ES2241001T3

ES2241001T3 - Extracto lipidico que tiene actividad antinflamatoria.

Info

Publication number: ES2241001T3
Application number: ES96929129T
Authority: ES
Inventors: Theodore Macrides; Nicolette Kalafatis
Original assignee: Pharmalink International Ltd
Current assignee: Pharmalink International Ltd
Priority date: 1995-09-11
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: DE69634666D1; JP4101876B2; DK0850068T3; JPH11512400A; US6083536A; PT850068E; ZA967626B; EP0850068A1; CA2231803C; AUPN531195A0; DE69634666T2; US6346278B1; CA2231803A1; EP0850068B1; ATE293984T1; WO1997009992A1; EP0850068A4

Abstract

SE DESCRIBE EL TRATAMIENTO ANTI - INFLAMATORIO, Y EN PARTICULAR ANTI - ARTRITICO, DE UN PACIENTE HUMANO O ANIMAL QUE INCLUYE LA ADMINISTRACION AL PACIENTE DE UNA CANTIDAD EFICAZ DE UN EXTRACTO LIPIDICO DE PERNA CANALICULUS O DE MYTILUS EDULIS.

Description

Extracto lipídico que tiene actividad antiinflamatoria.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a una preparación que tiene actividad antiinflamatoria y, en particular actividad antiartrítica, que es un extracto lipídico de mejillones, incluyendo el mejillón de labio verde de Nueva Zelanda, Perna canaliculus, y el mejillón azul Mytilus edulis.

Antecedentes de la invención

Existe en la actualidad una importante necesidad médica de nuevos fármacos antiinflamatorios y antiartríticos con efectos secundarios reducidos y actividad in vivo prolongada y, en particular, de compuestos que moderen el progreso de las artropatías. Las células vegetales y otras células vivas ofrecen un amplio depósito de compuestos que tienen efectos farmacológicos sobre los seres humanos. Los productos naturales han sido frecuentemente la fuente de fármacos eficaces y, últimamente, ha habido un aumento del interés por el análisis de estos productos naturales, especialmente cuando se reivindica un beneficio clínico. Los organismos marinos contienen metabolitos que pueden actuar como agentes farmacológicos y ayudan en el tratamiento de la inflamación.

La actividad antiinflamatoria de Perna canaliculus (mejillón de labio verde de Nueva Zelanda) se involucró por primera vez como parte de un estudio farmacológico sobre la leucemia. La evaluación inicial de la actividad antiinflamatoria de Perna canaliculus se intentó determinar por primera vez utilizando un modelo de poliartritis en ratas^{1}. Sin embargo, estos estudios fracasaron en demostrar la presencia de cualquier actividad antiinflamatoria significativa en la preparación de mejillón. Por el contrario, Miller y Ormrod^{2}, utilizando un ensayo de edema en la pata inducido por carragenina^{3}, pudieron demostrar que las preparaciones de mejillón, cuando se administraron por vía intraperitoneal, proporcionaron una reducción significativa en la inflamación de un edema de la pata de rata inducido por carragenina. Posteriormente, fraccionaron una fracción soluble en agua, que no era dializable, procedente de la preparación de mejillón que tenía actividad antiinflamatoria. El extracto acuoso mostró una actividad antiinflamatoria dependiente de la dosis cuando se administró por vía intraperitoneal y no pudo detectarse tras la administración oral de polvo de mejillón. Por tanto, se sugirió que la fracción soluble en agua contenía un componente irritante que tiene aparente actividad antiinflamatoria.

Rainsford y Whitehouse^{4} también informaron de que las preparaciones en polvo liofilizadas del mejillón completo administradas por vía oral a ratas mostraron actividad antiinflamatoria moderada en el ensayo del edema de la pata inducido por carragenina, y que este material reducía sorprendentemente la ulcerogenicidad gástrica de varios fármacos antiinflamatorios no esteroideos en ratas y cerdos.

También se ha informado sobre el uso del extracto de mejillón completo en el tratamiento tanto de la artritis reumatoide como de la osteoartritis en pacientes humanos^{5}.

