DE69106493T2

DE69106493T2 - Sulfonische Stilbenderivate zur Behandlung von Viruserkrankungen.

Info

Publication number: DE69106493T2
Application number: DE69106493T
Authority: DE
Inventors: Alan D Cardin; Stanley A Tyms
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-02-05
Filing date: 1991-02-05
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2011-02-06
Also published as: US5932614A; IE920360A1; KR0185683B1; US5672625A; ATE116637T1; DK0498095T3; DE69106493D1; ZA92669B; IE65161B1; US5494932A; EP0498095B1; JPH04338329A; AU1062092A; KR920016090A; EP0498095A1; GR3014998T3; AU652413B2

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND

Gegenwärtig beschäftigt sich die Forschung intensiv mit der Entwickung von Heilverfahren und Medikamenten zur Bekämpfung viraler Infektionen bei Menschen und Tieren. Vor allem ist die zunehmende Zahl von Menschen, die an AIDS und ARC erkranken, beängstigend. Die Überlebensrate von fünf Jahren für AIDS-Patienten ist entmutigend. AIDS-Patienten, deren Immunsystem durch die Infektion ernsthaft geschädigt ist, leiden an zahlreichen opportunistischen Infektionen, zu denen das Kaposi-Sarkom und die von Pneumocystis carinii verursachte Lungenentzündung gehören. Gegen AIDS ist kein Heilmittel bekannt. Die Wirksamkeit der derzeitigen Behandlungsmethoden ist größtenteils nicht ausreichend bewiesen und ihre Nebenwirkungen sind zahlreich und gravierend. Die Angst vor der Krankeit hat zu sozialer Ächtung und Diskriminierung derjenigen geführt, die die Krankheit haben oder im Verdacht stehen, sie zu haben.
Retroviren stellen eine Klasse von Ribonucleinsäure (RNA)-Viren dar, die sich mit Hilfe von reverser Transkriptase replizieren, wobei ein komplementärer DNA-Strang (cDNA) gebildet wird, aus dem eine doppelsträngige Provirus-DNA hergestellt wird. Diese Provirus-DNA wird dann in die chromosomale DNA der Wirtszelle eingebaut, was die virale Replikation durch Transkription dieser integrierten DNA und die Translation der viralen Boten-RNA in Proteine ermöglicht; der Einbau der neuen viralen RNA in eine Proteinhülle und die Freisetzung aus den Zellen führt zur Bildung der infektiösen Virus-Nachkommenschaft.
Viele bekannte Retroviren sind onkogen oder verursachen Tumore. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß die ersten zwei menschlichen Retroviren, die man entdeckt und als menschliches T-Zell-Leukämievirus I und II oder HTLV-I und II bezeichnet hat, bei Menschen nach Infektion von T-Lymphocyten seltene Leukämieformen verursachen. Ferner hat sich gezeigt, daß das dritte derartige menschliche Virus, das man entdeckt hat, HTLV-III, jetzt als HIV bezeichnet, Zelltod nach Infektion von T-Lymphocyten verursacht. Es ist als der Erreger des erworbenen Immundefekt-Syndroms (AIDS) und des mit AIDS verwandten Komplexes (ARC) identifiziert worden.
Das Hüllprotein von HIV ist ein 160 kDa-Glycoprotein. Das Protein wird durch eine Protease gespalten, wodurch ein 120 kDa-Außenprotein, gp 120, und ein Transmembranglycoprotein, gp 41, entstehen. Das gp 120-Protein enthält die Aminosäuresequenz, die den Rezeptor auf den CD4-positiven menschlichen T-Helfer-Zellen erkennt. Vor kurzem wurde berichtet, daß die polysulfatierten Polysaccharide Dextransulfat, Carrageenan aus Meeresalgen, Pentosanpolysulfat und Heparin in vitro hochwirksame Inhibitoren der HIV-1- Replikation sind (M. Ito et al., Antiviral. Res., 7(1987), 361-367; Baba et al., Antiviral. Res., 9 (1988), 335-343; O. Yoshida, Biochem. Pharmacol., 37 (1988), 2887-2981; R. Ueno and S. Kuno, Lancet i, (1987) 1379). Die antivirale Wirkung kann sich nur einstellen, wenn auf diesen Molekülen Sulfatgruppen vorhanden sind. Dieser Wirkungsmechanismus ist von Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 6132-6136, untersucht worden.
Die Anmelder haben entdeckt, daß eine Klasse sulfonierter Stilbene, die Sulfonsäure-Gruppen tragen, wirksam gegen HIV ist. Sowohl die Herpes- simplex-Viren (HSV) I und II als auch das Cytomegalievirus (CNIV) besitzen funktionell verwandte Glycoprotein-Hüllen und die virale Infektiosität kann durch die Verwendung der erfindungsgemäßen sulfonierten Stilbene auch herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFlNDUNG Verbindungen der Formel 1
in der
R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander eine H&sub2;N- O&sub2;N-, S=C=N-, N C- oder CH&sub3;C(O)NH-Gruppe bedeuten,
B eine -CH=CH- (cis oder trans), -C C- oder -CH&sub2;-CH&sub2;-Gruppe darstellt und M&sub1; und M&sub2; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation bedeuten,
lassen sich zur Behandlung von Krankheiten verwenden, die durch Infektionen mit Viren, die eine Proteinhülle besitzen, verursacht werden.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFlNDUNG

Pharmazeutisch verträgliche Kationen sind Kationen, die in der verabreichten Dosis zur Erzielung der gewünschten Wirkung nicht nennenswert toxisch sind und keine eigene ausgeprägte pharmakologische Wirksamkeit besitzen. Beispiele solcher Salze sind die Salze von Alkalimetallen, wie z.B. Natrium und Kalium; von Erdalkalimetallen, wie z.B. Calcium und Magnesium; von Leichtmetallen der Gruppe IIIA einschließlich Aluminium; und von organischen primären, sekundären und tertiären Aminen, wie z.B. Trialkylamine, umfassend Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabiethylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin. Natriumsalze sind bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich vom Durchschnittsfachmann leicht herstellen. Die Verbindungen sind sulfonierte Stilbenderivate und können auf verschiedene Weise mit Hilfe der wohl bekannten aromatischen elektrophilen Substitutionsverfahren hergestellt werden, wie sie beispielsweise in R. T. Morrison and R. N. Boyd, Organic Chemistry, 5. Ausgabe, Allyn and Bacon, Inc., Boston (1987), Kapitel 14, aufgeführt sind. Die effizienteste Weise, die Verbindungen der Formel herzustellen, besteht im allgemeinen in der Sulfonierung der entsprechenden nichtsulfonierten Verbindung der Formel 1a
in der B, R&sub1; und R&sub2; die vorstehend für die Verbindungen der Formel 1 angebene Bedeutung haben oder Gruppen darstellen, die sich leicht in diese Substituenten umwandeln lassen. Wenn die Herstellung von Verbindungen der Formel 1 oder 1a gewünscht wird, in denen B keine -C=C-Gruppe darstellt, wird im allgemeinen auch die entsprechende Verbindung, in der B eine -C=C- Gruppe bedeutet, zuerst hergestellt und anschließend wird die Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindung mittels bekannter Verfahren zur Herstellung des gewünschten Restes umgewandelt.
Die Verbindungen der Formel 1a, in denen B eine -C=C-Gruppe darstellt, können beispielsweise hergestellt werden, indem ein gegebenenfalls substituiertes Benzaldehyd einer in Schema A gezeigten Benzoinkondensation unterworfen wird, wobei sich zuerst ein Keto-Alkohol-Addukt der Formel 2 bildet SCHEMA A
in der die B-, R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen die vorstehend für die Verbindungen der Formel 1 angebene Bedeutung haben oder Gruppen darstellen, die anschließend in die vorstehend definierten Gruppen umgewandelt werden können. Ein guter allgemeiner Überblick über die Benzoinkondensationsumsetzung findet sich bei Ide and Buck, Org. Reactions, 4 (1948), 269-304. Das Zwischenprodukt der Formel 2 wird sodann reduziert, wobei sich ein Stilbenderivat bildet, d.h. eine Verbindung der Formel 1a, in der B eine -C=C-Gruppe darstellt. Die Reduktion kann in jeder herkömmlichen Weise durchgeführt werden, wie z.B. unter Verwendung eines Reduktionsverfahrens mittels Auflösen eines Metalls, in dem beispielsweise Zinkamalgam und eine verdünnte Saure, wie Essigsäure, verwendet werden. Die Reduktion führt meistens zu einem Gemisch von Stilbenen mit geometrischer cis- und trans-Konfiguration bezogen auf die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, wobei die trans-Konfiguration bevorzugt ist. Ein Isomer kann in das andere Isomer in jeder beliebigen Weise umgewandelt werden, die der Fachmann im allgemeinen zur Umwandlung geometrischer Isomere bezogen auf eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung verwendet. Ein trans-Stilben kann beispielsweise durch die Wirkung von UV-Licht in ein cis-Stilben umgewandelt werden.
Ein anderer Weg zur Herstellung der erfindungsgemäßen Stilbene ist in Schema B erläutert. Dieses Umsetzungsschema umfaßt die Umsetzung eines Aldehyds der Formel 3 mit einer Benzyl-Grignard-Verbindung der Formel 4, wobei ein Alkohol der Formel 5 gebildet wird, der nach Dehydratation das gewünschte Stilben liefert. Die Substituenten B, R&sub1; und R&sub2; der Verbindungen der Formeln 3, 4 und 5 haben die vorstehend für die Verbindungen der Formel 1 angegebene Bedeutung oder bedeuten Gruppen, die anschließend in diese Substituenten umgewandelt werden können. SCHEMA B
Ein weiterer Weg zur Herstellung der Stilbene der Formel 1a ist in Schema C erläutert und umfaßt die Umsetzung des Aldehyds der Formel 3 mit einem alpha- Phenylacetat der Formel 6, wobei ein Alkoholester der Formel 7 gebildet wird, der nach Dehydratation das Acrylat der Formel 8 ergibt und nach einer säurekatalysierten Decarboxylierung das Stilben der Formel 1a ergibt. SCHEMA C
