FR3045667A1 - Procede de bioproduction de dextrane en milieu tensioactif - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d'incubation d'une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose au moins 0,1 % en poids d'au moins un tensioactif par rapport au poids total dudit milieu aqueux.

Description

La présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextranes. Elle concerne également une composition comprenant lesdits dextranes et ses utilisations, en particulier comme dans des compositions cosmétique ou détergente.

Pour épaissir des formulations aqueuses avec une quantité réduite d’additif, on utilise généralement des polymères naturels, synthétiques, ou des dérivés de polymères naturels, car ils sont efficaces à de plus faibles concentrations que d’autres familles d’additifs, comme les tensioactifs par exemple.

Ces polymères ou dérivés de polymères peuvent être soit sous forme de poudres, soit sous forme de solutions aqueuses, soit sous forme de dispersions aqueuses.

Les poudres peuvent être délicates à solubiliser, comme c’est le cas des polysaccharides (guars et dérivés de guars, dérivés de cellulose, xanthane, succinoglycane, ...). Il faut tout d’abord vérifier que la poudre soit fine, non agglomérée et facilement coulable, avant de procéder à l’étape de dispersion puis à l’étape d’hydratation (solubilisation) qui nécessite parfois même un changement de pH. Les polymères ou dérivés de polymères épaississants en solution aqueuse ne sont pas non plus pratiques à manipuler car ils présentent généralement une viscosité élevée. Les polymères ou dérivés de polymères épaississants en dispersion aqueuse sont uniquement de type latex alcali-solubles, associatifs ou non (ASE, HASE), qui nécessitent un changement puis un ajustement du pH pour solubiliser le polymère.

Les dextranes et les dérivés de dextranes sont notamment utilisés comme épaississants dans un nombre d’applications industrielles croissant.

Par exemple, les dextranes de masse molaire faible ou moyenne (allant généralement de 1 à 70 kDa) sont notamment utilisés pour des applications analytiques, par exemple comme supports versatiles de chromatographie, dans le domaine médical, par exemple en tant qu’extenseur du plasma sanguin grâce à leur faible caractère antigénique et leur faible viscosité en solution saline, transporteur de fer ou anticoagulant (après fonctionnalisation), dans la prévention des chocs post-opératoires, dans le traitement des brûlures ou dans la réduction de risques de thrombose ou d’embolies.

Pour leur part, les dextranes de masse molaire plus élevée sont particulièrement intéressants pour leur viscosité élevée.

Sauf indication contraire, on entend par « masse molaire » ou « masses molaires moyennes », dans la présente invention, la masse molaire moyenne en poids.

Un des modes de préparation de ces dextranes est la voie enzymatique utilisant les glucane-saccharases.

Les glucane-saccharases d’origine bactérienne sont des transglucosylases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’a-glucanes formés d’unités glucosyle. Les glucane-saccharases présentent des spécificités de produits différentes, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées (a-1,2 ; a-1,3 ; a-1,4 ou a-1,6), que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés.

Parmi les glucane-saccharases, les dextrane-saccharases produisent du dextrane présentant de manière générale au moins 50 % de liaisons osidiques a-1,6 dans la chaîne principale, et des ramifications en a-1,2, a-1,3 et/ou a-1,4. Le taux de ramifications ainsi que leur arrangement spatial varient suivant l’enzyme productrice.

Il existe en particulier des glucane-saccharases permettant d’accéder à des dextranes de masse molaire très élevée, notamment supérieure à 105 kDa.

La souche Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F est un des microorganismes les plus utilisés depuis de nombreuses années pour la production industrielle de dextranes de haute masse molaire, allant de 103 à plus de 105 kDa. L’enzyme responsable de cette synthèse est la dextrane-saccharase appelée DSR-S. Cet homopolymère de glucose présente 95 % de liaisons glucosidiques a-1,6 et 5 % de liaisons glucosidiques a-1,3 (Monchois et al., Applied Microbiology and Biotechnology, October 1997, vol 48, Issue 4, 465-472).

Le gène codant pour la DSR-S a pu être cloné chez Escherichia coli (Monchois et al., Applied Microbiology and Biotechnology, October 1997, vol 48, Issue 4, 465-472 et Moulis et al, FEMS Microbiology Letters, August 2006, vol 261, Issue 2, 203-210), permettant la construction de différents variants de DSR-S. Notamment, des formes tronquées au niveau des domaines N et C-terminal de DSR-S synthétisent, directement à partir du saccharose, des dextranes de masses molaires contrôlées de 4,1.105 kDa, 40 kDa ou 1 kDa. L’un d’entre eux, dénommé DSR-S Δ4Ν et produit sous forme recombinante par Escherichia coli, catalyse, à partir du saccharose, la synthèse d’un dextrane de masse moléculaire évaluée à 4,1.105 kDa et constitué de 96 % de liaisons a-1,6 et 4 % de liaisons a-1,3. La solution de dextrane obtenue avec DSR-S Δ4Ν présente une viscosité supérieure d’un facteur 10 à 100 selon la contrainte de cisaillement appliquée par rapport à celle obtenue avec l’enzyme DSR-S, et présente un comportement rhéofluidifiant. Le dextrane obtenu avec DSR-S Δ4Ν s’avère donc particulièrement intéressant pour des applications dans le domaine des agents texturants et viscosifiants.

Toutefois, la mise en œuvre de ces enzymes requiert le plus souvent des conditions d’incubation très particulières, qui sont rarement adaptées à une mise en œuvre directement dans le milieu dans lequel l’utilisation des dextranes est envisagée.

Ainsi, les milieux tensioactifs sont en effet généralement reconnus comme inhibant l’activité de ces enzymes (cf. notamment Vincenzini et al. C. R. Soc. Biol. 1984, 178, 257-264). Par « milieu tensioactif », aussi appelé « milieu détergent », on entend un milieu comprenant au moins un tensioactif.

Or, l’utilisation de dextranes de masse molaire élevée est intéressante dans des compostions cosmétiques ou des compositions détergentes en raison de leur viscosité élevée. Toutefois, ce type de composition comporte le plus souvent au moins un tensioactif.

Il serait particulièrement intéressant de pouvoir produire ces dextranes in situ directement dans ces compositions en présence d’au moins un tensioactif. En effet, il est plus aisé de mélanger une dextrane-saccharase et du saccharose à un ou plusieurs tensioactif(s) que d’incorporer et solubiliser un dextrane de haute masse molaire dans une composition comprenant un ou plusieurs tensioactif(s).

