粒子或微小滴。
相信脂質及/或親脂性生物活性化合物在疏水相中之結構化粒子內部封裝並保護，且親水性及可能地其他生物活性化合物在親水相中分散或懸浮。
歸因於本發明之組合物之小的及均勻的粒子大小，各種乾燥方法皆為可能的，包括噴霧乾燥。
本發明之液體組合物之小的粒子大小及穩定且均勻的性質亦允許其他直接非熱滅菌製程，諸如待按需要用於適合任何可能應用的脈衝電場(Pulsed Electric Field；PEF)或超高溫(Ultra-High Temperature；UHT)、或高溫/短時(High Temperature/Short Time；HTST)巴氏消毒法。
本發明之組合物之另一優點在於，其等包含更多胺基酸及小的蛋白質及/或胜肽，其中一些為必需胺基酸，其中一些為香味增強劑且其中一些為功能胺基酸及胜肽。發明人已發現：本發明之組合物歸因於增加量的香味增強胺基酸而具有改良的感官屬性，包括氣味、口味或香味概況。參見第9圖及第10圖。第9圖顯示：本發明之乾燥綠唇貽貝組合物與現存產品相比具有更少的魚腥味及草味概況，且該等組合物具有較甜的香味概況。第10圖顯示：本發明之乾燥綠唇貽貝組合物與現存產品相比在粒子表面上具有更低的水平之鈉及氯化物且由此鹹度較小。
本發明之組合物具有增加產率之生物活性組分及意外且高度合乎需要的微觀結構，預期這增加生物活性組分之生物可用性。有利地，若藉由上文所述的酶水解方法製得組合物，則不需要在加工期間或之後添加抗氧化劑來維持組合物之生物活性。此外，組合物為穩定的且不需要添加表面活性劑、輔助表面活性劑或乳化劑以便維持組合物之穩定性。
本發明之液體或乾燥組合物可原樣使用，或經調配為呈各種劑量形式的其他成品產品，該等劑量形式包括口服劑量形式、局部劑量形式及如下文所述的用於各種用途的其他劑型。液體及乾燥組合物之進一步加工
本發明之液體及乾燥組合物可原樣使用，或調配為用於多種目的，包括作為用於食品應用中的食品、食品補充劑、食品成分，或用於化妝品、醫藥、營養製劑或獸醫學應用。替代地，本發明之液體及乾燥組合物可作為意欲用於進一步加工成許多不同的萃取物及/或產品形式的中間產品而使用或出售，該等萃取物及/或產品形式包括膳食補充劑、營養製劑組合物、獸醫學組合物、醫藥組合物或化妝品。組合物之均勻的粒子大小及穩定的性質使得該等組合物對於進一步加工以獲得萃取物及其他產品形式而言為合乎需要的，該等萃取物及其他產品形式包含高水平的具有改良生物可用性之生物活性組分。
可能的劑型包括而不限於：口服劑型，諸如錠劑、膠囊、乾粉形式、油劑、食物成分；用於外部使用的局部劑型，諸如乳劑、凝膠劑、潤滑劑、軟膏劑、洗劑、諸如硬膏劑及繃帶之敷料以及加藥敷料；及其他內部劑型，包括可注射形式。
本發明之液體及乾燥組合物可藉由此項技術中已知的用以產生不同的有用產品的方法而經受一或多個分餾、分離或萃取步驟。例如，組合物可進一步分離成各種餾分，包括但不限於疏水性或脂質富集餾分，及含有水溶性蛋白質、胜肽、胺基酸、核酸、礦物質、碳水化合物、維生素、生物素及其他物質之親水性餾分，以及不溶於水(高分子量材料)及未溶解的蛋白質等等。已發現：歸因於本發明之乾燥組合物之結構，該等乾燥組合物具有極好的可萃性特性且可生產高量產率之具有高生物活性的經萃取組分。
脂質富集及/或親水性萃取物可使用適合的載劑及賦形劑而調配成各種形式，包括食品調味劑、食品成分、油劑、醫藥組合物或營養補充劑，諸如錠劑、膠囊、扁囊劑、糖漿、酏劑、油劑或其他劑型。歸因於本發明之液體及乾燥組合物中之生物活性組分的增加產率，據認為由該等組合物生產的任何萃取物將具有增加濃度之生物活性組分及改良的生物可用性。可能的產品形式之實例
