DE3601136C2

DE3601136C2 -

Info

Publication number: DE3601136C2
Application number: DE3601136A
Authority: DE
Inventors: Heino Prof. Dr. Diringer; Karin Dr. Priv.-Doz. 1000 Berlin De Moelling
Original assignee: Bundesministerium fuer Gesundheit; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1986-01-16
Filing date: 1986-01-16
Publication date: 1990-10-18
Also published as: US5153181A; EP0232744B1; JPH0234926B2; DE3789561D1; ES2054622T3; EP0232744A2; JPS62215529A; EP0232744A3; DE3601136A1; ATE104148T1; DE3789561T2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von polymeren Kohlen hydraten, die anorganische anionische Gruppen, jedoch keine COOH- und NH₂-Gruppen enthalten, zur Prophylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen in Säugern.

Retroviren sind Viren, deren genetische Information aus Ribonucleinsäure (RNA) besteht. Wenn Retroviren Zellen infizieren, so wird während des Virus-Vermehrungszyklus eine Desoxyribonucleinsäure (DNA)-Kopie des Virusgenoms in den infizierten Zellen hergestellt. Diesen RNA-abhängigen DNA- Syntheseprozeß bewältigt ein für Retroviren spezifisches, Virusgenom-codiertes Enzym, die Reverse Transkriptase. Die Reverse Transkriptase ist Bestandteil des Virons.

Retroviren verursachen Krankheiten, wie Leukämie und andere Tumore bei Katzen, Mäusen, Rindern und beim Menschen und Sarkome bei Vögeln. Insbesondere wird AIDS (Aquired Immuno Deficiency Syndrom) beim Menschen durch ein Retrovirus, das LAV/HTLV III, verursacht.

Zur Prophylaxe oder Therapie der genannten Virus-Infektionen beim Menschen und bei anderen Säugern ist man von der Überlegung ausgegangen, daß ein selektiver Schutz gegen Virusvermehrung durch Hemmung der viralen RNA-abhängigen DNA-Synthese durch die Virus-spezifische, Viruscodierte Reverse Transkriptase, erzielt werden kann. Die beiden wichtigsten aus dem Stand der Technik bekannten Hemmstoffe der Reversen Transkriptase sind Foscarnet und Suramin. Die Wirkung von Foscarnet (Phosphonoformiat) als Hemmstoff der Reversen Transkriptase ist aus B. Öberg, "Antiviral effects of Phosphonoformate (PFA, Foscarnet Sodium)", Pharmac. Ther. 19 (1983), S. 387 bis 415 und aus B. Sundquist et al., "Phosphonoformate Inhibits Reverse Transcriptase", J. gen. Virol. 45 (1979), S. 273 bis 281, bekannt.

Foscarnet hat die folgende Formel:

Foscarnet ist jedoch wegen seiner in klinischen Versuchen ermittelten erheblichen Toxizität nicht für Prophylaxe oder Therapie von Retrovirus-Infektionen geeignet. Die Wirkung von Suramin als Hemmstoff der Reversen Transkriptase ist aus H. Mitsuya et al., "Suramin Protection of T-Cells in Vitro Against Infectivity and Cytopathic Effect of HTLV-III", Science 226 (1984), S. 172 bis 174, bekannt. Suramin wird zur Zeit auch zur Behandlung der Schlafkrankheit verwendet. Suramin hat die folgende Formel:

Ähnlich wie Foscarnet ist jedoch auch Suramin toxisch für den Säugetier-Organismus, so daß es gemäß klinischen Erprobungen in der Konzentration, die für Prophylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen erforderlich ist, nicht ohne Nebenwirkungen erfolgreich verwendet werden kann.

In der DE-OS 31 24 384 wird die Verwendung von Dermatan polysulfat und von polyanionischen Verbindungen gegen Herpes simplex-Viren, Poliomyelitits-Viren, Picorna-Viren, Echo-Viren, Gelbfieber-Viren und Influenza-Viren beschrieben.