Il existe donc un besoin pour produire de manière simple des dextranes, notamment de masse molaire élevée, dans un milieu tensioactif.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextranes dans un milieu comprenant au moins un tensioactif, habituellement peu favorable à la bioproduction enzymatique.

De manière surprenante, il a en effet été découvert qu’il est possible de produire des dextranes, notamment de masse molaire élevée, dans un milieu tensioactif en utilisant une dextrane-saccharase.

De manière encore plus surprenante, il a été observé qu’il est possible de produire, avec une dextrane-saccharase et dans un tel milieu, des dextranes présentant des propriétés rhéologiques sensiblement équivalentes à celles de dextranes obtenus avec la même enzyme mais dans des conditions d’incubation classiques, habituellement reconnues comme étant les seules conditions compatibles avec la production enzymatique de dextranes.

Procédé de bioproduction

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d’incubation d’une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose et au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total dudit milieu aqueux. L’étape d’incubation s’effectue dans des conditions, notamment de pH et de température, efficaces pour obtenir ledit dextrane.

Les conditions de mises en œuvre du procédé de l’invention sont décrites ci-après.

Le procédé de l’invention a l’avantage de présenter une mise en œuvre facile dans la mesure où les ingrédients sont aisés à incorporer et à dissoudre.

De plus, il permet de déclencher l’apparition de la viscosité avec un temps retard après la mise en présence des ingrédients, générant ainsi les propriétés souhaitées : propriétés rhéologiques (viscosité seule, viscosité + pouvoir suspensif), propriétés esthétiques (suspension de billes ou de paillettes), propriétés sensorielles (mousses des produits cosmétiques, comportement au rinçage, etc).

Le procédé de l’invention peut notamment être mis en œuvre dans le cadre de la préparation d’une composition cosmétique ou une composition détergente, le caractère épaississant des dextranes formés au cours de la polymérisation apparaissant lors de l’introduction d’ingrédients ajoutés ultérieurement.

Le poids total du milieu aqueux intègre le poids en eau pondéré du poids de l’ensemble des composés y étant présents, à savoir notamment le saccharose, la dextrane-saccharase et le tensioactif, et éventuellement des composés en solution dans l’eau comme par exemple un système tampon de pH.

Le milieu aqueux peut éventuellement comprendre des particules solides, en suspension ou non.

Le milieu aqueux peut éventuellement comprendre une phase huileuse, dispersée ou non dans le milieu aqueux.

Le procédé de l’invention peut être mis en œuvre avec toute dextrane-saccharase connue en soi pour la bioproduction de dextranes, en fonction des propriétés recherchées des dextranes que l’on souhaite produire.

La concentration en dextrane-saccharase dans le milieu aqueux est généralement comprise de 0,1 U/ml à 10 U/ml, de préférence comprise de 0,5 U/ml à 5 U/ml.

Une unité enzymatique (U) glucane-saccharase représente la quantité d’enzyme qui libère une micromole de fructose par minute, à 30°C, à partir de 100 g/kg de saccharose dans un tampon 50mM d’acétate de sodium, à pH 5,75. L’activité est déterminée par mesure de la vitesse initiale de production des sucres réducteurs à l’aide de la méthode à l’acide dinitro-salicilique (DNS). Au cours d’une cinétique, 100 pL de milieu réactionnel sont prélevés et la réaction est stoppée par ajout d’un volume équivalent de DNS. Les échantillons sont ensuite chauffés 5 min à 95°C, refroidis dans la glace, dilués au demi dans de l’eau, et l’absorbance est lue à 540 nm. Une gamme étalon de 0 à 2 g.L"1 de fructose permet d’établir le lien entre valeur d’absorbance et concentration en sucres réducteurs. D’une manière générale, la dextrane-saccharase est incubée dans un milieu aqueux contenant du saccharose.

La concentration en saccharose dans le milieu aqueux au début de l’incubation est généralement de 50 g/kg à 200 g/kg, de préférence de 50 g/kg à 150 g/kg.

Par « au début de l’incubation », on entend le moment où la dextrane-saccharase vient d’être mise en contact avec le saccharose. Dans la mesure où le saccharose est destiné à être consommé au cours de l’incubation, la concentration en saccharose dans le milieu diminue au cours de l’incubation.

De manière générale, il est connu que la masse molaire moyenne du dextrane synthétisé sera plus susceptible d’être élevée en utilisant une concentration initiale en saccharose faible.

Le saccharose présent dans le milieu peut y être mis en œuvre sous la forme d’un substrat carboné contenant du saccharose, comme par exemple de la mélasse.

De préférence, le milieu aqueux comprend de 1,0 % à 20,0 %, de préférence de 5,0 % à 15,0 %, en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total dudit milieu aqueux.

De manière surprenante, comme illustré dans l’exemple 3, la présence de tensioactif ne perturbe pas l’activité de la dextrane-saccharase et ne modifie pas sensiblement les propriétés structurelles et rhéologiques des dextranes produits.

Le ou les tensioactifs peu(ven)t être choisi(s) parmi les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs zwitterioniques, les tensioactifs non ioniques, et leurs mélanges.

Parmi les tensioactifs anioniques, on peut citer les sulfates, les sulfonates, les sulfosuccinates, les phosphates, et les carboxylates, éventuellement alcoxylés. A titre d’exemples de tensioactifs sulfates, on peut citer les alkylsulfates, les alkyl éther sulfates et leurs sels, notamment leurs sels de sodium, comme par exemple le mélange de Sodium Laureth Sulfate / Magnésium Laureth Sulfate / Sodium Laureth-8 Sulfate / Magnésium Laureth-8 Sulfate, vendu sous le nom de Texapon ASV® par la société Henkel ; le lauryl éther sulfate de sodium commercialisé sous la dénomination Rhodapex® ESB-70 NAT par la société Solvay, le lauryl éther sulfate d’ammonium (C12-14 70/30) (3 OE) commercialisé sous la dénomination SIPON LEA 370® par la société Henkel ; l’alkyl (C12-C14) éther (9 OE) sulfate d’ammonium commercialisé sous la dénomination RHODAPEX AB/20 ® par la société Solvay. A titre d’exemple de sulfonates, on peut citer les alpha-oléfines sulfonates, dont par exemple le Sodium Cl4-16 Olefin Sulfonate (commercialisé sous la dénomination Rhodacal ® LSS par Solvay) ou les taurates, dont par exemple le Sodium Methyl Cocoyl Taurate commercialisé par Solvay sous la dénomination Geropon® TC 42. A titre d’exemple de sulfosuccinates, on peut citer le Mackanate® EL (nom INCI : Disodium Laureth Sulfosuccinate) de formule :

où n va de là 4. A titre d’exemple de carboxylates, on peut citer le potassium cocoate ou les glycinates, en particulier les glycinates obtenus à partir de Cocoyl Acid Chloride and Lauroyl Acid Chloride :

A titre d’exemple de phosphates, on peut citer les laurylether phosphates possédant 1 motif éthylène oxyde et 3 motifs éthylène oxyde, commercialisés par exemple par Solvay sous le nom de Dermalcare® MAP L-210 et Dermalcare® MAP L-130 respectivement.

