FR3045668A1 - Procede de bioproduction de dextrane en milieu salin - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d'incubation d'une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose et au moins 0,1 % en poids de NaCl par rapport au poids total dudit milieu aqueux.

Description

La présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextranes. Elle concerne également une composition comprenant lesdits dextranes et ses utilisations, en particulier comme fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.

Les dextranes et les dérivés de dextranes ont un nombre d’applications industrielles croissant.

Par exemple, les dextranes de masse molaire faible ou moyenne (allant généralement de 1 à 70 kDa) sont notamment utilisés pour des applications analytiques, par exemple comme supports versatiles de chromatographie, dans le domaine médical, par exemple en tant qu’extenseur du plasma sanguin grâce à leur faible caractère antigénique et leur faible viscosité en solution saline, transporteur de fer ou anticoagulant (après fonctionnalisation), dans la prévention des chocs post-opératoires, dans le traitement des brûlures ou dans la réduction de risques de thrombose ou d’embolies.

Pour leur part, les dextranes de masse molaire plus élevée sont particulièrement intéressants pour leur viscosité élevée.

Sauf indication contraire, on entend par « masse molaire » ou « masses molaires moyennes », dans la présente invention, la masse molaire moyenne en poids.

Un des modes de préparation de ces dextranes est la voie enzymatique utilisant les glucane-saccharases.

Les glucane-saccharases d’origine bactérienne sont des transglucosylases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’a-glucanes formés d’unités glucosyle. Les glucane-saccharases présentent des spécificités de produits différentes, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées (a-1,2 ; a-1,3 ; a-1,4 ou a-1,6), que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés.

Parmi les glucane-saccharases, les dextrane-saccharases produisent du dextrane présentant de manière générale au moins 50 % de liaisons osidiques a-1,6 dans la chaîne principale, et des ramifications en a-1,2, a-1,3 et/ou a-1,4. Le taux de ramifications ainsi que leur arrangement spatial varient suivant l’enzyme productrice.

Il existe en particulier des glucane-saccharases permettant d’accéder à des dextranes de masse molaire très élevée, notamment supérieure à 105 kDa.

La souche Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F est un des microorganismes les plus utilisés depuis de nombreuses années pour la production industrielle de dextranes de haute masse molaire, allant de 103 à plus de 105 kDa. L’enzyme responsable de cette synthèse est la dextrane-saccharase appelée DSR-S. Cet homopolymère de glucose présente 95 % de liaisons glucosidiques α-1,6 et 5 % de liaisons glucosidiques a-1,3 (Monchois et al., Applied Microbiology and Biotechnology, October 1997, vol 48, Issue 4, 465-472).

Le gène codant pour la DSR-S a pu être cloné chez Escherichia coli (Monchois et al., Applied Microbiology and Biotechnology, October 1997, vol 48, Issue 4, 465-472 et Moulis et al, FEMS Microbiology Letters, August 2006, vol 261, Issue 2, 203-210), permettant la construction de différents variants de DSR-S. Notamment, des formes tronquées au niveau des domaines N et C-terminal de DSR-S synthétisent, directement à partir du saccharose, des dextranes de masses molaires contrôlées de 4,1.105 kDa, 40 kDa ou 1 kDa. L’un d’entre eux, dénommé DSR-S Δ4Ν et produit sous forme recombinante par Escherichia coli, catalyse, à partir du saccharose, la synthèse d’un dextrane de masse moléculaire évaluée à 4,1.105 kDa et constitué de 96 % de liaisons a-1,6 et 4 % de liaisons a-1,3. La solution de dextrane obtenue avec DSR-S Δ4Ν présente une viscosité supérieure d’un facteur 10 à 100 selon la contrainte de cisaillement appliquée par rapport à celle obtenue avec l’enzyme DSR-S, et présente un comportement rhéofluidifîant. Le dextrane obtenu avec DSR-S Δ4Ν s’avère donc particulièrement intéressant pour des applications dans le domaine des agents texturants et viscosifiants.

Toutefois, la mise en œuvre de ces enzymes requiert le plus souvent des conditions d’incubation très particulières, qui sont rarement adaptées à une mise en œuvre directement sur le site et/ou dans le milieu dans lequel rutilisation des dextranes est envisagée.

Ainsi, les milieux salins, comme l’eau de mer, sont en effet généralement reconnus comme inhibant l’activité de ces enzymes, en raison de leur teneur en NaCl et en particulier en ions chlorure. Il a en effet été observé que les ions chlorure sont des inhibiteurs de l’activité d’enzymes (voir notamment Degli Agosi et al. Biochem. Int. 1992, 26(4), 707-713, et Barber et al. Plant Physiol. 1989, 90, 70-64).

Or, l’utilisation de solution aqueuse de dextranes de masse molaire élevée est intéressante comme fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.

En effet, la récupération assistée du pétrole brut présent dans une formation rocheuse s'effectue généralement en plusieurs étapes. La première phase de production résulte de l'énergie naturelle du pétrole en place qui s'écoule librement. Cette récupération primaire représente en général de 5 % à 20 % de la quantité moyenne de pétrole présente dans la formation rocheuse. Lorsque la pression diminue et que l'extraction devient plus difficile, il devient nécessaire de mettre en œuvre d'autres phases de production, appelées méthodes de récupération secondaire et tertiaire. Ces méthodes consistent à injecter sous pression dans la formation souterraine un fluide d'injection via un puits d'injection. Du fait de ses propriétés d'immiscibilité avec le pétrole, le fluide d'injection pousse le pétrole vers les puits de production. Cette technique est appelée récupération assistée de pétrole (EOR pour Enhanced Oil Recovery en anglais) et elle permet généralement de récupérer de 25 % à 75 % du pétrole en présence. Dans la récupération secondaire, on injecte un liquide aqueux tel que de la saumure ou de l'eau douce dans un puits, tandis que dans le cadre de la récupération tertiaire, des additifs ont été mélangés avec le fluide d'injection aqueux préalablement aux étapes d'injection. L’utilisation des dextranes de l’invention est envisagée dans le cadre de la récupération tertiaire, en raison de leur capacité viscosifiante élevée. L’utilisation des dextranes de l’invention est également envisagée pour les fluides de forage pétrolier, notamment mis en œuvre pour construire les puits, et dans les fluides de fracturation, notamment mis en œuvre pour créer et maintenir ouvertes les fissures dans la formation rocheuse. Dans ce dernier cas, la capacité de ces dextranes à former des gels par simple réticulation avec des réticulants connus dans ce secteur (notamment l’acide borique et ses sels) serait mise à profit. Dans les deux cas, c’est avantageusement de l’eau de mer qui est utilisée, voire des saumures.

