JP2001231572A - アスペルギルス・オリゼー由来β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｎ−アセチルグルコサミンを含むオリゴ糖合
成に有用なβ-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼを効率的
に調製する。 【解決手段】 アスペルギルス・オリゼー由来β-Ｎ-ア
セチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、アスペルギルス・
オリゼー由来β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼをコー
ドする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】キチンはカニ殻あるいはかぶと虫などの
昆虫の羽の構成成分として天然界に多く存在し、セルロ
ースと並んで重要な糖資源であると同時に、キチンおよ
び脱アセチル化キチンであるキトサンはいろいろな生理
活性が報告されている（重政好弘、南三郎、高分子加
工、46巻、75-81、(1997 )）。また、キチンを酵素ある
いは酸で分解したキチンオリゴ糖についても、抗ガン作
用などいろいろな生理活性が知られている（特公昭59-2
7826）。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミンは糖脂質あ
るいは糖蛋白質の構成成分でもあり、その部分構造とし
てのＮ−アセチルグルコサミンを含むオリゴ糖の中にも
生理活性を示すものが数多く知られている。例えばシア
リルルイスｘは、糖脂質あるいは糖蛋白質の非還元末端
に現れる４糖であり細胞接着活性を有するとして知られ
ているが、これもＮ-アセチルグルコサミンを含んでい
る（神奈木玲児、他、化学と生物、26巻、220-234 (19
88).）。このように、Ｎ-アセチルグルコサミンを含む
オリゴ糖は医薬品、高機能食品として重要であるにも拘
わらず、その製造法に関しては十分に開発されている状
態とは言いがたい。

【０００３】例えば、Ｎ-アセチルグルコサミンを含む
オリゴ糖の合成方法として、β-Ｎ-アセチルグルコサミ
ニダーゼを用いた糖転移反応が報告されている（特開平
５-227982）。これは、例えばパラニトロフェニル-β-
Ｎ-アセチルグルコサミニドを糖供与体として、β-Ｎ-
アセチルグルコサミニダーゼの存在下アクセプターの糖
にＮ-アセチルグルコサミン残基を転移させる反応であ
る。この反応により、４-Ｏ-(２-アセトアミド-２-デオ
キシ-β-Ｄ−ガラクトピラノシル)-β-Ｄ−グルコピラ
ノースが合成されている。しかしながら、もしここでア
クセプターの糖として例えばラクトースの様な２糖を用
いる場合に、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの中
にβ-ガラクトシダーゼが混在していると、そのβ-ガラ
クトシダーゼによりラクトースが加水分解されてしま
い、目的の３糖を合成することはできない。従って、２
糖以上の糖をアクセプターとする場合にはアクセプター
のオリゴ糖を加水分解する酵素を含まないβ−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼを用いる必要がある。しかしな
がら、微生物起源あるいは動物臓器起源の酵素混合物の
中から純粋になるまでβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼを精製することは多大の労力を要し、工業的生産に
用いる酵素としては現実的ではない。そのような純度の
高い酵素を得る方法としては、近年発達してきた遺伝子
工学的技術を利用して、β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼをコードする遺伝子を取得して、その酵素を大量
に発現させる方法が最も適していることがわかる。

【０００４】一方、微生物あるいは動物その他の自然界
からある酵素の遺伝子をクローニングし、それを同じあ
るいは別の微生物に移入して酵素活性を発現させること
は、現在では広く一般に行われている技術である。実際
に本発明者らは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspe
rgillus nidulans）のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼの遺伝子をクローニングし、それを酵母で発現させ
ることができることを報告している（金宣和、他、日本
生物工学会平成11年度大会）。

【０００５】ここで、食品あるいは食品添加物としての
オリゴ糖を合成する場合、そこで用いる酵素としては病
原菌由来の酵素ではなく、安全な微生物起源の酵素が好
ましい。そのような観点から考えると、これまでにも食
品製造に利用されている微生物の酵素の遺伝子を用いる
ことが安全性の面からも最適である。例えば麹菌として
食品製造に広く使用されいるアスペルギルス・オリゼー
のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの遺伝子をクロ
ーニングして、その遺伝子を再度食品製造に利用されて
いる微生物に導入し酵素を発現できれば、酵素自体に関
する安全性は極めて高いと言うことができる。従ってそ
のような安全な酵素を用いた糖転移反応で合成したした
オリゴ糖は、食品あるいは食品添加物として使用する際
の安全性は十分高いということができる。

