DE3812181A1 - Arzneimittel, enthaltend natuerliche und/oder chemisch modifizierte mono- oder polysaccharide und deren verwendung - Google Patents

Description

Grundlage der Erfindung ist der Befund, daß human immunodeficiency virus (HIV)-Proteine glykosyliert sind (S. Chakrabarti et al., Nature 320: 535, 1986). Wie im Folgenden gezeigt wird - und dies ist Gegenstand der Erfindung - können Antikörper, gerichtet gegen Kohlehydrateinheiten, das Virus inaktivieren und nicht mehr infektiös werden lassen. Es ist davon auszugehen, daß auch im Menschen nach Bildung von Antikörpern (gerichtet gegen Zuckereinheiten), die durch Injektion von Mono- und/oder Polysacchariden induziert werden, das Virus inaktiviert wird.

Die Naturprodukte Mono- und Polysaccharide können durch chemische Methoden modifiziert werden.

Die Substanzen umfassen folgende Gruppen von organischen Zusammensetzungen:

(1) Natürlich vorkommende Mono- und Polysaccharide:
Besonders aus Pflanzensamen, Mikroben, Hefen und Pilzen können Mono- und Polysaccharide nach eingeführten Verfahren isoliert werden (zusammengefaßt bei: I. C. M. Dea und A. Morrison, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 31: 241, 1975; S. A. Barker und G. Zweifel, Chemistry and Industry p. 330, 1957). Die gewonnenen Mono- und Polysaccharide werden in die Gruppen z. B. Glucomannane, Mannane und Galaktane eingeteilt.

(2) Modifizierte Mono- und Polysaccharide:
(a) Chemisch quervernetzte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei das von N. M. Young und M. A. Leon (Carbohydr. Res. 66: 299, 1978) erwähnt, bei dem polymere oder monomere Saccharide durch Divinylsulfon nach Laugenbehandlung chemisch modifiziert werden. Zum Beispiel kann mit diesem Verfahren Mannose (Monomer) oder Gummi arabicum (Polymer: Gummiharz enthaltend Arabinsäure aus afrikanischen Acacia-Arten) quervernetzt werden.
(b) Chemisch modifizierte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei die Kopplung von Monosacchariden an Serumalbumin (z. B. Immunglobulin vom Mensch) nach der Methode von C. R. Mc Broom et al. (Meth. Enzymol. 28: 212, 1972). Bei diesem Verfahren wird z. B. p-Nitrophenyl-alpha-L-Fukopyranosid in Anwesenheit von Natrium-Carbonat und Albumin reagieren lassen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt gelchromatographisch gereinigt.

Aus diesen Gruppen wurden ausgewählt zur Untersuchung über deren pharmakologische Wirkung:
1. Galaktomannan (ab jetzt abgekürzt Gal): Die Herstellung von Gal wurde in der Publikation von P. A. J. Gorin et al. (Carbohydr. Res. 11: 387, 1969) beschrieben.
2. Hefe-Mannan (ab jetzt abgekürzt Man): Die Herstellung von Man wurde in der Publikation von W. N. Haworth et al. (Chem. Soc. p. 784, 1937) beschrieben.

Es wird nun beschrieben, daß natürliche und/oder modifizierte Mono- oder Polysaccharide immunprophylaktische und immuntherapeutische Eigenschaften besitzen. Diese Eigenschaften waren bisher unbekannt. Die nun beschriebene Erfindung läßt den Einsatz natürlicher und/oder modifizierter Mono- oder Polysaccharide bei der Behandlung der Immunschwäche AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) oder ARC (AIDS-related Complex) als sinnvoll erscheinen. Es war nicht naheliegend, modifizierte Polysaccharide zur Bekämpfung des o. g. Virus- bedingten Krankheitsbildes einzusetzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgsversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS bzw. ARC mit Hilfe von natürlichen oder modifizierten Mono- oder Polysacchariden aufzuzeigen.

AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), oder auch genannt Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenophathy-Associated Virus (LAV) verursacht. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS in Form des Kaposi-Sarcoms (KS) oder des ARC sich klinisch am schwersten manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nicht möglich.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß natürliche oder modifizierte Mono- oder Polysaccharide zur Bekämpfung von AIDS oder des ARC sehr geeignet sind. Inhalt dieser Erfindung ist der Nachweis, daß die natürlichen oder modifizierten Mono- oder Polysaccharide (nach Induktion von Antikörper im Organismus gegen diese Substanzen) einen anti-HIV Effekt bewirken.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und parenteral (intra­ muskulär, intravenös und subkutan) verabreicht werden können.

Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung oder Verbesserung von AIDS oder ARC wirksame oder immundefekt-beseitigende Menge wenigstens einer Verbindung aus der Klasse der natürlichen und/oder modifizierten Mono- oder Polysaccharide, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.

Wenn das Mittel in einer Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung.

Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natrium­ chlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylen­ diaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Benzylalkohol oder Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH.

Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch (antiviral, immun­ therapeutisch und/oder immunprophylaktisch) wirksamen Menge natürlicher und/oder modifzierter Mono- und/oder Polysaccharide davon an einen Patienten, der dieser Behandlung bedarf.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV), und sie wirken stimulierend auf das Immunsystem, so daß die körpereigenen Abwehrkräfte gegen AIDS, ARC und verwandte Erkrankungen gestärkt werden. Diese Verbindungen sind deshalb zur immuntherapeutischen und immunprophylaktischen Behandlung der durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wird nachfolgend am Beispiel von Man und Gal anhand pharmakologischer in vivo/in vitro-Testsysteme untersucht.

Beispiele: Pharmakologische Wirkungen von Man und Gal Beispiele:

1) Herstellung von Antikörper gegen Man und Gal (= anti-Man und anti-Gal);
2) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von anti-Man und anti-Gal;
3) Molekularer Wirkmechanismus von anti-Man und anti-Gal auf die Vermehrung des AIDS-Virus HIV;

1) Herstellung von Antikörper gegen Man und Gal

Die Antikörper wurden nach dem üblichen Verfahren gezogen (Ref.: A. Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry; Springer-Verlag, Berlin, 1979; Seite 210-214). Weiße Kaninchen wurden 1mal mit 0,5 mg Gal oder Man mit komplettem Freundschen Adjuvant behandelt. In der 2., 4. und 6. Woche wurden die Tiere mit der gleichen Dosis an Man oder Gal, aber dieses Mal mit inkomplettem Freundschen Adjuvant, behandelt.

Anschließend wurde das Serum gewonnen und die Immunglobuline nach dem üblichen Verfahren durch Ionenaustauschchromatographie an Diethylaminoethyl-Zellulose gereinigt (Ref.: A. Nowotny; siehe oben; Seite 8-12). Die gereinigten Antikörper gegen Man (ab jetzt abgekürzt anti-Man) waren Antikörper der Klasse IgM und diejenigen gegen Gal gerichtet (ab jetzt abgekürzt anti-Gal) konnten der Klasse IgG zugeordnet werden. Der Titer (diejenige Verdünnung an Antiserum, bei der noch eine Präzipitation mit dem Antigen im Difussionsansatz zu erkennen war) wurde nach der Ouchterlony- Methode (O. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26: 507, 1949) semiquantitativ bestimmt. Der Titer für anti-Man lag bei 1064 und für anti-Gal bei 512.

2) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von anti-Man und anti-Gal

Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte OKT4+ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS- Virus der Isolatbezeichnung HTLV-IIIB (zugehörig zu HIV-1) vermehrt (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed und R. C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).

Versuchsdurchführung

Assaybedingungen für die Reverse Transkriptase:
Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurde in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 5 mM DTT, 10 mM MgCl2, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C8H17-C6H4-(OCH2CH2)9-10-OH) oder NP40 (nicht- ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)15.(A)n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und 3H-Desoxythymidintriphosphat (3H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA- Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationszähler bestimmt.

HIV-Infizierung von H9-Zellen

H9-Zellen (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed, R. C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984)) wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HTLV-III- Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic, vgl. oben) pro 4 × 100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit Antikörper (anti-Man oder anti-Gal) behandelter Teil dieser Proben wurde als positive Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender Verbindung (anti-Man oder anti-Gal) gegeben wurden. Die HTLV-III Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben beschrieben analysiert.

Immunofluoreszenz-Assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol : Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HTLV-III p17 (Gag-Protein mit MG = 17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG = 24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln in den Zellen anzeigen. Die HTLV-III infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol- Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0,25% Triton X-100 enthält, 2 h gewachen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege- Antimaus IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

Untersuchungsparameter 1. Zellwachstum

H9-Zellen sowie mit HTLV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml Kulturmedium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3 × 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten H9-Zellen lediglich 0,5 × 1 000 000 Zellen/ml war, diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.