Schaffrath et al. beschrieben in Hoppe Seyler′s Z. Physiol. Chem. 357 (1976), S. 499-508, die inhibierende Wirkung von Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Heparin und Glycosaminoglycanpolysulfat auf die reverse Transkriptase.

Alle in der DE-OS 31 24 384 und von Schaffrath et al. ge nannten Verbindungen enthalten Aminogruppen. Aus der bei gefügten Fig. 1 ist die überraschende, vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäß zu verwendenden polymeren Kohlenhydrate ersichtlich, die anorganische anionische Gruppen, jedoch keine COOH- und NH₂-Gruppen enthalten.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Hemmstoffe der Reversen Transkriptase bereitzustellen, die gegenüber den bekannten Hemmstoffen eine höhere inhibitorische Aktivität bei geringen Nebenwirkungen auf den Säugetier-Organismus aufweisen und die deshalb für Prophylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen hervorragend geeignet sind. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß polymere Kohlenhydrate, die anorganische anionische Gruppen, jedoch keine COOH- und NH₂-Gruppen enthalten, wirk same Hemmstoffe der Reversen Transkriptase sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von poly meren Kohlenhydraten, die anorganische anionische Gruppen, jedoch keine COOH- und NH₂-Gruppen enthalten, für Prophylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen in Säugern.

In einer bevorzugten Verwendung ist das ge nannte polymere Kohlenhydrat aus Pentose-Monomeren aufge baut, die beispielsweise von Ribulose, Arabinose oder Xylose abgeleitet sind.

Vorzugsweise sind diese Pentose-Monomere Xylose-Reste. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Xylose-Reste Xylopyranose-Reste.

Vorzugsweise ist das polymere, aus Pentose-Monomeren aufgebaute Kohlenhydrat ein Pentosanpolysulfat.

In einer anderen bevorzugten Verwendung ist das polymere Kohlenhydrat aus Hexose-Monomeren aufgebaut, die beispielsweise von Mannose, Fructose, Sorbose, Galactose oder Glucose abgeleitet sind.

Vorzugsweise sind die Hexose-Monomere Glucose-Reste. Ferner sind die Glucose-Reste in den erfindungsgemäß zu verwendenden Polymeren vorzugsweise Glucopyranose-Reste. Vorzugsweise ist das polymere, aus Hexose-Resten aufgebaute Kohlenhydrat ein Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von mindestens 6000.

Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß eingesetzte polymere Kohlenhydrate, die anorganische anionische Gruppen, jedoch keine COOH- und NH₂-Gruppen enthalten, sind Dextransulfat MW. 500 000 (im folgenden als NO.5M bezeichnet), Dextransulfat MW.8000 (im folgenden als N8T bezeichnet) oder Pentosanpolysulfat MV.5000 (im folgenden als T bezeichnet).

Dextransulfat ist der Schwefelsäureester des Dextrans, das von Bakterien der Gattung Leuconostoc und anderen Lactobacillen aus Saccharose synthetisiert wird. Dextran ist überwiegend aus α-1,6- glykosidisch verknüpften a-D-Glucoseresten aufgebaut. Das durchschnittliche Molekulargewicht der in NO.5M enthaltenen Polymerisat-Moleküle beträgt 500 000. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Polymerisat-Moleküle in N8T beträgt etwa 8000. Pentosanpolysulfat MW.5000 (T) ist ein β-D(1,4)-Xylopyranose- Polymerisat, dessen einzelne Monomere jeweils Sulfatreste tragen.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der bevorzugt eingesetzten Stoffe NO.5M, N8T und T im einzelnen erläutert. Diese Stoffe wurden in der Humanmedizin bereits als Hemmstoffe der Blutgerinnung eingesetzt, wobei sich ihre pharmakologische Verträglichkeit erwiesen hat. Außerdem ist die Wirkung von NO.5M auf "Slow Virus Infections" (langsame Virus-Infektionen) bekannt, die zu spongioformen Encephalopathien führen, beispielsweise zu Scrapie beim Schaf oder bei der Maus und zum Jakob Creutzfeldt-Syndrom beim Menschen (Heino Diringer et al., "The Reticuloendothelial System in Scrapie Pathogenesis", J. gen. Virol. 65 (1984), Seiten 423-428; "Dextran Sulphate 500 Delays and Prevents Mouse Scrapie by Impairment of Agent Replication in Spleen", J. gen. Virol. 65 (1984), Seiten 1325-1330; "Ein Modell für Alterungsprozesse und degenerative biochemische Veränderungen des Gehirns - Scrapie", Funkt. Biol. Med. 4 (1985), Seiten 129-140). Schließlich ist die hemmende Wirkung von NO.5M auf die Replikation von Encephalo-Myocarditis (EMC)-Viren, ECHO-Viren, Coxsackie A9-Viren und von Herpes-Viren bekannt.