El trabajo inicial, que condujo a la presente invención, basado en extractos lipídicos procedentes de polvo de Perna canaliculus preparados utilizando técnicas de extracción con disolventes (al contrario al trabajo previo con fracciones acuosas), estableció que las fracciones lipídicas muestran cierta actividad antiinflamatoria, cuando se probaron en sistemas modelo apropiados. Se ha hecho disponible posteriormente una fuente fiable de extracto lipídico de Perna canaliculus y Mytilus edulis a través del procedimiento de extracción con fluidos supercríticos (SFE). El extracto lipídico se obtiene como un aceite viscoso amarillo oscuro-marrón que muestra una fuerte característica de absorción ultravioleta que concuerda con los datos físicos para los extractos lipídicos obtenidos a partir de los procedimientos anteriores de extracción con disolventes.

El documento WO96/05164, una referencia bajo el artículo 54(3) EPC, describe una preparación antiinflamatoria que comprende una fracción activa, aislada de un extracto lipídico de Perna canaliculus o Mytilus edulis, o un componente activo de la misma.

Sumario de la invención

Según un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un extracto lipídico de Perna canaliculus o Mytilus edulis rico en lípidos apolares, en el que dicho extracto lipídico se prepara mediante extracción con fluidos supercríticos de polvo de mejillón bruto en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiinflamatorio de un paciente animal o humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición antiinflamatoria que comprende un extracto lipídico de Perna canaliculus o Mytilus edulis como componente activo, junto con uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

\newpage

Descripción detallada de la invención

Los términos "tratamiento antiinflamatorio" y "composición antiinflamatoria" tal como se utilizan en el presente documento, se refieren al tratamiento, o a composiciones para el tratamiento de estados inflamatorios, en general, incluyendo estados artríticos tales como osteoartritis y artritis reumatoide, así como en el tratamiento de la esclerosis múltiple y diversas infecciones víricas. La actividad de un compuesto para su uso en tal tratamiento puede demostrarse utilizando ensayos habituales, por ejemplo, utilizando un ensayo de edema en la pata inducido por carragenina o mediante la capacidad para limitar de manera beneficiosa el inicio o la progresión de una poliartritis experimental, tal como se describe en detalle en el presente documento.

Preferiblemente, el extracto lipídico que se utiliza en el tratamiento o la composición de la presente invención es un extracto preparado mediante extracción con fluidos supercríticos (SFE) de mejillón en polvo liofilizado, utilizando un fluido criogénico (tal como el fluido criogénico, CO_{2}) como el medio de extracción. En comparación con las técnicas de extracción con disolventes, a extracción con fluidos supercríticos que utiliza el fluido criogénico CO_{2} produce un extracto lipídico rico en lípidos apolares, particularmente en ácidos grasos libres. Aunque no se ha establecido todavía la composición exacta del extracto lipídico, se sabe que contiene no sólo ácidos grasos libres (incluyendo ácidos grasos insaturados), sino también triglicéridos y ésteres de colesterol.

Está disponible una variedad de rutinas de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del estado particular que se esté tratando y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de esta invención, en general, pueden practicarse utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles terapéuticos del componente activo de la invención sin producir efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen las vías oral, rectal, tópica, nasal, transdérmica o parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular e intravenosa). En particular, se ha encontrado que el extracto lipídico de la presente invención es activo cuando se administra por vía oral, subcutánea y transdérmica.

La administración transdérmica del extracto lipídico es un modo de administración particularmente preferido, ya que se ha encontrado que el extracto lipídico tiene una sorprendente actividad antiinflamatoria cuando se administra por vía transdérmica.

Las composiciones de esta invención pueden presentarse convenientemente en una forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de poner en asociación el componente activo con un vehículo que constituye uno o más componentes auxiliares. En general, las composiciones se preparan poniendo en asociación, uniforme e íntimamente, el componente activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, darle forma al producto.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades diferenciadas tales como cápsulas, cachet (cápsula en forma de sello), comprimidos o pastillas para chupar que contienen, cada una, una cantidad predeterminada del componente activo, en liposomas o como una suspensión en un líquido acuoso o no en un líquido, tal como un jarabe, un elixir o una emulsión.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa estéril del componente activo que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede formularse según métodos conocidos utilizando estos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión. Una preparación inyectable estéril puede prepararse como una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico, aceptable por vía parenteral, por ejemplo como una solución en polietilenglicol y ácido láctico. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos, estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono y diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de composiciones inyectables.

Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica comprenden convenientemente el componente activo en una pomada o base de loción o vehículo, y pueden incluir un agente de aumento de la penetración en la piel para ayudar en la administración del componente activo. Bases o vehículos adecuados son aceites tales como el aceite de oliva o de emú, administrados solos o con un penetrante tal como cineol o limoneno.

Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de administración de liberación sostenida. Los sistemas de administración de liberación sostenida son aquellos que pueden proporcionar una liberación del componente activo de la invención en gránulos o cápsulas de liberación sostenida. Están disponibles muchos tipos de sistemas de administración de liberación sostenida. Éstos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas erosionales en los que el componente activo está contenido dentro de una matriz, y (b) sistemas difusionales en los que el componente activo penetra, a una velocidad controlada, a través de un polímero.

La formulación de tales composiciones terapéuticas se conoce bien por las personas expertas en este campo. Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, cargas, vehículos sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción convencionales y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica, y se describe, a modo de ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack Publishing Company, Pensilvania, EE.UU. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el componente activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. También pueden incorporarse principios activos complementarios a las composiciones.

Se preferirá la administración oral o transdérmica para muchos estados debido a la comodidad para el paciente, aunque puede ser más deseable una administración sostenida localizada para ciertas pautas de tratamiento.

El componente activo se administra en cantidades terapéuticamente eficaces. Una cantidad terapéuticamente eficaz significa aquella cantidad necesaria, al menos parcialmente, para obtener el efecto deseado, o para retrasar el inicio de, inhibir la progresión de, o detener totalmente, el inicio o la progresión del estado particular que se esté tratando. Tales cantidades dependerán, por supuesto, del estado particular que se esté tratando, la gravedad de los estados y los parámetros del paciente individual incluyendo la edad, estado físico, estatura, peso y tratamiento simultáneo. Estos factores se conocen bien por los expertos habituales en la técnica y pueden tratarse sin más experimentación que la rutinaria. Se prefiere generalmente que se utilice una dosis máxima, es decir, la mayor dosis segura según un criterio médico sensato. Sin embargo, se entenderá por los expertos habituales en la técnica que puede administrarse una dosis inferior o dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o prácticamente por cualquier otro
motivo.

Es especialmente ventajoso formular composiciones en una forma farmacéutica unitaria para la facilidad de administración y la uniformidad de dosificación. La forma farmacéutica unitaria, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los pacientes humanos o animales que van a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de componente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo y/o diluyente farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas farmacéuticas unitarias novedosas de la invención están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del componente activo y el efecto terapéutico particular que va a conseguirse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de tal componente activo para el tratamiento particular.

Generalmente, las dosis diarias de componente activo serán de desde aproximadamente 0,01 mg/kg al día hasta 1000 mg/kg al día. Inicialmente pueden administrarse dosis pequeñas (0,01 - 1 mg), seguido por dosis crecientes de hasta 1000 mg/kg al día. En el caso de que la respuesta en un sujeto sea insuficiente a tales dosis, pueden emplearse incluso dosis superiores (o dosis superiores eficaces por una vía de administración diferente, más localizada) hasta el grado que permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis al día para conseguir los niveles sistémicos apropiados del componente activo.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderán que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Ejemplo 1 A. Preparación de un extracto lipídico A.1. Materia prima

Se recogió el mejillón de labio verde (Perna canaliculus) en la costa meridional de Nueva Zelanda, momento en el cual se estabiliza la totalidad del mejillón con ácido tartárico. La liofilización da como resultado un polvo seco en forma pulverizada.

A.2. Extracción de lípidos

Se utiliza la técnica de extracción con fluidos supercríticos (SFE) para extraer los lípidos biológicamente activos del polvo bruto de mejillón. Se utiliza el fluido criogénico CO_{2} como el medio de extracción. El CO_{2} se expande hasta la presión atmosférica y el extracto se presenta como un aceite concentrado. El polvo produce un 3 - 3,5% de
aceite.

A.3. Perfil del aceite bruto

El aceite extraíble es de color naranja ambarino y es un líquido viscoso a temperatura ambiente. El extracto se almacenó a menos de 4ºC y se manejó en una atmósfera de nitrógeno. El aceite bruto mostró una fuerte actividad UV y se protege de la luz para minimizar la polimerización de los componentes con dobles enlaces.

B. Extracción con fluidos supercríticos a escala piloto

La extracción de los lípidos totales en polvo de mejillón liofilizado, Perna canaliculus, se llevó a cabo en una unida de SFE a escala piloto, realizado en el Instituto de Investigación de los Alimentos (Departamento de Agricultura, Werribee, Vic., Australia).