Parmi les tensioactifs non ioniques, on peut citer les copolymères oxyéthylénés oxypropylénés, les alcools gras alcoxylés, les acides gras alcoxylés, les alkylphénols alcoxylés, les esters de sorbitane éventuellement alcoxylés, les alkyl polyglucosides, et les amines oxydes. A titre d’exemples de tensioactifs non ioniques, on peut citer : les polymères blocs oxyéthylénés oxypropylénés tels que par exemple le Poloxamer 184 (nom CTFA) ; les esters gras tels que par exemple le Emulgin CO 60® (PEG-60 HYDROGENATED CASTOR OIL®) ; les alkylpolyglycosides et notamment les alkylpolyglucosides (APG) ayant un groupe alkyle comportant de 6 à 30 atomes de carbone (alkyl-C6-C30 polyglucosides) et de préférence 8 à 16 atomes de carbone, comme par exemple le décylglucoside (Alkyl-C9/Cll-polyglucoside (1.4) tel que par exemple le produit commercialisé sous la dénomination MYDOL 10® par la société Kao Chemicals, le produit commercialisé sous la dénomination Mackol® DG par Solvay, le produit commercialisé sous la dénomination PLANTAREN 2000 UP® ou PLANTACARE 2000 UP® par la société Henkel, et le produit commercialisé sous la dénomination ORAMIX NS 10® par la société Seppic ; le capiylyl/capryl glucoside comme par exemple le produit commercialisé sous la dénomination ORAMIX CG 110® par la Société Seppic ; le laurylglucoside comme par exemple les produits commercialisés sous les dénominations PLANTAREN 1200 N® et PLANTACARE 1200® par la société Henkel ; et le coco-glucoside comme par exemple le produit commercialisé sous la dénomination PLANTACARE 818/UP® par la société Henkel ; et le Cocamidopropylamine Oxide, commercialisé par exemple par Solvay sous la dénomination Mackamine® CAO E.

Parmi les tensioactifs zwitterioniques, on peut citer : les amphopropionates ou les amphoacétates, tels que par exemple le N-cocoyl-N-carboxyméthoxyéthyl-N-carboxyméthyl-éthylènediamine N-di-sodique (nom CTFA : Disodium cocoampho-diacetate) commercialisé en solution aqueuse saline sous la dénomination MIRANOL C2M CONC NP® par la société Solvay ; et le N-cocoyl-N-hydroxyéthyl-N-carboxyméthyl-éthylènediamine N-sodique (nom CTFA : sodium cocampho-acetate) ; les bétaïnes, telles que par exemple le Mirataine BET C30 (nom INCI : Cocamidopropyl Betaine) de formule :

les sultaïnes, dont par exemple la Cocamidopropyl Hydroxysultaine commercialisée sous la dénomination Mackam® CBS-50G par Solvay.

Les tensioactifs anioniques, zwitterioniques et non ioniques cités ci-dessus sont largement utilisés pour les shampoings et les produits d’hygiène et sont donc particulièrement appropriés à la préparation de composition cosmétique.

Ils sont également largement utilisés dans le domaine de la détergence et sont donc particulièrement appropriés à la préparation de composition détergente.

Selon un mode de réalisation particulier, le ou les tensioactifs sont choisis parmi les sulfosuccinates, les alkylsulfates, les bétaïnes, et leurs mélanges.

Le pH du milieu aqueux est de préférence de 5,0 à 6,5, avantageusement de 5,0 à 6,0, préférentiellement de 5,0 à 5,8.

Selon un mode de réalisation, le milieu aqueux comprend un système tampon de pH, par exemple un tampon physiologiquement acceptable. A titre de tampon, on peut citer le tampon composé d’acétate de sodium et d’acide acétique en quantités substantiellement équimolaires.

Le procédé de l’invention est de préférence mis en œuvre en préparant d’abord un mélange aqueux comprenant notamment de l’eau, la dextrane-saccharase, le saccharose, et éventuellement un tampon de pH.

Ce mélange peut être porté à une température propice à la bioproduction de dextrane avant que ne soit additionné le ou les tensioactifs.

Le ou les tensioactifs peuvent ensuite être additionnés à ce mélange, pour former le milieu aqueux considéré plus haut.

De préférence, l’étape d’incubation est effectuée à une température de 20°C à 40°C, de préférence de 25°C à 35°C, avantageusement de 30°C à 33°C.

Typiquement, la réaction est conduite à une température d’environ 30°C. L’homme du métier saura adapter la durée de l’incubation, en particulier en fonction de la quantité d’enzyme ajoutée dans le milieu aqueux et en fonction de la température. Typiquement, la l’incubation est conduite pendant une durée comprise de 30 minutes à 20 heures, de préférence comprise 30 minutes à 16 heures, de préférence de 30 minutes à 4 heures.

Après l’étape d’incubation, le procédé de l’invention peut en outre comporter une ou plusieurs étapes ultérieures, de manière à obtenir des hydrolysats de dextranes.

On entend ici par « hydrolysat de dextrane », un dextrane ayant subi une ou plusieurs étapes de traitement supplémentaires aptes à lui conférer une masse molaire contrôlée inférieure à la masse molaire atteinte selon la présente invention. De telles méthodes sont connues de l’homme du métier. Par exemple, une hydrolyse acide suivie d’un fractionnement, notamment au moyen de solvants organiques, peuvent être appliqués.

Après l’étape d’incubation, le procédé de l’invention peut en outre comporter une ou plusieurs étapes ultérieures, de manière à obtenir des dérivés de dextranes.