Die bekannten Wirkungen von NO.5M sowie der anderen besonders bevorzugten Substanzen der vorliegenden Erfindung legen jedoch die erfindungsgemäße Verwendung von anorganische anionische Gruppen enthaltenden organischen Polymerisaten nicht nahe. Sowohl in der Blutgerinnung als auch bei den vorstehend genannten Virus-Infektionen spielt nämlich die RNA-abhängige DNA-Synthese durch eine Virus-codierte und Virus-spezifische Reverse Transkriptase keine Rolle. Folglich konnte aus den bekannten Wirkungen der Verbindungen auch nicht auf eine spezifische Hemmung der Reversen Transkriptase von Retroviren geschlossen werden.

Die spezifische Hemmwirkung der erfindungsgemäß eingesetzten Stoffe auf die RNA-abhängige DNA-Synthese wird in vitro in einem Modellsystem untersucht, in dem die Reverse Transkriptase des Schmidt-Ruppin D (SR-D)-Virus enthalten ist.

Aus Ergebnissen eines solchen Testsystems, die eine Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen auf die Reverse Transkriptase eines Vogel-Retrovirus zeigen, kann ohne weiteres auf eine Hemmwirkung bei Säuger-Retroviren geschlossen werden. Es wurde nämlich bereits in vielen Untersuchungen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säuger-Retroviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind.

Zunächst wird die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen in einem Modellsystem untersucht, das neben der SR-D Reversen Transkriptase poly(rA)-RNA, daran als "Primer" angelagerte oligo(dT)-Fragmente und die zur DNA-Synthese erforderlichen Nucleotide dATP, ³H-dTTP, dCTP und dGTP ent hält.

Vor dem Start der Enzymreaktion wird einer der Hemmstoffe Foscarnet, Suramin, Chondroitinsulfat (CS), DEAE-Dextran (Diäthylaminoäthyl-Dextran, DN), Heparin (HE), Dextran (N), Dextransulfat MW5000 (N5T), Dextransulfat MW8000 (N8T), Dextransulfat MW500 000 (NO.5M) oder Pentosanpolysulfat MW5000 (T) zugegeben.

Chondroitinsulfat ist ein hochmolekulares Mucopolysaccharid, das aus Glucuronsäureresten oder Iduronsäureresten und Chondrosaminresten verestert mit H₂SO₄ besteht. Als Heparin werden aus tierischen Organen isolierbare hochmolekulare Mucopolysaccharide bezeichnet, die aus D-Glucosaminresten aufgebaut sind.

Das Ausmaß der Enzymreaktion wird bestimmt durch Messung der bei der Enzymreaktion in die neu synthetisierte DNA eingebauten Radioaktivität (³H-dTTP). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Fig. 1 aufgetragen.

Hervorragende Hemmaktivitäten zeigen die Verbindungen NO.5M und N8T. Eine geringere Hemmaktivität weisen die Verbindungen Foscarnet, Surmain und T auf.
Eine mäßige bis schlechte Hemmwirkung zeigen die Verbindungen HE, N5T, DN, N und CS.
Die schlechte Hemmaktivität von HE, CS, DN und N wird dabei darauf zurückgeführt, daß Aminogruppen (HE), Carboxylgruppen (CS), positive Ladungen (DN) oder keine negativen Ladungen (N) in den Verbindungen enthalten sind.