Dann wurden Proben von H9-HTLV-IIIB-Zellen 0,2 × 1 000 000 Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von anti-Man und anti-Gal behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß anti-Man (und anti-Gal) in den Konzentrationen von zwischen 256 und 512 (128 und 256) Titereinheiten/ml die Wachstumsrate von H9-HTLV-IIIB-Zellen auf Werte steigert, die im Bereich der Kontrolle (1 300 000 Zellen/ml), nämlich der H9-Zellen ohne HTLV-IIIB liegen.

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch H9-HTLV-IIIB-Zellen, die mit anti-Man und anti-Gal behandelt wurden

Es wurde untersucht, ob die 4tägige Zugabe von anti-Man oder anti-Gal zu H9-HTLV-IIIB-Zellen die Produktion von HTLV-III- Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HTLV-IIIB-Zellen, die nicht mit anti-Man oder anti-Gal behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von anti-Man oder anti-Gal führte zu einer dosisabhängigen Verringerung der Reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Bereits bei der Dosis von 256 (128) an anti-Man (anti-Gal) Titereinheiten/ml wurde eine nahezu komplette Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen, die die Antikörperbildung induzierten, sind deshalb in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu inhibieren, bei denen verschiedene in vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, nicht nachteilig beeinflußt werden.

3. Inhibierung der HTLV-IIIB p15 und p24 Expression in H9-HTLV-IIIB durch anti-Man oder anti-Gal

Es hat sich gezeigt, daß anti-Man und anti-Gal eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p24 und p15 in infizierten H9-Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem HTLV-IIIB-Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung kultiviert wurden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p24 und p15-Proteins. Nach Inkubierung der H9-HTLV-IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß anti-Man und anti-Gal eine signifikante Reduktion der Expression der HTLV-III-Proteine p15 und p24 verursachen.

3) Molekularer Wirkmechanismus von modifizierten Polysacchariden auf die Vermehrung des AIDS-Virus HIV

Der Wirkmechanismus von anti-Man und anti-Gal als Inhibitor der HIV-Vermehrung wurde als Hemmung der Assoziation von HIV- Proteinen mit T4-Zellen (Lymphozyten erkannt). Diese Assoziation ist notwendig für eine Infektion der Zielzelle (Ref.: R. C. Gallo et al., Progr. Allergy 37: 1, 1986).

Die Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt:
2 500 000 menschliche Blut-Lymphozyten wurden in 1 ml Ansätzen mit 125-Jod-radioaktivmarkiertem HIV-Protein (Markierung nach: A. C. C. Cuello et al., In: Immunohistochemistry. A. C. Cuello, Herausgeber. John Wiley & Sons, Inc. New York; Seite 214-256; 1983) in physiologischer Kochsalzlösung entsprechend früheren Angaben (M. Gramzow et al., J. Cell Biol. 102: 1344, 1986) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von dem Protein abgetrennt; nach dem Verfahren von G. Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660; 1949) wurde die Anzahl der Bindungsstellen für HIV-Proteine an Lymphozyten bestimmt. Der Ergebnisse ergaben folgende Werte:

Ergebnis: Hemmung der Bindung durch anti-Man und anti-Gal

Die durch anti-Man und anti-Gal bewirkte Hemmung der Bindung von HIV-Proteinen an Lymphozyten ist durch dieses Experiment erwiesen.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung Beispiele für pharmazeutische Mittel

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.

Beispiel a

Zur intramuskulären Injektion:
5 ml Ampullen
100 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
max. 0,5 mg p-(Äthyl-mercuri-thio)benzolsulfonsäure, Natrium-Salz

Beispiel b

Zur intramuskulären Injektion:
5 ml Ampullen
max. 7,5 mg Phenol

Beispiel c

Zur intravenösen Applikation:
10 ml Flaschen
250 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
85 mg Natriumchlorid
auffüllen mit Aqua ad iniectabilia, pyrogenfrei.

Claims (3)

1. Verwendung von natürlichen und/oder chemisch modifizierten Mono- oder Polysacchariden als Arzneimittel.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an natürlichen und/oder chemisch modifizierten Mono- oder Polysacchariden.

3. Verwendung von natürlichen und/oder chemisch modifizierten Mono- oder Polysacchariden zur antiviralen, immunprophylaktischen und/oder immuntherapeutischen Behandlung besonders von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bzw. ARC (AIDS- related Complex).