Il serait donc particulièrement intéressant de pouvoir produire ces dextranes in situ directement dans le fluide d’injection, qui comprend essentiellement de l’eau de mer sur les plates-formes pétrolières offshore.

Il existe donc un besoin pour produire de manière simple des dextranes, notamment de masse molaire élevée, dans un milieu comprenant du NaCl, comme par exemple l’eau de mer.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextranes dans un milieu habituellement peu favorable à la bioproduction enzymatique de dextranes.

De manière surprenante, il a en effet été découvert qu’il est possible de produire des dextranes, notamment de masse molaire élevée, dans un milieu salin en utilisant une dextrane-saccharase.

De manière encore plus surprenante, il a été observé qu’il est possible de produire, avec une dextrane-saccharase et dans un tel milieu, des dextranes présentant des propriétés rhéologiques sensiblement équivalentes à celles de dextranes obtenus avec la même enzyme mais dans des conditions d’incubation classiques, habituellement reconnues comme étant les seules conditions compatibles avec la production enzymatique de dextranes.

Procédé de bioproduction

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d’incubation d’une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose et au moins 0,1 % en poids de NaCl par rapport au poids total dudit milieu aqueux. L’étape d’incubation s’effectue dans des conditions, notamment de pH et de température, efficaces pour obtenir ledit dextrane.

Les conditions de mises en œuvre du procédé de l’invention sont décrites ci-après.

Le poids total du milieu aqueux intègre le poids en eau pondéré du poids de l’ensemble des composés y étant présents, à savoir notamment le saccharose, la dextrane-saccharase et le NaCl, et éventuellement des composés en solution dans l’eau comme par exemple d’autres sels.

Le milieu aqueux peut éventuellement comprendre des particules solides, en suspension ou non, comme du sable.

Le milieu aqueux peut éventuellement comprendre une phase huileuse, dispersée ou non dans le milieu aqueux.

Le procédé de l’invention peut être mis en œuvre avec toute dextrane-saccharase connue en soi pour la bioproduction de dextranes, en fonction des propriétés recherchées des dextranes que l’on souhaite produire.

La concentration en dextrane-saccharase dans le milieu aqueux est généralement comprise de 0,1 U/ml à 10 U/ml, de préférence comprise de 0,5 U/ml à 5 U/ml.

Une unité enzymatique (U) glucane-saccharase représente la quantité d’enzyme qui libère une micromole de fructose par minute, à 30°C, à partir de 100 g/kg de saccharose dans un tampon 50mM d’acétate de sodium, à pH 5,75. L’activité est déterminée par mesure de la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide dinitro-salicilique (DNS). Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel sont prélevés et la réaction est stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons sont ensuite chauffés 5 min à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L'1 de fructose permet d’établir le lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs. D’une manière générale, la dextrane-saccharase doit être incubée dans un milieu aqueux contenant du saccharose.

La concentration en saccharose dans le milieu aqueux au début de l’incubation est généralement de 50 g/kg à 200 g/kg, de préférence de 50 g/kg à 150 g/kg.

Par « au début de l’incubation », on entend le moment où la dextrane-saccharase vient d’être mise en contact avec le saccharose. Dans la mesure où le saccharose est destiné à être consommé au cours de l’incubation, la concentration en saccharose dans le milieu diminue au cours de l’incubation.

De manière générale, il est connu que la masse molaire moyenne du dextrane synthétisé sera plus susceptible d’être élevée en utilisant une concentration initiale en saccharose faible.

Le saccharose présent dans le milieu peut y être mis en œuvre sous la forme d’un substrat carboné contenant du saccharose, comme par exemple de la mélasse.

De préférence, le milieu aqueux comprend de 1,0 % à 10,0 %, de préférence de 2,0 % à 5,0 %, préférentiellement de 3,0 % à 4,0 %, en poids de NaCl par rapport au poids total dudit milieu aqueux.

De manière surprenante, comme illustré dans l’exemple 3, la présence de NaCl ne perturbe pas l’activité de la dextrane-saccharase et ne modifie pas sensiblement les propriétés structurelles et rhéologiques des dextranes produits.

Ainsi, contre toute attente, l’eau de mer s’avère donc être un milieu d’incubation adapté à la bioproduction de dextrane par une dextrane-saccharase dans les conditions du procédé de l’invention.

Selon un mode de réalisation préféré, le milieu aqueux comprend de l’eau de mer, et comprend éventuellement des particules solides, tel que du sable.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté à la préparation de fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole, notamment sur une plate-forme pétrolière offshore. L’eau de mer, en fonction de la région du globe terrestre, peut présenter une salinité différente.

Par « salinité », on entend ici la teneur massique en sels dissous par litre d’eau de mer, lesdits sels dissous étant essentiellement le NaCl. L’eau de mer comporte également d’autres sels, comprenant notamment des ions chlorure, sodium, sulfate, magnésium, calcium, potassium, hydrogénocarbonate, carbonate, bromure, ou fluorure.

La salinité de l’eau de mer peut varier d’environ 0,6 g/L pour les eaux de surface de la mer Baltique, à environ 3 g/L pour l’Atlantique Nord ou environ 4 g/L pour la mer Rouge, et aller jusqu’à environ 33 g/L pour la mer Morte.