【０００６】微生物起源のβ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼの遺伝子のクローニングということに関しても
これまでにもいくつか報告されている（A. Zhu, et a
l., Protein Expression and Purification, 8, 456-46
2, (1996)）。しかしながら、アスペルギルス・オリゼ
ーのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼに関しては、
酵素の精製(T. Mega et al., J. Biochem, 68, 109-117
(1970))、基質特異性(T.Mega et al., J. Biochem, 71,
107-114(1972))、糖転移反応によるオリゴ糖の調製法
(T. Mega et al., J. Biochem, 72, 1197-1203(1972))
に関しての報告はあるが、遺伝子に関してはこれまでに
報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明に於いては、食
品製造の面に於いて安全性が十分確かめられているアス
ペルギルス・オリゼーのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼの遺伝子のクローニングを行う。さらにその遺伝
子を、同じく安全性の高い食品製造用の微生物、例えば
サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）に導入し発現させ、オリゴ糖合成のために安全性
の高い酵素を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アスペル
ギルス・オリゼーのβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼの遺伝子のクローニングを行いその塩基配列を決定し
た。さらにその遺伝子を、同じく安全性の高い食品製造
用の微生物、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）に導入し発現させた。

【０００９】すなわち、本発明は、（１） アスペルギ
ルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のβ−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼをコードするDNA、（２）
配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
（３） 配列番号５に記載のDNA、（４） （１）〜
（３）のいずれかの遺伝子を含むベクター、（５）
（４）記載のベクターを含みβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼを産生することのできる形質転換体、（６）
（５）記載の形質転換体を用いるアスペルギルス・オ
リゼー由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの製
造方法、に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】即ち本発明者らは、これまでに遺
伝子がクローニングされているアスペルギルス・ニデュ
ランス, キャンディダ・アルビカンス（Candida albica
ns）, トリコデルマ・ハルジアナム（Tricoderma harzi
anum）のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の
塩基配列を比較し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼで保存されている領域を基にプライマーをデザインし
た（図１）。これらのプライマー、nagA560F（配列番
号：１）とnagA830R（配列番号：２）を用いてアスペル
ギルス・オリゼーのゲノムDNAをテンプレートとして94
℃ 30秒、50℃ 1分、72℃1分の条件でPCRを行った。増
幅されたDNA断片は270bpのDNA断片からなっており、ゲ
ノムライブラリ一から全長をスクリーニングするための
プローブとして用いた。プラークハイブリダイゼーショ
ンにより２個のポジティブクローンを取得した。さらに
２回目のプラークハイブリダイゼーションを行って得た
３個のポジティブクローンからファージDNAを回収し
た。目的の遺伝子をサブクローニングする目的で、回収
したファージDNAを５種の制限酵素で切断、DIG標識によ
るサザンブロッティングを行った。３個のポジティブク
ローンからのDNAの制限酵素切断とサザンブロッティン
グのパターンが同一であったことから、この３つのクロ
ーンは同一であることが判った。約９KbのBam HI断片を
pBluescript（STRATAGENE社より購入）にサブクローニ
ングし、両端から塩基配列を決定した。一方、約７Kbの
Eco RI断片をpBluescriptにサブクローニングし全長のD
NA断片をクローン化した。制限酵素地図を作製し（図
２）、さまざまな領域をサブクローニングし順次塩基配
列を決定した。この遺伝子のcDNAをβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ活性を持たないサッカロミセス・セレ
ビシアエ YPH500株に導入したところ、β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ活性が見られたため、この遺伝子
をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子であると
判断し、nagAと命名した。

【００１１】nagAゲノムDNAのシ一クエンスの結果を基
に、開始コドンを含む配列、並びに終始コドンを含む配
列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを合成した
（それぞれORYN（配列番号：３）及びORYC（配列番号：
４）と命名）。

【００１２】次に、本発明者らの所有しているアスペル
ギルス・オリゼー cDNA発現ライブラリー（酵母の発現
ベクター、pYES2に組み込んである）をテンプレートと
してプライマーORYN，ORYCを用いて94℃30秒、45℃30
秒、72℃1分30秒20サイクルのPCRを行った。この結果、
増幅された1800bpの断片の塩基配列を決定することによ
り、この断片がnagAのcDNAであることを確認した。

【００１３】クローニングしたnagA遺伝子のゲノムDNA
とcDNAの塩基配列を比較したところ、nagAは600個のア
ミノ酸からなる蛋白質であり、nagAにはイントロンがな
いことが判明した。

【００１４】サッカロミセス・セレビシアエ YPH500株
はβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産しないの
で、nagAがβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子
であれば、形質転換されたβ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ誘導株からβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼの活性が見いだされるはずである。発現ベクターpYES
2のGALl プロモーター下流にnagA cDNAを連結したプラ
スミドpYcNを作製した。これをサッカロミセス・セレビ
シアエ YPH500株に導入した。（図３）