On entend ici par « dérivé de dextrane », un dextrane ayant subi une ou plusieurs étapes de modification chimiques connues, notamment choisies parmi une éthérification, une estérification ou une réticulation. On peut ainsi obtenir un dérivé de dextrane tel qu’un dextrane réticulé, un ester de dextrane, par exemple un ester inorganique de dextrane (phosphate de dextrane, sulfate de dextrane) ou un ester organique de dextrane, un éther de dextrane, par exemple un éther de dextrane non-ionique (dextrane alkylé, éther d’hydroxyalkyle ou éther hydroxyalkyle aryle de dextrine, éther de dextrane poly(éthylène-glycol)-alkyle) ou un éther de dextrane ionique (dextrane sulfopropylé, dextrane carboxyméthylé, dextrane 2-(Diéthylamino)éthyl). De telles techniques de modification chimiques, ainsi que les applications pour lesquelles les dextranes ainsi obtenus sont adaptés, sont bien connues de l’homme du métier. On peut par exemple se référer au document Heinze et al (Adv Polym Sci (2006) 205: 199-291) et à la thèse de Ndegwa Henry Maina (Structure and macromolecular properties of Weissella confusa and Leuconostoc citreum dextrans with a potential application in sourdough, Ndegwa Henry Maina, lst June 2012, University of Helsinki, Department of Food and Environmental Sciences, Chemistry and Biochemistry Division).

DSR-OK

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de bioproduction de l’invention met en œuvre une dextrane-saccharase spécifique, appelée DSR-OK, permettant de synthétiser des dextranes aux propriétés structurelles et rhéologiques spécifiques, et ce même lorsqu’ils sont produits dans un milieu tensioactif conforme à l’invention. DSR-OK est une dextrane-saccharase très spécifique de la polymérisation par liaisons osidiques de type a-1,6, et est une excellente polymérase.

La dextrane-saccharase DSR-OK est composée de 1484 acides aminés, possédant la triade catalytique DED et les 4 motifs conservés décrits habituellement chez les enzymes de la famille 70 des glycoside-hydrolases. Les motifs protéiques conservés du cœur catalytique (I à IV) ont ainsi été identifiés de la position 936 à la position 942 pour le motif I, de la position 458 à la position 468 pour le motif II, de la position 495 à la position 505 pour le motif III et de la position 568 à la position 582 pour le motif IV. En comparaison avec la séquence protéique de la glucane-saccharase GTF-180, les cinq domaines structuraux classiquement décrits pour les glucane-saccharases (A, B, C, IV et V) (5) peuvent être identifiés dans la structure primaire de DSR-OK (Figure 1).

En outre, DSR-OK a une température optimale de fonctionnement d’environ 30°C et un pH optimal d’environ 5,75. A 30°C, cette dextrane-saccharase est stable et robuste, son temps de demi-vie étant d’environ 111 h lors d’une caractérisation en milieu brut, i.e. non purifié. Cette propriété est particulièrement intéressante et rare chez les glucane-saccharases. Ainsi, en comparaison, DSR-S Δ4Ν, autre glucane-saccharase recombinante, présente un temps de demi-vie de seulement 24h dans les mêmes conditions.

Par ailleurs, DSR-ΟΚ suit un mécanisme Michaelien, avec une inhibition par excès de substrat, et est un catalyseur très performant en comparaison à d’autres dextrane-saccharases similaires. Par exemple, DSR-ΟΚ a une constante d’affinité, Km, de 8.99 mM et une constante catalytique, Kcat, de 550 s"1. L’enzyme a donc une bonne affinité pour le substrat (Km), du même ordre de grandeur que la plupart des dextrane-saccharases caractérisées, et présente une constante catalytique (kcat) excellente, rarement observée chez les glucane-saccharases. L’enzyme DSR-ΟΚ est donc extrêmement efficace pour catalyser des réactions de polymérisation à partir de saccharose.

Les variants conservateurs de fonction peuvent également être mis en œuvre dans le procédé de l’invention.

On appelle « variant conservateur de fonction », un variant dans lequel un (ou plusieurs) résidu d’acide aminé donné dans une protéine a été modifié sans pour autant altérer la conformation globale et l’activité enzymatique de dextrane-saccharase permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention. Typiquement, la modification peut concerner des parties non sensibles de l’enzyme, et ne concerne notamment pas la triade catalytique.

Typiquement, un tel variant conservateur de fonction est une dextrane-saccharase dont la séquence d’acides aminés a au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité sur les positions allant de 359 à 1038 sur la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1, ce qui correspond aux domaines A+B+C de l’enzyme, à condition que l’activité enzymatique de dextrane-saccharase, permettant de synthétiser des dextranes conformes à l’invention, soit maintenue.

Une dextrane-saccharase adaptée à la mise en œuvre de l’invention peut donc aussi bien être l’enzyme de séquence SEQ ID NO : 1, telle que précédemment définie, qu’un variant de l’enzyme dextrane-saccharase de séquence SEQ ID NO : 1, à condition que ce variant soit conservateur de fonction de l’enzyme. L’activité enzymatique d’un variant de dextrane-saccharase peut être testée selon des techniques connues de l’homme du métier, par exemple par la méthode à l’acide dinitrosalicylique (DNS) de Sumner et Howell (Sumner & Howell, Journal of biological chemistry, 1935, vol 108, Issue 51) ou par analyse HPLC.

Bien entendu, la dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-OK telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, peut être exprimée à partir d’un vecteur d'expression approprié contenant la séquence nucléique adéquate et qui sera alors introduit dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote adéquat.

Le gène dsrok a été identifié au sein du génome d'Oenococcus kitaharae DSM 17330 (disponible dans la base de données NCBI sous le numéro de référence NZ CM001398) par blast nucléotidique contre une base de données constituée de séquences nucléotidiques de glucane-saccharases répertoriées dans la famille des glycoside-hydrolases 70 selon CAZY (Carbohydrate Active enZYme database, www.cazy.org/GH70_all.html). Il a été traduit en séquence protéique grâce au logiciel disponible en ligne, Transeq d’EMBOSS (www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/). L’absence de peptide signal a été prédite par le logiciel SignalP server 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Des alignements protéiques multiples (avec le logiciel d’alignement global, ClustalW2, disponible en ligne, www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) avec d’autres glucane-saccharases caractérisées ont permis d’identifier les motifs conservés du cœur catalytique de DSR-ΟΚ, et de découper l’enzyme en différents domaines protéiques (A, B, C, IV et V).