En général, la salinité de l’eau de mer est comprise de 0,5 g/L à 35 g/L, de préférence de 1 g/L à 20 g/L, préférentiellement de 2 g/L à 10 g/L, voire de 3 g/L à 5 g/L.

En matière (fanions, l’eau de mer comporte habituellement : de 5 g/L à 50 g/L, de préférence de 10 g/L à 25 g/L, préférentiellement de 15 g/L à 20 g/L d’ions chlorure, de 0,5 g/L à 10 g/L, de préférence de 1 g/L à 5 g/L, préférentiellement de 2 g/L à 3 g/L d’ions sulfate, de 0,01 g/L à 1 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 0,5 g/L, préférentiellement de 0,1 g/L à 0,2 g/L d’ions hydrogénocarbonate, de 0,005 g/L à 1 g/L, de préférence de 0,01 g/L à 0,5 g/L, préférentiellement de 0,05 g/L à 0,1 g/L d’ions bromure, de 0,001 g/L à 1 g/L, de préférence de 0,005 g/L à 0,5 g/L, préférentiellement de 0,01 g/L à 0,05 g/L d’ions carbonate, et de 0,0001 g/L à 0,01 g/L, de préférence de 0,001 g/L à 0,005 g/L d’ions fluorure.

En matière de cations, l’eau de mer comporte habituellement : de 1 g/L à 25 g/L, de préférence de 5 g/L à 20 g/L, préférentiellement de 10 g/L à 15 g/L d’ions sodium, de 0,1 g/L à 5 g/L, de préférence de 0,5 g/L à 3 g/L, préférentiellement de 1 g/L à 2 g/L d’ions magnésium, de 0,01 g/L à 4 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 2 g/L, préférentiellement de 0,1 g/L à 1 g/L d’ions calcium, et de 0,01 g/L à 4 g/L, de préférence de 0,05 g/L à 2 g/L, préférentiellement de 0,1 g/L à 1 g/L d’ions potassium.

En général, NaCl représente de 80 % à 85 % des sels dissous dans l’eau de mer.

Avantageusement, le milieu aqueux possède un pH compris de 5,0 à 6,5, de préférence de 5,0 à 6,0, préférentiellement de 5,0 à 5,8, au moins au début de l’incubation,

Par « au début de l’incubation », on entend le moment où la dextrane-saccharase vient d’être mise en contact avec le saccharose. Dans la mesure où le milieu aqueux ne comporte pas nécessairement de système tampon de pH, celui-ci peut évoluer au cours de l’étape d’incubation.

Lorsque le milieu aqueux comprend de l’eau de mer, le pH peut être préalablement ajusté par addition d’acide avant la mise en contact avec la dextrane-saccharase.

Selon un mode de réalisation, notamment adapté à l’utilisation d’eau de mer comme milieu d’incubation, le pH du milieu aqueux n’est toutefois pas contrôlé durant l’incubation.

Ainsi, selon une variante, le milieu aqueux est dépourvu de tout système tampon de pH.

De manière surprenante, il n’est pas donc nécessaire de contrôler le pH au cours de l’incubation pour permettre la bioproduction de dextranes selon le procédé de l’invention.

Cette variante présente l’avantage de ne pas nécessiter l’addition de sels en quantité importante et rend donc le procédé de bioproduction de l’invention plus économique et facile à mettre en œuvre directement sur le site dans lequel l’utilisation de dextranes est envisagée, comme par exemple une plate-forme pétrolière offshore en utilisant l’eau de mer comme milieu d’incubation.

De préférence, l’étape d’incubation est effectuée à une température de 20°C à 40°C, de préférence de 25°C à 35°C, avantageusement de 30°C à 33°C.

Typiquement, la réaction est conduite à une température d’environ 30°C. L’homme du métier saura adapter la durée de l’incubation, en particulier en fonction de la quantité d’enzyme ajoutée dans le milieu aqueux et en fonction de la température. Typiquement, la l’incubation est conduite pendant une durée comprise de 30 minutes à 20 heures, de préférence comprise de 4 heures à 16 heures, de préférence pendant une durée d’environ 12 heures.

Le procédé de l’invention est de préférence mis en œuvre en mettant en contact la dextrane-saccharase, le saccharose, et une solution aqueuse comprenant au moins le NaCl, pour former le milieu aqueux considéré plus haut.

Ce mélange est ensuite porté à une température propice à la bioproduction de dextrane.

Après l’étape d’incubation, le procédé de l’invention peut en outre comporter une ou plusieurs étapes ultérieures, de manière à obtenir des hydrolysats de dextranes.

On entend ici par « hydrolysat de dextrane », un dextrane ayant subi une ou plusieurs étapes de traitement supplémentaires aptes à lui conférer une masse molaire contrôlée inférieure à la masse molaire atteinte selon la présente invention. De telles méthodes sont connues de l’homme du métier. Par exemple, une hydrolyse acide suivie d’un fractionnement, notamment au moyen de solvants organiques, peuvent être appliqués.

Après l’étape d’incubation, le procédé de l’invention peut en outre comporter une ou plusieurs étapes ultérieures, de manière à obtenir des dérivés de dextranes.

On entend ici par « dérivé de dextrane », un dextrane ayant subi une ou plusieurs étapes de modification chimiques connues, notamment choisies parmi une éthérification, une estérification ou une réticulation. On peut ainsi obtenir un dérivé de dextrane tel qu’un dextrane réticulé, un ester de dextrane, par exemple un ester inorganique de dextrane (phosphate de dextrane, sulfate de dextrane) ou un ester organique de dextrane, un éther de dextrane, par exemple un éther de dextrane non-ionique (dextrane alkylé, éther d’hydroxyalkyle ou éther hydroxyalkyle aryle de dextrine, éther de dextrane poly(éthylène-glycol)-alkyle) ou un éther de dextrane ionique (dextrane sulfopropylé, dextrane carboxyméthylé, dextrane 2-(Diéthylamino)éthyl). De telles techniques de modification chimiques, ainsi que les applications pour lesquelles les dextranes ainsi obtenus sont adaptés, sont bien connues de l’homme du métier. On peut par exemple se référer au document Heinze et al (Adv Polym Sci (2006) 205: 199-291) et à la thèse de Ndegwa Henry Maina (Structure and macromolecular properties of Weissella confusa and Leuconostoc citreum dextrans with a potential application in sourdough, Ndegwa Henry Maina, lst June 2012, University of Helsinki, Department of Food and Environmental Sciences, Chemistry and Biochemistry Division).

