DE3812181C2 - - Google Patents
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- DE3812181C2 DE3812181C2 DE19883812181 DE3812181A DE3812181C2 DE 3812181 C2 DE3812181 C2 DE 3812181C2 DE 19883812181 DE19883812181 DE 19883812181 DE 3812181 A DE3812181 A DE 3812181A DE 3812181 C2 DE3812181 C2 DE 3812181C2
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- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7004—Monosaccharides having only carbon, hydrogen and oxygen atoms
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- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
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- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
Description
Grundlage der Erfindung ist der Befund, daß die humanen
Immundefizienz Viren (HIV)-Proteine glykosyliert sind (S.
Chakrabarti et al., Nature 320: 535, 1986). Wie im Folgenden
gezeigt wird - und dies ist Gegenstand der Erfindung - können
Antikörper, gerichtet gegen Kohlehydrateinheiten, das Virus
inaktivieren und nicht mehr infektiös werden lassen. Es ist davon
auszugehen, daß auch im Menschen nach Bildung von Antikörpern
(gerichtet gegen Zuckereinheiten), die durch Injektion von Mono-
und/oder Polysacchariden induziert werden, das Virus inaktiviert
wird.
Als Antigen wurden die Naturprodukte, Mono- und Polysaccharide,
die auch durch chemische Methoden modifiziert worden sind,
eingesetzt.
Die Substanzen können folgende Gruppen von organischen
Zusammensetzungen umfassen:
(1) Natürlich vorkommende Mono- und Polysaccharide:
Besonders aus Pflanzensamen, Mikroben, Hefen und Pilzen können Mono- und Polysaccharide nach eingeführten Verfahren isoliert werden (zusammengefaßt bei: I. C. M. Dea und A. Morrison, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 31: 241, 1975; S. A. Barker und G. Zweifel, Chemistry and Industry p. 330, 1957). Die gewonnenen Mono- und Polysaccharide werden in die Gruppen z. B. Glucomannane, Mannane und Galaktane eingeteilt.
Besonders aus Pflanzensamen, Mikroben, Hefen und Pilzen können Mono- und Polysaccharide nach eingeführten Verfahren isoliert werden (zusammengefaßt bei: I. C. M. Dea und A. Morrison, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 31: 241, 1975; S. A. Barker und G. Zweifel, Chemistry and Industry p. 330, 1957). Die gewonnenen Mono- und Polysaccharide werden in die Gruppen z. B. Glucomannane, Mannane und Galaktane eingeteilt.
(2) Modifizierte Mono- und Polysaccharide:
(a) Chemisch quervernetzte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei das von N. M. Young und M. A. Leon (Carbohydr. Res. 66: 299, 1978) erwähnt, bei dem polymere oder monomere Saccharide durch Divinylsulfon nach Laugenbehandlung chemisch modifiziert werden. Zum Beispiel kann mit diesem Verfahren Mannose (Monomer) oder Gummi arabicum (Polymer: Gummiharz enthaltend Arabinsäure aus afrikanischen Acacia-Arten) quervernetzt werden.
(b) Chemisch modifizierte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei die Kopplung von Monosacchariden an Serumalbumin (z. B. Immunglobulin vom Mensch) nach der Methode von C. R. McBroom et al. (Meth. Enzymol. 28: 212, 1972). Bei diesem Verfahren wird z. B. p-Nitrophenyl-alpha-L-Fukopyranosid in Anwesenheit von Natrium-Carbonat und Albumin reagieren lassen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt gelchromatographisch gereinigt.
(a) Chemisch quervernetzte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei das von N. M. Young und M. A. Leon (Carbohydr. Res. 66: 299, 1978) erwähnt, bei dem polymere oder monomere Saccharide durch Divinylsulfon nach Laugenbehandlung chemisch modifiziert werden. Zum Beispiel kann mit diesem Verfahren Mannose (Monomer) oder Gummi arabicum (Polymer: Gummiharz enthaltend Arabinsäure aus afrikanischen Acacia-Arten) quervernetzt werden.
