JP3504672B2 - ペニオフォラ・フィターゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はフィターゼ活性を示す単離されたポリペプチ
ド、対応のクローン化DNA配列、当該ポリペプチドを調
製するための方法、並びに数多くの産業上の利用、特に
動物飼料におけるその利用に関する。

発明の背景 フィチン酸又はミオ−イノシトール1,2,3,4,5,6−ヘ
キサキス二水素リン酸塩（又は短くは、ミオ−イノシト
ールヘキサキスリン酸塩）はイノシトールの主要源であ
り、且つ植物種子におけるリン酸塩の主要貯蔵体であ
る。事実、それは種子及びシリアル穀粒の成熟の際に天
然に形成される。マメ類の種子の中でそれはリン酸含量
の約70％を占め、そしてイノシトールの複合カリウム、
マグネシウム及びカルシウム塩であるフィチンとしてタ
ンパク質体と構造的に一体化している。種子、穀粒及び
マメ類は食品及び飼料調製品、特に動物飼料調製品の重
要な成分である。しかしながら、ヒト食用シリアル及び
マメ類においてもその重要性は高まっている。

フィチン酸のリン酸成分は二価及び三価の陽イオン、
例えば金属イオン、とりわけカルシウム、鉄、亜鉛及び
マグネシウム、並びに微量ミネラルであるマンガン、銅
及びモリブデンの栄養学的に必須のイオンをキレートす
る。

他に、フィチン酸は一定の範囲で静電相互作用により
タンパク質に結合する。タンパク質の等電点pIより低い
pHでは、正に帯電したタンパク質がフィテートに直接結
合する。pIより高いpHでは、負に帯電したタンパク質が
金属イオンを介してフィテートに結合する。

フィチン酸及びその塩、フィテートは往々にして代謝
されず、なぜならそれらは胃腸系で吸収されないからで
ある。即ち、そのリン、又はキレート化金属イオン、又
は結合タンパク質はいづれも栄養学的に有用でない。

従って、リンは全ての生体の成育にとって必須の元素
であるため、食品及び飼料調製品に無機リン酸塩を補充
する必要がある。しばしば、栄養学的に必須のイオン、
例えば鉄及びカルシウムも補充しなければならない。更
に、一定の食品の栄養価値はフィチン酸とのタンパク質
の結合を理由に低下する。従って、フィチン酸は往々に
してアンチ栄養因子と称される。

更に、フィチン酸は代謝されないため、フィテートの
リンはかかる動物の胃腸管を通過し、そして排泄物と一
緒に排泄されるため、水環境の富栄養化及び過度な藻の
成育の如きに結びつく環境の所望されないリン酸汚染を
もたらす。

本明細書において同義語で又は無作為に用いているフ
ィチン酸又はフィテートはフィターゼにより分解され
る。

フィチン酸を含むこのような植物種子のほとんどにお
いて、内因性フィターゼ酵素も見い出されている。これ
らの酵素は種子の発芽の際に形成され、そしてリン酸
塩、そして最終産物として植物成長の際に利用するため
の遊離ミオイノシトールの遊離を目的を達成する。

摂取されると、食品又は飼料成分フィターゼは理論的
には注目の種子の内因性植物フィターゼにより、腸の中
の微生物叢よりせき止められたフィターゼにより、そし
て腸内粘膜フィターゼにより加水分解される。しかしな
がら実際、内因性植物フィターゼ及び腸内粘膜フィター
ゼの加水分解能力は、存在するなら、フィターゼの結合
又は構成成分の生物有用性を有意に高めるにははるかに
及ばない。しかしながら、食品又は飼料を調製するプロ
セスが発芽、発酵又は浸漬を包含するなら、この内因性
フィターゼはフィターゼの分解にかなり貢献しうる。

反すう又は多胃系動物、例えばウマ及びウシにおい
て、その胃腸系はフィチン酸を分解できる微生物を宿し
ている。しかしながら、これは単胃系動物、例えばヒ
ト、家禽及びブタにおいては当てはまらない。従って、
上記の問題はかかる単胃系動物にとっての主たる問題で
ある。

植物及び微生物によるフィターゼの産生が報告されて
いる。微生物のうち、フィターゼ産生細菌及びフィター
ゼ産生真菌が知られている。

植物界からは、例えばコムギ−ブランフィターゼが公
知である（Thomlinsonら、Biochemistry,1（1962）,166
−171）。ユリ花粉由来のアルカリ性フィターゼがBarri
entosら、Plant.Physiol.,106（1994）,1489−1495によ
り発表されている。

細菌のうちで、バチルス・スブチリス（Bacillus sub
tilis）（Paver and Jagannathan,1982,Journal of Bac
teriology 151:1102−1108）及びシュードモナス（Pseu
domonas）（Cosgrove,1970,Australian Journal of Bio
logical Sciences 23:1207−1220）に由来するフィター
ゼが発表されている。更にまた、E.コリ由来のフィター
ゼがGreinerらArch.Biochem.Biophys.,303,107−113,19
93）により精製且つ特性決定されている。しかしなが
ら、この酵素はおそらくは酸性ホスファターゼである。

フィターゼ産生酵母、例えばカッカロマイセス・セレ
ビジエ（Saccharomyces cerevisiae）も発表されている
（Nayiniら、1984,Lebensmittel Wissenschaft und Tec
hnologie 17:24−26）、しかしながら、この酵素はおそ
らくはミオ−イノシトールモノホスファターゼである
（Wodzinskiら、Adv.Appl.Microbiol.,42,263−303）。
AU−Ａ−24840/95は酵母シュバンニオマイセス・オクシ
デンタリス（Schwanniomyces occidentalis）のフィタ
ーゼのクローニング及び発現を発表している。

フィターゼ産生糸状菌のいくつかの発表があるが、し
かしながらそれらは子嚢菌類の真菌門に属するものばか
りである。特に、アスペルギルス（Aspergillus）属の
フィターゼ産生子嚢菌類、例えばアスペルギルス・テレ
ウス（Aspergillus terreus）についてのいくつかの文
献がある（Yamadaら、1986,Agric.Biol.Chem.322:1275
−1282）。また、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ
（A.niger var.awamori）からのフィターゼ遺伝子のク
ローニング及び発現が発表されている（Piddingtonら、
1993,Gene 133:55−62）。EP 0,420,358号はアスペルギ
ルス・フィキュウム（A.ficuum）（ニガー（niger））
のクローニング及び発現を発表している。EP 0,684,313
号には子嚢菌類マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myce
liophthora thermophila）及びアスペルギルス・テレウ
ス（A.terreus）のフィターゼのクローニング及び発現
が記載されている。

フィターゼの命名及び位置特異性 本明細書において、フィターゼはフィテート（ミオ−
イノシトールヘキサキスリン酸塩）の（１）ミオ−イノ
シトール並びに／又は（２）そのモノ−、ジ−、トリ
−、テトラ−及び／もしくはペンタ−リン酸塩、並びに
（３）無機リン酸塩に至る加水分解を触媒する酵素であ
る。以下において、上記の化合物時折省略してIP6,I,IP
1,IP2,IP3,IP4,IP5及びＰそれぞれと称することがあ
る。これは、フィターゼの作用により、IP6がＰと、１
又は複数の成分IP5,IP4,IP3,IP2,IP1及びＩへと分解さ
れることを意味する。他に、位置p,q,r…に付加された
ｎ個のリン酸基を全部で担持するミオ−イノシトールを
Ins（p,q,r…）P_nと命名する。便宜上、Ins（1,2,3,4,
5,6）P₆（フィチン酸）はPAと略す。

酵素命名データーベースExPASy（EC（酵素分解）の付
与された特定の酵素のそれぞれのタイプの記載されたIn
ternational Union of Biochemistry and Molecular Bi
ology（IUBMB）の命名協会の推奨に主に基づく酵素命名
に関する情報保存）に従うと、２種類のタイプのフィタ
ーゼが知られている：いわゆる３−フィターゼ（ミオ−
イノシトール六リン酸３−ホスホヒドロラーゼEC 3.1.
3.8）及びいわゆる６−フィターゼ（ミオイノシトール
六リン酸６−ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.26）。３
−フィターゼはまず３位のエステル結合を加水分解し、
一方６−フィターゼはまず６位のエステル結合を加水分
解する。

イノシトールホスフェート命名法 フィチン酸に作用するフィターゼの一次加水分解産物
を考慮し、得られるエステルの一部はジアステレオマー
であり、そして一部は鏡像異性体である。一般に、ジア
ステレオマー同志は異なる物理特性を有するため区別し
易く、一方互いの鏡像である鏡像異性体同志は区別しに
くい。

かくして、Ins（1,2,4,5,6）P₅（３−リン酸塩除去）
及びIns（1,2,3,4,5）P₅（６−リン酸塩除去）はジアス
テレオマーであり、そして区別し易く、一方Ins（1,2,
4,5,6）P₅（３−リン酸塩除去）及びIns（2,3,4,5,6）P
₅（１−リン酸塩除去）は鏡像異性体である。これはIns
（1,2,3,4,5）P₅（６−リン酸塩除去）及びIns（1,2,3,
5,6）P₅（４−リン酸塩除去）の組にも当てはまる。従
って、フィチン酸のフィターゼ触媒加水分解の第一段階
より得られる６ペンタ−リン酸エステルのうち、２−,3
−,5−及び６−リン酸塩の除去されたエステル同志しか
容易に区別できず、即ち、４通りのジアステレオマーし
か得られず、残り２通りのエステルはそれぞれかかる化
合物の各々の鏡像異性体である（４−及び６−、同様に
１−及び３−が鏡像異性体である）。

最小ローカント則の利用 表示Ins（2,3,4,5,6）P₅及びIns（1,2,3,5,6）P₅を利
用する場合、ミオ−イノシトールの原子番号上の従来の
推奨の緩和が適用される。最小ローカント則のこの緩和
は著者が構造関係を持ち出すことを希望する場合常にIn
ternational Union of Biochemistryの命名協会により
推奨される通りである（Biochem.J.（1989）258,1−
２）。

この最小ローカント則において、Ｌ−及びＤ−命名法
が推奨される：ミオイノシトールのリン酸エステル、イ
ノシトールホスフェートは一般に1D−（又は1L−）−In
s（r,s,t,u,w,x）P_nと表示され、ｎはリン酸基を示し、
そしてローカントr,s,t,u,w及びｘはその位置を表わ
す。位置は上述のInternational Union of Biochemistr
yの命名協会（NC−IUB）に従って番号付けられ、そして
1D又は1Lは置換基が最低限の可能性のあるローカント又
は数値を有するように用いている（「最小ローカント
則」）。

フィターゼ特異体 前述の通り、フィターゼは一次加水分解工程における
その特異性に従って、即ち、どのリン酸エステル基が最
初に加水分解されるかに従って分類される。

既知のフィターゼの特異性に従うと、植物フィターゼ
は一般に６−フィターゼと称されている。しかしなが
ら、ユリ花粉フィターゼは５−フィターゼと称されてい
る。微生物由来フィターゼは主に３−フィターゼと称さ
れている。例えば、上述のExPASyベーターベースはアス
ペルギルス・アワモリ（Asperigillus awamori）（株AL
KO243）及びアスペルギルス・ニガー（株NRRL 3135）の
４種類のフィターゼについて３−フィターゼと称してい
る（Gene 133:55−62（1993）及びGene 127:87−94（19
93））。

Ｄ−/L−表示を利用する（ここでＤ−及びＬ−形態は
１−位に関する）、コムギ−ブランフィターゼはまずＬ
−６位のリン酸エステル基（＝Ｄ−４）を加水分解し、
一方３−フィターゼはＤ−３位のリン酸エステル基（＝
Ｌ−１）を加水分解する。