DSR-OK

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de bioproduction de l’invention met en œuvre une nouvelle dextrane-saccharase, appelée DSR-OK, permettant de synthétiser des dextranes aux propriétés structurelles et rhéologiques spécifiques, particulièrement adaptées à la récupération assistée du pétrole, et ce même lorsqu’ils sont produits dans un milieu aqueux salin conforme à l’invention. DSR-OK est une dextrane-saccharase très spécifique de la polymérisation par liaisons osidiques de type a-1,6, et est une excellente polymérase.

La dextrane-saccharase DSR-OK est composée de 1484 acides aminés, possédant la triade catalytique DED et les 4 motifs conservés décrits habituellement chez les enzymes de la famille 70 des glycoside-hydrolases. Les motifs protéiques conservés du cœur catalytique (I à IV) ont ainsi été identifiés de la position 936 à la position 942 pour le motif I, de la position 458 à la position 468 pour le motif II, de la position 495 à la position 505 pour le motif III et de la position 568 à la position 582 pour le motif IV. En comparaison avec la séquence protéique de la glucane-saccharase GTF-180, les cinq domaines structuraux classiquement décrits pour les glucane-saccharases (A, B, C, IV et V) (5) peuvent être identifiés dans la structure primaire de DSR-OK (Figure 1).

En outre, DSR-OK a une température optimale de fonctionnement d’environ 30°C et un pH optimal d’environ 5,75. A 30°C, cette dextrane-saccharase est stable et robuste, son temps de demi-vie étant d’environ 111 h lors d’une caractérisation en milieu brut, i.e. non purifié. Cette propriété est particulièrement intéressante et rare chez les glucane-saccharases. Ainsi, en comparaison, DSR-S Δ4Ν, autre glucane-saccharase recombinante, présente un temps de demi-vie de seulement 24h dans les mêmes conditions.

Par ailleurs, DSR-ΟΚ suit un mécanisme Michaelien, avec une inhibition par excès de substrat, et est un catalyseur très performant en comparaison à d’autres dextrane-saccharases similaires. Par exemple, DSR-ΟΚ a une constante d’affinité, Km, de 8.99 mM et une constante catalytique, Kcat, de 550 s'1. L’enzyme a donc une bonne affinité pour le substrat (Km), du même ordre de grandeur que la plupart des dextrane-saccharases caractérisées, et présente une constante catalytique (kcat) excellente, rarement observée chez les glucane-saccharases. L’enzyme DSR-ΟΚ est donc extrêmement efficace pour catalyser des réactions de polymérisation à partir de saccharose.

Les variants conservateurs de fonction peuvent également être mis en œuvre dans le procédé de l’invention.

On appelle « variant conservateur de fonction », un variant dans lequel un (ou plusieurs) résidu d’acide aminé donné dans une protéine a été modifié sans pour autant altérer la conformation globale et l’activité enzymatique de dextrane-saccharase permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention. Typiquement, la modification peut concerner des parties non sensibles de l’enzyme, et ne concerne notamment pas la triade catalytique.

Typiquement, un tel variant conservateur de fonction est une dextrane-saccharase dont la séquence d’acides aminés a au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité sur les positions allant de 359 à 1038 sur la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1, ce qui correspond aux domaines A+B+C de l’enzyme, à condition que l’activité enzymatique de dextrane-saccharase, permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention, soit maintenue.

Une dextrane-saccharase adaptée à la mise en œuvre de l’invention peut donc aussi bien être l’enzyme de séquence SEQ ID NO : 1, telle que précédemment définie, qu’un variant de l’enzyme dextrane-saccharase de séquence SEQ ID NO : 1, à condition que ce variant soit conservateur de fonction de l’enzyme. L’activité enzymatique d’un variant de dextrane-saccharase peut être testée selon des techniques connues de l’homme du métier, par exemple par la méthode à l’acide dinitrosalicylique (DNS) de Sumner et Howell (Sumner & Howell, Journal of biological chemistry, 1935, vol 108, Issue 51) ou par analyse HPLC.

Bien entendu, la dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-OK telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, peut être exprimée à partir d’un vecteur d'expression approprié contenant la séquence nucléique adéquate et qui sera alors introduit dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote adéquat.

Le gène dsrok a été identifié au sein du génome d’Oenococcus kitaharae DSM 17330 (disponible dans la base de données NCBI sous le numéro de référence NZ_CM001398) par blast nucléotidique contre une base de données constituée de séquences nucléotidiques de glucane-saccharases répertoriées dans la famille des glycoside-hydrolases 70 selon CAZY (Carbohydrate Active enZYme database, www.cazy.org/GH70_all.html). Il a été traduit en séquence protéique grâce au logiciel disponible en ligne, Transeq d’EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/). L’absence de peptide signal a été prédite parle logiciel SignalP server 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Des alignements protéiques multiples (avec le logiciel d’alignement global, ClustalW2, disponible en ligne, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) avec d’autres glucane-saccharases caractérisées ont permis d’identifier les motifs conservés du cœur catalytique de DSR-ΟΚ, et de découper l’enzyme en différents domaines protéiques (A, B, C, IV et V).