(b) Chemisch modifizierte Mono- und Polysaccharide. Als ein Verfahren sei die Kopplung von Monosacchariden an Serumalbumin (z. B. Immunglobulin vom Mensch) nach der Methode von C. R. McBroom et al. (Meth. Enzymol. 28: 212, 1972). Bei diesem Verfahren wird z. B. p-Nitrophenyl-alpha-L-Fukopyranosid in Anwesenheit von Natrium-Carbonat und Albumin reagieren lassen. Anschließend wird das Reaktionsprodukt gelchromatographisch gereinigt.
Aus diesen Gruppen wurden zur Untersuchung über deren
pharmakologische Wirkung ausgewählt:
1. Galaktomannan (ab jetzt abgekürzt Gal): Die Herstellung von Gal wurde in der Publikation von P. A. J. Gorin et al. (Carbohydr. Res. 11: 387, 1969) beschrieben.
Herstellungsmethode: Galacto-Mannan wird von Gummi arabicum gewonnen. Die Samen werden gemahlen zu einem feinen Pulver. Das gummiähnliche Material wird extrahiert mit Wasser oder wäßriger NaOH-Lösung. Der lösliche Anteil des gummiähnlichen Materiales wird dann durch Zentrifugation abgetrennt und die Polysaccharide entfernt durch Präzipitation mit Äthanol.
1. Galaktomannan (ab jetzt abgekürzt Gal): Die Herstellung von Gal wurde in der Publikation von P. A. J. Gorin et al. (Carbohydr. Res. 11: 387, 1969) beschrieben.
Herstellungsmethode: Galacto-Mannan wird von Gummi arabicum gewonnen. Die Samen werden gemahlen zu einem feinen Pulver. Das gummiähnliche Material wird extrahiert mit Wasser oder wäßriger NaOH-Lösung. Der lösliche Anteil des gummiähnlichen Materiales wird dann durch Zentrifugation abgetrennt und die Polysaccharide entfernt durch Präzipitation mit Äthanol.
Die spezifische Drehung des Produktes, das noch wenig Galactose
enthält, beträgt etwa -31,5°. Die Reinigung des rohen Galacto-
Mannan-Präparates wird erreicht durch Präzipitation mit Äthanol
und/oder Präzipitation in Form eines Kupfer oder Barium-Komplexes.
Die spezifische Drehung beträgt in der Regel dann =23°.
2. Hefe-Mannan (ab jetzt abgekürzt Man): Die Herstellung von Man wurde in der Publikation von W. N. Haworth et al. (Chem. Soc. p. 784, 1937) beschrieben.
Herstellungsmethode: Bäckerhefe wird für 8 Std. in Anwesenheit von gewöhnlich 6% NaOH-Lösung gekocht. Anschließend wird die Lösung zentrifugiert und der klare Überstand konzentriert. Nach Ansäuerung durch Zugabe von Natrium-Acetat wird die Lösung zentrifugiert. Drei Schichten erscheinen: 1. eine klebrige, solide Schicht im oberen Teil der Röhrchen, 2. eine klare Flüssigkeit und 3. ein unteres, granuläres Präzipitat. Schicht 1. und 3. werden kombiniert und in Anwesenheit von Essigsäure gerührt und anschließend zentrifugiert. Die klare Lösung wird, kombiniert mit Phase 2, filtriert durch Glaswolle, neutralisiert mit NaOH und konzentriert. Zusatz von Alkohol führt zu der Präzipitation von Roh-Mannan, welches abgetrennt und mit Äthanol nachgewaschen wird. Das Material wird in Wasser aufgelöst, die Lösung leicht alkalisch gemacht und Fehling'sche Lösung zugesetzt, bis die Farbe der Flüssigkeit tief blau wird. Das gebildete Präzipitat wird gründlich mit warmem Wasser gewaschen, dann mit HCl angesäuert und langsam gerührt, bis der Ansatz eine grün-graue Färbung erhält. Wenn der gesamte Mannan-Kupfer-Komplex sich aufgelöst hat, wird weitere Säure hinzugegeben und die Lösung in Alkohol geschüttet. Dabei bildet sich ein Präzipitat, das gewaschen wird mit Alkohol, anschließend wieder in Wasser gelöst wurde und erneut repräzi piert wird mit Alkohol. Das Präzipitat des Mannans wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet bei 50°C. Gewöhnlich wird 100 g Mannan aus 7 kg Bäckerhefe gewonnen. Brechung [α]20° /D+73°C in Wasser.