【００１５】β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ導入
株と親株（サッカロミセス・セレビシアエ YPH500）をY
NBGal＋発色基質; X-GlcNAc (5-bromo-4-chloro-3-indo
lyl-Ｎ-acetyl-β-D-glucosaminide)プレートで生育さ
せ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性を観察
した。その結果、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
導入株ではβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性
が見いだされ（図４）、本発明が完成した。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１７】[実施例１] アスペルギルス・オリゼーの
nagA遺伝子のクローン化 アスペルギルス・ニデュランス, キャンディダ・アルビ
カンス（Candida albicans）, トリコデルマ・ハルジア
ナム（Tricoderma harzianum）のβ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼ遺伝子の塩基配列を比較し、β−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼで保存されている領域を基に
して、図１に示す２種類のプライマーを合成した。次
に、これらのプライマー、nagA560F（配列番号：１）と
nagA830R（配列番号：２）を用いてアスペルギルス・オ
リゼーのゲノムDNAをテンプレートとして94℃ 30秒、50
℃ 1分、72℃1分の条件でPCRを行った。ここでアスペル
ギルス.・オリゼーのゲノムDNAは以下のようにして調製
した。即ち、ガラスフィルターで集菌し、ペーパータオ
ルで脱水した菌体約0.5ｇを液体窒素で凍結し、直ちに
磨砕した。磨砕菌体を２mLのTEバッファー（pH 8.0）に
懸濁し、２mLの抽出バッファー（50mM EDTA, 0.5% SDS,
pH 8.0）を加え37℃で30分間インキュベートした。さ
らにフェノール・クロロホルム処理し、エタノール沈殿
を行うことによって得たDNAをTEバッファーに溶解し
た。このDNA溶液を37℃で30分間RNase処理し、再びフェ
ノール・クロロホルム処理し、エタノール沈殿を行うこ
とによりゲノムDNAを調製した。PCR反応はのEx Taqキッ
ト（宝酒造(株)）を用い、操作は添付の手順書に従っ
た。増幅されたDNA断片は270bpのDNA断片からなってお
り、ゲノムライブラリ一から全長をスクリーニングする
ためのプローブとして用いた。次に、このDNA断片をT4
ポリヌクレオチド・キナーゼ（宝酒造(株)）により³²P
放射能ラベルしたものをプローブとして、アスペルギル
ス・オリゼーのλDASH IIを用いたファージライブラリ
ー（国税庁醸造研究所）よりプラークハイブリダイゼー
ションを２回繰り返すことにより３個のポジティブクロ
ーンからファージDNAを回収した。 一連の操作はJ. Sam
brookらの方法（J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T.
Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Edition, (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従った。回
収したファージDNAを５種の制限酵素（BamHI、EcoRI、P
stI、EcoRV、SalI）で切断し、両端からShimadzu DSQ10
00 DNA Sequencerを用いてダイデオキシチェーンターミ
ネーター法により塩基配列を決定した。図２に示す制限
酵素地図を作製することにより、全領域の塩基配列（配
列番号：７）を決定した。コーディング領域は、配列番
号７に記載した配列の塩基番号301番目から2103番目の1
800bpからなり、600アミノ酸をコードしていると考えら
れた。配列番号５に、コーディング領域の塩基配列およ
び翻訳アミノ酸配列を併記した。配列番号７にもコーデ
ィング領域については翻訳アミノ酸配列を併記した。コ
ーディング領域のアミノ酸配列を配列番号６に示す。

【００１８】[実施例２] サッカロミセス・セレビシア
エ YPH500株によるnagA cDNAの発現 発現ベクターpYES2（Invitrogen社）のGALl プロモータ
ー下流にnagA cDNAを連結したプラスミドpYcNを作製し
た。これを標準的なリチウム法（H. Ito, Y. Fukuda,
K. Murata, and A. Kimura, Transformation of intact
yeast cells treated with alkaline cations. J. Bac
teriol., 153, 163-168 (1983),）によりサッカロミセ
ス・セレビシアエ YPH500株（Stratagene社）に導入し
た。このβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ導入株と
親株（サッカロミセス・セレビシアエ YPH500）を0.67
％のYeast nitrogen base w/o amino acids（Difco社）
＋ 2.0% ガラクトース＋X-GlcNAc （発色基質；5-bromo
-4-chloro-3-indolyl-Ｎ-acetyl-β-D-glucosaminide、
Sigma社）プレートで生育させ、β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼの活性を観察した。その結果、β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ導入株ではプレート上で発
色し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性が確
認された。

【００１９】

【発明の効果】本酵素を用いた糖転移反応により、GlcN
Acβ1-6Galβ1-4Glc、GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc、GlcNAc
β1-3Galβ1-4Glcをはじめとするいろいろな種類のオリ
ゴ糖を合成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ２種類のプライマーの配列を示す図である。

【図２】 アスペルギルス・オリゼーのβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼの制限酵素地図を示す図である。