La séquence protéique de l’enzyme DSR-ΟΚ est la séquence 1, dite SEQ ID NO : 1, telle que décrite ci-après : mmatgsnlitaqaddlnqegtaaqsvspstaaanqsessaqsteqsatqaatdgeastvstavttitphyvqq agkwlymgsdgefvkgpqtidgnlqffdeqgiqikgs fetvdgssyyfdsqsgnavtgfkiinndlhyfeedg ketvnnyatdkqgnifyfdengqmatgvktiqgqsyyfdqdghmrkgysgvfdnqvlyfdkttgalantnvss ikegltaqnddftahnavystkses ftnidgyltaeawyrpadilengtdwrasradefrpilttwwpdkqte vnylnymktqgfitndqdfklsddqlllnhaaqsvqgeiekkisqqgstdwlktllqtfinqqpswngesedp gsdhlqggaltfvnspltpdsnsnfrllnrtptnqtgtpqydtdaslggfelllandvdnsnpvvqaeqlnwl yyllnfgsitaddpnanfdgiridavdnvdadllqiaaayfkdafksgsndqttnqhlsiledwshndpeymk aqgypqltmddymhtqliwsltkpdnirgtmqrfmdyylvnrandstnneavanysfvrahdsevqtviaqii sdlypnsgsglipttdqlqaafevynadmksdvkkytqynipsayamlltnkdtvprvyygdmytddgdyman kspyfdaistllkarvkyaaggqsmavdkndiltsvrfgqnamlasdsgdnqtrqegigvivsnnshlklaen dqvvlhmgaahknqafrallltiesglenfdtdlqapvkytdangdliftaaelagylnpevsgylsawvpvg aadnqdartaadsatstdgnvfhsnaaldsnvifegfsnfqsiptaeqhddftnvkiaenaglfkdwgitsfq lapqyjrsstdstfldsiiqngyaftdrydlgfdtptkygdvddlraaikalhanniqvmadwvpdqiynlqnp eiitvnrtdsygqpiagsdlqndlylaytngggqyqtkfggafleklqqlypdlftktqistgqtidpsqkit ewsakyfngsniqgrgayyvlrdsgtdqyfkvisndeneaflpkqltnqpgetgfsqddqgiiffstsgyqak nafvqgddgnyyyfdntghmvtgpqtingrhylffpngveaqnvfvqndrgetyyydqrgrqvanqyvtdtng nsfrfdengimlanqlaqvdghwqffkssgvqakdafilgsdgklryfesgngnmavnefkgsengryyyfga dgqavsglqtingrqlyfddhgqqmkdafytnqsgqrfyfnaltgdlvkgnfiytsasssftpdndssdsyqg dshlwyyadsqgqivtgfqtinghlqyfddisgqmitnrfmrradgnwiyldengeavrgmrvingltnyfrd dftqvkdgfaqdpnsgerhyfngtngamvtndyfspdqihwyyaddsgqpvtgfqtikgqvqyfdqdgiqlkg gsqtdpvtkqtyyfddkfgngqil.

Un vecteur d'expression est typiquement un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.

Typiquement, l'expression des acides nucléiques de la présente invention peut être réalisée dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes. Comme exemple non limitatifs de souches de cellule hôte procaryotes, on peut citer des souches telles que Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou des souches du genre Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococcus. Comme exemple non limitatifs de souches de cellules hôtes eucaryotes, on peut citer des souches telles que des parasites Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia) Leishmania ou Trypanosoma, ou des cellules de levure telles que Saccharomyces comme Saccharomyces cerevisiae oupombe, Pichiapastoris etc.

De manière préférentielle, des cellules hôtes procaryotes sont utilisées. Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules utilisées pour l’expression des acides nucléiques de la présente invention sont Escherichia coli et de manière encore préférentielle, les souches sont choisies parmi TOPIO, BL21AI, BL21 Star DE3, Arctic Express DE3.

De manière avantageuse, la dextrane-saccharase peut comprendre en outre, à l’extrémité N-terminale, une séquence signal. Cette séquence signal peut être une des séquences signal connues de l'homme du métier, notamment afin que, lorsque la protéine est synthétisée dans une cellule hôte, la synthèse de dextrane puisse être effectuée de manière extracellulaire. En effet, la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ ne possède pas de peptide signal. La présence d’un peptide signal adapté permet ainsi la synthèse de dextrane de manière extracellulaire. De plus, des outils génétiques sont de plus en plus développés pour l’expression hétérologue chez des microorganismes GRAS (Generally Recognized As Safe) du genre Bacillus et Lactococcus. Ainsi, il existe à l’heure actuelle, plusieurs systèmes connus d’excrétion de protéines recombinantes chez ces bactéries, pouvant être utilisées dans le cas présent par l’homme du métier.

Comme mentionné à l’Exemple 1, la production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites dans l’Exemple 1 atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture, ce qui permet son utilisation à faible coût dans des procédés de synthèse de dextranes.

Une dextrane-saccharase compatible à la mise en œuvre de l’invention peut ainsi être préparée par culture de cellules hôtes contenant une séquence d'acides nucléiques codant une dextrane-saccharase, de préférence une dextrane-saccharase DSR-ΟΚ telle que précédemment décrite ou un variant conservateur de fonction, dans des conditions permettant l’expression d’une dextrane-saccharase, et par isolement de ladite dextrane-saccharase du milieu de culture selon les techniques connues de l’homme du métier.

De telles dextrane-saccharases peuvent ensuite être purifiées par toute technique de purification connue de l’homme du métier, par exemple par précipitation, chromatographie par échange d’ions, chromatographie d’affinité, chromatographie d’échange hydrophobe, filtration sur gel, chromatographie HPLC en phase inverse, etc. Selon un mode de réalisation préférentiel, la dextrane-saccharase obtenue par culture de cellule hôte est purifiée par chromatographie d’affinité. Elles peuvent également être immobilisées par des techniques connues de l’homme du métier, notamment par exemple par adsorption, formation de liaison covalente entre le support et la protéine, inclusion ou encapsulation.

Selon un autre mode de réalisation, une dextrane-saccharase selon l’invention peut être préparée directement par culture de la souche native Oenococcus kitaharae. La souche Oenococcus kitaharae ne possède en effet qu’un seul gène de dextrane-saccharase, codant pour DSR-OK.

Ainsi, selon une variante préférée, le procédé de bioproduction de l’invention met en œuvre une dextrane-saccharase ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.

Le procédé de bioproduction selon ce mode de réalisation permet d’accéder à des dextranes de structure avantageuse.

Les dextranes obtenues à partir de cette enzyme DSR-OK sont caractérisés par le fait qu’ils présentent de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, ces dextranes présentent une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 1.106 kDa. Typiquement, la masse molaire moyenne en poids Mw de ces dextranes est inférieure à 5.107 kDa, de préférence inférieure à 1.107 kDa, de préférence inférieure à 5.106 kDa.

Ces dextranes présentent ainsi l’avantage d’avoir une masse molaire extrêmement élevée et contrôlée, de l’ordre de 10 fois supérieure aux dextranes synthétisés jusqu’à présent.