2. Hefe-Mannan (ab jetzt abgekürzt Man): Die Herstellung von Man wurde in der Publikation von W. N. Haworth et al. (Chem. Soc. p. 784, 1937) beschrieben.
Herstellungsmethode: Bäckerhefe wird für 8 Std. in Anwesenheit von gewöhnlich 6% NaOH-Lösung gekocht. Anschließend wird die Lösung zentrifugiert und der klare Überstand konzentriert. Nach Ansäuerung durch Zugabe von Natrium-Acetat wird die Lösung zentrifugiert. Drei Schichten erscheinen: 1. eine klebrige, solide Schicht im oberen Teil der Röhrchen, 2. eine klare Flüssigkeit und 3. ein unteres, granuläres Präzipitat. Schicht 1. und 3. werden kombiniert und in Anwesenheit von Essigsäure gerührt und anschließend zentrifugiert. Die klare Lösung wird, kombiniert mit Phase 2, filtriert durch Glaswolle, neutralisiert mit NaOH und konzentriert. Zusatz von Alkohol führt zu der Präzipitation von Roh-Mannan, welches abgetrennt und mit Äthanol nachgewaschen wird. Das Material wird in Wasser aufgelöst, die Lösung leicht alkalisch gemacht und Fehling'sche Lösung zugesetzt, bis die Farbe der Flüssigkeit tief blau wird. Das gebildete Präzipitat wird gründlich mit warmem Wasser gewaschen, dann mit HCl angesäuert und langsam gerührt, bis der Ansatz eine grün-graue Färbung erhält. Wenn der gesamte Mannan-Kupfer-Komplex sich aufgelöst hat, wird weitere Säure hinzugegeben und die Lösung in Alkohol geschüttet. Dabei bildet sich ein Präzipitat, das gewaschen wird mit Alkohol, anschließend wieder in Wasser gelöst wurde und erneut repräzi piert wird mit Alkohol. Das Präzipitat des Mannans wird mit Alkohol gewaschen und getrocknet bei 50°C. Gewöhnlich wird 100 g Mannan aus 7 kg Bäckerhefe gewonnen. Brechung [α]20° /D+73°C in Wasser.
Es wird nun beschrieben, daß Antikörper, die gegen Mannose oder Galaktose gerichtet sind,
immunprophylaktische und
immuntherapeutische Eigenschaften besitzen. Diese Eigenschaften
waren bisher unbekannt. Der Erfindung liegt die Aufgabe
zugrunde, einen erfolgsversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS
bzw. ARC mit Hilfe von gegen Mannose oder Galaktose gerichteten
Antikörpern aufzuzeigen.
AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), auch
Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic Virus vom Typ III (HTLV-III)
oder Lymphadenophathy-Associated Virus (LAV) genannt, verursacht.
HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die
Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen
AIDS in Form des Kaposi-Sarcoms (KS) oder des ARC sich klinisch am
schwersten manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung
von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nicht möglich.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Anitkörper, die gegen
Mannose oder Galaktose gerichtet sind, zur Bekämpfung von AIDS
oder des ARC sehr geeignet sind. Inhalt dieser Erfindung ist der
Nachweis, daß die Antikörper
(nach Induktion von Antikörper im Organismus gegen
diese Substanzen) einen anti-HIV Effekt bewirken.
Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im
allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als
Dosiseinheiten vorliegen und parenteral (intramuskulär, intravenös
und subukutan) verabreicht werden können.
Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung
oder Verbesserung von AIDS oder ARC wirksame oder immundefekt-
beseitigende Menge wenigstens einer Verbindung aus der Klasse der
natürlichen und/oder modifizierten Mono- oder Polysaccharide,
gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige
pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer
erfindungsgemäß verwendeten Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen
Träger.
Wenn das Mittel in einer Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält
diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung
kommenden Verbindung.
Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in
Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur
Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen
pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer
wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen
Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen
Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10
Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem
Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin,
Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon
besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung
nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die
sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich
sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand
üblicher Verfahren, beispielsweise durch Sterilfiltration und
Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der
erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in
Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie
Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA
(Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Benzylalkohol oder
Natriumhydroxyd zur Einstellung des pH.
Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC umfaßt die
Verabreichung einer therapeutisch (antiviral, immuntherapeutisch
und/oder immunprophylaktisch) wirksamen Menge von gegen Mannose oder Galaktose gerichteten Antikörper
an einen
Patienten, der dieser Behandlung bedarf.
Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen
Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der
Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten anhand
einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles
durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und
der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und
die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im
allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10,
insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.
Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der
Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen,
beispielsweise 4 bis 8 Wochen.
Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken
auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus
(HIV), und sie wirken stimulierend auf das Immunsystem, so daß die
körpereigenen Abwehrkräfte gegen AIDS, ARC und verwandte
Erkrankungen gestärkt werden. Diese Verbindungen sind deshalb zur
immuntherapeutischen und immunprophylaktischen Behandlung der
durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.
Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden
Verbindungen wird nachfolgend am Beispiel von Man und Gal anhand
pharmakologischer in vivo/in vitro-Testsysteme untersucht.
Die Einzelheiten sind in dem Artikel, der in der Zeitschrift AIDS-
Forschung erschienen ist (Jg. 5; Seite 78-82; 1990), angegeben.
Die Antikörper wurden nach dem üblichen Verfahren gezogen (Ref.:
A. Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry; Springer-Verlag,
Berlin, 1979; Seite 210-214). Weiße Kaninchen wurden 1mal mit 0,5
mg Gal oder Man mit komplettem Freundschen Adjuvant behandelt. In
der 2., 4. und 6. Woche wurden die Tiere mit der gleichen Dosis an
Man oder Gal, aber dieses Mal mit inkomplettem Freundschen
Adjuvant, behandelt.
Anschließend wurde das Serum gewonnen und die Immunglobuline nach
dem üblichen Verfahren durch Ionenaustauschchromatographie an
Diethylaminoethyl-Zellulose gereinigt (Ref.: A. Nowotny; siehe
oben; Seite 8-12). Die gereinigten Antikörper gegen Man (ab jetzt
abgekürzt anti-Man) waren Antikörper der Klasse IgM und diejenigen
gegen Gal gerichtet (ab jetzt abgekürzt anti-Gal) konnten der
Klasse IgG zugeordnet werden. Der Titer (diejenige Verdünnung an
Antiserum, bei der noch eine Präzipitation mit dem Antigen im
Difussionsansatz zu erkennen war) wurde nach der Ouchterlony-
Methode (O. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26: 507,
1949) semiquantitativ bestimmt. Der Titer für anti-Man lag bei
1064 und für anti-Gal bei 512.
Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine
klonierte OKT4⁺ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS-Virus der
Isolatbezeichnung HTLV-IIIB (zugehörig zu HIV-1) vermehrt (M.
Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed und R. C. Gallo; Science 224,
497-500, 1984).
Assaybedingungen für die Reverse Transkriptase:
Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 5 mM DTT, 10 mM Mgl₂, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01% Triton X- 100 (C8H17-C6H4-(OCH2CH2)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)15.(A)n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H-Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA-Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem Scintillationszähler bestimmt.
Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 5 mM DTT, 10 mM Mgl₂, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01% Triton X- 100 (C8H17-C6H4-(OCH2CH2)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)15.(A)n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H-Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA-Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem Scintillationszähler bestimmt.