La séquence protéique de l’enzyme DSR-ΟΚ est la séquence 1, dite SEQ ID NO : 1, telle que décrite ci-après : mmatgsnlitaqaddlnqegtaaqsvspstaaanqsessaqsteqsatqaatdgeastvstavtti tphyvqqagkwlymgsdgefvkgpqtidgnlqffdeqgiqikgsfetvdgssyyfdsqsgnavtgf kiinndlhyfeedgketvnnyatdkqgnifyfdengqmatgvktiqgqsyyfdqdghmrkgysgvf dnqvlyfdkttgalantnvssikegltaqnddftahnavystksesftnidgyltaeawyrpadil engtdwrasradefrpilttwwpdkqtevnylnymktqgfitndqdfklsddqlllnhaaqsvqge iekkisqqgstdwlktllqtfinqqpswngesedpgsdhlqggaltfvnspltpdsnsnfrllnrt ptnqtgtpqydtdaslggf elllandvdnsnpwqaeqlnwlyyllnfgsitaddpnanfdgirid avdnvdadllqiaaayfkdafksgsndqttnqhlsiledwshndpeymkaqgypqltmddymhtql iwsltkpdnirgtmqrfmdyylvnrandstnneavanysfvrahdsevqtviaqiisdlypnsgsg lipttdqlqaafevynadmksdvkkytqynipsayamlltnkdtvprvyygdmytddgdymanksp yfdaistllkarvkyaaggqsmavdkndiltsvrfgqnamlasdsgdnqtrqegigvivsnnshlk laendqvvlhmgaahknqafrallltiesglenfdtdlqapvkytdangdliftaaelagylnpev sgylsawvpvgaadnqdartaadsatstdgnvfhsnaaldsnvifegfsnfqsiptaeqhddftnv kiaenaglfkdwgitsfqlapqyrsstdstfldsiiqngyaftdrydlgfdtptkygdvddlraai kalhanniqvmadwvpdqiynlqnpeiitvnrtdsygqpiagsdlqndlylaytngggqyqtkfgg afleklqqlypdlftktqistgqtidpsqkitewsakyfngsniqgrgayyvlrdsgtdqyfkvis ndeneaflpkqltnqpgetgfsqddqgiiffstsgyqaknafvqgddgnyyyfdntghmvtgpqti ngrhylffpngveaqnvfvqndrgetyyydqrgrqvanqyvtdtngnsfrfdengimlanqlaqvd ghwqffkssgvqakdafilgsdgklryfesgngnmavnefkgsengryyyfgadgqavsglqting rqlyfddhgqqmkdafytnqsgqrfyfnaltgdlvkgnfiytsasssftpdndssdsyqgdshlwy yadsqgqivtgfqtinghlqyfddisgqmitnrfmrradgnwiyldengeavrgmrvingltnyfr ddftqvkdgfaqdpnsgerhyfngtngamvtndyfspdqihwyyaddsgqpvtgfqtikgqvqyfd qdgiqlkggsqtdpvtkqtyyfddkfgngqil.

Un vecteur d'expression est typiquement un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.

Typiquement, l'expression des acides nucléiques de la présente invention peut être réalisée dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes. Comme exemple non limitatifs de souches de cellule hôte procaryotes, on peut citer des souches telles que Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou des souches du genre Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococcus. Comme exemple non limitatifs de souches de cellules hôtes eucaryotes, on peut citer des souches telles que des parasites Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania ou Trypanosoma, ou des cellules de levure telles que Saccharomyces comme Saccharomyces cerevisiae ou pombe, Pichia pastoris etc.

De manière préférentielle, des cellules hôtes procaryotes sont utilisées. Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules utilisées pour l’expression des acides nucléiques de la présente invention sont Escherichia coli et de manière encore préférentielle, les souches sont choisies parmi TOP 10, BL21AI, BL21 Star DE3, Arctic Express DE3.

De manière avantageuse, la dextrane-saccharase peut comprendre en outre, à l’extrémité N-terminale, une séquence signal. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'homme du métier, notamment afin que, lorsque la protéine est synthétisée dans une cellule hôte, la synthèse de dextrane puisse être effectuée de manière extracellulaire. En effet, la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ ne possède pas de peptide signal. La présence d’un peptide signal adapté permet ainsi la synthèse de dextrane de manière extracellulaire. De plus, des outils génétiques sont de plus en plus développés pour l’expression hétérologue chez des microorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe) du genre Bacillus et Lactococcus. Ainsi, il existe à l’heure actuelle, plusieurs systèmes connus d’excrétion de protéines recombinantes chez ces bactéries, pouvant être utilisées dans le cas présent par l’homme du métier.

Comme mentionné à l’Exemple 1, la production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites dans l’Exemple 1 atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture, ce qui permet son utilisation à faible coût dans des procédés de synthèse de dextranes.

Une dextrane-saccharase compatible à la mise en œuvre de l’invention peut ainsi être préparée par culture de cellules hôtes contenant une séquence d'acides nucléiques codant une dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-ΟΚ telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, dans des conditions permettant l’expression d’une dextrane-saccharase, et par isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture selon les techniques connues de l’homme du métier.

De telles dextrane-saccharases peuvent ensuite être purifiées par toute technique de purification connue de l’homme du métier, par exemple par précipitation, chromatographie par échange d’ions, chromatographie d’affinité, chromatographie d’échange hydrophobe, filtration sur gel, chromatographie HPLC en phase inverse, etc. Selon un mode de réalisation préférentiel, la dextrane-saccharase obtenue par culture de cellule hôte est purifiée par chromatographie d’affinité. Elles peuvent également être immobilisées par des techniques connues de l’homme du métier, notamment par exemple par adsorption, formation de liaison covalente entre le support et la protéine, inclusion ou encapsulation.

Selon un autre mode de réalisation, une dextrane-saccharase selon l’invention peut être préparée directement par culture de la souche native Oenococcus kitaharae. La souche Oenococcus kitaharae ne possède en effet qu’un seul gène de dextrane-saccharase, codant pour DSR-OK.