B.1. Instrumentación

Las extracciones se llevaron a cabo en una unidad de extracción a escala piloto que consistía en cinco subunidades básicas (Distillers MG Limited., Inglaterra, RU). Las cinco unidades básicas comprenden: unidades de suministro de dióxido de carbono, extracción de componentes sólidos, separación primaria, evaporación y residuos.

La unidad de suministro de dióxido de carbono consiste en dos botellas de CO_{2} conectadas en paralelo y situadas sobre una balanza para recargarlas cuando sea apropiado. A la unidad de extracción puede suministrársele CO_{2}-SC líquido y CO_{2}-SC. Para este trabajo, la unidad de SFE se hizo funcionar utilizando CO_{2}-SC. Se colocó la materia sólida en la columna de lixiviación y el separador primario facilita la separación del material extraído mediante reducción de la presión (que permite que se deposite el extracto), adsorción o extracción líquida. El extracto fluido se hizo pasar a la unidad de evaporación, para evaporar el CO_{2} mediante el uso de tubos de calentamiento internos. El vapor puede contener componentes volátiles y, por tanto, se hace pasar posteriormente a la columna de residuos para lavarse mediante CO_{2} líquido puro. La unidad de residuos atrapa el CO_{2} gaseoso procedente de la unidad de evaporación y devuelve los componentes volátiles al evaporador.

B.2. Procedimiento de extracción en la planta piloto

Se cargó el polvo de mejillón (300 g) en la unidad de extracción (columna de lixiviación). Se suministró CO_{2}-SC a una velocidad de flujo de 3,0 kg/h durante dos horas por extracción. La temperatura del extractor se fijó en 40ºC y la presión del extractor en 310 bar (4.500 psi). La temperatura del evaporador se mantuvo constante en 40ºC. Los extractos lipídicos de mejillón se almacenaron bajo nitrógeno a -10ºC, en recipientes cerrados de vidrio ámbar.

Ejemplo 2

Se sometió a ensayo el extracto lipídico de Perna canaliculus (denominados en el presente documento "PCO") preparado mediante SFE, tal como se describe en el ejemplo 1, para determinar la actividad antiinflamatoria aguda en el ensayo habitual de edema de rata con carragenina, así como para determinar la actividad antiartrítica (midiendo la actividad en la supresión de la inflamación crónica) frente a poliartritis inducida experimentalmente en ratas^{6}.

Se llevaron a cabo pruebas comparativas con Seatone^{MR}, una preparación en polvo liofilizada disponible comercialmente de Perna canaliculus.

A. Métodos

Se mantuvo PCO a -20ºC. No se eliminaron las trazas de hexano, etc., antes de su uso. Las formulaciones se envejecieron no más de 24 horas a 4ºC.

A.1. Actividad antiinflamatoria

Se les administró previamente a ratas Wistar hembra (180 - 220 g) por v.o. o i.p. las formulaciones de prueba. Se les inyectó 40 minutos después en cada pata trasera 0,1 ml de solución salina que contenía 0,6 mg de carragenina de Na. Se cuantificó el posterior edema de la pata midiendo el aumento del grosor de la pata después de una y dos horas, con un micrómetro. La DE_{50} para la aspirina es de aproximadamente 150 mg/kg en este ensayo agudo. [El edema se retrae después de tres horas con esta dosis de carragenina].

A.2. Ensayo antiartrítico

Aunque lleva más tiempo, este ensayo es de más valor que el ensayo agudo (descrito anteriormente) ya que detecta no solamente (i) aquellos fármacos antiinflamatorios que actúan en el ensayo agudo (aunque a menudo a valores de DE_{50} inferiores) sino también (ii) otros agentes, por ejemplo clorabuzit (Clozic^{R}) o lobenzarit (CCA), que obviamente tienen propiedades únicas supresoras de la artritis pero no son antiedematosos / antipiréticos o detectables de otra manera en los ensayos agudos.