設想以下產品形式(非限制性)可源自對本發明之液體或乾燥貽貝組合物之進一步加工： ●油劑——呈液體形式(包括呈硬殼膠囊形式或軟凝膠形式之經封裝形式)、包括錠劑或粉末之乾燥形式、或帶載劑之油劑形式，其用於膳食補充劑、醫藥或營養製劑產品、化妝品或獸醫學產品； ●液體(整體貽貝組合物(包括脂質富集餾分)、或分餾之貽貝液體(移除脂質富集餾分))，其用於膳食補充劑、醫藥或營養製劑產品、化妝品或獸醫學產品； ●粉末(整體貽貝粉末(包括脂質富集餾分)、或分餾之貽貝粉末(移除脂質富集餾分))，其用於膳食補充劑、醫藥或營養製劑產品、化妝品或獸醫學產品； ●食品成分，諸如食品調味劑、調味品、現成醬汁、粗粉等等。 ●寵物食品 實例 1
綠唇貽貝(紐西蘭殼菜蛤)係藉由將60 kg之活的整體貽貝添加至可密封、可加壓的處理腔室中來加工。將腔室關閉，在100℃溫度下應用閃蒸蒸汽注入達90秒之時期。同時將腔室旋轉約5分鐘以達成均勻分佈在腔室內部的約45-50℃之最佳溫度，以便將貽貝打開或開出缺口且針對酶處理步驟調節貽貝。腔室隨後打開且手動地添加(呈液體形式)6%之酶調配物(基於3-4 kg之總蛋白質量)。酶調配物包含源自桿菌物種(作為ESP153市售之地衣芽孢桿菌)之蛋白酶。處理腔室之內部溫度係藉由初始蒸汽注入(無需進一步的蒸汽)而維持在約55-60℃下。旋轉腔室達約40分鐘之時期。在此時間段結束時，腔室藉由啟動排氣口而停用，該排氣口自該腔室排出熱及壓力。腔室之內容物隨後排出至分離篩上以移除任何殘餘貝殼、貝殼碎片及任何其他大的粒子。液體組合物隨後經由200 μm篩網過濾器過濾。
第4圖顯示了所得液體組合物之粒子大小分佈的顯微術影像及相關聯圖表。粒子大小從1 μm至100 μm變化，其中大多數粒子大小在1 μm-50 μm之間。存在高比例的在1 μm-10 μm之間的粒子。液體組合物包含具有均勻大小及分佈之懸浮粒子(呈水性介質)之類乳液組合物。乳液可為包含低分子量蛋白質/胜肽及其他物質之雙重或多重乳液，該等低分子量蛋白質/胜肽及其他物質表現出保持在油/水滴之表面上且輔助穩定化組合物。
在分離及過濾步驟之後，液體組合物係藉由冷凍乾燥來乾燥而無需任何穩定化步驟。第5圖為顯示在本發明之此實例中生產的乾燥綠唇貽貝組合物之粒子大小分佈的圖表。將乾燥組合物復水。粒子大小從1 μm至100 μm變化，其中大多數粒子大小在10 μm-50 μm之間。
在此實例中獲得約45-50%產率之液體組合物(亦即，約25-30L之液體組合物)。由此獲得約6-7%產率之乾燥組合物(亦即約3-4 kg)。乾燥組合物具有小於6%之水分含量。乾燥組合物高度可溶且可容易地在水溶液中復水以達成實質上與原始液體組合物(如第4圖所示)相同的穩定組合物。
第6圖提供了在此實例中生產的乾燥綠唇貽貝組合物之主要組分之分析。如第6圖所示，組合物之組分不同於藉由典型機械製程生產的乾燥組合物之彼等(在對照習知製程中，活的貽貝經手動地打開，移除肉或鮮肉且切碎並隨後冷凍乾燥)。此實例中生產的乾燥組合物包含在其水性相中的約10%脂質、32%蛋白質及29%其他可溶性組分，且包含約2%脂質、18%蛋白質及9%其他不可溶組分。相比較而言，藉由習知機械加工生產的乾燥組合物包含在其水性相中的約3%脂質、5%蛋白質及29%其他可溶性組分，且包含約8%脂質、45%蛋白質及10%不可溶組分。
假定存在於貽貝中之生物材料之組合物在季節之間變化，本發明之乾燥組合物很可能包含約7-16%脂質及約45-55%蛋白質。有利地，預期本發明之乾燥組合物將包含在其水性相中的＞85%之可溶性蛋白質及其他組分。相比較而言，藉由習知機械加工生產的乾燥組合物典型地包含在其水性相中的僅25%之可溶性蛋白質及其他組分。