Die Anmelder bevorzugen die Verbindungen der Formel 1, in denen B eine -CH&sub2;-CH&sub2;-Gruppe darstellt und bevorzugen besonders die Verbindungen, in denen B eine -CH=CH-Gruppe ist, insbesondere die Verbindungen mit trans- Konfiguration. Die Anmelder bevorzugen auch die Verbindungen der Formel 1, in denen R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander eine S=C=N- oder eine CH&sub3;C(O)N- Gruppe bedeuten. Die Anmelder bevorzugen ferner die Verbindungen der Formel 1, in denen M&sub1; und M&sub2; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Natrium-Kation darstellen. Die Anmelder bevorzugen die Verbindungen, in denen sich die R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen in der para (oder 4)- Position zum Kohlenstoffatom, an dem die B-Gruppe angelagert ist, befinden und in denen sich die Sulfonylgruppen in der γ-ortho (oder 2)-Position zum Kohlenstoffatom, an dem die B-Gruppe angelagert ist, befinden. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen sind 4,4'- Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'-disulfonsäure (H&sub2;DIDS), 4-Acetamido-4'- isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure (SITS) und insbesondere 4,4'- Diisothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure (DIDS).
Die sulfonierten Stilbene können zur Verhinderung einer HIV-Infektion von Zellen und Syncytiumbildung in Zellen mit bestehenden HIV-Infektionen verwendet werden oder gegen andere verwandte, das gp 120- Oberflächenprotein tragende Viren ebenso wie gegen die Herpes-simplex- Viren (HSV) I und II, und gegen das Cytomegallevirus (CMV) eingesetzt werden. Die sulfonierten Stilbene können sowohl zur Behandlung von AIDS, ARC und anderer Krankheiten, die durch das Retrovirus HIV oder andere verwandte, das gp 120-Oberflächenprotein besitzende Viren verursacht werden, als auch zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch die Herpes- simplex-Viren (HSV) I und II und das Cytomegalievirus (CMV) verursacht werden.
Die Auswertung der mit dem Virus GB8 akut infizierten menschlichen T- Zellinie JM zeigte, daß DIDS, H&sub2;DIDS und SITS (Tabelle I) die Bildung von virusinduzierten mehrkernigen Riesenzellen (Syncytien) unterdrückten. Die antivirale Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde durch die dosisabhängige Hemmung des viralen Kernantigens p24 (Tabelle I) und durch die Abwesenheit infektiöser Virenpartikel in zellfreien Überständen (Ergebnisse nicht gezeigt) bestätigt. Wir haben auch die antiviralen Eigenschaften dieser Verbindungen in einem zweiten Wirtszell-/Virus-System untersucht, d.h. bei hochgradig CD4- positiven C8166-Zellen, die mit dem haitianischen HIV-1-Stamm RF infiziert worden waren. Wie vorstehend beschrieben, blockierten DIDS und H&sub2;DIDS die HIV-1-Infektion; SITS war jedoch in einer Dosis von 100 ug/ml unwirksam, wie durch Bestimmung der Syncytienbildung und des p24-Antigens festgestellt wurde (Tabelle I). Wie mittels des Tetrazolium-Verminderungstestverfahren (Nakashima et al., (1989)) festgestellt wurde, blockierten DIDS und H&sub2;DIDS in nicht cytotoxischen Konzentrationen auch die RF-Entwicklung in MT-4-Zellen, während SITS nur eine schwache antivirale Wirksamkeit besaß (nicht gezeigt). In allen drei Wirtszell-/Virus-Systemen war die antivirale Wirksamkeit durchwegs DIDS> H&sub2;DIDS»SITS. TABELLE I ANTIVIRALE WlRKUNG DER STILBENDISULFONSÄURE-ANALOGEN DIDS, H&sub2;DIDS UND SITS GEGEN INFEKTIONEN VON JM-ZELLEN MIT DEN HIV-1- STÄMMEN GB8 UND RF Verbindung Konzentration uM Durchschnittliche Syncytienzahla p24-Antigenb % Viruskontrolle Viruskontrolle a Am 4. Tag p.i. (nach Infektion) b Viruskontrolle = 7,35 x 10&sup4; pg/ml am 6. Tag p.i. (nach Infektion.) c Die Werte in Klammern beziehen sich auf den HIV-1-Stamm RF in C8166- Zellen.
Die Stilbendisulfonsäuren blockierten die Replikation von HIV-1, wenn die Verbindungen während der 2-stündigen Virusadsorption, d.h. vor der Viruspenetration, zugesetzt wurden und wenn die Zellen in Gegenwart der Inhibitoren gezüchtet wurden. Danach wurden die Verbindungen auf ihre antivirale Wirksamkeit in späteren Phasen des Infektionsprozesses untersucht. Bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 der infektiösen Einheiten/Zelle (GB8-Virus) zeigen sich virale Glycoproteine auf der Oberfläche von JM-Zellen innerhalb von 24 Stunden nach Infektion (p.i.) und initiieren die Fusion mit benachbarten CD4&spplus;-Zellen. Die Anzahl der Syncytien steht im Einklang mit der Produktion zellfreier Viren (Tyms et al., (1990)). Tabelle II zeigt, daß im Vergleich zur Viruskontrolle die Fusion durch Zugabe von 100 ug/ml DIDS und H&sub2;DIDS 24 Stunden nach Infektion vollständig unterdrückt war, wie durch Auswertung nach 52 Stunden und 68 Stunden nach Infektion festgestellt wurde. Wenn DIDS erst 43 Stunden nach Infektion Kulturen zugesetzt wurde, die eine erhebliche Anzahl von Syncytien enthielten, fehlten 68 Stunden nach Infektion diese Syncytien tatsächlich vollständig und hatten sich in mit H&sub2;DIDS behandelten Kulturen deutlich zurückentwickelt. Im Vergleich zur Viruskontrolle besaß SITS jedoch keine gegen die Syncytien gerichtete Wirksamkeit, obwohl das p24-Antigen etwas vermindert war, was auf eine geringere antivirale Wirkung hindeutete. Die relative Rangordnung der anthiralen Wirkung der Stilbendisulfonsäuren gegen bestehende HIV-1-Infektionen stimmt mit der Rangordnung überein, die bei akuten Infektionen festgestellt worden ist, d.h. DIDS > H&sub2;DIDS » SITS. Das deutet darauf hin, daß der antivirale Wirkungsmechanismus in späten und frühen Stadien der Infektion gleich ist. TABELLE II WIRKUNG VON DIDS, H&sub2;DIDS UND SITS AUF BESTEHENDE INFEKTIONEN VON HIV-1 (STAMM GB8) IN JM-ZELLEN Syncytien Verbindung Zeit der Zugabe (h)a Syncytienb zur Zeit der Zugabe p24-Antigen ng/ml h Medium ohne Medikament a Zeit bezogen auf Stunden p.i. (nach Infektion) b Durchschnittliche Syncytienanzahl (n=3) zum Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung. Während des Bebrütungszeitraums von 43 bis 52 Stunden p.i. erhöhte sich in den Kontrollen ohne Medikament die durchschnittliche Syncytienzahl von 9 auf 53 Syncytien pro Vertiefung. c Neg = kein Antigen nachgewiesen.