En outre, ces dextranes présentent un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3, de préférence compris de 1,5 à 2,5. De préférence encore, l’indice de dispersité Dj est de 1,8 ± 0,3. Ainsi, bien que leur masse molaire soit très élevée, ces dextranes présentent également l’avantage d’avoir un indice de dispersité faible. En comparaison, un dextrane commercial de 2.103 kDa a un indice de dispersité de 3,49 (Rolland-Sabaté et al, Biomacromolecules, 2008, vol 9, 1719-1730).

Ainsi, les dextranes conformes à ce mode de réalisation présentent de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97.6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6. Les dextranes conformes à ce mode présentent en outre de manière avantageuse de 1 % à 5 %, de préférence de 2 % à 3 %, de préférence encore de 2 % à 2,5 %, de liaisons glucosidiques a-1,3. De manière particulièrement avantageuse, ces dextranes présentent 97,55 % de liaisons glucosidiques α-1,6 et 2,45 % de liaisons glucosidiques a-1,3. Les dextranes conformes à ce mode sont donc quasi-linéaires.

Composition

Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet une composition aqueuse comprenant du dextrane et au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif tel que défini ci-desssus par rapport au poids total de ladite composition, ledit dextrane étant tel qu’il présente de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.10e kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.

Cette composition peut être obtenue par la mise en œuvre du procédé de l’invention décrit ci-dessus.

Selon une variante, cette composition est directement issue de la mise en œuvre du procédé de l’invention décrit ci-dessus et peut ainsi correspondre au milieu aqueux directement obtenu à l’issue de la mise en œuvre dudit procédé.

Selon une autre variante, cette composition est obtenue à partir du milieu aqueux directement obtenu à l’issue de la mise en œuvre dudit procédé, auquel on peut rajouter d’autres actifs.

En particulier, cette composition peut être obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention avec la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ décrite ci-dessus, ayant pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou un variant conservateur de fonction dont la séquence d’acides aminés comprend au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.

De préférence, cette composition est obtenue en mettant en œuvre le procédé de l’invention avec un milieu aqueux d’incubation comprenant de 1,0 % à 20,0 %, de préférence de 5,0 % à 15,0 % en poids d’au moins un tensioactif.

La composition selon l’invention peut comprendre tout tensioactif ou mélange de tensioactifs décrits ci-dessus.

Application

Les caractéristiques structurales particulières de ces dextranes leur confèrent des propriétés physico-chimiques particulièrement intéressantes, permettant leur utilisation dans de nombreuses applications, et notamment dans une composition cosmétique ou une composition détergente.

En ce qui concerne les propriétés rhéologiques, les dextranes conformes à l’invention ont une viscosité dynamique élevée pour de faibles vitesses de cisaillement et présentent un comportement de type rhéofluidifiant ou pseudo-plastique, leur viscosité dynamique diminuant avec l’augmentation du gradient de vitesse (ou vitesse de cisaillement).

En outre, ces dextranes présentent un seuil d’écoulement relativement élevé, en particulier compris de 25 et 40 Pa selon la quantité initiale de saccharose présente dans le milieu réactionnel.

Les dextranes conformes à ce mode de réalisation ont un comportement de type gel faible. Ceci est caractérisé par des mesures de rhéologie en conditions dynamiques, avec détection des modules élastique ou module de conservation G’ et le module visqueux ou module de perte G”. Pour un gel, G’ est supérieur à G” sur la gamme de fréquence étudiée.

Enfin, les dextranes conformes à ce mode de réalisation présentent des températures de transition vitreuse de 95 °C pour un teneur en eau de 6,6 %, et de 25 °C pour une teneur en eau de 12,9 %. En d’autres termes, pour une teneur en eau d’environ 13 %, les dextranes selon l’invention présentent un état caoutchouteux, souple à des températures supérieures à 25°C environ et sont considérés comme « cassant » en dessous de 25°C environ.

Au regard de ces propriétés, la composition de l’invention est particulièrement adaptée à une utilisation dans une composition cosmétique, en association avec un milieu physiologiquement acceptable.

Au regard de ces propriétés, la composition de l’invention est également particulièrement adaptée à une utilisation dans une composition détergente.

Ainsi, comme illustré dans les exemples, les dextranes de la composition de l’invention présentent en effet un comportement rhéofluidifiant, avec une viscosité stable dans le temps lors de contraintes de cisaillement constantes de longue durée, et un seuil d’écoulement relativement élevé (de l’ordre de 30 Pa).

Figures

Figure 1 : Représentation schématique de la structure primaire de DSR-ΟΚ (basée sur l’alignement protéique avec l’enzyme GFT180 de Lactobacillus reuteri 180). Cinq domaines sont distincts : domaine V en rouge, domaine IV en jaune, domaine B en vert, domaine A en bleu et domaine C en violet. La triade catalytique est indiquée par les lettres blanches « D », « E » et « D ».

Figure 2 : Spectre obtenu par RMN du proton sur le dextrane synthétisé par DSR-OK recombinante. Les flèches correspondent aux liaisons a-1,3 et a-1,6.

Figure 3 : Profil d’élution obtenu par AF4-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation - Multi-Angle Laser Light Scattering) (DI = réponse réfractométrique, Dl-DL = diffusion de lumière) et distribution en masse molaire du dextrane produit par préparation de DSR-OK recombinante (DI Mw).

Figure 4 : Représentation du rayon de giration (en nm) en fonction de la masse molaire pour différents dextranes : gcnl produit par un mutant de DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par DSR-OK et un dextrane commercial T2000 (Pharmacosmos) de 2.103 kDa.

Figure 5 : Courbes de viscosité des dextranes obtenus à partir de la dextrane-saccharase DSR-OK en présence de tensioactifs.

Figure 6 : Mesures du seuil d’écoulement des dextranes obtenus à partir de la dextrane-saccharase DSR-OK en présence de tensioactifs.

EXEMPLES

Exemple 1 - Préparation de la dextrane-saccharase DSR-OK

Le gène dsrok a tout d’abord été amplifié par PCR, à partir de l’ADN génomique de la souche Oenococcus kitaharae DSM 17330, en utilisant les deux amorces présentés dans le Tableau 1.

Tableau 1 L’addition des 4 bases, CACC, en 5’ de l’amorce forward a permis l’insertion correcte du fragment PCR dans le vecteur d’entrée pENTR/D/TOPO (Life Technologies), afin de procéder par la suite à un clonage utilisant la technologie Gateway.