Ainsi, selon une variante préférée, le procédé de bioproduction de l’invention met en œuvre une dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.

Le procédé de bioproduction selon ce mode de réalisation permet d’accéder à des dextranes de structure avantageuse.

Les dextranes obtenues à partir de cette enzyme DSR-OK sont caractérisés par le fait qu’ils présentent de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, ces dextranes présentent une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à El O6 kDa. Typiquement, la masse molaire moyenne en poids Mw de ces dextranes est inférieure à 5.107 kDa, de préférence inférieure à 1.107 kDa, de préférence inférieure à 5.106 kDa.

Ces dextranes présentent ainsi l’avantage d’avoir une masse molaire extrêmement élevée et contrôlée, de l’ordre de 10 fois supérieure aux dextranes synthétisés jusqu’à présent.

En outre, ces dextranes présentent un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, de préférence compris de 1,5 à 2,5. De préférence encore, l’indice de dispersité Dj est de 1,8 ± 0,3. Ainsi, bien que leur masse molaire soit très élevée, ces dextranes présentent également l’avantage d’avoir un indice de dispersité faible. En comparaison, un dextrane commercial de 2.103 kDa a un indice de dispersité de 3 .49 (Rolland-Sabaté et al, Biomacromolecules, 2008, vol 9, 1719-1730).

Ces dextranes présentent de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97.6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6. Les dextranes conformes à ce mode présentent en outre de manière avantageuse de 1 % à 5 %, de préférence de 2 % à 3 %, de préférence encore de 2 % à 2,5 %, de liaisons glucosidiques a-1,3. De manière particulièrement avantageuse, les dextranes conformes à ce mode présentent 97,55 % de liaisons glucosidiques a-1,6 et 2,45 % de liaisons glucosidiques a-1,3. Les dextranes conformes à ce mode sont donc quasi-linéaires.

Composition

Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition aqueuse comprenant du dextrane et au moins 0,1 % en poids de NaCl par rapport au poids total de ladite composition, ledit dextrane étant tel qu’il présente de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.

Cette composition peut être obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention décrit ci-dessus.

Selon une variante, cette composition est directement issue de la mise en œuvre du procédé de l’invention décrit ci-dessus et peut ainsi correspondre au milieu aqueux directement obtenu à l’issue de la mise en œuvre dudit procédé.

Selon une autre variante, cette composition est obtenue à partir du milieu aqueux directement obtenu à l’issue de la mise en œuvre dudit procédé, auquel on peut rajouter d’autres actifs.

En particulier, cette composition peut être obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention avec la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ décrite ci-dessus, ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou un variant conservateur de fonction dont la séquence d’acides aminés comprend au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.

De préférence, cette composition est obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention avec un milieu aqueux comprenant de l’eau de mer.

Application

Les caractéristiques structurales particulières des dextranes de la composition de l’invention leur confèrent des propriétés physico-chimiques particulièrement intéressantes, permettant leur utilisation dans de nombreuses applications, et notamment dans l’industrie pétrolière.

En ce qui concerne les propriétés rhéologiques, ces dextranes ont une viscosité dynamique élevée pour de faibles vitesses de cisaillement et présentent un comportement de type rhéofluidifiant ou pseudo-plastique, leur viscosité dynamique diminuant avec l’augmentation du gradient de vitesse (ou vitesse de cisaillement).

Par ailleurs, la viscosité de ces dextranes est peu affectée par des contraintes de cisaillement constantes de longue durée, leur permettant d’être adaptés à des procédés industriels pour lesquels une agitation permanente est nécessaire.

En outre, ces dextranes présentent un seuil d’écoulement relativement élevé, en particulier compris de 25 à 40 Pa selon la quantité initiale de saccharose présente dans le milieu réactionnel.

Ces dextranes ont un comportement de type gel faible. Ceci est caractérisé par des mesures de rhéologie en conditions dynamiques, avec détection des modules élastique ou module de conservation G’ et le module visqueux ou module de perte G’ ’. Pour un gel, G’ est supérieur à G” sur la gamme de fréquence étudiée.

Enfin, ces dextranes présentent des températures de transition vitreuse de 95°C pour un teneur en eau de 6,6 %, et de 25°C pour une teneur en eau de 12,9 %. En d’autres termes, pour une teneur en eau d’environ 13 %, ces dextranes présentent un état caoutchouteux, souple à des températures supérieures à 25°C environ et sont considérés comme « cassant » en dessous de 25°C environ.

Au regard de ces propriétés, la composition de l’invention est particulièrement adaptée à une utilisation comme fluide de forage, fluide de fracturation ou fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.

Ainsi, comme illustré dans les exemples, les dextranes de la composition de l’invention présentent en effet un comportement rhéofluidifiant, avec une viscosité stable dans le temps lors de contraintes de cisaillement constantes de longue durée, et un seuil d’écoulement relativement élevé (de l’ordre de 30 Pa).

Figures

Figure 1 : Représentation schématique de la structure primaire de DSR-ΟΚ (basée sur l’alignement protéique avec l’enzyme GFT180 de Lactobacillus reuteri 180). Cinq domaines sont distincts : domaine V en rouge, domaine IV en jaune, domaine B en vert, domaine A en bleu et domaine C en violet. La triade catalytique est indiquée par les lettres blanches « D », « E » et « D ».

Figure 2 : Spectre obtenu par RMN du proton sur le dextrane synthétisé par DSR-OK recombinante. Les flèches correspondent aux liaisons a-1,3 et a-1,6.

Figure 3 : Profil d’élution obtenu par AF4-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation - Multi-Angle Faser Fight Scattering) (DI = réponse réfractométrique, Dl-DL = diffusion de lumière) et distribution en masse molaire du dextrane produit par préparation de DSR-OK recombinante (DI Mw).

Figure 4 : Représentation du rayon de giration (en nm) en fonction de la masse molaire pour différents dextranes : gcnl produit par un mutant de DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par DSR-OK et un dextrane commercial T2000 (Pharmacosmos) de 2.103 kDa.