H9-Zellen (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed, R. C. Gallo,
Science: 224, 497-500, 1984) wurden mit Polybren (im Handel
erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C
behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HTLV-III-
Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic,
vgl. oben) pro 4×100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit
Antikörper (anti-Man oder anti-Gal) behandelter Teil dieser Proben
wurde als positive Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den
Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender
Verbindung (anti-Man oder anti-Gal) gegeben wurden. Die HTLV-III
Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben
beschrieben analysiert.
Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol : Aceton (1 : 1)
fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der
Maus) gegen HTLV-III p17 (Gag-Protein mit MG=17 000) und p24
(Gag-Protein mit MG=24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine
sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln in
den Zellen anzeigen. Die HTLV-III infizierten Zellen wurden mit
oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert.
Nach der Fixierung mit Methanol-Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei
Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern
bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper
wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer
Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der
0,25% Triton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann
1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege-Antimaus IgG (Capell
Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100
enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%iges
Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss-
Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
H9-Zellen sowie mit HTLV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer
Konzentration von 0,2×1 000 000 Zellen/ml Kulturmedium zum
Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4tägiger Inkubation
betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3×1 000 000 Zellen/ml, während
die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten H9-Zellen lediglich 0,5×
1 000 000 Zellen/ml war, diese beiden Werte bildeten die
Kontrollwerte.
Dann wurden Proben von H9-HTLV-IIIB-Zellen 0,2×1 000 000
Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von anti-
Man und anti-Gal behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse
erhalten:
Es ist ersichtlich, daß anti-Man (und anti-Gal) in den
Konzentrationen von zwischen 256 und 512 (128 und 256)
Titereinheiten/ml die Wachstumsrate von H9-HTLV-IIIB-Zellen
auf Werte steigert, die im Bereich der Kontrolle (1 300 000
Zellen/ml), nämlich der H9-Zellen ohne HTLV-IIIB liegen.
Es wurde untersucht, ob die 4tägige Zugabe von anti-Man oder anti-
Gal zu H9-HTLV-IIIB-Zellen die Produktion von HTLV-III-Viren
einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die
Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen
Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse
sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HTLV-IIIB-Zellen, die
nicht mit anti-Man oder anti-Gal behandelt wurden, eine
beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die
Zugabe von anti-Man oder anti-Gal führte zu einer dosisabhängigen
Verringerung der Reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand.
Bereits bei der Dosis von 256 (128) an anti-Man (anti-Gal)
Titereinheiten/ml wurde eine nahezu komplette Inhibierung
beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden
Verbindungen, die die Antikörperbildung induzierten, sind deshalb
in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu
inhibieren, bei denen verschiedene in vitro-Parameter,
beispielsweise das Zellwachstum, nicht nachteilig beeinflußt
werden.
Es hat sich gezeigt, daß anti-Man und anti-Gal eine stark
inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p24 und p15 in
infizierten H9-Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem
HTLV-IIIB-Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung
kultiviert wurden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie
mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur
Expression des p24 und p15-Proteins. Nach Inkubierung der H9-HTLV-
IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe
vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende
Ergebnisse erhalten:
Es ist ersichtlich, daß anti-Man und anti-Gal eine signifikante
Reduktion der Expression der HTLV-III-Proteine p15 und p24
verursachen.
Experimentelle Einzelheiten sind in dem Artikel, der in der
Zeitschrift AIDS-Forschung erschienen ist (Jg. 5; Seite 78-82;
1990), angegeben.
Wir untersuchten, ob das Anti-Mannan-Antiserum und der daraus
isolierte Antikörper in der Lage ist, die HIV-induizierte Zell-
Synzytienbildung zu blockieren. Um zu bestimmen, ob der
neutralisierende Effekt nur auf HTLV-IIIB-Isolate beschränkt ist,
wurden Untersuchungen mit einem weiteren Isolat, D34,
durchgeführt. Als Maß wurde der Grad der Synzytienbildung
genommen. Das Antiserum (Antikörper) gegen Mannan unterdrückte die
Synzytien-Bildung bei einer Verdünnung (Konzentration) von 1 : 18
(10 µg/ml) völlig (Tabelle). Ein Präimmunserum, ein adsorbiertes
Antiserum oder die daraus isolierten Antikörper hatten keinen
Effekt auf die Synzytienbildung.