El protocolo utilizado es preestablecer la enfermedad inyectando el artritógeno el día 0, buscar los primeros signos de inflamación de la pata (normalmente se manifiestan en los días 10 - 12) y luego administrar a los animales los materiales de prueba durante cuatro días. Durante este periodo, la inflamación de la pata en los animales control sin tratar se "desarrolló" rápidamente hasta alcanzar un máximo próximo en el día 14. Los fármacos que actúan durante este periodo de tiempo para contener la inflamación de la pata son ciertamente antisintomáticos pero rara vez eliminan la enfermedad. Con el cese del tratamiento, normalmente hay un recrudecimiento de los síntomas. Sin embargo, esto es una característica positiva de este ensayo ya que indica claramente que a) el fármaco tiene una acción finita pero da una idea de su duración de eficacia mediante la rapidez (o de otra manera) de la rebote; y b) los animales con signos mínimos de enfermedad en el día 14 reflejaron un efecto farmacológico positivo en lugar de un fracaso en responder al artritógeno (es decir, falsos negativos). Una descripción exacta de este ensayo es "profilaxis tardía". Obviamente, retrasando el tratamiento hasta después del día 14, se puede buscar "actividad terapéutica", pero ya que los cambios pueden ser lentos o insignificantes en un plazo de cuatro días (incluso con algunos potentes AINEs), es difícil la recogida de los datos adecuados.

Los detalles del protocolo utilizado son: inyectar el artritógeno en la base de la cola de ratas Wistar hembra (160 - 200 g) = 800 mcg de Mycobact tuberculosis destruidas con calor, suspendidas en 0,1 ml de escualano, de tal manera que se evite cualquier vaso sanguíneo y para promover el drenaje óptimo en los vasos linfáticos. Diez días después, se pesaron los animales, se midió el grosor de las patas traseras y la cola y se puntuaron los signos de inflamación en las patas delanteras con una puntuación de 0 a 4+. Tras la dosificación de los compuestos de prueba una vez al día durante cuatro días (es decir, en los días 10 a 13 tras administrar el artritógeno), se repitieron estas mediciones en los días 14 y 18 (es decir, tras la finalización del tratamiento y de nuevo después de cuatro días de rebote) para monitorizar el desarrollo de artritis. Para la administración transdérmica de las formulaciones de prueba, se afeitaron los animales en la parte posterior del cuello con anestesia ligera (Forthane) en el día 10, para dejar al descubierto una zona de piel = aproximadamente 6 cm^{2}. Se aplicaron las formulaciones una vez al día con fricción durante hasta tres minutos en un volumen = 2,5 ml/kg (es decir, aproximadamente 0,5 ml/rata). La primera aplicación se administró seis horas después del afeitado para estar seguro de que no había excoriaciones cutáneas antes del tratamiento.

Ensayo antipirético

Se inocularon ratas jóvenes (menos de 160 g) con 2 g/mg de levadura de cerveza desecada, suspendida en solución salina a las 11 p.m. A las 8 a.m., se midieron sus temperaturas rectales. Las que mostraron fiebre estable (temperatura superior a 39,2ºC), a las 9 a.m., se les administró entonces los compuestos de prueba. Se utilizó paracetamol, 150 mg/kg, como referencia.

B. Resultados Actividad antiinflamatoria aguda (tabla 1)

La tabla 1 indica que ni Seatone ni PCO expresaron actividad antiedematosa en el ensayo a corto plazo. La coadministración con un agente sinérgico no tuvo ningún efecto, mientras que amplificó el del ibuprofeno.

Ensayo antiartrítico (tabla 2)

La tabla 2 muestra los resultados de las dos primeras pruebas de PCO aplicado a ratas artríticas, o bien por vía oral (v.o.) o bien por vía subcutánea (s.c.), o bien en una aplicación transdérmica (t.d.) a una dosis de 50 mg/kg administrado durante cuatro días sucesivos.

Diluir PCO en aceite de oliva comercial refinado (Vetta) permitió que se probara la misma solución madre en los tres modos de administración (v.o. / s.c. / t.d.). La base de aceite de oliva (AO) excluye en gran parte el oxígeno y contiene poca cantidad de catalizador metálico y, por tanto, tienen propiedades "mantenidas" para muchos compuestos inestables (insaturados).

Las formulaciones transdérmicas se prepararon a partir de la reserva de AO añadiendo agentes de aumento de la penetración de la piel (AP) en la proporción relativamente alta del 20% v/v. Los AP utilizados fueron cineol (= eucaliptol), salicilato de metilo (= esencia de gaulteria) o isopropanol (= alcohol de fricción). El grupo salicilato de PCO fue quizá el que menos respondió, lo que podría indicar cierta interacción (negativa) entre este éster de salicilato y el (los) principio(s) activo(s) de PCO.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

TABLA 1 Actividad antiinflamatoria en el edema de pata por carragenina agudo

\hskip1cm

n = 2 ratas/grupo {}\hskip1,5cm MPL = Misoprostal, 0,5 mg/kg v.o. como agente sinérgico.