その特異性は幾通りかの方法、例えばHPLC又はNMRス
ペクトルにより調べることができる。しかしながら、こ
れらの方法は例えばＤ−６及びＬ−６位におけるリン酸
エステル基の加水分解は直ちに区別できず、なぜなら加
水分解産物Ｄ−Ins（1,2,3,4,5）P₅及びＬ−Ins（1,2,
3,4,5）P₅は鏡像異性体であり（鏡像）、それ故同一のN
MRスペクトルを有するからである。

換言すれば、本明細書において、６−フィターゼはＬ
−６−もしくはＤ−６−フィターゼのいづれか、又はそ
の両者を意味し、即ち、フィターゼはＬ−６−フィター
ゼ、Ｄ−６−フィターゼ又は（（Ｄ−６−）＋（Ｌ−６
−））−フィターゼ（共に活性を有する）である。この
後者は時折D/L−６−フィターゼとも表示されている。

発明の概要 本発明の目的は様々なフィターゼ、詳しくは増強した
熱安定性又はフィテートからのリン酸塩のより迅速な放
出の如き優れた特性を有し、且つ商業的に有用な量で生
産されうるフィターゼの提供にある。

本発明者は驚くべきことにフィターゼ活性を示す酵素
がウロコタケ目の株（Stereales）、特にカクタケ（Pen
iophoraceae）科の株、より詳しくはペニオフォラ・ラ
イチイ（Peniophora lycii）の真菌株から得られること
ができることをこの度見い出し、そして当該酵素をコー
ドするDNA配列のクローニングの成功を収めた。DNA配列
及び推定アミノ酸配列はそれぞれ配列表の中にSEQ ID N
o.1及びNo.2で挙げている。

以下の実験の章において更に概略する通り、この新規
のフィターゼは驚くべきことにフィチン酸からのリンの
早い初期遊離を、特に既知のフィターゼ（アスペルギル
ス・ニガーフィターゼ、Phytase Novo（登録商標））と
比べてもつようになっている。これはpH3.5及びpH5.5で
の関連コーンアッセイ用途並びにNMR−研究において示
されている。

更にまた、本発明のフィターゼは興味深い異なる分解
プロフィールを有するようになっている。pH3.5では、
それはフィチン酸の６位及び３位に対して高い初期親和
性を示す新規のフィターゼのクラスに属し、換言すれば
それは３−フィターゼでも６−フィターゼでもなく、い
かなるフィターゼについて今までに報告されているもの
よりも弱く位置特異的である。しかしながら、pH5.5で
はそれは６−フィターゼに分類されるであろう。

また、ペニオフォラ・ライチイの比活性は非常に高レ
ベルであり、即ち200より高く、好ましくは400より高
く、特に600より高く、特に800より高く、最も好ましく
は約1000FYT/mgであり、実施例4aに言及している。これ
は少なくとも真菌フィターゼについてはあまり予測でき
ないことである（既知のアスペルギルスフィターゼは約
180FYT/mgの比活性しかもたない）。

ウロコタケ目は帽菌類（Hymenomycetes）の真菌綱及
び担子菌類の真菌門に属する。既知のフィターゼ産生真
菌は子嚢菌類の門に属する。

第一の観点において、本発明はフィターゼ活性を有
し、且つSEQ ID No.2のアミノ酸配列もしくはそのアミ
ノ酸31〜439の配列、又はこれらの配列のいづれかと少
なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を有する単
離ポリペプチドに関する。

更なる観点において、本発明は上記ポリペプチドをコ
ードするクローン化DNA配列、並びにこのようなクロー
ン化DNA配列を含んで成るベクター及び宿主細胞を提供
する。

本発明の範囲に属する更なる別の観点にあるのはフィ
チン酸からの無機リン酸塩の遊離のための本発明のフィ
ターゼの利用、並びに幾通りかの更なる特異的な利用及
び組成物、特に本発明のフィターゼを含んで成る食品及
び飼料調製品及び添加物である。

一般に、本明細書において用いる用語及び表現は当業
界における通常の意味と解釈される。しかしながら、疑
いが生じたときは、本明細書の定義が有用となりうる。

一般定義 「フィターゼ酵素を有する／示す単離されたポリペプ
チド／酵素」又は「単離されたフィターゼ」なる表現は
フィターゼ活性を有し（下記参照）且つ本質的にその他
の非フィターゼポリペプチドを含まない。例えばSDS−P
AGEによる決定に従い少なくとも約20％の純度、好まし
くは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の
純度、更により好ましくは約80％の純度、最も好ましく
は約90％の純度、そして更に最も好ましくは約95％の純
度である任意のペプチド又はタンパク質を意味する。時
折り、かかるポリペプチドは「精製フィターゼ」と称す
ることがある。

「単離されたポリペプチド」の定義はまた別のポリペ
プチドがそのポリペプチド又はフラグメントのＮ−末端
又はＣ−末端に融合している融合ポリペプチド又は切断
可能融合ポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは本発
明の核酸配列（又はその一部）に別のポリペプチドをコ
ードする核酸配列（又はその一部）を融合することによ
り作る。融合ポリペプチドを作るための技術は当業界に
おいて公知であり、そして当該ポリペプチドをコードす
るコード配列をそれらがイン・フレームとなり、且つ融
合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミ
ネーターのコントロール下となるようにライゲーション
させることを含む。

「フィターゼ活性を示すポリペプチド又は酵素」又は
「フィターゼ」なる表現は様々なミオ−イノシトールリ
ン酸塩から無機リン酸塩又はリンの遊離を及ぼすことが
できる全ての酵素を包括することを意味する。かかるミ
オ−イノシトールリン酸塩（フィターゼ基質）の例はフ
ィチン酸及び任意のその塩、例えばフィチン酸ナトリウ
ムもしくはフィチン酸カリウム又はその複合塩である。
また、ミオ−イノシトールのモノ−、ジ−、トリ−、テ
トラ−又はペンタ−リン酸塩の任意の立体異性体がフィ
ターゼ基質を担いうる。

上記の定義に従うと、フィターゼ活性はこのような基
質のいづれかを利用する任意のアッセイを利用して決定
できる。本明細書において（何らかのことわりのない限
り）、フィターゼ活性はFYT単位で決定され、ここで1FY
Tは下記の条件下で１分当り１μmolの無機オルト−リン
酸塩を遊離する酵素の量である:pH5.5;温度37℃；基質
0.0050mol/の濃度のフィチン酸ナトリウム（C₆H₆O₂₄P
₆Na₁₂）。適当なフィターゼアッセイは実験の部に記載
されている。

「ポリペプチド相同性」又は「アミノ酸相同性」は二
本の配列間の同一の程度として決定される。この相同性
は当業界において公知のコンピュータープログラム、例
えばGCGバージョン８プログラムパッケージにおいて供
されているGAP（Program Manual for the Wisconsin Pa
ckage,Version 8,Genetics Computer Group,575 Scienc
e Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711）（Needleman,
S.B.and Wunsch,C.D.,（1970）,Journal of Molecular
Biology,48,443−453）により、ポリペプチド配列につ
いて下記の設定値を有するGAPを利用して適切に決定さ
れうる（5.0のGAP構築ペナルティー及び0.3のGAP伸長ペ
ナルティー）。

本明細書において、「６−フィターゼ」とはフィチン
酸の６位をまず加水分解する、又はこれらの複数の位置
（複数形を利用するのは、この語が２つの位置を包括す
るため）を優先して加水分解するフィターゼを意味す
る。詳しくは、第一工程の加水分解産物の50％以上がIn
s（1,2,3,4,5）P₅及び／又はIns（1,2,3,5,6）P₅であ
る。好ましくは、これら２種類の化合物は少なくとも60
％、より好ましくは少なくとも70％、更により好ましく
は少なくとも80％、特に少なくとも90％、そして最も好
ましくは95％以上のPAの初期加水分解工程産物を含んで
成る。

その他の特異的な語、例えば「３−フィターゼ」
「（３＋６）−フィターゼ」、「6D−フィターゼ」及び
「6L−フィターゼ」は対応して解釈され、同じ好適な態
様を含む。

「寄託E.コリ（E.coli）株の中に存在するプラスミド
にクローニングされたDNA配列のフィターゼコード部
分」及び「配列表に示す対応のDNA配列のフィターゼコ
ード部分」は現在同一と信じられており、従って同義語
として用いていることがある。

主に、DNA配列との関連で用いられている「フィター
ゼコード部分」とはフィターゼ活性を有するポリペプチ
ド配列へと翻訳されるDNA配列の領域を意味する。往々
にして、第一「ATG」開始コドン（mRNAにおける「AUG」
コドン」）と一番はじめの停止コドン（「TAA」、「TA
G」又は「TGA」）との間の領域である。

しかしながら、上述の通りに翻訳されたポリペプチド
は往々にしてフィターゼ活性を示す成熟配列に加えて、
Ｎ−末端シグナル配列及び／又はプロ−ペプチド配列を
含んで成る。一般に、このシグナル配列はポリペプチド
の分泌を誘導し、そしてプロペプチドはポリペプチドの
ファルディングを誘導する。更なる情報についてはEgne
ll,P.ら、Molecular Microbiol.6（９）:1115−19（199
2）又はStryer,L.,「Biochemistry」W.H.,Freeman and
Company/New York,ISBM 0−7167−1920−７を参照のこ
と。従って、「フィターゼコード部分」なる語は、翻訳
ポリペプチドの成熟部、又は複数存在しているならかか
る成熟部それぞれに対応するDNA配列をも包含するつも
りである。

更にまた、ポリペプチドフラグメントをコードするか
かる配列の任意のフラグメントであって多少のフィダー
ゼ活性を保持するものがこの定義の中に含まれる。

クローン化DNA配列又は「DNA構築体」、「DNAセグメ
ント」もしくは「単離されたDNA配列」は、DNAセグメン
トをその天然の位置からそれらを複製させるべき別の部
位へと転移させる遺伝子操作において利用される標準ク
ローニング手順に従ってクローニングされうるDNA配列
を意味する。この語は一般にその他の核酸配列を本質的
に含まず、例えばアガロースゲル電気泳動による決定に
従い少なくとも純度20％、好ましくは少なくとも純度40
％、より好ましくは約純度60％、更により好ましくは純
度約80％、最も好ましくは純度約90％、そして更に最も
好ましくは純度約95％である核酸配列を概して意味す
る。クローニング手順は当該ポリペプチドをコードする
核酸配列を含んで成る所望の核酸フラグメントの切除及
び単離、当該フラグメントのベクター分子への挿入、並
びに当該組換ベクターの宿主細胞への組込みを含んで成
り、その細胞で当該核酸配列の複数のコピー又はクロー
ンが複製されるであろう。この核酸配列はゲノム、cDN
A、RNA、半合成、合成起源、又は任意のそれらの組合せ
であってよい。

二本の核酸配列間の同一性又は「相同性」の度合いは
当業界において公知のコンピュータープログラム、例え
ばGCGプログラムパッケージにおいて供されているGAP
（Program Manual for the Wisconsin Package,Version
8,1996年８月、Genetics Computer Group,575 Science
Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711）（Needleman,S.
B.and Wunsch,C.D.,（1970）,Journal of Molecular Bi
ology,48,443−453）により決定することができうる。D
NA配列のために下記の設定値でGAPを利用する:5.0のGAP
構築ペナルティー及び0.3のGAP伸長ペナルティー。