Die Experimente zur Untersuchung der Neutralisierung von HIV-1
durch Anti-Mannan-Antiserum und -Antikörper wurden wie folgt
durchgeführt: Periphere Blutzellen (1 ml-Ansätze) wurden in RPMI
1640 Medium, das 20% FCS enthielt, bei einer Endkonzentration von
2×10⁵ Zellen/ml inkubiert. Die Sera oder die Antikörper wurden 1
Stunde vor Zugabe des HIV-1-Isolates D34 hinzugefügt; die
Multiplizität der Infektion war 0,01. Nach 3tägiger Inkubation
wurden die Kulturen mikroskopisch nach HIV-induzierter
Synzytienbildung ausgewertet. Die Synzytienbildung wurde
semiquantitativ bestimmt: -, keine Synzytien; +, seltene kleine
Synzytien; ++, mittelgroße Synzytien; +++, große Synzytien:
In einer weiteren Reihe von Experimenten wurde der Einfluß des
Antiserums und der Antikörper auf die Synthese der virus-
spezifischen mRNA in HIV-1 infizierten H9-Zelen untersucht. Es
wurde gefunden, daß sowohl das Anti-Mannan-Antiserum als auch die
Anti-Mannan-Antikörper die Transkription des pol-Gens effizient
verhindern.
Um festzustellen, an welches Protein die von uns hergestellten
Anti-Mannan-Antikörper binden, wurden Western-Blot-Untersuchungen
durchgeführt. Gereinigte HIV-1-Virus-Antigene wurden durch
Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt und dann auf
Nitrozellulose transferiert. Mit Hilfe des Serums eines HIV-1-
infizierten Patienten konnte das normale Protein-Muster des HIV-1
erkannt werden. Durch Inkubation des Blots mit Anti-Mannan-
Antikörpern konnte nur gp120/gp160 sichtbar gemacht werden. In
Kontrollexperimenten mit Anti-Mannan-Antikörpern, die an Mannan
adsorbiert oder mit gereinigtem gp120 vorbehandelt worden waren,
konnte keine Immunkomplexbildung beobachtet werden; dies
deutet darauf hin, daß die Bindung der Anti-Mannan-Antikörper an
gp120/gp160 spezifisch ist.
Um festzustellen, ob die Antikörper an das Proteingerüst oder den
Kohlenhydrat-Anteil des gp120 binden, wurde das gp120-Molekül
gereinigt und mit Hilfe der Western-Blot-Technik entweder vor oder
nach Vorbehandlung mit Endoglykosidase F auf seine Binde-Affinität
zu den Anti-Mannan-Antikörpern hin untersucht. Die Ergebnisse
zeigten, daß die Antikörper nur an intaktes gp120 nicht aber an
die völlig deglykosylierte 48-60 kDa Form banden. Um diese Befunde
zu erhärten, wurden Immunpräziipitationsexperimente durchgeführt.
Die Anti-Mannan-Antikörper präzipitierten intaktes, metabolisch
markiertes gp120, sowie die Endoglykosidase F behandelte gp120-
Präparation, die sowohl den Protein- als auch den Kohlenhydrat-
Anteil des gp120 erhält. Es konnte jedoch keine Präzipitation
festgestellt werden, wenn die 58-60 kDa Form des gp120 oder ein
Überschuß an Glykanen, isoliert aus gp120, zu dem intakten gp120
hinzugefügt wurden. Daher ist es sehr wahrscheinlich, daß die in
der vorliegenden Studie benutzten Antikörper nur gegen die
Kohlenhydratstruktur des gp120 gerichtet sind.