Die niedrige Hemmaktivität von N5T (MW5000) und die hohe Hemmaktivität von T (MW5000) zeigt, daß die erfindungsgemäße Hemmaktivität der anorganische anionische Gruppen enthaltenden organischen Polymere nicht direkt mit dem Molekulargewicht einzelner Polymere korreliert werden kann. Aus den Versuchergebnissen kann lediglich geschlossen werden, daß erfindungsgemäß zu verwendende Dextransulfate ein Molekulargewicht von mindestens 6000 haben sollten.

Die überlegenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen N8T, NO.5M und T gegenüber den Verbindungen des Standes der Technik werden bei der Berechnung des Wirkungsindex (LD₅₀/Hemmkonzentration) deutlich. Die LD₅₀-Werte sind aus der Literatur bekannt. Die Hemmkonzentration für eine 99%ige und 90%ige Hemmung der Aktivität der Reversen Transkriptase werden aus Fig. 1 abgelesen.

Die in Tabelle I zusammengefaßten Ergebnisse der Berechnungen zeigen, daß der Wirkungsindex der erfindungsgemäßen Substanzen bis zu etwa 140 mal höher ist als der der bekannten Hemmstoffe der Reversen Transkriptase (Foscarnet und Suramin).

Die in Fig. 2 und 3 gezeigten Versuchsergebnisse bestätigen die in Fig. 1 gezeigten Versuchsergebnisse. Dabei ist das vorstehend erläuterte Modellsystem dahingehend abgewandelt, daß anstelle von poly(rA)-RNA nur die endogene RNA, also Virus-eigenen RNA enthalten ist (Fig. 2). In einem weiteren Modellsystem ist im Reaktionsgemisch zusätzlich Actinomycin D enthalten (Fig. 3).

Actinomycin D hemmt dabei die neben der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität in der Reversen Transkriptase enthaltene DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität.

Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäß zu verwendenden Substanzen beruht vermutlich darauf, daß sie als anorganische anionische Gruppen enthaltende organische Polymerisate eine strukturelle Verwandtschaft mit einzelsträngigen Nucleinsäuren, also den natürlichen Substraten der Reversen Transkriptase, aufweisen.

Neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Substanzen in einer geeigneten Konzentration enthalten die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls Substanzen wie übliche pharmakologisch verträgliche Träger, Farbstoffe, Geschmacksstoffe sowie Hilfs- und Zusatzstoffe.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Ergebnisse der Inhibition der Poly(rA)/oligo- (dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase mit den Stoffen Foscarnet, Suramin, CS, DN, HE, N, N5T, N8T, NO.5M und T.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Stoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate zeigt im logarithmischen Maßstab die Anzahl der durch das ³H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute, die proportional zur synthetisierten DNA Menge sind.

Fig. 2 Ergebnisse der Inhibition der oligo(dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase an endogener RNA mit den in Fig. 1 genannten Hemmstoffen (außer Foscarnet). Die Abszisse zeigt die Konzentration des Hemmstoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate zeigt (im linearen Maßstab) die Anzahl der durch das ³H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute.

Fig. 3 Ergebnisse der Inhibition der oligo(dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase an endogener RNA in Anwesenheit von Actinomycin D.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Hemmstoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate die Anzahl der durch das ³H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung des SR-D-Virus und Reverse Transkriptase-Test system