1

Conclusiones

(i)	Tanto PCO como Seatone son inactivos, incluso con un agente sinérgico.
(ii)	El ensayo responde a un AINE habitual y este agente sinérgico particular.

TABLA 2 Actividad antiinflamatoria en ratas artríticas

\hskip0,2cm

n = 4 ratas/grupo.

Los compuestos de prueba se administraron en 4 dosis diarias sucesivas.

A - Aplicación oral (v.o.) o subcutánea (s.c.)

2

3

B - Aplicación transdérmica

4

Conclusiones

(i)	PCO activo a 50 mg/kg en 6 modos de administración diferentes.
(ii)	Los controles de vehículo (aceite de oliva solo/con cineol) tuvieron un efecto insignificante sobre la
	artritis.

Ejemplo 3

Este ejemplo expone los resultados de experimentos adicionales sobre la actividad antiartrítica y antiinflamatoria aguda del extracto lipídico de Perna canaliculus (PCO), que muestran que es activo hasta 10 mg/kg, y posiblemente incluso a 2,5 mg/kg, administrado por vía oral o por vía transdérmica en un vehículo de aceite de oliva.

Actividad antiartrítica

Dos experimentos que se establecieron para evaluar el PCO en dosis inferiores al nivel de 50 mg/kg encontraron que mostraba actividad antiinflamatoria en ratas artríticas cuando se administraba por v.o. o t.d. (véase el ejemplo 2).

En el primer experimento (parte A, tabla 3), la formulación en aceite de oliva mostró actividad hasta 2,5 mg/kg administrada por vía oral. Hubo un rebote significativo durante los cuatro días siguientes, al cesar la dosificación, en los tres grupos de tratamiento.

En el segundo experimento (parte B, tabla 3) utilizando la administración transdérmica, la formulación en aceite de oliva "diluida" con un 20% de cineol (v/v) mostró buena actividad hasta 10 mg/kg. El resultado a 2,5 mg/kg es sólo provisional ya que no está claro que hubiera un "rebote" total (lo que indica posiblemente que algunos animales eran "falsos positivos" = que reaccionan poco al artritógeno original).

Las formulaciones dérmicas alternativas a base de aceite de oliva con un 20% de D-limoneno o un vehículo distinto al aceite (isopropanol con un 20% v/v de propilenglicol, añadiéndose este último para minimizar la deshidratación cutánea) fueron claramente menos satisfactorios que el sistema de suministro original de aceite de oliva con cineol. El vehículo alcohólico habría facilitado probablemente la descomposición de PCO, al contrario que el aceite de oliva.

Actividad antiinflamatoria

Se investigó el edema de la pata inducido por caolín como un posible ensayo para PCO, ya que esta inflamación es de desarrollo más lento que la inducida con carragenina (que se retrae después de tres horas). El protocolo supone inyectar 5 mg de caolín, suspendido en agua (no en solución salina, en la que se agrega), en cada pata trasera, 40 minutos después de administrar a las ratas PCO, tanto administrado por v.o. como i.p., como dispersiones preparadas con un 0,02% de Tween en agua (v.o.) o solución salina (i.p.). Entonces, se estudió la inflamación de las patas dos horas y cinco horas después de la inyección de caolín.

Los resultados de un experimento (tabla 4) con sólo dos ratas por grupo fueron ambiguos: la aplicación oral puede haber proporcionado cierta actividad antiedematosa. La emulsión de PCO / solución salina i.p. fue físicamente menos satisfactoria y parece haber sido inactiva.

TABLA 3 Estudios adicionales de la acción antiinflamatoria de PCO en ratas artríticas

\hskip0,2cm

N = 4 ratas/grupo A. Mediante administración oral

5

B. Mediante aplicación dérmica

6

Conclusiones

(i)	PCO activo a 10 mg/kg por v.o. o t.d.
(ii)	PCO puede ser activo incluso a 2,5 mg/kg
(iii)	Cineol > limoneno para uso t.d. con PCO
(iv)	Un vehículo que no sea de aceite parece inapropiado para la administración t.d. de PCO.

TABLA 4 Edema en la pata inducido por caolín en ratas Wistar hembra

\hskip0,2cm

N = 2 ratas/grupo sólo {}\hskip0,7cm SIN = agente sinérgico, Misoprostol a 1 mg/kg por v.o.