Die Bildung von Syncytienzellen hängt von der Wechselwirkung zwischen dem in den Membranen infizierter Zellen exprimierten gp 120 mit dem CD4- Antigen auf benachbarten Zellen ab (Camerini and Seed, (1990)). Zur Untersuchung der Wirkung der Stilbendisulfonsäuren auf den gp 120-CD4- abhängigen Fusionsprozeß nutzten wir ein Cokultivierungs-System von Zellen. Dieses System besteht darin, daß chronisch mit HIV-1 RF infizierte H9-Zellen (gp 120&spplus;-Zellen) mit nicht infizierten C8166-Zellen (CD4&spplus;-Zellen) als Fusionsindikator gemischt werden. Bei diesem Test trat die Zellfusion 2 bis 3 Stunden nach Vermischen bei 37ºC auf und eine erhebliche Syncytienbildung wurde nach weiteren 3 bis 4 Stunden festgestellt (Figur 1, Bild A). Die Behandlung der Zellen mit 100 ug/ml DIDS zum Zeitpunkt des Vermischens der Zellen verhinderte die Zellfusion vollständig (Bild B), während H&sub2;DIDS die Syncytienbildung nur teilweise verhinderte (nicht gezeigt). In einer Konzentration von 200 ug/ml besaß SITS keine Wirkung (Bild C), während DIDS in dieser Konzentration die C8166-Zellen 5 Tage lang nach dem Vermischen vollkommen schützte (nicht gezeigt). In Parallelexperimenten zeigten 10 ug/ml Dextransulfat mit einem MG von 500 000 (Bild E) ebenso wie DIDS eine vollständige Hemmwirkung, verglichen mit der nichtbehandelten Viruskontrolle (Bild D); 250 ug/ml Heparin (Bild F) und 100 ug/ml Dextransulfat mit einem MG von 8 000 (nicht gezeigt) waren jedoch vollkommen unwirksam. Diese Beobachtungen mit den sulfatierten Polysacchariden stimmten mit einem früheren Bericht überein (Montefiori et al., (1990)). Während sich Heparin und Dextransulfat mit einem MG von 8 000 als unwirksam bei der Blockierung der virusinduzierten Zellfusion bzw. des Zellabsterbens erwiesen, zeigten DIDS und H&sub2;DIDS somit eine deutliche antivirale Wirkung.
In den weiteren Experimenten wurden CD4&spplus;-C8166-Zellen über Nacht entweder mit DIDS (100 ug/ml), SlTS (100 ug/ml) oder einem medikamentenfreien Medium vorbehandelt. Die nicht adsorbierten Verbindungen wurden durch wiederholtes Waschen entfernt und chronisch infizierte H9-Zellen wurden danach zugegeben. Wie in den Figuren 2A und B gezeigt, konnte durch die Vorbehandlung mit SITS bzw. dem medikamentenfreien Medium die Syncytienbildung während des Beobachtungszeitraums von 6 Stunden nicht gestoppt werden. Im Gegensatz dazu blieben die mit DIDS behandelten Zellen frei von Syncytien (Figur 2C). Ebenfalls im Gegensatz dazu wurde keine Schutzwirkung festgestellt, wenn die Zellen mit Heparin oder mit Dextransulfat mit einem MG von 500 000 vorbehandelt wurden. Das Waschen der Zellen vor dem Mischen mit den H9- Zellen hob somit die Schutzwirkung auf (Figur 1, Bild E), die wie vorstehend beschrieben, bei ständiger Gegenwart von Dextransulfat mit einem MG von 500 000 im Test festgestellt worden war.
Die Menge an sulfoniertem Stilben der Formel 1, die zur Verhinderung der Syncytiumbildung in HIV-, HSV- oder CMV-infizierten Zellen benötigt wird, kann eine beliebige wirksame Menge sein. Die Anmelder haben experimentell ermittelt, daß die Anwendung sulfonierter Stilbene in einer Konzentration von 50 - 100 ug/ml sowohl zur vollständigen Hemmung der Syncytiumbildung als auch zum Absinken des P24-Antigens, eines Indikators der Replikation des HIV- Virus, unter 3,0 x 10² führt. Die Menge an sulfoniertem Stilben der Formel 1, die zur Behandlung sowohl von AIDS, ARC oder einer anderen, durch HIV verursachten Krankheit als auch von durch HSV- und CMV-Infektionen verursachte Krankheiten verabreicht werden muß, kann entsprechend der eingesetzten speziellen Dosierungseinheit, der Behandlungsdauer, dem Alter und Geschlecht des behandelten Patienten, der Art und dem Ausmaß der Krankheit sowie anderen, dem Fachmann wohl bekannten Faktoren stark variieren. Sulfonierte Stilbene der Formel 1 können außerdem in Verbindung mit anderen Mitteln, von denen bekannt ist, daß sie sich zur Behandlung retroviraler Krankheiten verwenden lassen, und in Verbindung mit Mitteln verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie sich zur Behandlung der Symptome von Krankheiten und Leiden, die durch Retroviren verursacht werden, sowie damit einhergehender Komplikationen verwenden lassen. Die zu verabreichende, antiviral wirksame Menge der Sulfonsäurestilbene der Formel 1 kann im allgemeinen von etwa 15 mg/kg bis zu 500 mg/kg reichen. Eine Dosiseinheit kann 25 bis 500 mg Sulfonsäurestilbene enthalten und kann ein- oder mehrmals pro Tag eingenommen werden. Die sulfonierten Stilbene der Formel 1 können zusammen mit einem pharmazeutischen Trägermittel unter Verwendung herkömmlicher Dosierungsformen entweder oral oder parenteral verabreicht werden.