Un clone d’entrée positif (vecteur d’entrée contenant le fragment PCR dans le sens désiré) a été sélectionné et recombiné avec le vecteur de destination pET-53-DEST (Novagen) à l’aide de la LR clonase enzyme mix II (Life technologies). Les clones recombinants positifs ont été sélectionnés et analysés par restriction. L’absence de mutation au sein des plasmides a été confirmée par séquençage (GATC).

Pour la production de l’enzyme recombinante, des cellules d"Escherichia coli BL21 star DE3 ont été transformées avec le plasmide pET-53/DSR-OK construit comme indiqué précédemment. 300 pL du mix de transformation ont été ensemencés dans 30 mL de milieu LB (Lysogeny Broth), supplémenté avec 100 pg/mL d’ampicilline, et mis à incuber pendant la nuit à 37°C afin de préparer une préculture.

Des cultures d’IL en milieu ZYM5052 modifié (1 % glycérol, 0 % glucose, 1 % lactose, cf. Studier et al. Prot. Exp. Pur. 2005, 41, 207-234) ont ainsi été ensemencées à une densité optique DO600 nm initiale de 0,05 à partir de la pré-culture de la veille, puis mises à incuber 24 heures à 23°C et 150 rpm. En fin de fermentation, les milieux de culture sont centrifugés (15 min, 6500 rpm, 4°C) et les culots sont concentrés à une DO de 80 nm dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75.

Afin d’obtenir l’enzyme recombinante (produite par Escherichia coli de manière intracellulaire), les cellules sont cassées aux ultrasons selon le protocole suivant : 5 cycles de 20 secondes à 30 % de la puissance maximale de la sonde, à froid, espacés de 4 minutes de repos dans la glace. Le surnageant de sonication (contenant l’enzyme recombinante soluble) est ensuite récupéré après 30 minutes de centrifugation (10000 rpm, 10°C) et conservé à 4°C.

La production recombinante de dextrane-saccharase chez Escherichia coli utilisant les conditions décrites ici atteint environ 30 000 Unités d’activité enzymatique par litre de culture.

Exemple 2 - Caractérisation du dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-OK

Les synthèses de dextrane sont réalisées à partir de concentrations variables en saccharose (généralement 100 g/kg), à 30°C dans 50 mM de tampon acétate de sodium, pH 5,75 et en utilisant 1 U/mL d’enzyme sur une durée de 15 h. Pour la plupart des analyses, le polymère a été purifié par deux précipitations à l’éthanol 50 %, suivi de deux lavages et d’une re-suspension dans de l’eau ultra-pure avant d’être lyophilisé.

Après lyophilisation, 20 mg de dextrane purifié sont dilués dans 0,5 mL d’eau deutérée et analysés par RMN du proton avec le spectromètre Bruker Avance (500 MHz). Les spectres sont ensuite traités et interprétés avec le logiciel TOPSPIN 3.0.

Il a ainsi été mis en évidence par les analyses RMN que le produit synthétisé à partir de 100 g/kg de saccharose, à 30°C, pH 5.75, est un polymère d’unités glucosyle liées à 97,6 % (± 0.2 %) en a-1,6, et 2,4 % en a-1,3, comme le montre la Figure 2.

La masse molaire moyenne en nombre et en poids, et la structure du dextrane synthétisé par DSR-OK, ont été analysées par AFFFF-MALLS (Asymmetric Flow-Field-Flow-Fractionation -Multi-Angle Laser Light Scattering), à partir des milieux de synthèse bruts selon les conditions de production décrites dans l’Exemple 1.

Les échantillons ont été dilués 500 fois, dans de l’eau contenant 0,02 % d’azoture de sodium et filtrés sur membrane Durapore de 0,45 pm avant injection (rendement de filtration > 90 %). Le mode opératoire est le même que celui utilisé pour caractériser les dextranes de haute masse molaire synthétisés par des variants de DSR-S Δ4Ν (Irague et al, BioMacromolecules, 2012, vol 13, Issue 1, 187-195). Ainsi, les échantillons sont injectés à 0,2 mL/min sur une durée de 300s avec un flux croisé de 1 mL/min. Une fois l’injection terminée, un temps de relaxation de 60 secondes est imposé aux échantillons. L’élution est réalisée sous un flux d’entraînement de 0,84 mL/min, à un flux croisé constant de 0,1 mL/min pendant 3125 secondes, à température ambiante. Les valeurs des masses molaires (Mi) et celles des rayons de giration (RGi) sont déterminées avec le logiciel ASTRA version 5.3.2.13 (Wyatt Technology). A chaque intervalle de temps (i), la réponse réfractométrique permet de déterminer la concentration Ci. La masse molaire et le rayon de giration sont déterminés par extrapolation de la relation de la diffusion de la lumière à angle nul, à l’aide d’un diagramme de Berry selon :

où, K est la constante optique, Re, le rapport de Rayleigh, λ, la longueur d’onde du faisceau du laser incident, n l’indice de réfraction de la lumière et Θ, l’angle d’observation.

Le logiciel ASTRA calcule directement les masses molaires moyennes en poids (Mw) et en nombre (Mn), ainsi que le rayon de giration moyen en z (Rgz) selon les relations suivantes :

Le rapport MvMn représente l’indice de dispersité, Di.

La densité (dGapp) est calculée à partir de l’équation suivante :

où RGw représente le rayon de giration moyen en poids.

Le coefficient hydrodynamique, est déterminé à partir de la représentation graphique du rayon de giration (RGi) en fonction de la masse molaire (Mi) et selon l’équation : où KG est une constante.

La valeur du paramètre de branchement gM est calculée selon la relation suivante :

où RGw(br) et RGw(iin) représentent les rayons de giration moyen en poids du polymère branché de son équivalent linéaire de même nature chimique et de même masse molaire.

Il a ainsi été mis en évidence par l’analyse des caractéristiques macromoléculaires que le dextrane présente une très haute masse molaire moyenne en poids Mw d’environ 1,01.106 kDa (± 0,3.106 kDa), comme visible à la Figure 3.

La masse molaire moyenne en nombre est également élevée, à savoir Mn = 5,5.105 kDa (± 1.6.105 kDa). L’indice de dispersité Dj du dextrane produit par DSR-ΟΚ est donc d’environ 1,8, ce qui représente un indice très faible par rapport aux dextranes produits jusqu’à présent.

Par exemple, en comparaison du dextrane produit par la souche historique L. mesenteroides NRRL B-512F, et du dextrane produit par l’enzyme recombinante DSR-S Δ4Ν, le dextrane produit par la dextrane-saccharase DSR-ΟΚ est de taille plus élevée, et est nettement moins polydisperse que le dextrane natif produit par la souche L. mesenteroides NRRL B-512F.