Das im nachfolgenden Testsystem beispielhaft verwendete Vogelretrovirus, das Schmidt-Ruppin D (SR-D)-Virus, wird aus dem Kulturüberstand von Virus-produzierenden Zellen isoliert. Dem Fachmann ist bekannt, daß auch die Reverse Transkriptase anderer Retroviren im nachstehend erläuterten Modellsystem verwendet werden kann. Das SR-D-Virus wurde für das nachstehend beschriebene Modellsystem ausgewählt, weil es von den Wirtszellen sezerniert wird und im Verlauf der Virus-Synthese die Wirtszellen nicht zerstört werden. Damit unterscheidet sich dieses Virus vom sogenannten LAV/HTLV III-Virus, das seine Wirtszellen zerstört. Isolate des LAV-HTLV III-Virus sind wegen dieses zythopathischen Effektes mit zellulären DNA-Polymerasen verunreinigt, wobei die DNA-Synthese-Aktivitäten sich nicht ohne weiteres von der eigentlichen Reversen Transkriptase unterscheiden lassen. Aus diesem Grund ist ein Modellsystem zur Ermittlung von spezifischen Hemmwirkungen zu untersuchender Substanzen, das die Reverse Transkriptase des SR-D-Virus enthält, zuverlässiger, als ein Modellsystem, das die aus LAV-HTLV III-Viren isolierte Reverse Transkriptase enthält.

Es wurde jedoch bereits in vielen Versuchen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säugerviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind. Es lassen sich somit alle nachfolgend beschriebenen Erkentnisse ohne weitere Einschränkungen auf die Reverse Transkriptase von LAV-HTLV III- und anderen Retroviren übertragen.

a) Gewinnung des Virus

Die Isolierung des SR-D-Virus erfolgt im wesentlichen nach K. Mölling ("Characterization of Reverse Transcriptase und RNase H from Friend-Murine Leukemia Virus", Virology 62 (1974), S. 46 bis 59; "Further Characterization of the Friend-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase- RNase H Complex", J. of Virol. 18 (1976), S. 418 bis 425; "Two Avian Sarcoma Virus Mutants with Defects in the DNA Polymerase-RNase H Complex", J. of Virol. 32 (1979), S. 370 bis 378). Dementsprechend werden normale Hühnerembryofibroblasten, die nach Standartmethoden aus Hühnerembryonen isoliert werden, mit dem SR-D- Virus infiziert. Das SR-D-Virus ist bei der American Type Tissue Centure Collection (ATCC) Rockville, Maryland, USA, erhältlich (ATCCVR354). In Abständen von 24 Stunden werden die Kulturüberstände entnommen, bei -70°C eingefroren und die Zellkulturen mit neuem Medium versehen. Auf diese Weise werden etwa 5 Liter Zellkulturüberstand gesammelt. Die Zellkulturüberstände werden anschließend aufgetaut und durch Zentrifugation (10 000 Upm, 30 Min., 4°C in GSA Sorvall Rotor) vorgereinigt. Anschließend werden die enthaltenen Viruspartikel durch hochtourige Zentrifugation pelletiert (20 000 Upm, 2 Stunden, 4°C im SW27 Beckman Rotor). Nach Entfernen des Überstandes werden die abzentrifugierten Viruspartikel in etwa einem Tausendstel des Ausgangsvolumens (5 ml) physiologischem Puffer, wie TNE (0,05 M Tris-Hydrochlorid, 0,1 M NaCl und 0,005 M EDTA, pH 7,4) resuspendiert. Danach werden die Viruspartikel durch Zentrifugation über einen 20 bis 70% Saccharose- Gradienten in physiologischem Puffer, wie TNE (30 000 Upm, 8 Stunden, 4°C im SW27-Rotor) gereinigt. Viruspartikel mit einer Schwimmdichte von 1,16 g/cm³ werden aus dem Gradienten isoliert. Die so erhaltene hochreine Virussuspension wird mit dem den Gradienten entsprechenden Puffer auf eine Konzentration von etwa 1 mg/ml eingestellt und läßt sich dann ohne große Enzymaktivitätsverluste in kleineren Portionen mehrere Wochen bei -20°C lagern.

b) Reverse Transkriptase-Modellsystem

Im nachstehend beschriebenen Modellsystem erfolgt die Bestimmung der Aktivität der Reversen Transkriptase in Gegenwart eines Hemmstoffes im wesentlichen nach K. Mölling, a. a. O.