7

8

Conclusiones

(i)	PCO, v.o., puede mostrar actividad retrasada en este ensayo antiinflamatorio.
(ii)	PCO, i.p., no.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra el efecto del extracto lipídico de Perna canaliculus (PCO) y otros diversos aceites disponibles en el mercado al por menor de alimentos naturales, cuando se administran de manera profiláctica a ratas Wistar hembra que desarrollan poliartritis inducida por un adyuvante (véase el ejemplo 2). El tratamiento se llevó a cabo en seis grupos (n = 5 ratas por grupo) tal como sigue:

A:	Grupo control no tratado
B:	Aceite de lino (Barleaus); 2000 mg/kg de peso corporal/día.
C:	Aceite de onagra (Efamol); 2000 mg/kg de peso corporal/día.
D:	Aceite de salmón noruego (J.R. Carlson); 2000 mg/kg de peso corporal/día.
E:	MAXEPA (Solgar); 2000 mg/kg de peso corporal/día.
F:	PCO; 20 mg/kg de peso corporal/día.

En la tabla 5, se muestran los resultados, en los que la inflamación de las patas artríticas se expresa como porcentaje del grupo A control no tratado. Estos resultados muestran que PCO es 200 veces más potente que EPA, y 350 veces más potente que el aceite de onagra.

TABLA 5

9

Ejemplo 5

Este ejemplo muestra el tratamiento terapéutico de la inflamación debida a artritis en ratas, utilizando PCO, extracto de mejillón completo inestabilizado (mejillón LV (labio verde) NZ), extracto de mejillón completo estabilizado (mejillón LV Aust), aceite de semilla de apio e indometacina. Las ratas con los primeros signos de artritis 10 días después de la inoculación con un artritógeno micobacteriano se trataron entonces por vía oral con los materiales de prueba, durante 4 días solamente. Se midió la eficacia de los materiales de prueba como el aumento del espesor de la pata en el día 14, en comparación con el grupo H control.

Los resultados se muestran en la tabla 6 e indican que PCO es más eficaz que indometacina en este modelo.

TABLA 6

10

11

Ejemplo 6

Este ejemplo proporciona datos adicionales que comparan la eficacia del extracto lipídico de Perna canaliculus (PCO), cuando se compara con el polvo de mejillón completo liofilizado (Seatone^{MR}) e ibuprofeno (Nurofen^{MR}), probados frente a artritis autoalérgica inducida por colágeno (II) en ratas. También se llevó a cabo un ensayo de gastrotoxicidad con los materiales de prueba.

Ensayo antiartrítico

Se indujo poliartritis inducida por colágeno (tipo II) en ratas Wistar hembra mediante inyección de colágeno (II) con un adyuvante no artritogénico para sensibilizar los animales de prueba.

La tabla 7 muestra los resultados obtenidos en el tratamiento terapéutico (es decir, retrasado) con los materiales de prueba. El tratamiento se retrasó hasta el día 8, con los primeros signos de artritis, luego se continuó hasta el día 14 (es decir, 7 dosis diarias) evaluándose la artritis el día 15 y de nuevo el día 18 (este último indicando rebote al cesar la dosificación). Se administró PCO por vía oral tras dilución en aceite de oliva (8 mg/ml) y se administró a 2,5 ml/kg/día para dar 20 mg/kg.

Los resultados muestran que PCO a 20 mg/kg es tan eficaz en el tratamiento terapéutico como el extracto de mejillón estabilizado a 300 mg/kg (Seatone) e ibuprofeno 50 mg/kg (Nurofen).

La tabla 8 muestra los resultados obtenidos tanto en el tratamiento profiláctico como en el terapéutico con los materiales de prueba. El tratamiento profiláctico fue desde el día 1 hasta el día 13 (es decir, 15 dosis totales) por vía oral (v.o.). El tratamiento terapéutico fue desde el día 9 hasta el día 13 (es decir, 5 dosis totales) por vía transdérmica (t.d.). Se diluyó PCO en aceite de oliva (6 mg/ml) para la dosificación por v.o. a 2,5 mg/kg/día para dar 15 mg/kg, y se diluyó en aceite de oliva-cineol (17,3 v/v) (10 mg/ml) para la administración t.d. a 2 ml/kg/día para dar 20 mg/kg.