【図３】 プラスミドpYcOの構築を示す図である。

【図４】 アスペルギルス・オリゼーのβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ遺伝子導入株（pYcN）と親株（Co
ntrol）のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を5
-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グ
ルコサミニドを基質に用いて測定した図である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Meiji Milk Products Co., Ltd. <120> Novel beta-N-acetylglucosaminidase <130> 00H002 <140> <141> <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 atcgcggact tatggttgat actgggagga ggaactt 37 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 2 ggcatatcaa tttccgggat cacacg 26 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 aatatcattc aattatgcgg at 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 aactatgttt actgaattgc 20 <210> 5 <211> 1800 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <220> <221> CDS <222> (1)..(1800) <400> 5 atg cgg att tcc cag atc tgc acc gtg ctc tcc acg gta acc tca gcc 48 Met Arg Ile Ser Gln Ile Cys Thr Val Leu Ser Thr Val Thr Ser Ala 1 5 10 15 gtc gct gtt ggt gta aat ccc ttg ccg gcg ccg cgc gag atc tcc tgg 96 Val Ala Val Gly Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Glu Ile Ser Trp 20 25 30 ggt tcc tcc ggt ccc aag tcc atc gcc gga gag ctg cag ctg cgc acc 144 Gly Ser Ser Gly Pro Lys Ser Ile Ala Gly Glu Leu Gln Leu Arg Thr 35 40 45 gac tct gac tcg gct gac ggg att gtg gcc gat gca tgg aat cgt gca 192 Asp Ser Asp Ser Ala Asp Gly Ile Val Ala Asp Ala Trp Asn Arg Ala 50 55 60 tgg gag acc ata gtc gcc ttg cga tgg gtc ccc gct gct acg gaa gct 240 Trp Glu Thr Ile Val Ala Leu Arg Trp Val Pro Ala Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 cct atc tcc tcc ttc gaa cct ttc cca acc ccc aca gcg ggc gct tcc 288 Pro Ile Ser Ser Phe Glu Pro Phe Pro Thr Pro Thr Ala Gly Ala Ser 85 90 95 aaa aag tcg aag cgc gcc tca aat tca ctg caa tat gtc aac gta caa 336 Lys Lys Ser Lys Arg Ala Ser Asn Ser Leu Gln Tyr Val Asn Val Gln 100 105 110 gtc aaa gac att gag gcc gat ctt cag cac ggt gtt gat gag tct tac 384 Val Lys Asp Ile Glu Ala Asp Leu Gln His Gly Val Asp Glu Ser Tyr 115 120 125 acg ctc gat gtc gag gag gat tca gat acc atc aca att aat gct gag 432 Thr Leu Asp Val Glu Glu Asp Ser Asp Thr Ile Thr Ile Asn Ala Glu 130 135 140 acc gtt tgg ggt gct ctg cat gca ttt acc act ctt caa cag ctg gtc 480 Thr Val Trp Gly Ala Leu His Ala Phe Thr Thr Leu Gln Gln Leu Val 145 150 155 160 ata tcc gat ggc cat ggc ggt ctg att atc gaa gag cca gtc aac atc 528 Ile Ser Asp Gly His Gly Gly Leu Ile Ile Glu Glu Pro Val Asn Ile 165 170 175 aaa gat tct cca ctt tat ccc tac cgt gga atc atg ctt gat act ggt 576 Lys Asp Ser Pro Leu Tyr Pro Tyr Arg Gly Ile Met Leu Asp Thr Gly 180 185 190 cgt aac ttc gtc tcc ctg ccc aaa ata ttc gaa cag ctg gag ggc atg 624 Arg Asn Phe Val Ser Leu Pro Lys Ile Phe Glu Gln Leu Glu Gly Met 195 200 205 tcc ctt tcg aaa ctc aac gtc ttg cac tgg cac ata gac gat gcg caa 672 Ser Leu Ser Lys Leu Asn Val Leu His Trp His Ile Asp Asp Ala Gln 210 215 220 tct tgg cct atc tgg gtc gac gtt tat ccc gag atg gtc aaa gat gct 720 Ser Trp Pro Ile Trp Val Asp Val Tyr Pro Glu Met Val Lys Asp Ala 225 230 235 240 tac tcg ccc cat gag ata tac tcg cgc aat gat gtc cgc aac att gtc 768 Tyr Ser Pro His Glu Ile Tyr Ser Arg Asn Asp Val Arg Asn Ile Val 245 250 255 aat tat gct cgg gct cgt ggt att cgt gtg att ccc gaa atc gac atg 816 Asn Tyr Ala Arg Ala Arg Gly Ile Arg Val Ile Pro Glu Ile Asp Met 260 265 270 