所定のDNA又はRNA配列が特定のヌクレオチド又はオリ
ゴヌクレオチドプローブに「ハイブリダイズ」するかど
うかを決定するために適当な条件は、ハイブリダイゼー
ションを調べるためのDNAフラグメント又はRNAを含むフ
ィルターの５×のSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナト
リウム）中で10分の予備浸漬（J.Sambrook,E.F.Fritsch
and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laborator
y Manual第２版、Cold Spring Harbor,New York）、並
びに５×のSSC、５×のDenhardt溶液（Sambrookら、198
9）、0.5％のSDS及び100μg/mlの変性音波処理サケ精子
DNA（Sambrookら、1989）の溶液中でのこのフィルター
のプレハイブリダイゼーション、それに次ぐ10ng/mlの
濃度のランダムプライム化（Feinberg,A.P.and Vogelst
ein,B.（1983）Anal.Biochem.132:6−13）、³²P−dCTP
−ラベル化（比活性＞１×10⁹cpm/μｇ）プローブを含
む同溶液の中での約45℃で12時間のハイブリダイゼーシ
ョンを包含する。

次いでフィルターを２×のSSC、0.5％のSDSの中で55
℃以上（低ストリンジェンシー）、60℃以上（中ストリ
ンジェンシー）、65℃以上（中／高ストリンジェンシ
ー）、70℃以上（高ストリンジェンシー）又は75℃以上
（超高ストリンジェンシー）の中で30分２回洗う。

これらの条件下でオリゴヌクレオチドがハイブリダイ
ゼーションする分子をＸ線フィルムに導く。

２本の所定のDNA配列が所定の特異的な条件下でハイ
ブリダイズするかどうかを理論的に予測することができ
ることが見い出されている。

従って、上記の実験に代わるのは、類似のDNA配列が
上記のヌクレオチドプローブにハイブリダイズするか否
かの決定が、既知の配列をもつ２本の異種DNA配列が特
定の条件下（例えば、陽イオン濃度及び温度に関して）
でハイブリダイズするTm（融点）の理論的な計算を基礎
とする。

異種DNA配列の融点（Tm（hetero））を決定するた
め、相同性DNA配列の融点（Tm（homo））をまず決定す
る必要がある。

２本の完全に相補性であるDNA鎖（ホモ二量体形成）
間の融点（Tm（homo））は下記の式を利用することによ
り決定し得る： Tm（homo）＝81.5℃＋16.6（logM）＋0.41（％GC）−
0.61（％form）−500/L （「Current protocols in Molecular Biology」John
Wiley ＆ Sons,1995）。

ここで、 「Ｍ」は洗浄バッファー中のモル陽イオン濃度を表わ
し、 「％GC」はDNA配列中の総塩基数の％グアニン（Ｇ）
及びシトシン（Ｃ）であり、 「％form」は洗浄液中の％ホルムアミドであり、そし
て 「Ｌ」はDNA配列の長さである。

上記式により決定されるTmは２本の完全に相補性のDN
A配列間でのホモ二量体形成のTm（Tm（homo））であ
る。Tm値を２本の異種DNA配列のそれに適合させるた
め、２本の異種配列間でのヌクレオチド配列における１
％の相違はTmの１℃の下降に相当するものと仮定する
（「Current protocols in Molecular Biology」John W
iley and Sons,1995）。従って、ヘテロ二量体形成のTm
（hetero）はTm（homo）から注目の類似配列と上記のヌ
クレオチドプローブとの相同％差を差し引くことにより
見い出される。差し引くDNA相同％は本明細書記載の通
りに計算する（前掲）。

「ベクター」とは「核酸構築体」、「DNA構築体」、
「発現ベクター」又は「組換ベクター」なる語／物体を
含むことを意図する。

核酸構築体は本発明の核酸配列を含んで成り、その配
列は１又は複数のコントロール配列に作用可能式に連結
されており、そのコントロール配列はそれと適合する条
件下で適当な宿主細胞の中でコード配列の発現を指令で
きるものである。

「核酸構築体」とは本明細書においては核酸分子であ
って、一本鎖又は二本鎖であり、天然遺伝子から単離さ
れたものであるか、又は自然には本来ない状態で結合し
て並んだ核酸のセグメントを含むように改質されたもの
と定義する。

核酸構築体なる語は、当該核酸構築体が本発明のコー
ド配列の発現のために必要なコントロール配列の全てを
含むとき、用語発現カセットと同じ意味でありうる。

本明細書において定義する「コード配列」なる語は上
記のコントロール配列のコントロール下に置かれたとき
にmRNAへと転写され、そして本発明のポリペプチドへと
翻訳される配列を主として含んで成る。コード配列の境
界は一般に５′末端にある翻訳開始コドンATG及び３′
末端にある翻訳停止コードコドンにより決定される。コ
ード配列には、限定することなく、DNA,cDNA及び組換核
酸配列が含まれる。

本明細書において定義する「コントロール配列」なる
語は核酸配列のうちのコード配列の発現のために必須又
は有利な全ての成分を含む。各コントロール配列は当該
ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然又は外
来性であってよい。かかるコントロール配列には、限定
することなく、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペ
プチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ター
ミネーターが挙げられる。最低限、このコントロール配
列はプロモーター並びに転写及び翻訳停止シグナルを含
む。コントロール配列はポリペプチドをコードする核酸
配列のコード領域とのコントロール配列のライゲーショ
ンを助長する特異的な制限部位を導入する目的でリンカ
ーが備っていることがある。

発現ベクターにおいては、フィターゼをコードするDN
A配列は適当なプロモーター及びターミネーター配列に
作用可能式に連結されているべきである。このプロモー
ターは選定の宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA
配列であってよく、そして宿主細胞にとって同族又は異
種のいづれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由
来しうる。フィターゼをコードするDNA配列、プロモー
ター及びターミネーターをライゲーションするのに用い
るこの手順並びにそれらを適当なベクターに挿入する手
順は当業者に周知である（例えば、Sambrookら、（198
9）,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spr
ing Harbor,NY）。

組換発現ベクターは任意のベクター（例えばプラスミ
ド又はウイルス）であって、組換DNA手順に簡単にかけ
ることができ、そして核酸配列の発現を供しうるもので
あってよい。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の複数の
コピーを宿主細胞に挿入し、この核酸配列の発現を増幅
させることができうる。核酸配列の安定な増幅は少なく
とも配列の少なくとも一種の追加のコピーを宿主細胞ゲ
ノムの中に当業界周知の方法を利用して組込み、そして
形質転換体を選別することにより得られうる。

上記の要素を本発明の組換発現ベクターにライゲーシ
ョンするのに用いる手順は当業者に周知である（例えば
Sambrookら、1989、前掲）。

「宿主細胞」又は「組換宿主細胞」は複製の際に生ず
る突然変異に基づき親細胞と同一でない親細胞の任意の
子孫を包括する。

この細胞は好ましくは本発明の核酸配列を含んで成る
ベクターで形質転換し、その後ベクターは宿主染色体に
組込まれる。

「形質転換」は本発明の核酸配列を宿主細胞に導入
し、当該ベクターが染色体組込物として又は自己複製染
色体外ベクターとして維持される。組込が一般に有利と
考えられ、なぜならこの方が核酸配列は細胞の中に安定
に維持されるようであるからである。宿主細胞へのベク
ターの組込は上記の如き相同性又は非相同性組換により
生じうる。

当該宿主細胞は単細胞微生物、例えば原核細胞、又は
非単細胞微生物、例えば真核細胞であってよい。真核細
胞の例は哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細
胞である。有用な哺乳動物細胞にはチャイニーズハムス
ター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎
（BHK）細胞、COS細胞、又は例えばアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションから入手できる任意の幾多
のその他の不死化細胞系が挙げられる。

好適な態様において、宿主細胞は真菌細胞である。本
明細書において用いる「真菌」には子嚢菌類門、担子菌
類門、ツボカビ類（Chytridiomycota）門及び接合菌類
（Zygomycota）門（Hawksworthら、Ainsworth and Bisb
y's Dictionary of The Fungi、第８版、1995,CAB Inte
rnational,University Press,Cambridge,UKに記載）並
びに卵菌類（Oomycota）（Hawksworthら、1995、前掲、
頁171）、並びに全ての不完全菌類（Hawksworthら、199
5、前掲）が挙げられる。Ｊlich,1981,Higher Taxa o
f Basidiomycetes and Hansen ＆ Knudsen（編）,Nordi
c Macromycetes vol.2（1992）及び３（1997）も参照の
こと。

真菌細胞はプロトプラスト形成、プロトプラストの形
質転換及び周知の方法での細胞壁の再生を包括する工程
により形質転換されうる。

好適な宿主細胞はフサリウム（Fusarium）、トリコデ
ルマ（Trichoderma）又はアスペルギルス（Aspergillu
s）の株、特にフサリウム・グラミネアルム（F.gramine
arum）、フサリウム・ベネナトウム（F.venenatum）、
フサリウム・セレアリス（F.cerealis）、フサリウム種
であってフサリウムATCC 20334の同定特性を有し、PCT/
US/95/07743に更に記載されているもの、トリコデルマ
・ハージアヌム（Trichoderma harzianum）又はトリコ
デルマ・リーセイ（T.reesei）、アスペルギルス・ニガ
ー（A.niger）又はアスペルギルス・オリザ（A.oryza
e）である。

図面の簡単な説明 以下の本発明の詳細な説明において図面を言及する。
ここで、 図１はペニオフォラ・フィターゼのpH活性曲線である
（5mMのフィテート、30min、37℃）。

図２はそのpH安定曲線である（1h、40℃でのプレイン
キュベーション）。

図３はその温度活性曲線である（0.1MのNa−酢酸、5m
Mのフィテート、pH5.5、30min）。

図４はその熱安定曲線である（0.1MのNa−酢酸 pH5.
5での60minのプレインキュベーション）。

図５はその示差走査熱量（DSC）曲線である（0.1MのN
a−酢酸、pH5.5;Td＝59.6℃）。

図６−７はアスペルギルス・ニガー及びペニオフォラ
・フィターゼそれぞれの産物プロフィールを示すNMRス
ペクトルスタックプロット（24hまで）である。

図８−９は4.5hまでのスタックプロットである上記NM
Rスペクトルである。

図10a−ｃは20分（pH5.5）、24時間（pH5.5）及び20
分（pH3.5）後に観察されたそれぞれのNMRプロフィール
である。

図11はIns（1,2）P₂及びIns（２）Ｐそれぞれの濃
度、対、時間を示す曲線である。そして 図12−13はpH5.5及びpH3.5のそれぞれでのトウモロコ
シ由来の無機リン酸塩、対、時間の放出を示す曲線であ
る。

寄 託 本発明のフィターゼが由来するペニオフォラ・ライチ
の単離株は特許手続に関する微生物の寄託の国際承認に
基づくブダペスト条約に従いCentraalbureau voor Schi
mmel−cultures,P.O.Box 272,3740 AG Baarn,The Nethe
rlands（CBS）に下記の通りに寄託してある。

寄託日:1996年12月４日 寄託者番号:NN006113 CBS No.:ベニオフォラ・ライチCBS No.686.96 更にまた、本発明のこのフィターゼをコードする全長
cDNA配列を含んで成る発現プラスミド（シャトルベクタ
ー）pYES 2.0はエッシェリヒア・コリの株の中に形質転
換させ、特許手続に関する国際承認に基づくブダペスト
条約に従いDeutsche Sammlung von Mikroorganismen un
d Zellkulturen GmbH.,Mascheroder Weg 1b,D−38124 B
raunschweig,Germany（DSM）に下記の通りに寄託してあ
る： 寄託日:1996年12月２日 寄託者の番号:NN049282 DSM No.:エッシェリヒア・コリDSM No.11312 発明の詳細な説明 既知のフィターゼのアミノ酸配列SEQ ID NO:2のフィ
ターゼ及びSEQ ID NO:1のDNA配列に対する相同性は下記
の通りである： フィターゼに対する相同性（アミノ酸及びDNAレベル
のそれぞれ）： 「−」はP.ライチイとE.コリのフィターゼ間での実際
の認定をしていないことを示す。