Zur oralen Verabreichung können die sulfonierten Stilbene der Formel 1 als Fest- oder Flüssigpräparate formuliert werden, wie z.B. als Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Lutsch- und Schmelzbonbons, Pulver, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Eine Einheitsdosis in fester Form kann eine Kapsel mit normaler, harter oder weicher Gelatinehülle sein, enthaltend beispielsweise oberflächenaktive Mittel, Gleitmittel und inerte Füllstoffe, wie z.B. Lactose, Sucrose, Calciumphosphat und Maisstärke. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten hergestellt werden mit herkömmlichen Tablettengrundbestandteilen, wie z.B. Lactose, Sucrose und Maisstärke, in Kombination mit Bindemitteln, wie z.B. Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine, mit Sprengmitteln, die das Aufbrechen und die Auflösung der Tablette nach Verabreichung unterstützen sollen, wie z.B. Kartoffelstärke, Alginsäure, Maistärke und Guar-Mehl, mit Gleitmitteln, die den Fluß des Tablettengranulats verbessern und die Haftung des Tablettenmaterials an den Oberflächen der Tablettierprägestempel-Stanzen verhindern sollen, z.B. Talkum, Stearinsäure bzw. Magnesium-, Calcium- oder Zinkstearat, mit Farbstoffen, farbgebenden Stoffen und Geschmacksstoffen, die die ästhetischen Eigenschaften der Tabletten verbessern sollen und damit die Akzeptanz durch den Patienten erhöhen sollen. Geeignete Excipienten zur Verwendung bei oral verabreichten flüssigen Dosierungsformen umfassen Verdünnungsmittel, wie z.B. Wasser und Alkohole, z.B. Ethanol, Benzylalkohol und Polyethylenalkohole, entweder mit oder ohne Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen, oberflächenaktiven Mittels, Suspendiermittels oder Emulgators.
Die sulfonierten Stilbene der Formel 1 können auch parenteral verabreicht werden, d.h. subcutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, als Injektionslösungen der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Trägermittel, das eine sterile Flüssigkeit oder ein Gemisch von Flüssigkeiten sein kann, wie z.B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, ein Alkohol wie z.B. Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, ein Glykol, wie z.B. Propylenglykol oder Polyyethylenglykol, ein Glycerinketal, wie z.B. 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, ein Ether wie z.B. Polyethylenglykol 400, ein Öl, eine Fettsäure, ein Fettsäureester oder Glycerid, oder ein acetyliertes Fettsäureglycerid, mit oder ohne Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen oberflächenaktiven Mittels, wie z.B. einer Seife oder eines Detergens, eines Suspendiermittels, wie z.B. Pektin, ein Carbomer, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose, oder eines Emulgators und anderer pharmazeutischer Hilfsmittel. Geeignete Öle, die in erfindungsgemäßen, parenteral anzuwendenden Präparaten verwendet werden können, sind Petroleum, Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, z.B. Erdnußöl, Sojabohnenöl, Sesamöl, Baumwollsamenöl, Maisöl, Olivenöl, Petrolatum, und Mineralöl. Geeignete Fettsäuren umfassen Oleinsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure. Geeignete Fettsäureester sind beispielsweise Ethyloleat und Isopropylmyristat. Geeignete Seifen umfassen Fettsalze von Alkalimetallen, Ammonium und Triethanolamin. Geeignete Detergentien umfassen sowohl kationische Detergentien, z.B. Dimethyldialkylammoniumhalogenide, Alkylpyridinhalogenide und Alkylaminacetate; anionische Detergentien, z.B. Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate sowie Sulfosuccinate; nichtionische Detergentien, z.B. Fettaminoxide, Fettsäurealkanolamide und Polyoxyethylenpolypropylen-Copolymere; und amphotere Detergentien, z.B. Alkyl-beta-aminopropionate und quaternäre Ammoniumsalze von 2-Alkylimidazolin als auch Gemische davon. Die erfindungsgemäßen Mittel zur parenteralen Anwendung enthalten typischerweise etwa 0,5 bis etwa 25 Gew.% sulfonierte Stilbene in Lösung. Vorteilhafterweise können auch Konservierungsmittel und Puffer verwendet werden. Zur Minderung oder Beseitigung von Reizungen an der Injektionsstelle können die Mittel ein nichtionisches, oberflächenaktives Mittel mit einem hydrophilen-lipophilen Gleichgewicht (HLB) von etwa 12 bis etwa 17 enthalten. Die Menge des oberflächenaktiven Mittels in solchen Präparaten reicht von etwa 5 bis eiwa 15 Gew.%. Das oberflächenaktive Mittel kann ein einzelner Bestandteil mit dem vorstehenden HLB oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren Bestandteilen mit dem gewünschten HLB sein. Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die in Präparaten zur parenteralen Anwendung verwendet werden, sind die Klasse der Polyethylensorbitanfettsäureester, z.B. Sorbitanmonooleat und die Addukte hohen Molekulargewichts von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglykol gebildet werden.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1