本發明之組合物中存在超過70%的親水性餾分，此幾乎為藉由習知機械加工方法生產的組合物中之37%親水性餾分的兩倍。本發明之組合物具有更多呈高度生物可用形式的生物活性組分。設想不可溶部分可使用一或多個不同的酶水解步驟進一步加工以分解或轉換不可溶材料來釋放進一步的生物活性及可溶性組分。生物活性研究
將實例1之乾燥組合物連同以相同方式製備但藉由噴霧乾燥而非冷凍乾燥來乾燥的一種其他乾燥組合物針對其抗炎性質進行測試，並與兩種現存的乾燥貽貝萃取物比較。
測試樣本之相對抗炎性質係藉由建立其抑制嗜中性球之活化的能力來測定，如藉由超氧化物之生產來量測的。測試樣本之功效對照阿司匹靈以及未補充之對照組。
測試樣本之細節在下表中陳述：
樣本1及2係由同一批貽貝生產。上文測試樣本中之每個係利用乙醇以1:10 (w:v)之比率萃取且隨後將殘餘物用蒸餾水以相同比率萃取，使得可測試測試樣本中之每個的脂質富集或疏水性餾分及親水性或水性餾分兩者之活性。用於測定測試樣本對炎症之效果的實驗程序係基於Tan，AS and Berridge，MV (2000)中描述的方法。藉由活化嗜中性球產生的超氧化物有效地還原四唑鎓鹽WST-1以產生可溶性甲䐶：a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening of anti-inflammatory agents. J Immunol. Meth. 238 ：59-68。嗜中性球自大鼠全血收穫且利用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA)活化。經活化的嗜中性球隨後在存在測試樣本中每個及對照物時孵育並培養。量測WST-1染料之還原以測定超氧化物之產物。對照組經設定在100%活性(0%抑制)下且將所有樣本之抑制與此參考比較。阿司匹靈為已知的抗炎化合物且因此測試來用於參考且在400 μg/mL之濃度下呈現50.2%抑制(在100 μg/mL之濃度下呈現16.5%抑制，且在200 μg/mL之濃度下呈現48.12%抑制，從而顯示劑量反應效應)。
基於藉由活化之嗜中性球抑制超氧化物，在400 μg/mL下測試來自測試樣本中之每個的乙醇及水萃取物(脂質富集及親水性餾分)之抗炎活性。使用每個萃取物之產率連同每個之活性來獲得針對兩種餾分而言對測試樣本中每個內的總活性之估計值。結果顯示於下表中。
乙醇萃取物—所測試樣本中每個中之脂質餾分對抗炎活性之相對貢獻
水萃取物—所測試樣本中每一者中之親水性餾分對抗炎活性之相對貢獻
結果顯示：所有樣本顯示一定程度之抗炎活性，其中脂質餾分中之活性高於親水性餾分中之活性。然而令人驚訝地發現，親水性餾分中存在抗炎活性，因此貽貝萃取物之脂質餾分及親水性餾分兩者皆對測試樣本之總體抗炎活性做出貢獻。第7圖為顯示基於阿司匹靈當量之IC50 (在400 μg/mL下)的就測試樣本(亦即，結合的脂質餾分及親水性餾分)之總生物活性而言的此研究之結果的圖表。此圖表顯示：實例1之測試樣本顯示比現存整體綠唇貽貝組合物產品高得多的生物活性水平。這可能係歸因於藉由實例1生產的測試樣本之親水性餾分之相對高產率與脂質餾分之良好產率及高活性之組合，該組合總體上給出萃取物之總體增加的生物活性。需要實例1中生產的測試樣本之極小劑量之親水性餾分以便達成100%抑制。類似地，將總體上需要極小劑量之萃取物以便達成100%抑制。結果顯示：在本發明之組合物中存在增加產率之生物活性組分。