cca agt cac tcc tcg tca ggc tgg aag caa gtt gac ccc gaa atg gtt 864 Pro Ser His Ser Ser Ser Gly Trp Lys Gln Val Asp Pro Glu Met Val 275 280 285 act tgc aca gat tcc tgg tgg tcc aat gat gac tgg cca ctc cat acc 912 Thr Cys Thr Asp Ser Trp Trp Ser Asn Asp Asp Trp Pro Leu His Thr 290 295 300 gcg gtt gag cca aat cca ggt cag ctt gac atc atc tac aac aag act 960 Ala Val Glu Pro Asn Pro Gly Gln Leu Asp Ile Ile Tyr Asn Lys Thr 305 310 315 320 tac gag gtc gtc ggc aat gtt tac aag gag ctg tcg gac att ttc cct 1008 Tyr Glu Val Val Gly Asn Val Tyr Lys Glu Leu Ser Asp Ile Phe Pro 325 330 335 gat cat tgg ttc cat gtc gga gga gac gag atc caa cct aac tgc ttc 1056 Asp His Trp Phe His Val Gly Gly Asp Glu Ile Gln Pro Asn Cys Phe 340 345 350 aat ttc agt acc cac gtc acc aag tgg ttt gct gag gat ccc tcg cgc 1104 Asn Phe Ser Thr His Val Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp Pro Ser Arg 355 360 365 acg tac cac gac ctg gct caa tac tgg gtt gat cat gct gtg cct att 1152 Thr Tyr His Asp Leu Ala Gln Tyr Trp Val Asp His Ala Val Pro Ile 370 375 380 ttc cag aac tac agc caa gaa cgc cgt ctg gtt atg tgg gag gac att 1200 Phe Gln Asn Tyr Ser Gln Glu Arg Arg Leu Val Met Trp Glu Asp Ile 385 390 395 400 gcg ctg tcc gcg gat aat gca cat gat gtg ccc aag aac att gta atg 1248 Ala Leu Ser Ala Asp Asn Ala His Asp Val Pro Lys Asn Ile Val Met 405 410 415 cag agc tgg aac aat ggt cta gag tac atc tca aac ttg acc gct aga 1296 Gln Ser Trp Asn Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Ser Asn Leu Thr Ala Arg 420 425 430 ggc tac gac gtc atc gtg tct tcc tct gac ttt ctg tac ctg gac tgt 1344 Gly Tyr Asp Val Ile Val Ser Ser Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys 435 440 445 ggt cat gga ggc ttt gtc acc aac gat ccg cgg tac aat gtg atg gct 1392 Gly His Gly Gly Phe Val Thr Asn Asp Pro Arg Tyr Asn Val Met Ala 450 455 460 aac cca gat gcg aat acc cct aac ttc aac tat ggg ggc aat gga gga 1440 Asn Pro Asp Ala Asn Thr Pro Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asn Gly Gly 465 470 475 480 tcg tgg tgc gcc cct tac aaa acc tgg caa cgt atc tac gac tac gac 1488 Ser Trp Cys Ala Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp 485 490 495 ttc act ctc aac ctc act gag acg caa gct aag cat atc att ggc gca 1536 Phe Thr Leu Asn Leu Thr Glu Thr Gln Ala Lys His Ile Ile Gly Ala 500 505 510 acc gct cct ctt tgg ggc gag caa gtt gat gat atc aac gtc tct agc 1584 Thr Ala Pro Leu Trp Gly Glu Gln Val Asp Asp Ile Asn Val Ser Ser 515 520 525 atg ttc tgg cct cgt gct gca gct ctg gca gag cta gtc tgg tcc gga 1632 Met Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Leu Val Trp Ser Gly 530 535 540 aac cgc gac gct aat ggc aac aag cgc acc acg gag atg aca cag cgt 1680 Asn Arg Asp Ala Asn Gly Asn Lys Arg Thr Thr Glu Met Thr Gln Arg 545 550 555 560 atc ctc aac ttc cgt gaa tac ctc gtt gcg aat ggt gtt cag gct caa 1728 Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Gln 565 570 575 gct ctg gtt ccg aag tac tgc ttg caa cat cct cat gct tgc gat ctc 1776 Ala Leu Val Pro Lys Tyr Cys Leu Gln His Pro His Ala Cys Asp Leu 580 585 590 tac cgt aac caa gcc gca att cag 1800 Tyr Arg Asn Gln Ala Ala Ile Gln 595 600 <210> 6 <211> 600 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 6 Met Arg Ile Ser Gln Ile Cys Thr Val Leu Ser Thr Val Thr Ser Ala 1 5 10 15 Val Ala Val Gly Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Glu Ile Ser Trp 20 25 30 Gly Ser