Die Wirkung von Stilbendisulfonsäuren und verschiedenen sulfatierten Polysacchariden auf die virusinduzierte Zellfusion. Bei diesem Test wurden 10&sup5; chronisch mit dem HIV-1-Stamm RF infizierte H9-Zellen gemeinsam mit 10&sup5; nichtinfizierten C8166-Zellen in Gegenwart bzw. Abwesenheit der getesteten Verbindungen gezüchtet. Bild A: Positivkontrolle, keine Verbindung zugesetzt Bild B: 100 ug/ml DIDS; Bild C: 100 ug/ml SITS; Bild D: Positivkontrolle; Bild E: 10 ug/ml Dextransulfat mit einem MG von 500 000; Bild F: 250 ug/ml Heparin.

Figur 2

Die Vorbehandlung der CD4&spplus;-C8166-Zellen mit DIDS blockiert die Fusion mit chronisch infizierten H9-Zellen. Bei diesem Experiment wurden die C8166- Zellen über Nacht mit verschiedenen Stilbendisulfonsäuren oder medikamentenfreiem Medium (Fusionskontrolle) vorbehandelt. Die Zellen wurden gewaschen, mit chronisch infizierten H9-Zellen bebrütet und Syncytien wurden 6 Stunden nach Mischen fotografiert. Die Bedingungen der Vorbehandlung waren wie folgt: Bild A: 100 ug/ml SITS; Bild B: medikamentenfreies Medium; und Bild C: 100 ug/ml DIDS.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen. Die folgenden Informationen über Reagentien, Zellinien, Virusstämme und Testverfahren gelten für die Beispiele 1 -7.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Reagentien

4,4'-Diisothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure (DIDS), 4,4'- Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'-disulfonsäure (H&sub2;DIDS) und 4-Acetamido-4'- isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure (SITS) stammten von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Diese Verbindungen wiesen eine Reinheit von > 95% auf, wie durch HPLC-Analyse mit Umkehrphasen-Diodenanordnung festgestellt wurde; das System arbeitet mit einem HP1040-Detektor von Hewlett Packard, der an ein Trennsystem, Modell 130A (Applied Biosystems, Inc.), mit einer Umkehrphasen (C-8)-Säule Aquapore RP-300 (2,1 x 30 mm) gekoppelt ist.

CD4&spplus;-Zellinien und HIV-1-Stämme

Die verwendeten Zellinien waren die halbreife, menschliche, Lymphoblastenleukämie-T-Zellinie JM, die menschliche T-Lymphoblasten- Zellinie C8166, die menschliche Haut-T-Zell-Lymphomlinie H9 und die transformierte menschliche T-Zellinie MT-4. Stammkulturen der HIV-1-Stämme RF und GB8 (freundlicherweise von Dr. Graham Farrar, Center for Applied Microbiological Research, Porton Down, England, zur Verfügung gestellt) wurden aus chronisch infizierten H9-Zellen bzw. akut infizierten JM-Zellen hergestellt. Die Virusstammkulturen bestanden aus zellfreiem Wachstumsmedium (RPMI 1640-Medium plus 10% foetales Kälberserum), das gerade freigesetzte Viren enthielt. Die Virustiter wurden mittels eines Standard-Plaqueverminderungstests bestimmt.

Virusinfektionstestverfahren

Virusstammkulturen (Stämme RF oder GB8) wurden in Wachstumsmedium verdünnt, das verschiedene Konzentrationen von DIDS, H&sub2;DIDS oder SITS enthielt. Die erforderliche Anzahl von Zellen wurde dann sofort zugesetzt und bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,001 infektiösen Einheiten/Zelle ließ man den Virus 2 Stunden bei 37ºC adsorbieren. Die mit dem Virus infizierten Zellen wurden pelletiert, das Pellet wurde dreimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in frischem, geeignete Konzentrationen der Stilbendisulfonsäuren enthaltendem Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (Falcon) verteilt und wie nachstehend beschrieben auf Virusinfektion untersucht. In einer anderen Ausführungsform wurden die Zellen zuerst mit HIV-1 (Stämme RF oder GB8) 2 Stunden bei 37ºC bei der vorstehend genannten MOI infiziert. Nach ausgiebigem Waschen wurden die Zellen auf Platten mit frischem Wachstumsmedium übertragen, das verschiedene Konzentrationen von Stilbendisulfonsäuren enthielt. Bei den vorstehenden Experimenten wurden Syncytien 2 bis 4 Vage nach Infektion (p.i.) dreifach unter Verwendung eines Umkehr-Mikroskops CK2 von 0lympus ausgezählt. Die Kulturflüssigkeiten wurden 3 bis 5 Tage nach Infektion gewonnen, durch 5minütige Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (2000 Upm) aufgereinigt und in den Überständen wurde der Spiegel des HIV-1- Kernantigens p24 mit Hilfe eines p24-Antigen-ELISA-Verfahrens (Coulter) bestimmt. Die Konzentrationen der Stilbendisulfonsäuren, die eine 50%-ige Hemmung der HIV-1-Vermehrung (IC&sub5;&sub0;) zeigten, wurden aus den Dosis- Reaktionskurven mittels linearer Regressionsanalyse ermittelt.
Bei den Nachbehandlungsexperimenten wurden die Zellen zuerst mit dem HIV-1-Stamm RF oder GB8 2 Stunden bei 37ºC bei einer MOI von 0,01 infiziert. Danach ließ man sie entweder 24 oder 43 Stunden wachsen, bevor sie auf Kulturplatten mit frischem Wachstumsmedium übertragen wurden, das 100 ug/ml DIDS, H&sub2;DIDS oder SITS enthielt. Syncytien wurden dann 52 und 68 Stunden nach Infektion dreifach ausgezählt. In den Kulturflüssigkeiten wurde das Viruskernantigen p24 75 Stunden nach Infektion untersucht, wie vorstehend beschrieben.