此研究之結果由後續研究進一步支持，該後續研究係對相同測試樣本進行來評定測試樣本中每個之DPPH清除活性。
使用DPPH清除方法(亦即，藉由使用穩定的自由基2,2-聯苯-1-(2,4,6-三硝基苯基)偕腙肼作為基質)測試樣本中每個之抗氧化劑活性。儘管DPPH方法並非直接抗炎檢定，但抗氧化劑活性已在許多研究情況中成為抗炎活性之指示。DPPH溶液係在0.1 mM乙醇中製備且在使用之前於黑暗中保持在冰凍器中。陽性對照為在含有檸檬酸及NaHPO4 (pH 5)之緩衝液中以0.1 mg/ml製備的抗壞血酸。將相等量之樣本溶液及DPPH溶液添加到一起，且在黑暗中將檢定管或板孵育30分鐘，繼之以在分光光度計上於517 nm之吸光度量測。在每個樣本之空白對照實驗中，利用乙醇來替代DPPH。在DPPH空白對照實驗中，利用在其中製備樣本的介質(水或溶劑)來替代樣本。
清除活性(DPPH抑制%)係僅藉由樣本對照DPPH的吸光度百分比來計算：
所有樣本係在10 mg/ml之濃度下測試。結果顯示：所有樣本具有抗氧化劑活性(在所有樣本中高於80%抑制)。結果在下表中概括： 水萃取之樣本中DPPH抑制之IC50 值 乙醇萃取之樣本中DPPH抑制之IC50 值
該些結果顯示在第8圖中，該圖為顯示基於維生素E當量之IC50 (在9.26 μg/mL下)的就測試樣本(亦即，結合的脂質餾分及水性餾分或親水性餾分)之總生物活性而言的此研究之結果的圖表。自該等結果明顯的是，實例1之樣本呈現比現存整體綠唇貽貝組合物產品更強的抗氧化劑活性。水萃取物及乙醇萃取物兩者皆對總體抗氧化劑活性做出貢獻。實例 2
藉由使整體新鮮貽貝肉(未粉碎)經受酶處理步驟來製備兩種液體貽貝組合物。在溫和攪動下，在55℃之溫度下藉由將1%的包含ESP153之酶調配物應用至貽貝肉達60分鐘之時期來製備第一組合物。在溫和攪動下，在55℃之溫度下藉由將2%的包含ESP153之酶調配物應用至貽貝肉達60分鐘之時期來製備第二組合物。
使用環氧合酶(COX，亦稱為前列腺素H合酶或PGHS)檢定來測試所得液體組合物之抗炎活性。環氧合酶為呈現COX及過氧化物酶活性兩者的雙功能酶。近來的研究已確立，存在COX:COX-1及COX-2兩種不同的同功型。COX-1在各種細胞類型中表現，且涉及正常細胞生物學。COX-2係藉由有絲分裂刺激物(LPS及細胞介素)來誘導且負責在急性炎症病狀下前列腺素(prostaglandin；PG)之生物合成且由此COX-2為用於非類固醇抗炎化合物之抗炎活性之靶酶。理想的抗炎候選物應僅擁有COX-2抑制，而非COX-1抑制。使用來自Cayman化學公司(MI，USA)之COX-2比色抑制劑篩選檢定套組。
每種液體組合物之測試樣本係藉由以DMSO介質按100 mg/ml萃取液體組合物，隨後在PBS中稀釋樣本至5 mg/ml之濃度來製備。
藉由手動地打開綠唇貽貝，萃取並在55℃下孵育鮮肉達60分鐘，隨後將鮮肉均質化繼之以用DMSO介質按100 mg/ml萃取，隨後在PBS中稀釋樣本至5 mg/ml之濃度來生產對照樣本。
測試結果顯示於第13圖中。結果顯示：實例2之組合物具有極高水平之COX-2抑制活性。
COX-2抑制活性與抗炎活性有關，且預期歸因於本發明之組合物之獨特的結構及性質，存在於組合物中之生物活性抗炎組分將具有改良的生物可用性且由此在炎症病狀之治療中具有良好的功效。實例 3