従って、ペニオフォラ・フィターゼは既知のフィター
ゼとはやや相違し、最も近似しているのはマイセリオフ
ソラ・サーモフィラのフィターゼである（EP 068431
3）。

下記の実験の部においてより詳しく説明する通り、ア
スペルギルスの中で発現させたとき、ペニオフォラ・フ
ィターゼはLeu−Pro−Ile−Pro−Ala−Gln−Asn（SEQ I
D NO:2のアミノ酸31−37）のＮ−末端アミノ酸配列を有
する。従って、SEQ ID NO:2のアミノ酸31−439の配列は
現在成熟フィターゼ配列であると信じられている。

好ましくは、本願のアミノ酸相同性は全て55％以上、
又は60％以上、又は65％以上、特に70％以上である。好
ましくは、相同性の度合いは80％以上、より好ましくは
90％以上、更により好ましくは95％以上、特に97％以上
である。

フィターゼポリペプチドはペニオフォラ・ライチイCB
S 686.96より入手でき、そして下記の特徴を１又は複数
有する： （ｉ）３〜６の至適pH; （ii）30〜65℃の至適温度； （iii）pH3〜９及び40℃で少なくとも１時間安定； （iv）０〜50℃の温度で１時間のプレインキュベーショ
ン後残留活性75％以上； （ｖ）43〜53kDの脱グリコシル化形態の分子量； （vi）70℃で60分プレインキュベーション後少なくとも
20％の残留活性； （vii）DSCによる決定に従い50〜65℃のほどけ温度。

いくつかの別の又はより好ましい域を以下に列挙す
る： （ｉ）好ましくは3.5〜5.5、より好ましくは3.7〜5.2、
最も好ましくは3.8〜5.0の至適pH; （ii）好ましくは35〜62℃、より好ましくは37〜58℃付
近、可能として50℃前後の至適温度； （iii）好ましくはpH3〜６、より好ましくはpH3〜５に
て40℃で少なくとも１時間にわたる安定性； （iv）好ましくはpH5.5で０〜50℃の温度にて１時間の
インキュベーション後に少なくとも80％の残留活性、よ
り好ましくはpH5.5で０〜50℃の温度にて１時間のイン
キュベーション後に少なくとも90％の残留活性； （ｖ）48kDaと計算されたSEQ ID NO:2に従うポリペプチ
ドの脱グリコシル化形態の分子量。ポリペプチドは酵素
的又は化学的に脱グリコシル化することができ、そして
分子量は例えば質量スペクトル又はSDS−PAGEゲルによ
り決定できる。化学脱グリコシル化は「Carbohydrate a
nalysis−a practical approach」M.F.Chaplin ＆ J.F.
Kennedy（編）,IRL Press,Oxford,1986、特に第Ｖ章に
記載されている。酵素的脱グリコシル化は酵素供給者に
より指定の手順に従う。他に、約67kDaの見かけ上分子
量MrがSDS−PAGEにおける分子量マーカーの泳動に対し
て決定される。約67kDaのこの値は酵素をアスペルギル
スの中で発現させたときに得られる（下記の実施例参
照）。

（vi）好ましく、70℃、pH5.5で60分のインキュベーシ
ョン後少なくとも30％、より好ましくは少なくとも40
％、最も好ましくは少なくとも50％の残留活性；又は好
ましくは60〜80℃の温度、pH5.5で１時間のプレインキ
ュベーションの後に少なくとも30％、より好ましくは少
なくとも40％、最も好ましくは少なくとも50％の残留活
性； （vii）好ましくは、DSCによる決定に従い、55〜62℃、
より好ましくは58〜62℃、更により好ましくは約60℃の
ほどけ温度。

その他に、下記の事項が本発明の特徴である:37℃で
測定して３〜７の範囲の至適pH;より好ましくは、37℃
で測定して４〜６の範囲の至適pH;そして更により好ま
しくは37℃で測定して4.5〜5.5の範囲の至適pH;そして
又は26℃での活性と対比して測定して、70℃で20分のイ
ンキュベーション後に少なくとも65％の残留フィターゼ
活性；より好ましくは26℃での活性と対比して測定し
て、70℃で20分のインキュベーション後に少なくとも75
％の残留フィターゼ活性；そして更により好ましくは、
26℃での活性と比較して測定して、70℃で20分のインキ
ュベーション後に少なくとも80％の残留フィターゼ活
性。

本発明のポリペプチドは任意の帽菌類網の株、好まし
くはウロコタケ目、より好ましくはペニオフォラ属の
株、そして更により好ましくはペニオフォラ・ライチイ
の任意の株からも入手できる。

好ましくは、本発明のポリペプチドは、変性後にその
フィターゼ活性の10％以上、好ましくは20％以上、より
好ましくは30％以上、更により好ましくは40％以上、そ
して最も好ましくは50％以上復活するようにリフォルデ
ィングできる。

かかる真菌ポリペプチドをスクリーニングするための
一の方法は下記の通りである：注目の微生物をフィテー
ト複製プレート上にプレーティングし（実施例１「陽性
コロニーの同定」参照）、そして例えば30又は37℃でイ
ンキュベーションする。フィターゼ陽性コロニーを単離
し、振盪フラスコの中で培養し、そしてその上清液を捨
てる。上清液のフィターゼ活性を例えば実施例１の方法
（「A.オリザ形質転換体の試験」により70℃で20分熱処
理する前後でアッセイする。例えば70℃で20分のインキ
ュベーション後もフィターゼ陽性であり続けるサンプル
は熱安定性であるか、又はリフォルディングしてそのフ
ィターゼ活性の重要な部分を復活できるものである。真
に熱安定性のものは実施例５又は６の方法、即ち、温度
上昇により残留活性が降下するか又は再上昇するかどう
かを樹立するために関連の領域において様々な温度でイ
ンキュベーションした後に残留活性を検定することによ
り排除できうる。

この方法は注目の生体の要求に応じる基礎培地及び温
度によりその他の微生物、例えば細菌に似たように応用
できる。

本発明は更にフィターゼ活性を示す単離されたポリペ
プチドにも関連し、それはPA基質（完全リン酸化）を非
常にすばやく、特に５時間以内、好ましくは４時間以
内、より好ましくは３時間以内、特に２時間以内、特に
１時間以内、そして極めて特に1/2時間以内に消失させ
る（本明細書の実施例５参照のこと）。

本発明は更にフィターゼ活性を示し、そしてフィチン
酸から無機リン酸塩を特にpH3.5ですばやく遊離させる
単離されたポリペプチドにも関連する（本明細書の実施
例６参照のこと）。

本発明は更に任意の４通りのタイプのフィターゼの、
特にベーキング、ドウ作製、イノシトール又はその誘導
体の調製、食品又は飼料、特に動物飼料又は動物飼料添
加剤における利用に関連する。

請求項４は本発明のフィターゼのヌクレオチド配列、
特にDNA配列に関する。

「ハイブリダイゼーション」の定義については、いく
つかの好適なハイブリダイゼーション条件も列挙してい
る冒頭の「一般定義」の章を参照されたい。

２本の核酸配列間の同一性又は相同性の度合いは一般
定義の章に記載の通りにして決定し得る。請求項４の事
項（ｃ）における相同性に関し、（ａ）及び（ｂ）に記
載の核酸配列に対する相同性の度合いは少なくとも約55
％である（フィターゼ活性を示すポリペプチドをコード
し続ける）。特に、相同性は少なくとも60％、又は少な
くとも65％、特に少なくとも70％、好ましくは少なくと
も約80％、より好ましくは少なくとも約90％、より好ま
しくは少なくとも約95％、そして最も好ましくは少なく
とも約97％である。特に、相同性の度合いは記載の配列
全体もしくはその相補鎖、又は「成熟」フィターゼに対
応するその任意のサブ配列との対比に基づく。

好ましくは、ハイブリダイゼーションの条件（事項
（ｄ））は低、中、中／高、高、又は超高ストリンジェ
ンシーである。

本発明のDNA配列は以下を包括する任意の一般方法に
よってもクローニングできうる： ・適当なベクターの中で、注目のフィターゼを産生する
ものと予測される任意の生体由来のcDNAライブラリーを
クローニングする； ・適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換する； ・この宿主細胞を適当な条件下で培養し、cDNAライブラ
リー中のクローンによりコードされる注目の任意の酵素
を発現させる； ・かかるクローンにより産生される酵素の任意のフィタ
ーゼ活性を決定することにより陽性クローンをスクリー
ニングする；そして ・かかるクローンからDNAをコードする酵素を単離す
る。

一般的な単離方法はWO 93/11249及びWO 94/14953に開
示されている。スクリーニング方法の詳細な説明は実験
の部に示す。

本発明は更にフィテート又はフィチン酸から無機リン
酸塩を遊離するための（又はその遊離を触媒するため
の）請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドの
利用にも関連する。換言すれば、フィテートを、無機リ
ン酸塩並びにミオ−イノシトール及び／又はそのモノ
−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−リン酸エステル
へと変換させることができる。本請求の範囲には、本発
明のフィターゼがそのフィターゼ活性を前述の通りに発
揮する任意の方法がある。

本発明に係るより特定の用途はヒト食品もしくは動物
飼料調製品、又はかかる調製品のための添加剤であり、
ここでフィターゼはとりわけ （ｉ）肥料のフィテートレベルを下げる； （ii）消化性を高め、成長を促進し、又は食品及び飼料
利用率もしくはその転換効率を高め、とりわけ本来フィ
テートに結合しているタンパク質を有用なものとし、 （iii）必須イオン及びリン酸塩の欠如により惹起され
る栄養失調又は病気、例えば貧血を防ぎ、即ち、ミネラ
ルの生物有用性を高め、又はその吸収を高め、補助リン
酸塩及びイオン等の添加についてのニーズをなくさせ
る； 目的を達成せしめる。

特に、本発明のフィターゼは卵の殻の品質を高める
（破損による損失を低下させる）ためニワトリの餌にも
利用されうる。例えばThe Merck Veterinary Manual,
（第７版、Merck ＆ CO.,Inc.,Rahway,N.J.,U.S.A.,199
1;p.1268）;Jerochら;Bodenkultur Vol.45,No.4 pp.361
−368（1994）;Poultry Science,Vol.75,No.1 pp.62−6
8（1996）;Canadian Journal of Animal Science Vol.7
5,No.3 pp.439−444（1995）;Poultry Science Vol.74,
No.5 pp.784−787（1995）及びPoultry Science Vol.7
3,No.10 pp.1590−1596（1994）参照のこと。

「飼料」及び「食品」はそれぞれ任意の自然又は人工
食餌、ミール等、又はかかるミールの成分であって、動
物及びヒトそれぞれにより食され、消化されることを意
図し、又は適当であるものを意味する。

フィターゼはin vitro又はin vivoで、即ち、摂取前
又は個体の胃の中でそれぞれその作用を発揮し得る。ま
た併合作用も可能である。

本発明に係るフィターゼ組成物は常に少なくとも一種
の本発明のフィターゼを含んで成る。

一般にフィターゼ組成物は液体又は乾燥品である。

液体組成物はフィターゼ酵素以外の何も含む必要がな
く、好ましくは高純度形態にある。しかしながら、通
常、安定剤、例えばグリセロール、ソルビトール又はモ
ノプロピレングリコールを加えてもよい。この液体組成
物はその他の添加剤、例えば塩類、糖類、保存剤、pH調
整剤、タンパク質、フィテート（フィターゼ基質）をも
含んで成ってよい。典型的な液体組成物は水性又は油性
スラリーである。液体組成物はその任意のペレット化の
後に食品又は飼料に加えてよい。