Somit wird die Virion-assoziierte Reverse Transkriptase zunächst durch Detergens-Behandlung für die Enzymreaktionspartner zugänglich gemacht. Etwa 10 µg Viruspartikel einer wie vorstehend beschriebenen erhaltenen 1 mg/ml Virus-Suspension werden mit 0,8% Nonidet (NP-40®) (Fluka AG, Buchs) 10 Minuten bei 4°C aufgeschlossen und anschließend einem Enzymtest zugesetzt, der ein Gesamtvolumen von 100 µl hat und folgende Bestandteile enthält: 50 mM Tris-HCl, pH 7,8; 8 mM MgCl₂, 80 mM KCl, 1 mM DTT (Dithiothreitol), je 20 mµMol dATP, dGTP, dCTP und 0,2 mµMol ³H-TTP (sepz. Akt. 50 Ci/mMol). Je nach Zielsetzung dieses Tests werden verschiedene Matrizen zugesetzt, z. B. poly(rA) (Beipiels 2) oder endogene RNA (Beispiel 3 und Beispiel 4). Dem so erhaltenen Reaktionsansatz werden die einzelnen Hemmstoffe zugefügt. Diese wurden vorher in Stammlösungen von 10 mg/ml oder 1 mg/ml in H₂O angesetzt und lassen sich ebenfalls bei -20°C lagern. Die Hemmstoffmengen werden in maximal 10 µl bei einem Gesamtvolumen von 100 µl zugesetzt. Zum Vergleich werden Suramin (Bayer, Leverkusen) und Foscarnet (Astra Läkemedel AB, Södertälje, Schweden) mitgetestet. Die Enzymreaktion wird anschließend 60 Minuten bei 37°C durchgeführt. Danach wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 10% Trichloressigsäure (TCA, 0,5 ml) beendet. Die synthetisierte DNA wird durch die TCA in 20 Minuten bei 4°C gefällt und durch Filtration durch ein Membranfilter von den nicht eingebauten ³H-dTTP- Molekülen abgetrennt. Die Menge an radioaktiver DNA auf dem Filter wird durch Flüssigkeitsszintillationsmessung bestimmt. Als unspezifischer Hintergrund wird diejenige Radioaktivität subtrahiert, die nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise in einem Test in Abwesenheit von Virusproteinen auf dem Filter haftete (ca. 1000 cpm, entsprechend etwa 1%). Um den unspezifischen Hintergrund so niedrig zu halten, werden die Filter mehrfach mit 5% TCA-Lösung (insgesamt etwa 50 ml) und Pyrophosphat-Lösung (10 ml, gesättigte Lösung) gewaschen.

Die Zahl der gemessenen radioaktiven Zerfälle (³H-cpm) wird dann in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen der Inhibitoren graphisch aufgetragen. Dabei entspricht die Konzentration der Inhibitoren (µg/µl) der Endkonzentration im Test.

Beispiel 2 Inhibition der poly(rA)/oligo/(dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase

Eine der wirksamsten Matrizen der Reversen Transkriptase ist das synthetische Polymer poly(rA) von etwa 100 bis 200 Nucleotiden Länge, das mit oligo(dT)-Stücken ("Primern") der Länge von 10 Nucleotiden gemischt wird (Boehringer Mannheim).
Somit besteht die in diesem Testsystem verwendete Matrize aus einer synthetischen RNA, an die kurze DNA-Primer gebunden sind. Die Primer dienen der Reversen Transkriptase als Startstellen.
Die RNA-abhängige DNA-Synthese an dieser Matrize ist etwa 100fach effizienter als die an der endogenen RNA. poly(rA)oligo(dT)₁₀ wird in einer Stammlösung von 1 mg/ml angesetzt. Pro Enzymtest wird eine Endkonzentration von 50 µg/ml verwendet. Der Enzymtest wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Enzymreaktionen unter Zugabe der Hemmstoffe Foscarnet, Suramin, CS, DN, HE, N, N5T, N8T, NO.5M und T sind in Fig. 1 dargestellt. Mit Hilfe der graphischen Darstellung der Meßergebnisse in Fig. 1 können die Konzentrationen der zugegebenen Substanzen ermittelt werden, bei denen die Aktivität der Reversen Transkriptase zu 99% bzw. zu 90% gehemmt wird. Der Koeffizient aus den von den Substanzen aus der Literatur bekannten LD₅₀-Werten und den aus Fig. 1 ermittelten Hemmkonzentrationen ist der Wirkungsindex der Substanzen (vgl. Tabelle I).