Test auf antisyncytiale Wirkung

Nichtinfizierte CD4&spplus;-C8166-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen überimpft (2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung), die Wachstumsmedium und verschiedene Konzentrationen der getesteten Verbindungen enthielten. Mit dem HIV-1-Stamm RF chronisch infizierte H9-Zellen wurden gewaschen und dann als gp 120&spplus;-Zellausgangsmaterial in einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/Vertiefung zugegeben, außer bei der nichtcytopathischen Kontrolle: in diese Vertiefungen wurden nichtinfizierte H9-Zellen gegeben. Die Platten wurden danach bei 37ºC bebrütet. Die gemeinsam bebrüteten Zellen wurden 1 bis 6 Stunden nach Infektion untersucht. Syncytien wurden auf Fotofilmen dokumentiert.
Bei den Vorbehandlungsexperimenten wurden CD4&spplus;-C8166-Zellen in serumfreiem Medium (RPMI 1640-Medium plus 50 ug/ml menschliches Transferrin, 20 ug/ml Rinderinsulin, 2 mg/ml Rinderserumalbumin) gehalten und wurden dann der Verbindung durch Inkubation über Nacht ausgesetzt. Die behandelten Zellen wurden zweimal in frischem serumfreiem Medium gewaschen und danach gemeinsam mit chronisch infizierten H9-Zellen in serumfreiem Medium gezüchtet. Zellzahlen, Analysenbedingungen und die Auszählung der Syncytien waren ansonsten genauso, wie vorstehend beschrieben.

BEISPIEL 1

ANTIVIRALE WIRKUNG VON DIDS, H&sub2;DIDS UND SITS GEGEN HIV-1

Protokoll: JM-Zellen wurden mit HIV-1 bei einer Multiplizität der Infektion von 0,001 infiziert. Die Virusadsorption fand 2 Stunden bei Raumtemperatur statt. Die Zellen wurden gewaschen, in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte verteilt, die verschiedene Konzentrationen der getesteten Verbindungen enthielten, und bebrütet. Nach 2 Tagen wurden die Zellen untersucht und die Syncytien wurden ausgezählt. Die zellfreien Überstandsflüssigkeiten wurden 4 und 6 Tage nach Infektion geerntet und auf die Viruskernantigen p24-Spiegel untersucht. Zur Bestimmung der Anzahl infektiöser Viruspartikel wurden die Überstände nach 6 Tagen auch titriert. Ergebnisse: Verbindung & Konzentration Durchschnittliche Syncytienzahl 2 Tage p.i. % Kontrolle Viruskontrolle nicht nachgewiesen RÜCKTITRATION ZELLFREIER ÜBERSTÄNDE 6 TAGE NACH INFEKTION (SFUs)* VERBINDUNG Viruskontrolle nicht durchgeführt * Syncytienbildende Einheit; zellfreie Überstände aus virusinfizierten Zellen, die mit den angegebenen Konzentrationen der Verbindungen behandelt worden waren, wurden mit frischen, nichtinfizierten JM-Zellen bebrütet und die Syncytien wurden zur Bestimmung der Anzahl infektiöser Einheiten/ml ausgezählt. Diese Ergebnisse wurden mit den zellfreien Überständen aus virusinfizierten Zellkontrollen verglichen, die nicht medikamentös behandelt worden waren.

BEISPIEL 2

BEHANDLUNG VON HIV-1-INFIZIERTEN ZELLEN MIT DIDS, SITS UND ddC

Protokoll: JM-Zellen wurden mit HIV so infiziert, daß nach 3 Tagen etwa 100 Syncytien erhalten wurden. Die Virusadsorption erfolgte 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen und in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte in einer Konzentration von 1 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung verteilt. 24 Stunden nach Infektion wurde entweder DIDS (100 ug/ml), SITS (100 ug/ml) oder ddC (5 uM) in die Vertiefungen mit den infizierten Zellen gegeben. In einige Vertiefungen, die als Viruskontrollen dienten, wurde kein Medikament gegeben. 42 Stunden nach Infektion wurde in andere Vertiefungen entweder ddC (5 uM), SITS (100 ug/ml) oder DIDS (100, 50, 25, 12,5, 6,25 ug/ml) gegeben. Die Syncytien wurden 3 und 4 Tage nach Infektion ausgezählt. Zur Bestimmung des p24-Kernantigens wurden Überstandsflüssigkeiten nach 3 und 4 Tagen geerntet. Ergebnisse: Verbindung und Zeitpunkt der Zugabe Konzentration Durchschnittliche Syncytienzahl/Vertiefung 3 Tage p.i. pg/ml p24-Antigen 3 Tage p.i. % Kontrolle Viruskontrolle DIDS nach h SITS nach h ddC nach h wie Viruskontr. Verbindung Konzentration Durchschnittliche Syncytienzahl/Vertiefung 4 Tage p.i. pg/ml p24-Antigen 4 Tage p.i. % Kontrolle Viruskontrolle DIDS nach h SITS nach h ddC nach h wie Viruskontr.