乾燥組成物はスプレードライ組成物であってよく、そ
のような場合この組成物は乾燥形態で酵素以外の何も含
む必要がない。しかしながら、通常乾燥組成物はいわゆ
る顆粒であり、それは例えば食品又は飼料成分と容易に
混合でき、又は好ましくはプレミックスの成分を形成す
る。酵素顆粒の粒径は好ましくは当該混合物のその他の
成分のそれと適合させる。これは例えば動物飼料への酵
素の組込みの安全且つ簡単な手段を担う。

凝集顆粒は高剪断ミキサー（例えばＬdgie）で凝集
技術を利用し、その際充填材料及び酵素を一緒に凝集さ
せて顆粒が形成されるようにして調製する。吸収顆粒は
酵素を吸収する酵素によりコーティングされる担体材料
のコアを有することにより調製する。

典型的な充填材料は塩類、例えば硫酸二ナトリウムで
ある。その他の充填剤はカオリン、タルク、珪酸マグネ
シウムアルミニウム及びセルロースファイバーである。
任意的に結合剤、例えばデキストリンも凝集顆粒の中に
含ませる。

典型的な担体材料は、例えばカッサバ、コーン、ポテ
ト、コメ及びコムギの形態におけるデンプンである。塩
類も利用してよい。

任意的に、顆粒はコーティング混合物でコーティング
する。かかる混合物はコーティング剤、好ましくは疎水
性コーティング剤、例えば水素化ヤシ油及び獣脂、そし
て所望するならその他の添加剤、例えば炭酸カルシウム
又はカオリンを含んで成る。

更に、フィターゼ組成物はその他の代替物、例えば着
色剤、芳香化合物、安定剤、ビタミン、ミネラル、その
他の飼料又は食品改善酵素等を含んでよい。これは特に
いわゆるプレ−混合物に当てはまる。

「食品又は飼料添加剤」は本質的に純粋な化合物であ
るか、又は食品もしくは飼料に添加することを意図する
もしくは適当な多成分組成物である。特に、それは用途
が食品もしくは飼料製品の成分となり始めている、又は
食品もしくは飼料製品の任意の特徴に影響を及ぼす物質
である。それは上記のフィターゼ組成物と同じように構
成される。

好適な態様において、本発明のフィターゼ組成物は更
に１又は複数種の飼料改善酵素、特にα−ガラクトシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、その他
のフィターゼ、β−グルカナーゼ、特にエンド−β−1,
4−グルカナーゼ及びエンド−β−1,3（４）−グルカナ
ーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、
特にアラビノガラクタン、エンド−1,4−β−ガラクト
シダーゼ及びアラビノガラクタンエンド−1,3−β−ガ
ラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド−1,
2−β−グルカナーゼ、エンド−1,3−α−グルカナー
ゼ、及びエンド−1,3−β−グルカナーゼ、ペクチン分
解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペ
クチンリアーゼ、ポリガラクトロナーゼ、アラビナナー
ゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロンアセ
チルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン−α−ラムノ
シダーゼ、ペクテートリアーゼ及びα−ガラクツロニシ
ダーゼ、マンナナーゼ、β−マンノシダーゼ、マンナン
アセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラー
ゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナー
ゼ及び脂肪分解酵素、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ
及びクチナーゼから成る群より選ばれる飼料改善酵素を
含んで成る。

本発明の動物飼料添加物は食餌の前又は一緒に単胃系
動物に付与する。好ましくは、本発明の動物飼料添加物
は食餌と一緒に単胃系動物に付与する。より好適な態様
において、この動物飼料添加物は顆粒又は安定化液体の
形態で食餌に加える。

食品又は飼料中のフィターゼの有効な量は1kgの食品
又は飼料当り約10〜20,000;好ましくは約10〜15,000、
より好ましくは約10〜10,000、特に約100〜5,000、特に
約100〜約2,000FYTである。

本発明のフィターゼのその他の特異的な用途はダイズ
加工及びイノシトール又はその誘導体の製造における用
途である。

本発明は更に動物性肥料中のフィテートのレベルを低
下させるための方法に関連し、これにおいては動物に有
効量の本発明のフィターゼを含んで成る飼料を供給す
る。本願の冒頭に記載の通り、その一の重要な効果は環
境のリン酸塩汚染を低下させることにある。

更に本発明の範囲に属するのは食品又は飼料調製品又
は添加物の調製の際の本発明のフィターゼの利用であ
り、即ち、フィターゼは製造の際にのみそのフィターゼ
活性を発揮し、そして最終食品又は飼料製品においては
活性でない。この観点は例えばドウ作製及びベーキング
に関連する。

本発明は更に寄託微生物の実質的に純粋な生物学的培
養物及び株であって、本発明のフィターゼをコードする
DNA配列をその遺伝子設備の一部として含んで成るもの
に関する。実質的に純粋な生物学的培養物の定義内に含
まれるのはフィターゼコード能力を保持する当該株の任
意の突然変異体である。

本発明を以下の限定でない実施例により更に説明す
る。

実施例 材料及び方法 培地： フィテート複製プレート： 200mlの溶融SCアガーに以下を添加 20mlの20％のガラクトース 800μｌの５％のスレオニン 25mlの溶液Ａ 25mlの溶液Ｂ 200μｌの微量元素溶液（DSMカタログ141） 溶液A: 6gのCaCl₂・2H₂O 8gのMgCl₂・6H₂O １となるまでddH₂Oを添加 pH＝6.5 溶液B: 35.12gのNa−フィテート １となるまでH₂Oを添加 pH＝6.5 培地A: 酵母窒素ベースw/oアミノ酸（Difco 0919） 7.5g/ コハク酸（Merck 822260） 11.3g/ NaOH（Merck 6498） 6.8g/ カスアミノ酸w/oビタミン（Difco 0288） 5.6g/ トリプトファン（Merck 8374） 0.1g/ スレオニン 1.0g/ Na−フィテート（35.12g/ pH6.5） 125ml/ ガラクトース 20.0g/ 微量金属（DSM 141） 1.0ml/ １となるまでH₂Oを添加 微量金属溶液： ニトリロトリ酢酸 1.50 g MgSO₄・7H₂O 3.00 g MnSO₄・2H₂O 0.50 g NaCl 1.00 g FeSO₄・7H₂O 0.10 g CoSO₄・7H₂O 0.18 g CaCl₂・2H₂O 0.10 g ZnSO₄・7H₂O 0.18 g CuSO₄・5H₂O 0.01 g KAl（SO₄）_２・12H₂O 0.02 g H₃BO₃ 0.01 g Na₂MoO₄・2H₂O 0.01 g NiCl₂・6H₂O 0.025g Na₂Se₃O・5H₂O 0.30 g 蒸留水 １ pH7.0 まずニトリロトリ酢酸を溶かし、そしてKOHでpHを6.5
に調整し、次いでミネラルを添加する。最終pH7.0（KOH
による）。

培地B: 培地Ａと同じだが、但しガラクトースの代わりにグル
コースをＣ源として加える。

YPD: 10gの酵母エキス、20gのペプトン、900mlに至るまで
のH₂O。オートクレーブにかけ、100mlの20％のグルコー
ス（無菌濾過）を加える。

YPM: 10gの酵母エキス、20gのペプトン、900mlに至るまで
のH₂O。オートクレーブにかけ、100mlの20％のマルトデ
キストリン（無菌濾過）を加える。

10％の基礎塩： 75gの酵母窒素、塩基、113gのコハク酸、68gのNaOH、
1000mlに至るまでのH₂O、無菌濾過。

SC−URA: 100mlの10×の基礎塩、28mlの20％のカスアミノ酸
（ビタミン抜き）、10mlの１％のトリプトファン、900m
lに至るまでのH₂O、オートクレーブ処理、3.6mlの５％
のスレオニン及び100mlの20％のグルコース又は20％の
ガラクトースを添加。

SC−アガー： 20g/のSC−URAを添加。

SC−変異アガー： 20gのアガー、20mlの10×の基礎塩、900mlに至るまで
H₂O、オートクレーブ処理。

一般分子生物学的方法 何らかのことわりのない限り、DNAの操作及び形質転
換は分子生物学の標準的な方法を利用して実施する（Sa
mbrookら（1989）Molecular cloning:A laboratory man
ual,Cold Spring Harbor lab.,Cold Sprnig Harbor,NY;
Ausubel,F.M.ら（編）「Current protocols in Molecul
ar Biology」John Wiley and Sons,1995;Harwood,C.R.,
and Cutting,S.M.（eds.）「Molecular Biological Met
hods for Bacillus」John Wiley and Sons,1990）。

何らかのことわりのない限り、DNA操作のための全て
の酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は
New England Biolabs,Inc.から入手した。これらの酵素
は供給者の指示に従い利用した。

実施例１ ペニオフォラ・ライチイCBS No.686.96からのフィター
ゼのクローニング及び発現 寄託微生物： ペニオフォラ・ライチイCBS No.686.96は本発明のフ
ィターゼコードDNA配列を含んで成る。

エッシェリヒア・コリDSM No.11312はシャトルベクタ
ーpYES 2.0の中に本発明のフィターゼをコードする全長
cDNA配列を含んで成るプラスミドを含む。

その他の株： 酵母株：利用したサッカロマイセス・セレビジエはW312
4とした（van den Hazel,H.B;Kielland−Brandt,M.C.;W
inther,J.R.Eur.J.Biochem.,207,277−283,1992;（MAT
a;ura 3−52;leu 2−3,112;his 3−D200;pep 4−1137;p
rc1::HIS3;prb1::LEU2;cir＋）。

E.コリ株:DH10B（Life Technologies） プラスミド： アスペルギルス発現ベクターpHD414はプラスミドp775
の誘導体である（EP 238,023に記載）。pHD414の構築体
はWO 93/11249に更に記載されている。

pYES 2.0（Invitrogen） pA2phy2（実施例１参照） 酵母内での発現クローニング 酵母内での発現クローニングは引用することで本明細
書に組入れるH.Dalboegeら（H.DalboegeらMol.Gen.Gene
t（1994）243:253−260;WO 93/11249;WO 94/14953）に
記載の通りに行った。全RNAの抽出、cDNAの合成、マン
グ・ビーン（Mung bean）ヌクレアーゼ処理、T4 DNAポ
リメラーゼによりブラント末端化、及びライブラリーの
構築の全ての個々の工程は上記の文献を参考に実施し
た。

mRNA単離のためのペニオフォラ・ライチイCBS No.686.
96の発現手順： ペニオフォラ・ライチイCBS 686.96を発芽後成長菌糸
体と共にプレートから100mlの培地Ｂ（ダイズ30g/、
マルトデキストリン15g/、バクトペプトン5g/、プ
ルロニック0.2g/）を含む振盪フラスコに接種した。
この培養物を26℃で15日静置培養した。得られる培養液
をミラクロスで濾過し、そして菌糸体を液体窒素の中で
凍結した。

mRNAはこの培養由来の菌糸体からH.Dalboegeら、Mol.
Gen.Genet（1994）243:253−260;WO 93/11249;WO 94/14
953に記載の通りにして単離した。