Tabelle I

Aus Tabelle I geht hervor, daß die erfindungsgemäß besonders bevorzugten Substanzen einen bis zu etwa 140fach höheren Wirkungsindex als die aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen Suramin und Foscarnet haben.

Beispiel 3 Inhibition der von endogener RNA und oligo(dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase

Gemäß Beispiel 2 wird die Hemmaktivität der in Beispiel 2 verwendeten Substanzen ermittelt, wobei jedoch anstelle der poly(rA)-RNA die endogene RNA der Viruspartikel verwendet wird. Pro 100 µl Enzymtest werden dabei 5µg oligo(dT)₁₀-Primer-Moleküle aus einer 1 mg/ml Stammlösung zugegeben. Die durch Anlagerung der Primer-Moleküle an die endogene RNA zusätzlich entstehenden Startstellen für die DNA-Synthese durch die Reverse Transkription ermöglichen eine etwa 2fach höhere DNA-Synthese-Aktivität an der RNA. In diesen Enzymtest-Reaktionen wird somit die Aktivität der Reversen Transkriptase an endogener RNA inhibiert und gemessen.

Die Ergebnisse der Reaktionen sind in Fig. 2 zusammengefaßt.

Aus Fig. 2 geht hervor, daß die Hemmwirkung der getesteten Substanzen im wesentlichen der in Fig. 1 dargestellten entspricht.

Beispiel 4 Inhibition der von endogener RNA und oligo(dT)₁₀-stimulierten Reversen Transkriptase in Anwesenheit von Actinomycin D

Neben der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verfügt die Reverse Transkriptase über eine DNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität. Letztere Aktivität läßt sich in einem Modellsystem durch Zugabe von Actinomycin D, einem in doppelsträngige DNA interkallierenden Antibiotikum, spezifisch hemmen. Folglich wird in einem solchen System nur die eigentliche Reverse Transkription, d. h. die RNA- abhängige DNA-Polymerase-Aktivität der Reversen Transkriptase gemessen.

Die Testreaktionen werden gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Es werden 10 µg pro 100 µg Testansatz Actinomycin D (Boehringer Mannheim) aus einer 1 mg/ml Stammlösung zum Reaktionsgemisch zugesetzt. Wie in Beispiel 3 dient bei dieser enzymatischen Reaktion ausschließlich die endogene virale RNA als Matrize und oligo(dT) als Primer Moleküle. Die Ergebnisse dieser Testreihe sind in Fig. 3 zusammengefaßt. Getestet wurden lediglich die Substanzen Foscarnet, Suramin, N3T, NO.5M und T.

Aus Fig. 3 geht hervor, daß die Ergebnisse im wesentlichen den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Versuchsergebnissen entsprechen und damit diese Versuchsergebnisse bzw. die daraus ermittelten Wirkungsindices bestägigen.

Claims

1. Verwendung von polymeren Kohlenhydraten, die anorganische anionische Gruppen, jedoch kine COOH- und NH₂- Gruppen enthalten, zur Prophylaxe und Therapie von Retrovirusinfektionen in Säugern.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat aus Pentose-Monomeren auf gebaut ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat aus Hexose-Monomeren auf gebaut ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat aus Pyranoseresten mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen besteht.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß die Pyranosereste Xylopyranosereste sind.

6. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyranosereste Glucopyranosereste sind.

7. Verwendung nach Anspruch 2, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat ein Pentosanpolysulfat ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat Pentosanpolysulfat MW5000 ist.

9. Verwendung nach Anspruch 3, 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat ein Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von mindestens 6000 ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat Dextransulfat MW8000 ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat Dextransulfat MW500 000 ist.