Este experimento también incluyó aurotiomalato sódico (ATM = Mycocrysin®) administrado como fármaco antiartrítico de referencia, administrado cada dos días (total = 8 dosis) por vía subcutánea en solución salina a 6,3 mg/kg (las dosis superiores eran tóxicas). El aumento de peso relativamente alto de los animales tratados con ATM puede ser engañoso, siendo quizá un signo de lesión renal incipiente (alteración de la micción), en lugar de una reducción beneficiosa de la pérdida de peso normal asociada con la inflamación crónica.

Se administró Seatone^{MR} por v.o. a 300 mg/kg; se administró Nurofen^{MR} por v.o. a 50 mg/kg; se administró aurotiomalato de Na (ATM) en 8 dosis a 6,3 mg/kg por vía subcutánea (s.c.).

Los resultados muestran que PCO particularmente eficaz cuando se administra por vía transdérmica a 20 mg/kg, y que PCO a 15 mg/kg es tan eficaz como Seatone a 300 mg/kg y Nurofen a 50 mg/kg.

Ensayo de gastrotoxicidad

Se llevaron a cabo estudios de gastrotoxicidad con ratas Wistar hembra, con artritis probada, con colágeno (tipo II), sin tratamiento farmacológico. Se suspendieron aspirina y PCO con Tween-20 al 0,04% para la dosificación oral, tras tener a los animales en ayuno durante la noche. La dosis administrada fue de 30 mg/kg.

La tabla 9 muestra que PCO fue prácticamente inocuo para el estómago cuando se administró a 20 veces la dosis eficaz. Sin embargo, esta dosis elevada (300 mg/kg) fue la dosis eficaz para la aspirina en el ensayo antiartrítico habitual (poliartritis de rata inducida con un adyuvante), dosis a la cual la aspirina puede producir una lesión gástrica considerable.

TABLA 7

12

Nota: Rebote significativo en Gps (iii) y (iv) al cesar la dosificación.

TABLA 8

13

14

TABLA 9

15

Bibliografía

1. Cullen, J.C., Flint, M.H. y Leider, J. (1975). N.Z. Med. J. 81: 260-261.

2. Miller, T.E. y Ormrod, D.J. (1980). N.Z. Med. J. 92: 187-193.

3. Winter, C.A., Risely, E.A. y Nuss, G.W. (1962). Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 111: 544-547.

4. Rainsford, K.D. y Whitehouse, M.W. (1980). Arzneim.-Forsch./Drug Res. 30 (ii), 2128-2132.

5. Gibson, R.G., Gibson, S.L.M., Conway, V. y Chappel, D. (1980). The Practitioner 224:955-960.

6. Whitehouse, M.W. "Adjuvant-Induced Polyarthritis in Rats", en Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases, Vol. 1, páginas 3-16, Editores R.A. Greenwald y H.S. Diamond, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, EE.UU.

Claims

1. Composición antiinflamatoria que comprende un extracto lipídico de Perna canaliculus o Mytilus adulis rico en lípidos apolares y un componente activo del mismo, en el que dicho extracto lipídico se prepara mediante extracción con fluidos supercríticos de polvo bruto de mejillón, junto con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que se utiliza el fluido criogénico CO_{2} en dicha extracción con fluidos supercríticos.

3. Composición según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en la que dicha composición se formula para la administración oral o subcutánea de dicho componente activo.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha composición se formula para la administración transdérmica de dicho componente activo.

5. Composición según la reivindicación 4, que comprende una pomada de base de loción o vehículo, y opcionalmente un agente de aumento de la penetración en la piel.

6. Composición según la reivindicación 5, en la que dicha base o vehículo comprende un aceite tal como aceite de oliva o aceite de emú.

7. Composición según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, que incluye un agente de aumento de la penetración en la piel tal como cineol o limoneno.

8. Uso de un extracto lipídico de Perna canaliculus o Mytilus adulis rico en lípidos apolares, en el que dicho extracto lipídico se prepara mediante extracción con fluidos supercríticos de polvo bruto de mejillón, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiinflamatorio de un paciente humano o animal.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que se utiliza el fluido criogénico CO_{2} en dicha extracción con fluidos supercríticos.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que dicha administración es administración oral o subcutánea.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha administración es administración transdérmica.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que dicho tratamiento antiinflamatorio es el tratamiento de artritis, incluyendo artritis reumatoide y osteoartritis.