全RNAの抽出はグアニジニウムチオシアネートにより
実施し、次いで5.7MのCsClクッションにより超遠心分離
にかけた。ポリ（Ａ）⁺RNAの単離はWO 94/14953に記載
の手順を利用してオリゴ（dT）−セルロースアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより実施した。

cDNA合成： 二本鎖cDNAは5mgのポリ（Ａ）⁺RNAから、RNase H方法
により合成した（Gubler and Hoffman（1983）Gene 25:
263−269,Sambrookら（1989）Molecular cloning:A lab
oratory manual,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring
Harbor,NY）。ポリ（Ａ）⁺RNA（５μｌのDEPC処理水中
５μｇ）を70℃で８分、プレシリコン処理RNase非含有
エッペンドルフチューブの中で加熱し、氷上で冷却し、
そして50μｌの最終容量で逆転写酵素バッファー（50mM
のトリス−Cl、pH8.3、75mMのKCl、3mMのMgCl₂、10mMの
DTT、Bethesda Research Laboratories）であって1mMの
dATP,dGTP及びdTTP並びに0.5mMの５−メチル−dCTP（Ph
armacia）、40単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒ
ビター（RNasin,Promega）、1.45μｇのオリゴ（dT）₁₈
−Not Iプライマー（Pharmacia）及び1000単位のSuper
Script II RNase H逆転写酵素（Bethesda Research La
boratories）を含むものと合わせた。第一鎖cDNAはこの
反応混合物を45℃で１時間インキュベーションすること
により合成した。合成後、mRNA:cDNAハイブリド混合物
をMicrospin S−400 HR（Pharmacia）スピンカラムでそ
の製造者の仕様に従いゲル濾過した。

ゲル濾過後、これらのハイブリドを200μｌづつのdNT
P、60単位のE.コリDNAポリメラーゼＩ（Pharmacia）、
5.25単位のRNase H（Promega）及び15単位のE.コリDNA
リガーゼ（Boehringer Mannheim）を含む第二鎖バッフ
ァー250μｌに希釈した。第二鎖cDNA合成はこの反応チ
ューブを16℃で２時間、更に25℃で15分インキュベーシ
ョンすることにより実施した。反応はEDTAを20mMの最終
濃度となるまで加えることにより停止させ、次いでフェ
ノール及びクロロホルム抽出を行った。

マングビーンヌクレアーゼ処理： 二本鎖cDNAを2volの96％のEtOH、0.2volの10MのNH₄Ac
の添加により−20℃で12時間かけて沈殿させ、遠心分離
により回収し、70％のEtOHで洗い、乾かし、そして25単
位のマングビーンヌクレアーゼ（Pharmacia）を含む30
μｌのマングビーンヌクレアーゼバッファー（30mMのNa
Ac、pH4.6、300mMのNaCl、1mMのZnSO₄、0.35mMのDTT、
２％のグリセロール）に再懸濁した。一本鎖ヘアーピン
DNAを30℃で30分反応体をインキュベーションすること
によりクリップし、次いで70μｌの10mMのトリス−Cl、
pH7.5、1mMのEDTAを加え、フェノール抽出し、そして2v
olの96％のEtOH及び0.1volの3MのNaAc、pH5.2により氷
上で30分沈殿させた。

T4 DNAポリメラーゼによるブラント末端化 二本鎖cDNAを遠心分離により回収し、そして0.5mMづ
つのdNTP及び５単位のT4 DNAポリメラーゼ（New Englan
d Biolabs）を含む30mlのT4 DNAポリメラーゼバッファ
ー（20mMのトリス−酢酸、pH7.9、10mMのMgAc、50mMのK
Ac、1mMのDTT）の中で、その反応混合物を16℃で１時間
インキュベーションすることによりブラント末端化し
た。反応はEDTAを20mMの最終濃度となるように添加する
ことにより停止させ、そしてフェノール及びクロロホル
ム抽出し、そして2volの96％のEtOH及び0.1volの3MのNa
Ac、pH5.2の添加により−20℃で12時間かけて沈殿させ
た。

アダプターライゲーション、Not I消化及びサイズ選
別： フィル・インの後、cDNAを遠心分離により回収し、70
％のEtOHで洗い、そして乾かした。cDNAペレットを2.5
μｇの非パリンドロームBstX Iアダプター（Invitroge
n）及び30単位のT4リガーゼ（Promega）を含む25μｌの
ライゲーションバッファー（30mMのトリス−Cl、pH7.
8、10mMのMgcL₂、10mMのDTT、0.5mMのATP）の中に再懸
濁し、そして16℃で12時間インキュベーションした。こ
の反応を65℃で20分加熱することにより停止させ、そし
て氷上で５分冷却した。アダプターの付いたcDNAをNot
I制限酵素により、20μｌの水、５μｌの10×のNot I制
限酵素バッファー（New England Biolabs）及び50単位
のNot I（New England Biolabs）の添加、それに次ぐ37
℃で2.5時間のインキュベーションにより消化した。反
応は65℃で10分加熱することにより停止させた。cDNAを
１×のTBE中での0.8％のSea Plaque GTG低融点アガロー
スゲル（FMC）での電気泳動によりサイズ分画し、ライ
ゲーションされていないアダプター及び小cDNAを分離し
た。cDNAを0.7kbでのカットオフ値でサイズ選別し、そ
してｂ−Agarase（New England Biolabs）を利用し、そ
の製造者の仕様に従い釣り出し、そして2volの96％のEt
OH及び0.1volの3MのNaAc、pH5.2の添加により−20℃で1
2時間かけて沈殿させた。

ライブラリーの構築： 指向性サイズ選別cDNAを遠心分離により回収し、70％
のEtOHで洗い、乾かし、そして30μｌの10mMのトリス−
Cl、pH7.5、1mMのEDTAの中で再懸濁した。このcDNAをMi
cro Spin S−100 HR（Pharmacia）スピンカラムでその
製造者の仕様に従ってゲル濾過することにより脱塩し
た。３通りの試験ライゲーションを５μｌの二本鎖cDNA
（反応チューブ＃１及び＃２）、15単位のT4リガーゼ
（Promega）並びに30ng（チューブ＃１）、40ng（チュ
ーブ＃２）及び40ng（チューブ＃３、ベクターバックグ
ランドコントロール）のBstX I−Not I切断pYES 2.0ベ
クターを含む10μｌのライゲーションバッファー（30mM
トリス−CL、pH7.8、10mMのMgCl₂、10mMのDTT、0.5mMの
ATP）の中で実施した。ライゲーション反応は16℃で12
時間のインキュベーション、70℃で20分の加熱、及び各
チューブに10μｌの水を添加することにより実施した。
１μｌづつのライゲーション混合物を40μｌの電気コン
ピテントE.コリDH10B細胞（Bethesda Research Laborat
ories）の中に発表の通りにしてエレクトロポレーショ
ンした（Sambrookら（1989）Molecular cloning:A labo
ratory manual,Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring
Harbor,NY）。最適条件を利用し、ライブラリーをプー
ルから成るE.コリにおいて樹立した。各プールは形質転
換E.コリをLB＋アンピシリンアガープレートにまき、37
℃で24時間のインキュベーション後15,000〜30,000コロ
ニー／プレートとなるようにして作製した。20mlのLB＋
アンピシリンをプレートに加え、そして細胞をその中に
懸濁した。その細胞懸濁物を50mlのチューブの中で37℃
で１時間振盪させた。プラスミドDNAをQIAGENプラスミ
ドキットを利用してその製造者の仕様に従い細胞から単
離し、そして−20℃で保存した。個々のプールに由来す
る１μｌの精製プラスミドDNA（100ng/ml）のアリコー
トをS.セレビジエW3124にエレクトロポレーション（Bec
ker and Guarante（1991）Methods Enzymol.194:182−1
87）により形質転換し、そしてその形質転換体を２％の
グルコースを含むSCアガー上にプレーティングし、そし
て30℃でインキュベーションした。

陽性コロニーの同定 ３〜５日間増殖後、アガープレートを一組のフィテー
ト複製プレート上にレプリカプレーティングし、そして
30℃で３〜５日インキュベーションした。0.2MのCaCl₂
を含む１％のLSB−アガロースをこのプレートの上に注
ぎ、そして１〜４日後、フィターゼ陽性クローンを透明
ゾーンに囲まれたコロニーとして同定する。

酵素陽性コロニー由来の細胞をアガー上での孤立コロ
ニー単離のためにまき、そして同定した各フィターゼ産
生コロニーについて酵素産生独立コロニーを選別した。

アスペルギルスにおける発現のためのcDNA遺伝子の単
離： フィターゼ産生酵母コロニーを50mlのガラス製試験管
中の20mlのYPD液体培地の中に接種した。この試験管を3
0℃で２回振盪した。細胞を3,000rpmで10分の遠心分離
により回収した。

DNAはWO 94/14953に従って単離し、そして50mlの水に
溶かした。DNAを標準の手順によりE.コリに形質転換し
た。プラスミドDNAを標準手順を利用してE.コリから単
離し、そして制限酵素分析により分析した。

このcDNAインサートを制限酵素Hind III及びXba Iを
利用して切り出し、そしてアスペルギルス発現ベクター
pHD414にライゲーションし、プラスミドpA2phy2を得
た。

pA2phy2のQiagen構築プラスミドDNAのcDNAインサート
（Qiagen,USA）をTaqデオキシ末端サイクル配列決定キ
ット（Perkin Elmer,USA）及び合成オリゴヌクレオチド
プライマーにより、Applied Biosystems ABI PRISM（商
標）377 DNA Sequencerを用い、その製造者の仕様に従
って配列決定した。

アスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーの
形質転換 プロトプラストは、本明細書に引用することで組入れ
るWO 95/02043、第16頁、第21行〜第17頁、第12行に記
載の通りに調製する。

100μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC（1.2M
のソルビトール、10mMのトリス−HCl、pH＝7.5、10mMの
CaCl₂）の中で適当なDNA 5〜25μｇと混合する。プロト
プラストをp3SR2と混合する（A.ニドウランス（A.nidul
ans）amdS遺伝子担持プラスミド）（Tove Christensen
ら、Bio/Technology,p 1419−142,vol.6、1988年12月）
と混合する。この混合物を室温で25分放置する。0.2ml
の60％のPEG 4000（BDH 29576）、10mMのCaCl₂及び10mM
のトリス−HCl、pH7.5を加え、そして慎重に（２回）混
合し、そして最後に0.85mlの同溶液を加え、そして慎重
に混合する。この混合物を室温で25分放置し、2500gで1
5分遠心分離し、そしてそのペレットを2mlの1.2Mのソル
ビトールに再懸濁する。もう一回沈降させたら、プロト
プラストを1.0Mのスクロース、pH7.0、窒素源としての1
0mMのアセトアミド及びバックグランド増殖を阻害する
ための2mMのCsClを含む最少プレート（Cove,Biochem.Bi
ophys.Acta 113（1966）51−56）上にまく。37℃で４〜
７日インキュベーション後、胞子を拾い、そして孤立コ
ロニーのためにまく。この手順を繰り返し、そして２回
目の再単離後の孤立コロニーの胞子を規定の形質転換体
として保存する。

A.オリザ形質転換体の試験 各A.オリザ形質転換体を10mlのYPM（下記参照）の中
に接種し、そして増殖させる。30℃で２〜５日インキュ
ベーションしたら、その上清液を取り除く。

フィターゼ活性は20μｌの上清液を0.1Mの酢酸ナトリ
ウムpH4.5及び0.1％のイノシトール六リン酸を含む１％
のLSB−アガロープレートに穴開けした直径4mmの穴に適
用することにより同定する。プレートを37℃で一夜放置
する。0.1MのCaCl₂及び0.2Mの酢酸ナトリウムから成る
バッファーpH4.5をこのプレートの上に注ぎ、そしてプ
レートを室温に１時間放置する。次いでフィターゼ活性
を透明ゾーンとして同定する。

供給バッチ発酵： 供給バッチ発酵は炭素源としてのマルトデキストリ
ン、窒素源としての尿素、及び酵母エキスを含んで成る
培地の中で実施した。供給バッチ発酵は注目のA.オリザ
宿主細胞の振盪フラスコ培養物を3.5％の炭素源及び0.5
％の窒素源を含んで成る培地に接種することにより実施
した。pH7.0及び34℃で24時間培養後、追加の炭素源及
び窒素源の連続供給を開始した。炭素源は限界係数とし
て保ち、そして酸素が過剰に存在することを確実にし
た。供給バッチ培養を４日続けた。