BEISPIEL 3

GEGEN HIV GERICHTETE WIRKUNG VON DIDS, SITS UND H&sub2;DlDS

Protokoll: Mit dem HIV-1-Stamm RF chronisch infizierte H9-Zellen und nichtinfizierte C8166-Zellen wurden in Gegenwart von entweder DIDS, SITS, H&sub2;DIDS, Dextransulfat oder Heparin (100 ug/ml) gemischt. Die Zellen wurden nach 2, 3 1/2 und 5 1/2 Stunden untersucht und das Ausmaß der Zellfusion wurde quantifiziert. Ergebnisse: SYNCYTIEN VERBINDUNG KONZENTRATION nach h Viruskontrolle Heparin Dextransulfat

BEISPIEL 4

HEMMUNG DER DURCH HIV INDUZIERTEN ZELLFUSION NACH VORBEHANDLUNG DER NICHTINFIZIERTEN ZELLEN MIT DIDS, SITS UND H&sub2;DIDS

Protokoll: C8166-Zellen wurden 2,5 Stunden entweder mit DIDS, SITS oder H&sub2;DIDS (in Konzentrationen von 500 und 250 ug/ml) vorbehandelt. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen und mit H9-Zellen, die mit HIV-1 chronisch infiziert waren, gemischt. Die Zellfusion wurde nach 4 und 24 Stunden quantifiziert. Ergebnisse: SYNCYTIEN-BEWERTUNG VERBINDUNG KONZENTRATlON Viruskontrolle

BEISPIEL 5

GEGEN HIV GERICHTETE WIRKUNG VON DIDS, SlTS UND H&sub2;DIDS

Protokoll: Mit HIV-1 chronisch infizierte H9-Zellen und nichtinfizierte C8166- Zellen wurden in Gegenwart von entweder DIDS, SITS, H&sub2;DIDS, Dextransulfat, Heparin (in einer Konzentration von 100 ug/ml), OKT4 oder OKT4A (in einer 1/50 Verdünnung) gemischt. Die Zellen wurden nach 4 Stunden untersucht und das Ausmaß der Zellfusion wurde quantifiziert. OKT4 und OKT4A sind monoclonale Antikörper, die an das CD4-Zelloberflächenantigen binden. Ergebnisse: VERBINDUNG KONZENTRATION Syncytien nach 4 h Viruskontrolle Heparin Dextransulfat (8000) Dextransulfat (500 000)

BEISPIEL 6

WIRKUNG VON DIDS, H&sub2;DIDS UND SITS AUF BESTEHENDE HIV-1-INFEKTIONEN

Protokoll: JM-Zellen wurden mit HIV bei einer Multiplizität der Infektion von 0,00025 syncytienbildenden Einheiten pro Zelle infiziert. Die Virusadsorption erfolgte eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen und in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte in einer Konzentration von 2 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung verteilt. 0, 24, 43 und 51 Stunden nach Infektion wurde entweder DIDS, SITS oder H&sub2;DIDS (jeweils in einer Konzentration von 100 ug/ml) in die Vertiefungen gegeben. In einige Vertiefungen, die als Viruskontrollen dienten, wurde kein Medikament gegeben. Die Syncytien wurden 43, 52 und 68 Stunden nach Infektion ausgezählt. Die zellfreien Überstandsflüssigkeiten aus den Vertiefungen mit den Viruskontrollen wurden 33, 43, 51, 68 und 75 Stunden nach Infektion geerntet, während alle anderen Vertiefungen 75 Stunden nach Infektion abgeerntet wurden. Die Überstandsflüssigkeiten wurden dann auf das Viruskernantigen p24 untersucht. Ergebnisse: Zeitverlauf der Syncytienbildung und der p24-Antigenproduktion Zeit Durchschnittliche Syncytienzahl Stunden neg P24-Antigen (75 Stunden nach Infektion) (pg/ml) Zeit der Zugabe (Stunden) Verbindung Negativ Auszählungen der Syncytien VERBINDUNG Zeit der Zugabe (Stunden) Durchschnittliche Syncytienzahl h wie Viruskontrolle Viruskontrolle * Durchschnittliche Syncytienzahl zum Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung

BEISPIEL 7

WIRKUNG SULFONIERTER STILBENE AUF DIE VERMEHRUNG VON HSV UND CMV

Protokoll: Test auf Verminderung der Plaquezahl. Behandlung nach Adsorption während der Bebrütung. Ergebnisse bei HCMV: Verbindung Konzentration ug/ml Plaquezahlen Durchschnitt % Viruskontrolle Viruskontrolle Gancyclovir HSV 2 Verbindung Konzentration Plaquezahlen Durchschnitt % Viruskontrolle Viruskontrolle HSV 2 Verbindung Konzentration Plaquezahlen Durchschnitt % Viruskontrolle Viruskontrolle Acyclovir

Claims

1. Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung einer Virusinfektion durch HIV (menschliches Immunschwächevirus), HSV (Herpes-simplex-Virus) oder CMV (Cytomegalievirus), wobei die Verbindung die folgende Formel 1 hat

in der R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus -NH&sub2;, -NO&sub2;, -NCS, -CN und -NH-COCH&sub3;;

B die Gruppe -C=C- (cis oder trans), -C C- oder -CH&sub2;-CH&sub2;- bedeutet; und

M&sub1; und M&sub2; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation bedeuten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei B die Gruppe -C=C- bedeutet.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander -NCS oder -NH-COCH&sub3; bedeuten.

4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Sulfonylgruppen sich jeweils in der ortho-Stellung in bezug auf B befinden.

5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei M&sub1; und M&sub2; jeweils ein Wasserstoffatom oder ein Natriumatom bedeuten.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4,4'- Diisothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4,4'- Diisothiocyanatdihydrostilben-2,2'-disulfonsäure ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4- Acetamido-4'-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure ist.