Le rayon de giration du polymère est aussi extrêmement élevé, de l’ordre de 370 nm (Figure 4). Le coefficient hydrodynamique, soit la pente du graphique représentant le rayon de giration en fonction de la masse molaire (Figure 4) est de 0.48. Cette valeur montre qu’il s’agit d’un polymère quasi-linéaire, très peu branché.

Le Tableau 2 reprend les principales caractéristiques macromoléculaires du dextrane produit par DSR-ΟΚ recombinante.

Tableau 2

Exemple 3 - Production de dextrane en présence de tensioactifs Méthodes

La production in situ en présence de tensioactifs a été effectuée à 30°C dans un tampon acétate à 50 mM à pH 5,2 dans les conditions décrites dans le Tableau 3.

La production de dextranes a commencé avec seulement le saccharose.

Après lh30, les tensioactifs ont été ajoutés (Mackanate EL, Mirataine BET C30, Mackol DG et leurs mélanges) pour atteindre une quantité de tensioactifs de 10 % en poids par rapport au poids total du mélange, une concentration de saccharose de 100 g/kg et une concentration de dextrane-saccharase de 1 U/ml.

La consommation du saccharose a été suivie par « High-Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Détection » (HPAEC-PAD). Des prélèvements du milieu réactionnel ont été dilués à une concentration de 10 mg/kg et analysés par HPAEC-PAD sur une colonne 4 x 250 mm Dionex Carbopac PA 100. Un gradient de sodium acétate (de 6 à 300 mM en 30 min) dans 150 mM NaOH a été appliqué à un débit de 1 mL/min. La détection a été effectuée en utilisant un module Dionex ED40 avec une électrode de travail en Au et une référence en Ag/AgCl.

Pour toutes les réactions, la conversion totale du saccharose a été observée en présence de DSR-OK.

Tableau 3

Solution de DSR-OK (140 U/ml)

Tableau 3 (suite)

Solution de DSR-OK (140 U/ml)

Les propriétés rhéologiques ont été analysées en utilisant un rhéomètre Thermo Scientific™ HAAKE™ MARS™ avec une géométrie cône-plan (diamètre=60 mm ; angle du cône=l° ; cône C60/10 TiL). Les mesures ont été effectuées à 20°C. Une pré-contrainte a été appliquée à l’échantillon pour homogénéisation (500 s'1 pendant 120 secondes). Après 5 minutes de repos, les mesures ont été effectuées à des contraintes allant de 0.1 s'1 à 60 s"1 (Figure 5).

La méthode dite de « controlled stress ramp » (CS) a été utilisée pour déterminer le seuil d’écoulement (yield stress) de l’échantillon en traçant la déformation (y) en fonction de la contrainte appliquée (τ) (Figure 6). Résultats L’analyse HPAEC-PAD a révélé que la totalité du saccharose présent dans le milieu réactionnel a été consommé par l’enzyme DSR-ΟΚ, et ce même en présence de tensioactifs.

En présence de tensioactifs, la viscosité la plus élevée et le seuil d’écoulement le plus élevé ont été obtenus avec DSR-OK + Mackanate 5 % + Mackol DG 5 % (Figures 5 et 6).

Claims (17)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de bioproduction de dextrane, comprenant au moins une étape d’incubation d’une dextrane-saccharase dans un milieu aqueux comprenant du saccharose au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total dudit milieu aqueux.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la dextrane-saccharase a pour séquence d’acides aminés la séquence SEQ ID NO : 1, ou au moins 80 %, de préférence 85 %, de préférence encore 90 %, de préférence encore 95 %, de préférence encore 98 % d’identité avec la séquence allant des positions 359 à 1038 de la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu aqueux comprend de 1,0 % à 20,0 %, de préférence de 5,0 % à 15,0 %, en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total dudit milieu aqueux.
4. 4. Procédé l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le tensioactif est choisi dans le groupe constitué par les tensioactifs anioniques, les tensioactifs cationiques, les tensioactifs zwitterioniques, les tensioactifs non ioniques, et leurs mélanges.
5. 5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le tensioactif est choisi parmi les sulfates, les sulfonates, les sulfosuccinates, les phosphates, et les carboxylates, éventuellement alcoxylés, les copolymères oxyéthylénés oxypropylénés, les alcools gras alcoxylés, les acides gras alcoxylés, les alkylphénols alcoxylés, les esters de sorbitane éventuellement alcoxylés, les alkyl polyglucosides, les amines oxydes, les amphopropionates, les amphoacétates, les bétaïnes, les sultaïnes, et leurs mélanges.
6. 6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le tensioactif est choisi parmi les sulfosuccinates, les alkylsulfates, les bétaïnes, et leurs mélanges.
7. 7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l’incubation est effectuée à une température de 20°C à 40°C, de préférence de 25°C à 35°C, avantageusement de 30°C à 33°C.
8. 8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la concentration en saccharose dans le milieu aqueux au début de l’incubation est de 50 g/kg à 200 g/kg, de préférence de 50 g/kg à 150 g/kg.
9. 9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le saccharose présent dans le milieu est sous la forme d’un substrat carboné contenant du saccharose, comme par exemple de la mélasse.
10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le pH du milieu aqueux est de 5,0 à 6,5, avantageusement de 5,0 à 6,0, préférentiellement de 5,0 à 5,8.
11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le milieu aqueux comprend un système tampon de pH, par exemple un tampon composé d’acide acétique et d’acétate de sodium en quantités substantiellement équimolaires.
12. 12. Composition aqueuse comprenant du dextrane et au moins 0,1 % en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total de ladite composition, ledit dextrane étant tel qu’il présente de 95 % à 99 %, de préférence de 97 % à 98 %, de préférence encore de 97,4 % à 97,6 %, de liaisons glucosidiques a-1,6, une masse molaire moyenne en poids Mw au moins égale à 0,7.106 kDa, et un indice de dispersité Dj compris de 1,3 à 3.
13. 13. Composition aqueuse selon la revendication 12, comprenant de 1,0 % à 20,0 %, de préférence de 5,0 % à 15,0 %, en poids d’au moins un tensioactif par rapport au poids total de ladite composition.
14. 14. Composition aqueuse selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle le tensioactif est choisi parmi les tensioactifs cités dans les revendications 4 à 6.
15. 15. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications 12 à 14, comprenant en outre une dextrane-saccharase, de préférence la dextrane-saccharase telle que définie dans la revendication 2.
16. 16. Utilisation d’une composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications 12 à 15 dans une composition cosmétique.
17. 17. Utilisation d’une composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications 12 à 15 dans une composition détergente.