Figure 5 : Propriétés rhéologiques des dextranes produits par la dextrane-saccharase DSR-OK : viscosité (5A) et seuil d’écoulement (5B) mesuré en milieu tampon sodium acétate (+) ; dans de l’eau de mer Méditerranée (Δ) ; dans de l’eau de l’océan Atlantique (O).

EXEMPLES

Exemple 1 - Préparation de la dextrane-saccharase DSR-OK

Le gène dsrok a tout d’abord été amplifié par PCR, à partir de l’ADN génomique de la souche Oenococcus kitaharae DSM 17330, en utilisant les deux amorces présentés dans le Tableau 1.

Tableau 1 L’addition des 4 bases, CACC, en 5’ de l’amorce forward a permis l’insertion correcte du fragment PCR dans le vecteur d’entrée pENTR/D/TOPO (Life Technologies), afin de procéder par la suite à un clonage utilisant la technologie Gateway.

Un clone d’entrée positif (vecteur d’entrée contenant le fragment PCR dans le sens désiré) a été sélectionné et recombiné avec le vecteur de destination pET-53-DEST (Novagen) à l’aide de la LR clonase enzyme mix II (Life technologies). Les clones recombinants positifs ont été sélectionnés et analysés par restriction. L’absence de mutation au sein des plasmides a été confirmée par séquençage (GATC).

Pour la production de l’enzyme recombinante, des cellules d"Escherichia coli BL21 star DE3 ont été transformées avec le plasmide pET-53/DSR-OK construit comme indiqué précédemment. 300 pL du mix de transformation ont été ensemencés dans 30 mL de milieu LB (Lysogeny Broth), supplémenté avec 100 pg/mL d’ampicilline, et mis à incuber pendant la nuit à 37°C afin de préparer une préculture.

Des cultures d’IL en milieu ZYM5052 modifié (1 % glycérol, 0 % glucose, 1 % lactose, cf. Studier et al. Prot. Exp. Pur. 2005, 41, 207-234) ont ainsi été ensemencées à une densité optique DO600 nm initiale de 0,05 à partir de la pré-culture de la veille, puis mises à incuber 24 heures à 23°C et 150 rpm. En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés (15 min, 6500 rpm, 4°C) et les culots sont concentrés à une DO de 80 nm dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75.

Afin d’obtenir l’enzyme recombinante (produite par Escherichia coli de manière intracellulaire), les cellules sont cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30 % de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Le surnageant de sonication (contenant l’enzyme recombinante soluble) est ensuite récupéré après 30 minutes de centrifugation (10000 rpm, 10°C) et conservé à 4°C.

La production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites ici atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture.

Exemple 2 - Caractérisation du dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-OK

Les synthèses de dextrane sont réalisées à partir de saccharose (généralement 100 g/kg), à 30°C dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75 et en utilisant 1 U/mL d’enzyme sur une durée de 15 h. Pour la plupart des analyses, le polymère a été purifié par deux précipitations à l’éthanol 50 %, suivi de deux lavages et d’une re-suspension dans de l’eau ultra-pure avant d’être lyophilisé.

Après lyophilisation, 20 mg de dextrane purifié sont dilués dans 0,5 mL d’eau deutérée et analysés par RMN du proton avec le spectromètre Bruker Avance (500 MHz). Les spectres sont ensuite traités et interprétés avec le logiciel TOPSPIN 3.0.

Il a ainsi été mis en évidence par les analyses RMN que le produit synthétisé à partir de 100 g/kg de saccharose, à 30°C, pH 5.75, est un polymère d’unités glucosyle liées à 97,6 % (± 0.2 %) en a-1,6, et 2,4 % en a-1,3, comme le montre la Figure 2.

La masse molaire moyenne en nombre et en poids, et la structure du dextrane synthétisé par DSR-OK, ont été analysées par AFFFF-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation -Multi-Angle Laser Light Scattering), à partir des milieux de synthèse bruts selon les conditions de production décrites dans l’Exemple 1.

Les échantillons ont été dilués 500 fois, dans de l’eau contenant 0,02 % d’azoture de sodium et filtrés sur membrane Durapore de 0,45 pm avant injection (rendement de filtration > 90 %). Le mode opératoire est le même que celui utilisé pour caractériser les dextranes de haute masse molaire synthétisés par des variants de DSR-S Δ4Ν (Irague et al, BioMacromolecules, 2012, vol 13, Issue 1, 187-195). Ainsi, les échantillons sont injectés à 0,2 mL/min sur une durée de 300s avec un flux croisé de 1 mL/min. Une fois l’injection terminée, un temps de relaxation de 60 secondes est imposé aux échantillons. L’élution est réalisée sous un flux d’entraînement de 0,84 mL/min, à un flux croisé constant de 0,1 mL/min pendant 3125 secondes, à température ambiante. Les valeurs des masses molaires (Mi) et celles des rayons de giration (RGi) sont déterminées avec le logiciel ASTRA version 5.3.2.13 (Wyatt Technology). A chaque intervalle de temps (i), la réponse réfractométrique permet de déterminer la concentration Ci. La masse molaire et le rayon de giration sont déterminés par extrapolation de la relation de la diffusion de la lumière à angle nul, à l’aide d’un diagramme de Berry selon :

où, K est la constante optique, Re, le rapport de Rayleigh, λ, la longueur d’onde du faisceau du laser incident, n l’indice de réfraction de la lumière et Θ, l’angle d’observation.

Le logiciel ASTRA calcule directement les masses molaires moyennes en poids (Mw) et en nombre (Mn), ainsi que le rayon de giration moyen en z (Rgz) selon les relations suivantes :

Le rapport M„/Mn représente l’indice de dispersité, Di.

La densité (dcapp) est calculée à partir de l’équation suivante :

où RGw représente le rayon de giration moyen en poids.