藍貽貝(紫殼菜蛤(Mytilus edulis))係藉由將60 kg之活的整體貽貝添加至可密封、可加壓的處理腔室中來加工。將腔室關閉且採用如下形式的升溫步驟：在100℃之溫度下，閃蒸蒸汽注入至腔室中達90秒之時期。同時將腔室旋轉(藉由外部旋轉構件)約5分鐘以達成均勻分佈在腔室內部的約45-50℃之最佳溫度，以便將貽貝打開或開出缺口且針對酶處理步驟調節貽貝。酶處理包含應用6%的包含源自桿菌物種(作為ALCALASE市售)之蛋白水解酶的酶調配物(基於在3-4 kg之間的總蛋白質量)。可已使用替換酶，諸如ESP153或ENZIDASE PTX6L或NEUTRASE。腔室之內部溫度係藉由初始蒸汽注入而維持在約55-60℃下。處理持續時間為約30分鐘。腔室之內容物排出至分離篩上以移除任何殘餘貝殼、貝殼碎片及任何其他大的粒子。剩餘的液體組合物經過濾並穩定化。觀察到，組合物之結構及穩定性係實質上類似於利用綠唇貽貝製備的彼等，從而指示類似的組合物及萃取物可由其他貽貝物種生產。優點
本發明之貽貝組合物或萃取物具有以下潛在的可實現的優點： a) 生物活性組分之增加的產率 b) 液體組合物之結構允許使用多個乾燥選項，包括噴霧乾燥 c) 液體及乾燥組合物之結構允許使用多個分餾、分離及萃取製程以用於製成各種成品產品 d) 液體組合物之小的粒子大小及穩定且均勻的性質允許使用其他直接非熱滅菌製程，諸如脈衝電場(Pulsed Electric Field；PEF)或超高溫(Ultra-High Temperature；UHT)、或高溫/短時(High Temperature/Short Time；HTST)巴氏消毒法 e) 組合物係高度可溶的，這改良了其在許多應用中調配的能力 f) 組合物具有包括氣味、口味及香味概況之改良的感官屬性，使得組合物適合於許多應用 g) 在水性介質中具有高溶解度的組合物之類乳液結構允許改良的生物可用性，此係歸因於增加的吸收至身體中的能力 h) 合乎需要的生物活性脂質化合物係經天然地保護或封裝在組合物中，從而增加該些化合物之生物可用性及功效 i) 組合物係天然穩定的且不需要用於穩定化的額外非天然表面活性劑、輔助表面活性劑或其他乳化劑或添加劑。 變化
當然應當明白，儘管前述內容係藉由本發明之說明性實例之方式給出，但如將對熟習此項技術者明顯的，對其作出的所有此等及其他修改及變化係視為落入如上文描述的本發明之廣泛範疇及界限內。
儘管實例顯示藉由酶水解方法使用某些酶來生產的組合物，但該些實例僅顯示了一些較佳的酶調配物。設想大多數市售的酶將在生產本發明之組合物中為有效的，且酶之實際選擇係基於許多因素來決定，該等因素諸如每種酶之最佳加工溫度及pH、利用每種酶類型獲得充分的水解度通常耗費之時間、不同類型之酶的相應成本及一般易得性。另外，應當考慮貽貝之物種及貽貝之靶基質以及所要最終產物及規格。
在實例中，使用綠唇貽貝及藍貽貝。預期類似的組合物可由其他貽貝物種來獲得。
亦將理解，在如本文描述或主張的產品、方法或製程係不完整出售、作為獨立組件或作為「部件之套組」出售、或作為獨立或分離步驟來進行的情況下，此種利用將落入本發明之界限內。
出於下文描述的目的，術語「上部」、「下部」、「右」、「左」、「垂直」、「水平」、「頂部」、「底部」、「側向」、「縱向」、「側面」、「前方」、「後方」及其衍生詞應關於本發明在其圖式中定向的情況。然而，應理解，本發明可假設各種替代變化，除非其中明確指定與之相反。亦應理解，附圖中示出及以下說明書中描述的特定裝置僅僅為本發明之示範性實施例。因此，與本文所揭示的實施例有關的特定尺寸及其他實體特性不應視為限制性的。
10‧‧‧酶處理步驟
11‧‧‧液體類乳液組合物
12‧‧‧分離步驟
13‧‧‧過濾步驟
14‧‧‧後續酶處理步驟