Der Wirkmechanismus von anti-Man und anti-Gal als Inhibitor
der HIV-Vermehrung wurde als Hemmung der Assoziation von HIV-Proteinen
mit T4-Zellen (Lymphozyten erkannt). Diese Assoziation ist
notwendig für eine Infektion der Zielzelle (Ref.: R. C. Gallo et
al., Progr. Allergy 37: 1, 1986).
Die Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt:
2 500 000 menschliche Blut-Lymphozyten wurden in 1 ml Ansätzen mit ¹²⁵-Jod-radioaktivmarkiertem HIV-Protein (Markierung nach: A. C. Cuello et al., In: Immunohistochemistry. A. C. Cuello, Herausgeber. John Wiley & Sons, Inc. New York; Seite 214-256; 1983) in physiologischer Kochsalzlösung entsprechend früheren Angaben (M. Gramzow et al., J. Cell Biol. 102: 1344, 1986) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von dem Protein abgetrennt; nach dem Verfahren von G. Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660; 1949) wurde die Anzahl der Bindungsstellen für HIV-Proteine an Lymphozyten bestimmt. Die Ergebnisse ergaben folgende Werte:
2 500 000 menschliche Blut-Lymphozyten wurden in 1 ml Ansätzen mit ¹²⁵-Jod-radioaktivmarkiertem HIV-Protein (Markierung nach: A. C. Cuello et al., In: Immunohistochemistry. A. C. Cuello, Herausgeber. John Wiley & Sons, Inc. New York; Seite 214-256; 1983) in physiologischer Kochsalzlösung entsprechend früheren Angaben (M. Gramzow et al., J. Cell Biol. 102: 1344, 1986) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von dem Protein abgetrennt; nach dem Verfahren von G. Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660; 1949) wurde die Anzahl der Bindungsstellen für HIV-Proteine an Lymphozyten bestimmt. Die Ergebnisse ergaben folgende Werte:
Ergebnis: Hemmung der Bindung durch anti-Man und anti-Gal.
Die durch anti-Man und anti-Gal bewirkte Hemmung der Bindung
von HIV-Proteinen an Lymphozyten ist durch dieses Experiment
erwiesen.
In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff
jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden
Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen
erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.
Zur intramuskulären Injektion:
5 ml Ampullen 100 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
max. 0,5 mg p-(Athyl-mercurithio)benzolsulfonsäure, Natrium-Salz
5 ml Ampullen 100 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
max. 0,5 mg p-(Athyl-mercurithio)benzolsulfonsäure, Natrium-Salz
Zur intramuskulären Injektion: 5 ml Ampullen
max. 7,5 mg Phenol
max. 7,5 mg Phenol
Zur intravenösen Applikation:
10 ml Flaschen 250 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
5 mg Natriumchlorid auffüllen mit Aqua ad iniectabilia, pyrogenfrei.
10 ml Flaschen 250 mg Aminoessigsäure (Glykokoll) als Stabilisator
5 mg Natriumchlorid auffüllen mit Aqua ad iniectabilia, pyrogenfrei.
Claims (1)
- Verwendung von gegen Mannose oder Galaktose gerichteten Antikörpern zur Behandlung von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) oder ARC (AIDS-related Complex).
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883812181 DE3812181A1 (de) | 1988-04-13 | 1988-04-13 | Arzneimittel, enthaltend natuerliche und/oder chemisch modifizierte mono- oder polysaccharide und deren verwendung |
PCT/EP1989/000399 WO1989009601A2 (fr) | 1988-04-13 | 1989-04-13 | Monosaccharides ou polysaccharides utilises en tant qu'agents antiviraux |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883812181 DE3812181A1 (de) | 1988-04-13 | 1988-04-13 | Arzneimittel, enthaltend natuerliche und/oder chemisch modifizierte mono- oder polysaccharide und deren verwendung |
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DE3812181C2 true DE3812181C2 (de) | 1993-06-17 |
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EP0240098A3 (de) * | 1986-04-04 | 1989-05-10 | Kabushiki Kaisha Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo | Oligo und Polysaccharide zur Behandlung von Krankheiten verursacht durch Retroviren |
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1988
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