Ser Gly Pro Lys Ser Ile Ala Gly Glu Leu Gln Leu Arg Thr 35 40 45 Asp Ser Asp Ser Ala Asp Gly Ile Val Ala Asp Ala Trp Asn Arg Ala 50 55 60 Trp Glu Thr Ile Val Ala Leu Arg Trp Val Pro Ala Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Pro Ile Ser Ser Phe Glu Pro Phe Pro Thr Pro Thr Ala Gly Ala Ser 85 90 95 Lys Lys Ser Lys Arg Ala Ser Asn Ser Leu Gln Tyr Val Asn Val Gln 100 105 110 Val Lys Asp Ile Glu Ala Asp Leu Gln His Gly Val Asp Glu Ser Tyr 115 120 125 Thr Leu Asp Val Glu Glu Asp Ser Asp Thr Ile Thr Ile Asn Ala Glu 130 135 140 Thr Val Trp Gly Ala Leu His Ala Phe Thr Thr Leu Gln Gln Leu Val 145 150 155 160 Ile Ser Asp Gly His Gly Gly Leu Ile Ile Glu Glu Pro Val Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Ser Pro Leu Tyr Pro Tyr Arg Gly Ile Met Leu Asp Thr Gly 180 185 190 Arg Asn Phe Val Ser Leu Pro Lys Ile Phe Glu Gln Leu Glu Gly Met 195 200 205 Ser Leu Ser Lys Leu Asn Val Leu His Trp His Ile Asp Asp Ala Gln 210 215 220 Ser Trp Pro Ile Trp Val Asp Val Tyr Pro Glu Met Val Lys Asp Ala 225 230 235 240 Tyr Ser Pro His Glu Ile Tyr Ser Arg Asn Asp Val Arg Asn Ile Val 245 250 255 Asn Tyr Ala Arg Ala Arg Gly Ile Arg Val Ile Pro Glu Ile Asp Met 260 265 270 Pro Ser His Ser Ser Ser Gly Trp Lys Gln Val Asp Pro Glu Met Val 275 280 285 Thr Cys Thr Asp Ser Trp Trp Ser Asn Asp Asp Trp Pro Leu His Thr 290 295 300 Ala Val Glu Pro Asn Pro Gly Gln Leu Asp Ile Ile Tyr Asn Lys Thr 305 310 315 320 Tyr Glu Val Val Gly Asn Val Tyr Lys Glu Leu Ser Asp Ile Phe Pro 325 330 335 Asp His Trp Phe His Val Gly Gly Asp Glu Ile Gln Pro Asn Cys Phe 340 345 350 Asn Phe Ser Thr His Val Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp Pro Ser Arg 355 360 365 Thr Tyr His Asp Leu Ala Gln Tyr Trp Val Asp His Ala Val Pro Ile 370 375 380 Phe Gln Asn Tyr Ser Gln Glu Arg Arg Leu Val Met Trp Glu Asp Ile 385 390 395 400 Ala Leu Ser Ala Asp Asn Ala His Asp Val Pro Lys Asn Ile Val Met 405 410 415 Gln Ser Trp Asn Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Ser Asn Leu Thr Ala Arg 420 425 430 Gly Tyr Asp Val Ile Val Ser Ser Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys 435 440 445 Gly His Gly Gly Phe Val Thr Asn Asp Pro Arg Tyr Asn Val Met Ala 450 455 460 Asn Pro Asp Ala Asn Thr Pro Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asn Gly Gly 465 470 475 480 Ser Trp Cys Ala Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp 485 490 495 Phe Thr Leu Asn Leu Thr Glu Thr Gln Ala Lys His Ile Ile Gly Ala 500 505 510 Thr Ala Pro Leu Trp Gly Glu Gln Val Asp Asp Ile Asn Val Ser Ser 515 520 525 Met Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Leu Val Trp Ser Gly 530 535 540 Asn Arg Asp Ala Asn Gly Asn Lys Arg Thr Thr Glu Met Thr Gln Arg 545 550 555 560 Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Gln 565 570 575 Ala Leu Val Pro Lys Tyr Cys Leu Gln His Pro His Ala Cys Asp Leu 580 585 590 Tyr Arg Asn Gln Ala Ala Ile Gln 595 600 <210> 7 <211> 2267 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <220> <221> CDS <222> (301)..