SEQ ID No.1に示すDNA配列の単離： 本発明のフィターゼをコードするSEQ ID No.1示すDNA
配列のフィターゼコード部分は寄託生物エッシェリヒア
・コリDSM 11312から、当業界において公知の方法によ
るプラスミドDNAの抽出により得ることができる（Sambr
ookら（1989）Molecular cloning:A Laboratory manua
l,Cold Spring Harbor.,Cold Spring Harbor,NY）。

クローニング及び発現は上記の酵母技術における発現
クローニングを利用することにより実施した。

mRNAを上述の通りにペニオフォラ・ライチイCBS No.
686.96から単離した。

菌糸体は15日間の増殖の後に回収し、直ちに液体窒素
の中で凍結し、そして−80℃で保存した。約９×10⁵個
の個別のクローンから成るペニオフォラ・ライチイCBS
No.686.96由来のライブラリーをE.コリの中で、１％
のバックグランドのベクターをもって、記述の通りにし
て構築した。いくつかのプール由来のプラスミドDNAを
酵母に形質転換し、そして250〜400個の酵母コロニーを
含む50〜100枚のプレートを各プールから得た。

フィターゼ陽性コロニーを上記の通りに同定及び単離
し、そして50mlのガラス製試験管中の20mlのYPD培養液
の中に接種した。この試験管を30℃で２日間振盪させ
た。細胞を10分間3000rpmで遠心分離することにより回
収した。DNAはWO 94/14953に従って単離し、そして50μ
ｌの水に溶かした。DNAは標準の手順によりE.コリに形
質転換させた。プラスミドDNAを標準の手順を利用して
E.コリから単離し、そしてフィターゼをコードするcDNA
のDNA配列をTaqデオキシターミナルサイクルシーケンシ
ングキット（Perkin Elmer,USA）及びApplied Biosyste
ms ABI PRISM（商標）377 DNA Sequencerを利用し、そ
の製造者の仕様に従って配列決定した。フィターゼをコ
ードするcDNAのDNA配列はSEQ ID No.1に示し、そして対
応のアミノ酸配列はSEQ ID No.2に示す。SEQ ID No.1に
おいて、No.1〜No.1320のDNAヌクレオチドはフィターゼ
コード領域を規定する。

フィターゼの成熟部をコードするSEQ ID No.1におけ
るDNA配列部分は91位〜1320位であり、それはSEQ ID N
o.2のアミノ酸31−439位に相当する。

cDNAはDSM 11312中のプラスミドから得られる。

全DNAを酵母コロニーから単離し、そしてプラスミドD
NAを前述の通りE.コリの形質転換にそり釣り出した。ア
スペルギルスの中でフィターゼを発現させるため、DNA
を適当な制限酵素により消化し、ゲル上でサイズ分画
し、そしてフィターゼ遺伝子に対応するフラグメントを
精製した。この遺伝子を次にpHD414にライゲーション
し、適当な制限酵素で消化し、プラスミドpA2phy2を得
た。

E.コリの中でのDNAの増幅の後、このプラスミドを前
述の通りアスペルギルス・オリザに形質転換した。

A.オリザ形質転換体の試験 各形質転換体を前述の通り酵素活性について試験し
た。形質転換体の一部はアスペルギルス・オリザバック
グランドより有意に高いフィターゼ活性を有していた。
このことはアスペルギルス・オリザの中でのフィターゼ
の効率的な発現を実証する。

実施例２ アスペルギルス・オリザにおいて発現されるペニオフォ
ラ・ライチイ由来のフィターゼの精製及び特性決定 ペニオフォラ・ライチイ・フィターゼをアスペルギル
ス・オリザIFO4177の中で発現させ、そして排出させ
た。

フィルター助材を、濾過布で濾過した培養培地に加え
た。この溶液を更にSeitz深遠フィルタープレートで濾
過し、透明溶液を得た。この濾液を3kDaカットオフ値の
ポリエーテルスルホンでの限外濾過により濃縮し、次い
で蒸留水で透析濾過（diafiltration）して導電率を下
げた。濃縮酵素のpHをpH7.5に調整した。濃縮酵素の導
電率は1.2mS/cmであった。

フィターゼを20mMのトリス/CH₃COOH、pH7.5で平衡に
したＱ−Sepharose FFカラムに載せ、そして酵素を上昇
線形NaCl勾配（０→0.5M）で溶出させた。フィターゼ活
性は一本のピークとして溶出した。このピークをプール
し、そして（NH₄）₂SO₄を1.5Mの最終濃度となるまで加
えた。フェニルToyopearl 650Sカラムを1.5Mの（NH₄）₂
SO₄、10mMのコハク酸/NaOH、pH6.0で平衡にし、そして
フィターゼをこのカラムに載せ、そして下降線形（N
H₄）₂SO₄勾配（1.5→0M）で溶出させた。フィターゼ含
有画分をプールし、そしてそのバッファーをSephadex G
25カラムで20mMのトリス/CH₃COOH、pH7.5と交換した。G
25濾液を20mMのトリス/CH₃COOH、pH7.5で平衡にしたＱ
−Sepharose FFカラムに載せた。カラムを平衡バッファ
ーでよく洗った後、フィターゼを上昇線形NaCl勾配（０
→0.5M）で溶出させた。フィターゼ活性をプールし、そ
してバッファーを透析により20mMのトリス/CH₃COOH、pH
7.5と交換した。透析したフィターゼは20mMのトリス/CH
₃COOH、pH7.5で平衡にしたSOURCE 30Qカラムに載せた。
カラムを平衡バッファーでよく洗った後、フィターゼを
上昇線形NaCl勾配（０→0.3M）で溶出させた。SOURCE 3
0Qカラムからの画分をSDS−PAGEにより分析し、そして
純粋フィターゼ画分をプールした。

ペニオフソラフィターゼはゲルにおいてMr＝67kDaを
有するバンドとして泳動する。67kDa成分のＮ末端アミ
ノ酸配列決定をSDS−PAGEに従って実施し、そしてPVDF
−膜にエレクトロブロッティングした。下記のＮ−末端
アミノ酸配列が推定されうる： Leu−Pro−Ile−Pro−Ala−Gln−Asn− この配列はcDNA誘導アミノ酸配列中のアミノ酸残基31
−37に相当する。

従って、フィターゼの成熟アミノ酸配列は、アスペル
ギルスの中で発現されたとき、SEQ ID No.2の31〜439位
と推定される。

実施例３ 粗発酵培養液の上清液の中に存在するペニオフォラ・ラ
イチイのフィターゼの特性決定 下記の特性決定を粗培養液の上清液に対して実施し
た。

フィターゼ活性アッセイ： 各フィターゼサンプルにつき、20μｌのアリコート２
つを100μｌのフィチン酸（0.1Mの酢酸ナトリウム中5mM
のフィチン酸ナトリウム、pH5.5）に加える。

Ｔ＝０分の時に100μｌのFe試薬（15mlのモリブデン
酸アンモニウム溶液（水で250mlに希釈した2.5gの（N
H₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O及び8mlのH₂SO₄）中の100μｌのFe試
薬（1.1gのFeSO₄・7H₂O）を対照サンプルに加える。こ
の対照混合物を37℃で５分インキュベーションする。青
色の強度を光度計で750nmで測定する。

酵素サンプルを37℃で30分インキュベーションする。
Ｔ＝30分にて、100μｌのFe試薬を加える。このサンプ
ルを37℃で５分インキュベーションし、そして750nmで
光度測定する。酵素サンプルと対照サンプルとの差はリ
ン酸塩の検量曲線に対する放出されたリン酸塩の量の指
標である。

温度安定性 フィターゼの安定性は酵素サンプルを下記の表に表示
する温度で20分プレインキュベーションし、次いでサン
プルを室温にまで冷却し、そして残留活性を測定するこ
とにより測定した。

得られる結果、即ち26℃で20分インキュベーションし
た残留活性に対する結果を下記の表に示す。

至適pH pHプロフィールも粗培養液の上清液について、上記の
フィターゼ活性アッセイを利用して決定した。5mMのフ
ィチン酸溶液を下記のバッファーの中で作った:pH3.0
（0.1Mのグリシン/HCl）、pH4.0（0.1Mの酢酸ナトリウ
ム）、pH5.0（酢酸ナトリウム）、pH5.5（酢酸ナトリウ
ム）、pH6.0（50mMのMES）、pH7.0（0.1Mのトリス−HC
l）、pH8.0（0.1Mのトリス−HCl）、pH9.0（0.1Mのグリ
シン/NaOH）。

その結果を相対値で下記の表に示す。指数100はpH5.0
での活性を示す。

実施例４ ペニオフォラ・ライチイの精製フィターゼの特性決定 ペニオフォラ・ライチイのフィターゼを実施例２に記
載の通りにしてアスペルギルスで発現させ、そして精製
した。

フィターゼ活性は下記のアッセイを利用して測定し
た:10μｌの希釈酵素サンプル（0.1Mの酢酸ナトリウ
ム、0.01％のTween 20、pH5.5に希釈）を0.1Mの酢酸ナ
トリウム、0.01％のTween 20、pH5.5（pHはフィチン酸
ナトリウムを溶解した後に調節し、基質は予備加熱し
た）中の250μｌの5mMのフィチン酸ナトリウム（Sigm
a）に加え、そして37℃で30分インキュベーションし
た。反応は250μｌの10％のTCAを添加することにより停
止させ、そして遊離リン酸を100mlのモリブデン酸試薬
（250mlに希釈した8ml中の2.5gの（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H
₂O）中の7.3gのFeSO₄ 500μｌを加えることにより停止
させた。750nmでの吸収を96穴マイクロタイタープレー
ト中の200μｌのサンプルで測定した。基質及び酵素ブ
ランクを含ませた。リン酸標準曲線も含ませた（０〜2m
Mのリン酸）。1FYTは所定の条件で１μmolのリン酸/min
を放出させる酵素の量に相当する。

温度プロフィールはアッセイを様々な温度で実施する
ことにより得られる（基質を予備加熱する）。

温度安定性はフィターゼを0.1Mのリン酸ナトリウム、
pH5.5の中で、残留活性を測定する前に様々な温度でプ
レインキュベーションすることにより調べた。

pH安定性は残留活性を測定する前に酵素をpH3（25mM
のグリシン−HCl）、pH4〜５（25mMの酢酸ナトリウ
ム）、pH6（25mMのMES）、pH7〜９（25mMのトリス−HC
l）で40℃で１時間インキュベーションすることにより
測定した。

pHプロフィールはアッセイを同バッファー系（50mM、
pHは基質を溶かすときに再調整）を用い、様々なpHで実
施することにより得た。

上記のpH−プロフィール、pH安定性、温度プロフィー
ル及び温度安定性試験の結果はそれぞれ図1,2,3及び４
に示す。

図１から、ペニオフォラ・ライチイのフィターゼはpH
3〜６の妥当な活性を有することがわかる（即ち、最大
活性の40％以上）。pH3.5〜5.5では、最大活性の60％以
上が認められ、pH3.8〜5.0では90％以上が認められる。
至適pHはpH4〜５の領域にある。

図２から、ペニオフォラ・ライチイのフィターゼはpH
3〜９の全域において40℃で１時間にわたり非常に安定
である（即ち、最大活性の80％以上を保持）。

温度プロフィールに関しては、図３から明らかな通
り、ペニオフォラ・ライチイフィターゼは30〜65℃の温
度で妥当な活性を有し（即ち、最大活性の60％以上）、
一方35〜62℃の温度では活性は最大活性の70％以上であ
り、そして至適温度50℃近くでありうる。