15‧‧‧穩定化
16‧‧‧乾燥步驟
17‧‧‧研磨或碾磨
18‧‧‧產品形式
20‧‧‧處理腔室
21‧‧‧可密封開口
22‧‧‧加熱構件
23‧‧‧給料系統
24‧‧‧攪動構件
25‧‧‧加熱元件/熱夾套/熱交換器
26‧‧‧給料構件
28‧‧‧排氣系統
本發明現將僅以實例之方式參考隨附圖式來描述：
第1圖為用於由貽貝生產本發明之液體或乾燥組合物的較佳製程之流程圖。
第2圖為可用於第1圖之製程中的處理腔室之示意性表示。
第3圖為結合第2圖之處理腔室的用於由貽貝生產液體或乾燥組合物之較佳製程之示意性表示。
第4圖為顯示由綠唇貽貝生產的本發明之液體組合物之粒子大小分佈的共焦顯微術影像及相關聯圖表。
第5圖為顯示由綠唇貽貝生產的本發明之經復水之乾燥組合物之粒子大小分佈的圖表。
第6圖為顯示藉由酶水解生產的本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之餾分(顯示於右側)與藉由機械加工方法生產的典型乾燥綠唇貽貝組合物之餾分(顯示於左側)之比較的圖表。
第7圖為顯示實例1之兩種乾燥綠唇貽貝組合物與兩種現存的乾燥綠唇貽貝產品之抗炎活性比較的抗炎活性研究之結果的圖表。
第8圖為顯示實例1之兩種乾燥綠唇貽貝組合物與兩種現存的乾燥綠唇貽貝產品之抗氧化劑活性比較的抗氧化劑活性研究之結果的圖表。
第9圖為顯示相較於現存的整體貽貝組合物產品而言本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之典型香味概況的圖表。
第10圖為顯示相較於現存的整體貽貝組合物產品而言本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之典型口味概況(鹹度)的圖表。
第11圖為在FEI Quanta 450 SEM上收集的一些掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope；SEM)影像，其顯示相較於現存的整體貽貝組合物產品之微觀結構而言本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之微觀結構。將樣本固定在SEM臺上且以碳塗佈以使視覺化優化。
第12圖為一些SEM影像，其顯示在水中復水的本發明之乾燥綠唇貽貝組合物之典型微觀結構。
第13圖為顯示實例2的兩種乾燥綠唇貽貝組合物之抗炎活性(COX-2抑制)檢定之結果的圖表。
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (17)

  1. 一種整體貽貝組合物，其具有至少兩相，包括：至少一個疏水相，包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物；以及一或多個親水相或水性相，具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分。
  2. 如請求項1所述之貽貝組合物，其中該組合物係呈一液體組合物的形式，該液體組合物包含一類乳液結構，其中該至少一個疏水相包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物，且該一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物係分散在該親水相或水性相中，且其中該親水相或水性相具有分散或懸浮在其中的一或多種親水性生物活性組分。