(2103) <400> 7 ccttcggaat cctgggactc attctcgaac gtatctcgat ccctctgttc ccctgcagat 60 tcttggtgaa atgagaagga tggtgaccgg tatggtggat ggaatgccaa cagagaaagg 120 gatcgacatt accaaccctt gactgaatca atccactatc gattattttg cctagtcttt 180 aagctcgccc ttccctcaca gccttatcta ctgcatttcc ttttctcttt tcttttttta 240 ttcccttgtg cgaacaacaa ctctttacgc cagggttgtc tcaagcaata tcattcaatt 300 atg cgg att tcc cag atc tgc acc gtg ctc tcc acg gta acc tca gcc 348 Met Arg Ile Ser Gln Ile Cys Thr Val Leu Ser Thr Val Thr Ser Ala 1 5 10 15 gtc gct gtt ggt gta aat ccc ttg ccg gcg ccg cgc gag atc tcc tgg 396 Val Ala Val Gly Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Glu Ile Ser Trp 20 25 30 ggt tcc tcc ggt ccc aag tcc atc gcc gga gag ctg cag ctg cgc acc 444 Gly Ser Ser Gly Pro Lys Ser Ile Ala Gly Glu Leu Gln Leu Arg Thr 35 40 45 gac tct gac tcg gct gac ggg att gtg gcc gat gca tgg aat cgt gca 492 Asp Ser Asp Ser Ala Asp Gly Ile Val Ala Asp Ala Trp Asn Arg Ala 50 55 60 tgg gag acc ata gtc gcc ttg cga tgg gtc ccc gct gct acg gaa gct 540 Trp Glu Thr Ile Val Ala Leu Arg Trp Val Pro Ala Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 cct atc tcc tcc ttc gaa cct ttc cca acc ccc aca gcg ggc gct tcc 588 Pro Ile Ser Ser Phe Glu Pro Phe Pro Thr Pro Thr Ala Gly Ala Ser 85 90 95 aaa aag tcg aag cgc gcc tca aat tca ctg caa tat gtc aac gta caa 636 Lys Lys Ser Lys Arg Ala Ser Asn Ser Leu Gln Tyr Val Asn Val Gln 100 105 110 gtc aaa gac att gag gcc gat ctt cag cac ggt gtt gat gag tct tac 684 Val Lys Asp Ile Glu Ala Asp Leu Gln His Gly Val Asp Glu Ser Tyr 115 120 125 acg ctc gat gtc gag gag gat tca gat acc atc aca att aat gct gag 732 Thr Leu Asp Val Glu Glu Asp Ser Asp Thr Ile Thr Ile Asn Ala Glu 130 135 140 acc gtt tgg ggt gct ctg cat gca ttt acc act ctt caa cag ctg gtc 780 Thr Val Trp Gly Ala Leu His Ala Phe Thr Thr Leu Gln Gln Leu Val 145 150 155 160 ata tcc gat ggc cat ggc ggt ctg att atc gaa gag cca gtc aac atc 828 Ile Ser Asp Gly His Gly Gly Leu Ile Ile Glu Glu Pro Val Asn Ile 165 170 175 aaa gat tct cca ctt tat ccc tac cgt gga atc atg ctt gat act ggt 876 Lys Asp Ser Pro Leu Tyr Pro Tyr Arg Gly Ile Met Leu Asp Thr Gly 180 185 190 cgt aac ttc gtc tcc ctg ccc aaa ata ttc gaa cag ctg gag ggc atg 924 Arg Asn Phe Val Ser Leu Pro Lys Ile Phe Glu Gln Leu Glu Gly Met 195 200 205 tcc ctt tcg aaa ctc aac gtc ttg cac tgg cac ata gac gat gcg caa 972 Ser Leu Ser Lys Leu Asn Val Leu His Trp His Ile Asp Asp Ala Gln 210 215 220 tct tgg cct atc tgg gtc gac gtt tat ccc gag atg gtc aaa gat gct 1020 Ser Trp Pro Ile Trp Val Asp Val Tyr Pro Glu Met Val Lys Asp Ala 225 230 235 240 tac tcg ccc cat gag ata tac tcg cgc aat gat gtc cgc aac att gtc 1068 Tyr Ser Pro His Glu Ile Tyr Ser Arg Asn Asp Val Arg Asn Ile Val 245 250 255 aat tat gct cgg gct cgt ggt att cgt gtg att ccc gaa atc gac atg 1116 Asn Tyr Ala Arg Ala Arg Gly Ile Arg Val Ile Pro Glu Ile Asp Met 260 265 270 cca agt cac tcc tcg tca ggc tgg aag caa gtt gac ccc gaa atg gtt 1164 Pro Ser His Ser Ser Ser Gly Trp Lys Gln Val Asp Pro Glu Met Val 275 280 285 act tgc aca gat tcc tgg tgg tcc aat gat gac tgg cca ctc cat acc 1212 Thr Cys Thr Asp Ser Trp Trp Ser Asn Asp Asp Trp Pro Leu His Thr 290 295 300 gcg gtt gag cca aat cca ggt cag ctt gac atc atc tac aac aag act 1260 Ala Val Glu Pro Asn Pro Gly Gln Leu Asp Ile Ile Tyr Asn Lys Thr 305 310 315 320 tac gag gtc gtc ggc aat gtt tac aag gag ctg tcg gac att ttc cct 1308 Tyr Glu Val Val Gly Asn Val Tyr Lys Glu Leu Ser Asp Ile Phe Pro 325 330 335 gat cat tgg ttc cat gtc gga gga gac gag atc caa cct aac tgc ttc 1356 Asp His Trp Phe His Val Gly Gly Asp Glu Ile Gln Pro Asn Cys Phe 340 345 350 aat ttc agt acc cac gtc acc aag tgg ttt gct gag gat ccc tcg cgc 1404 Asn Phe Ser Thr His Val Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp Pro