Le coefficient hydrodynamique, Ug- est déterminé à partir de la représentation graphique du rayon de giration (Rgî) en fonction de la masse molaire (Mi) et selon l’équation : où KG est une constante.

La valeur du paramètre de branchement gM est calculée selon la relation suivante :

où RGw(br) et RGw(iin) représentent les rayons de giration moyen en poids du polymère branché de son équivalent linéaire de même nature chimique et de même masse molaire.

Il a ainsi été mis en évidence par l’analyse des caractéristiques macromoléculaires que le dextrane présente une très haute masse molaire moyenne en poids Mw d’environ 1,01.106 kDa (± 0,3.106 kDa), comme visible à la Figure 3.

La masse molaire moyenne en nombre est également élevée, à savoir Mn = 5.5.105 kDa (± 1.6.105 kDa). L’indice de dispersité Dj du dextrane produit par DSR-ΟΚ est donc d’environ 1,8, ce qui représente un indice très faible par rapport aux dextranes produits jusqu’à présent.

Par exemple, en comparaison du dextrane produit par la souche historique L. mesenteroides NRRL B-512F, et du dextrane produit par l’enzyme recombinante DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ est de taille plus élevée, et est nettement moins polydisperse que le dextrane natif produit par la souche L. mesenteroides NRRL B-512F.

Le rayon de giration du polymère est aussi extrêmement élevé, de l’ordre de 370nm (Figure 4). Le coefficient hydrodynamique, soit la pente du graphique représentant le rayon de giration en fonction de la masse molaire (Figure 4) est de 0.48. Cette valeur montre qu’il s’agit d’un polymère quasi-linéaire, très peu branché.

Le Tableau 2 reprend les principales caractéristiques macromoléculaires du dextrane produit par DSR-ΟΚ recombinante.

Tableau 2

Exemple 3 - Production de dextrane en présence de NaCl L’activité de la dextrane-saccharase en présence d’eau de mer provenant de mer de Méditerranée ou de l’océan Atlantique (laboratoire SILFIAC) a été mesurée en utilisant la méthode de l’acide dinitrosalycilique (DNS).

Les tests ont été réalisés à 30°C dans des échantillons d’eau de mer, préalablement ajustés à pH 5,2, en utilisant 100 g/kg de saccharose et 0,8 U/ml de DSR-OK.

La concentration en fructose a été déterminée par la méthode DNS en utilisant le fructose comme référence. Une unité (U) de dextrane-saccharase correspond à la quantité d’enzyme qui catalyse la production de 1 pmol de fructose par minute en présence de 100 g/kg de saccharose.

Les résultats des tests d’activité de l’enzyme sont rassemblés dans le Tableau 3:

Tableau 3

Les propriétés rhéologiques des solutions de dextrane obtenues ont été mesurées et comparées à une solution comparative de dextrane, obtenue par production de l’enzyme DSR-OK (0.2 U/ml) dans un tampon sodium acétate 50 mM à pH 5,2.

Les propriétés rhéologiques ont été analysées en utilisant un rhéomètre Thermo Scientific™ HAAKE™ MARS™ avec une géométrie cône-plan (diamètre=60 mm ; angle du cône=l° ; cône C60/10 TiL). Les mesures ont été effectuées à 20°C. Une pré-contrainte a été appliquée à l’échantillon pour homogénéisation (500 s"1 pendant 120 secondes). Après 5 minutes de repos, les mesures de viscosité (Pa.s) ont été effectuées à des contraintes allant de 0.1 s"1 à 60 s'1 (Figure 5A). La méthode dite de « controlled stress ramp » (CS) a été utilisée pour déterminer le seuil d’écoulement (yield stress) de l’échantillon en traçant la déformation (γ) en fonction de la contrainte appliquée (x) (Figure 5B).

Comme le montre la Figure 5, les courbes de viscosités et les seuils d’écoulement des solutions de dextranes obtenues dans l’eau de mer sont équivalents à ceux de la solution de dextrane comparative, obtenue dans un tampon sodium acétate.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d’incubation d’une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose et au moins 0,1 % en poids de NaCl par rapport au poids total dudit milieu aqueux.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la dextrane-saccharase a pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu aqueux comprend de 1,0 % à 10,0 %, de préférence de 2,0 % à 5,0 %, préférentiellement de 3,0 % à 4,0 %, en poids de NaCl par rapport au poids total dudit milieu aqueux.
4. 4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le milieu aqueux comprend de l’eau de mer, et comprend éventuellement des particules solides, tel que du sable.
5. 5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’incubation est effectuée à une température de 20°C à 40°C, de préférence de 25°C à 35°C, avantageusement de 30°C à 33°C.
6. 6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la concentration en saccharose dans le milieu aqueux au début de l’incubation est de 50 g/kg à 200 g/kg, de préférence de 50 g/kg à 150 g/kg.
7. 7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le saccharose présent dans le milieu aqueux est sous la forme d’un substrat carboné contenant du saccharose, comme par exemple de la mélasse.
8. 8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le pH du milieu aqueux est de 5,0 à 6,5, de préférence de 5,0 à 6,0, préférentiellement de 5,0 à 5,8, au moins au début de l’incubation.
9. 9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le pH du milieu aqueux n’est pas contrôlé durant l’incubation.
10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le milieu aqueux est dépourvu de tout système tampon de pH.
11. 11. Composition aqueuse comprenant du dextrane et au moins 0,1 % en poids de NaCl par rapport au poids total de ladite composition, ledit dextrane étant tel qu’il présente de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.
12. 12. Composition aqueuse selon la revendication 11, comprenant de l’eau de mer.
13. 13. Composition aqueuse selon la revendication 11 ou 12, comprenant une dextrane-saccharase, de préférence la dextrane-saccharase telle que définie dans la revendication 2.
14. 14. Utilisation de la composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications 11 à 13 comme fluide de forage, fluide de fracturation ou fluide d’injection pour la récupération assistée du pétrole.