  3. 如請求項1或2所述之組合物，其中該疏水相包含至少一些小滴或小球，該等小滴或小球具有圍繞或封裝該等小滴或小球的一層，其中該等脂質或親脂性生物活性組分位於該等小滴或小球內部。
  4. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物包含具有在約100 nm-100 μm之間的一平均粒子大小分佈的粒子大小之一混合物，該混合物包括一些微粒子及/或微小滴及/或一些奈米粒子及/或奈米小滴。
  5. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物中之大多數該等粒子為具有在100-50,000 nm之間的範圍內之大小的微粒子。
  6. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物包含在該疏水相中之至少5%的脂質或親脂性組分、及在該親水相中之至少75%的親水性組分。
  7. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物包含用作乳化劑、表面活性劑及/或輔助表面活性劑的一或多種天然組分。
  8. 如請求項7所述之組合物，其中用作乳化劑、表面活性劑及/或輔助表面活性劑的該一或多種天然組分為在該親水相中、及/或位於該疏水相中之該等粒子或小球之該表面上的蛋白質及/或胜肽。
  9. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物為一乾燥組合物。
  10. 如請求項9所述之組合物，其中該乾燥組合物在水或水性介質中復水時形成具有如請求項2所述之液體組合物之性質的一液體組合物。
  11. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物具有一自乳化組合物之性質及/或特性。
  12. 一種藉由萃取或分餾及回收貽貝組合物之疏水相而由如前述請求項中任一項所述之組合物產生的脂質貽貝萃取物。
  13. 一種藉由萃取或分餾及回收貽貝組合物之親水相而由如前述請求項中任一項所述之組合物產生的非脂質貽貝萃取物。
  14. 一種膳食補充劑營養製劑組合物、獸醫學組合物或醫藥組合物，包含如前述請求項中任一項所述之組合物、或如請求項15或16中任一項所述之萃取物。
  15. 一種源自貽貝之乾燥自乳化組合物及/或生物活性遞送系統，該組合物具有至少兩相，包括：至少一個疏水相，包含一或多種脂質及/或親脂性生物活性化合物；以及一或多個親水相或水性相，具有分散或懸浮在其中的一或多種生物活性組分，且具有一或多種天然組分，該天然組分用作表面活性劑及/或輔助表面活性劑及/或乳化劑，使得該組合物在被添加至一水性介質時形成一類乳液結構。
  16. 如前述請求項中任一項所述之組合物，其中該組合物係藉由在一或多個酶處理步驟中酶水解整體新鮮或活的貽貝材料來製備。
  17. 如請求項16所述之組合物，其中該酶水解方法包含將該等貽貝之該等貝殼開出缺口或至少部分地打開或以其他方式暴露該等貽貝之該等貝殼內部的至少一些材料，及將包含一或多種酶之一酶調配物應用至該等貽貝，及(a)使該等貽貝與該酶調配物接觸直至鮮肉及其他生物材料實質上與該等貽貝之該等貝殼分離，及(b)藉由在該相同的酶處理步驟中使用該相同的酶調配物及/或藉由在該相同或一或多個後續酶處理步驟中應用一不同的酶調配物而使該鮮肉及其他生物材料液化。
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