Ser Arg 355 360 365 acg tac cac gac ctg gct caa tac tgg gtt gat cat gct gtg cct att 1452 Thr Tyr His Asp Leu Ala Gln Tyr Trp Val Asp His Ala Val Pro Ile 370 375 380 ttc cag aac tac agc caa gaa cgc cgt ctg gtt atg tgg gag gac att 1500 Phe Gln Asn Tyr Ser Gln Glu Arg Arg Leu Val Met Trp Glu Asp Ile 385 390 395 400 gcg ctg tcc gcg gat aat gca cat gat gtg ccc aag aac att gta atg 1548 Ala Leu Ser Ala Asp Asn Ala His Asp Val Pro Lys Asn Ile Val Met 405 410 415 cag agc tgg aac aat ggt cta gag tac atc tca aac ttg acc gct aga 1596 Gln Ser Trp Asn Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Ser Asn Leu Thr Ala Arg 420 425 430 ggc tac gac gtc atc gtg tct tcc tct gac ttt ctg tac ctg gac tgt 1644 Gly Tyr Asp Val Ile Val Ser Ser Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys 435 440 445 ggt cat gga ggc ttt gtc acc aac gat ccg cgg tac aat gtg atg gct 1692 Gly His Gly Gly Phe Val Thr Asn Asp Pro Arg Tyr Asn Val Met Ala 450 455 460 aac cca gat gcg aat acc cct aac ttc aac tat ggg ggc aat gga gga 1740 Asn Pro Asp Ala Asn Thr Pro Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asn Gly Gly 465 470 475 480 tcg tgg tgc gcc cct tac aaa acc tgg caa cgt atc tac gac tac gac 1788 Ser Trp Cys Ala Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr Asp Tyr Asp 485 490 495 ttc act ctc aac ctc act gag acg caa gct aag cat atc att ggc gca 1836 Phe Thr Leu Asn Leu Thr Glu Thr Gln Ala Lys His Ile Ile Gly Ala 500 505 510 acc gct cct ctt tgg ggc gag caa gtt gat gat atc aac gtc tct agc 1884 Thr Ala Pro Leu Trp Gly Glu Gln Val Asp Asp Ile Asn Val Ser Ser 515 520 525 atg ttc tgg cct cgt gct gca gct ctg gca gag cta gtc tgg tcc gga 1932 Met Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Ala Glu Leu Val Trp Ser Gly 530 535 540 aac cgc gac gct aat ggc aac aag cgc acc acg gag atg aca cag cgt 1980 Asn Arg Asp Ala Asn Gly Asn Lys Arg Thr Thr Glu Met Thr Gln Arg 545 550 555 560 atc ctc aac ttc cgt gaa tac ctc gtt gcg aat ggt gtt cag gct caa 2028 Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Gln Ala Gln 565 570 575 gct ctg gtt ccg aag tac tgc ttg caa cat cct cat gct tgc gat ctc 2076 Ala Leu Val Pro Lys Tyr Cys Leu Gln His Pro His Ala Cys Asp Leu 580 585 590 tac cgt aac caa gcc gca att cag taa acatagttgc tcacttgatt 2123 Tyr Arg Asn Gln Ala Ala Ile Gln 595 600 actcgtgtgc tttggttcat tgggtggcta agcataacat gggatgtaca tagcaacaat 2183 tcggatagca ccctcttgtc acgttttcag tgttacctat ttaattttga ttagcttctt 2243 accagcccac gtgcgatcga gcag 2267

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/24 (Ｃ１２Ｎ 9/24 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/24 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 鯵坂 勝美 神奈川県小田原市成田540番地 明治乳業 株式会社ヘルスサイエンス研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA12 CA04 DA12 EA04 GA11 HA20 4B050 CC03 DD03 LL05 4B065 AA63Y AA80X AB01 AC14 BA02 CA31 CA41 CA44

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスペルギルス・オリゼー（Aspergillu
   s oryzae）由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
   をコードするDNA。
2. 【請求項２】 配列番号６に記載のアミノ酸配列をコー
   ドするDNA。
3. 【請求項３】 配列番号５に記載のDNA。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかの遺伝子を含む
   ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載のベクターを含みβ−Ｎ−
   アセチルグルコサミニダーゼを産生することのできる形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を用いるアス
   ペルギルス・オリゼー由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサ
   ミニダーゼの製造方法。