そして最後に、図４に示す温度安定性結果に関し、本
発明のフィターゼは０〜約50℃の温度で非常に安定であ
る（即ち、90％以上の残留活性）。残留活性の一定の降
下が50℃を超える温度でのプレインキュベーション後に
認められた。いづれにせよ、60〜80℃では50〜60％の残
留活性が残り続けた。

この事実は酵素が驚くべくことにその熱変性の後にリ
フォルディングできることに基づくものと考えられる。
リフォルディングの程度は正確な条件に依存するであろ
う（pH、酵素濃度）。

図５はペニオフォラ・フィターゼについての示差走査
熱量（DSC）測定の結果を示す。

DSCにおいて、サンプルセル内での定常温度上昇を保
つのに消費される熱を対照セルと比較して測定する。定
常加熱速度を保つ（例えば90℃／時間）。吸熱過程（熱
消費過程−例えば酵素／タンパク質のほどけ）は、定常
温度上昇を保つためにセルに伝達する熱の上昇として観
察される。

DSCはMicrocal由来のMC2装置を利用して実施した。セ
ルを20℃で20分平衡にし、次いで90゜/hのスキャン速度
で90℃までスキャニングする。0.1Mの酢酸ナトリウム、
pH5.5中の2.5mg/ml前後のペニオフォラ・フィターゼの
サンプルを装填した。

温度安定性試験はDSCにより確認し、なぜなら図５か
らペニオフォラ・フィターゼがpH5.5で約60℃の変性又
は「融点」を有することが明らかだからである。

実施例4a ペニオフォラ・フィターゼの比活性の決定 比活性はフィターゼの高純度サンプルで決定した（純
度はたった一つの成分の存在を示すSDSポリアクリルア
ミドゲルで予め検定した）。

フィターゼサンプル中のタンパク質の濃度は下記の通
りのアミノ酸分析により決定した：フィターゼサンプル
のアリコートを脱気ガラス管の中で6NのHCl、0.1％のフ
ェノールで110℃で16h加水分解した。得られるアミノ酸
をApplied Biosystems 420Aアミノ酸分析系を用い、製
造者の仕様に従って運転して定量した。アミノ酸の量が
加水分解アリコート中のタンパク質の総質量、それ故濃
度が計算できる。

活性はFYTの単位で決定する。1FYTはpH5.5、37℃での
例えば実施例４記載のアッセイで１分当りフィテートか
ら（5mMのフィテート）１マイクロモルの無機リン酸を
遊離させる酵素の量に相当する。

比活性は987FYT/mgの酵素タンパク質と計算される。

実施例５¹ H NMRスペクトルによるフィチン酸のフィターゼ触媒加
水分解の経時−分解生成物−プロフィール ペニオフォラフィターゼ及び商品アスペルギルス・ニ
ガーフィターゼ（Phytase Novo（登録商標））により触
媒されるフィチン酸（PA）の加水分解を（27mMのフィテ
ート、1FYT/ml、pH5.5及び3.5、並びに27℃）、24時間
にわたる生成物混合物の¹H NMRプロフィール作製により
調べた。

以下において、（Ins（p,q,r,‥）P_n）は位置p,q,r‥
に付加されたリン酸基を全部でｎ個担持するミオ−イノ
シトールを意味する。便宜上、Ins（1,2,3,4,5,6）P
₆（フィチン酸）はPAと略する。尚、本願の「フィター
ゼの命名及び位置特異性」の欄を参照されたい。

当該技術はPA分子に対する酵素による攻撃の初期位置
についての特定の情報、及び最終産物の同定についての
情報を提供する。他方、中間産物混合物の領域を反映す
るピークの展開パターンは個々の酵素間の類似性及び相
違の同定のために適当な定量手段、フィンガープリント
を供する。

NMRは、ほとんどのその他の分析方法と同様に鏡像関
係になり立体異性体（ジアステレオマー）同志は区別で
きるが、鏡像関係にある異性体（鏡像異性体）同志の組
は区別できず、そる故同一のNMRスペクトルを示す。

かくして、Inc（1,2,4,5,6）P₅（３−リン酸除去）は
Ins（1,2,3,4,5）P₅（６−リン酸除去）とは異なるNMR
スペクトルを示し、なぜならこれらの異性体はジアステ
レオマーだからである。

しかしながら、Ins（1,2,4,5,6）P₅及びIns（2,3,4,
5,6）P₅（１−リン酸除去）のNMRスペクトルは同一であ
り、なぜならこれらの異性体は鏡像異性体だからであ
る。これはIns（1,2,3,4,5）P₅及びIns（1,2,3,5,6）P₅
（４−リン酸除去）にも当てはまる。

かくして、NMRによっては、３−及び１−フィターゼ
同志を区別することはできず、そして６−及び４−フィ
ターゼ同志を区別することはできない（又は、最少ロー
カント則を利用してＬ−６及びＤ−６−フィターゼ同志
を区別できない）。

論文における３−及び６−フィターゼの詳細に従い、
我々は我々の酵素について３−及び６−フィターゼなる
用語を利用しているが、我々が実際には１−及び４−フ
ィターゼを獲得したのかは定かではない。

実 験 NMRスペクトルは5mmの選択反転プローブヘッドの備っ
たBruker DRX400装置で300K（27℃）で記録した。４本
のダミースキャンを先行させ、16本のスキャンを8Kデー
ターポイントによりカバーされた2003Hz（5ppm）のスウ
ィープ幅を利用して集積した。残留HOD共鳴の衰退は３
秒間の予備飽和時間により達成された。スペクトルはHO
Dシグナル（δ4.70）を対照とした。

NMR分析のためのPAサンプルは下記の通りにして用意
した:PA（100mg、フィチン酸二カリウム塩、Sigma P−5
681）を脱イオン水（4.0ml）に溶かし、そしてpHを水性
NaOH（4N）の添加により5.5又は3.5に調整した。脱イオ
ン水を加え（5ml添加）、20mgづつのフィチン酸に対応
する部1mlをスクリューキャップバイヤルに移し、そし
て溶媒をエバポレーションした（真空遠心）。ドライサ
ンプルを酸化重水素（2ml、Merck 99.5％Ｄ）の中に溶
かし、そして再び乾くまでエバポレーションした（使用
するまで−18℃で保存）。

NMR分子のため、１本の20mgのフィチン酸サンプルを
酸化重水素（1.0ml、Merck 99.95％Ｄ）に溶かした。こ
の溶液をNMRチューブに移し、そして¹H NMRスペクトル
を記録した。酵素溶液（1FTU、適宜酸化重水素に溶解、
希釈）を加え、よく混合した（１分）。¹H NMRスペクト
ルを酵素を添加した直ちに記録し（ｔ＝０）、次いで5,
10,15,20,25,30,45,60,75,90,105,120,135,150,165,18
0,195,210分（＝3.5時間）、4.5,5.5,6.5,7.5,8.5,9.5,
11.5,13.5,15.5,17.5,19.5,21.5及び23.5時間後に記録
した。NMRチューブ内のpHを測定した。追加のスペクト
ルを48及び120時間後（５日）に獲得し、そこでは酵素
がその触媒活性を保持しているなら基質部（PA、6mg）
を加えた。

公開NMRデーター（Scholz,P.;Bergmann,G.,and Mayr,
G.W.:Methods in Inositide Research（Ed.Irvine,R.
F.）pp 65−82,Raven Press,Ltd.,New York（1990））
と一緒にPAの部分消化により得られたイノシトールリン
酸塩混合物の2D NMR分析により、Ins（1,2,3,4,5,6）P₆
（PA）,Ins（1,2,4,5,6）P₅,Ins（1,2,3,4,5）P₅,Ins
（1,2,5,6）P₄,Ins（1,2,6）P₃,Ins（1,2）P₂及びIns
（２）Ｐに寄与する特徴的な¹H NMRシグナルを同定し、
そしてこの反応の最中のこれらの物質の相対的定量を可
能とした。

pH5.5で24時間の反応時間をカバーするアスペルギル
スフィターゼ及びペニオフォラフィターゼについての産
物プロフィールのスタックプロットを図６及び図７にそ
れぞれ示す。

δ3.25（ｔ）でのシグナルはIns（1,2）P₂におけるＨ
−５を表わし、一方δ3.18（ｔ）でのシグナルはIns
（２）ＰにおけるＨ−５を表わす。Ins（1,2）P₂はアス
ペルギルスフィターゼとの約４時間の反応時間を経て蓄
積し始め、そしてペニオフォラフィターゼとは約１時間
の反応時間を経て蓄積し始める。Ins（２）ｐはアスペ
ルギルスフィターゼとの約10時間の反応時間を経て、そ
してペニオフォラフィターゼとは約３時間の反応時間を
経て蓄積し始める。24時間の反応後、Ins（1,2）P₂の量
又はレベルは双方のフィターゼに関して非常に低く、一
方Ins（２）Ｐの量は24時間後に双方のフィターゼに関
して最大であった。

従って、24時間の反応時間を経て観察されるプロフィ
ールは双方のフィターゼがPAをIns（２）Ｐに分解する
ことを実証した。

双方の酵素に関して、24hでの反応混合物はIns（２）
Ｐの他に、微量のIns（1,2）P₂を含んで成る。長い反応
時間（数日）は残留Ins（1,2）P₂の消失をもたらすが、
完全に脱リン酸化された物質イノシトール（Ins）は全
く観察されなかった。この観察は酵素の不可逆性阻害／
変性では説明がつかず、なぜならこれらの酵素は、室温
で５日間保持した後にNMRチューブに添加した新鮮なPA
部を消化する能力により実証される通り、長時間その触
媒活性を保持するからである。

図８及び９を見ると、これらは最初の4.5時間の間にp
H5.5で展開するパターンをより詳細に示す。図10から、
Ins（1,2,4,5,6）P₅（Ａと表示）のＨ−３はδ3.66（d
d）においてシグナルを示しIns（1,2,3,4,5）P₅（Ｂ）
のＨ−６はδ3.87（ｔ）においてシグナルを示し、そし
てIns（1,2,5,6）P₄（Ｃ）のＨ−３はδ3.56（dd）にお
いてシグナルを示すことがわかる。ここで、化合物Ａは
３位の、Ｂは６位の、そしてＣは３及び４位のリン酸が
加水分解されたものに相当する。

図８から明らかな通り、化合物Ａはアスペルギルスフ
ィターゼを利用しての主要第一産物として出現し（ｔ＝
5min）、一方化合物Ｂは出現しない。化合物Ｃは20〜25
分後に出現する。

図９から（ペニオフォラ・フィターゼ）、化合物Ｂは
ペニオフォラフィターゼを利用しての主要一次産物（ｔ
＝5min）であることがわかる。

δ4.82（dt,H−２）,4.38（q,H−4/H−６）,4.13（q,
H−５）及び4.11（dt,H1/H3）でのシグナルは基質フィ
チン酸PAに寄与する。図８及び９を比較して、これらの
ピークはアスペルギルスフィターゼよりもペニオフォラ
フィターゼで早く消失することが明らかである。

このような差は図10aに強調され、それはpH5.5で20分
後に観察されたプロフィールを、上に表示の診断シグナ
ル（A,B,C）をラベルして示す。

図10bはpH5.5でのフィチン酸の加水分解（即ち、図６
及び７の上方線分に対応）の（このような条件下での）
最終結果を示す。上方のペニオフォラ態様にラベルして
あるシグナルは全て化合物Ins（２）Ｐ、即ち、そのプ
ロトンを示す。右から左にかけて、H5,H1及びH3,H4及び
H6、そして最後にＨ−２である。相対強度1:2:2:1。対
応のシグナルはアスペルギルスの下方の態様において見
い出せる。このことは、最終産物が双方の態様において
Ins（２）Ｐであることを示す。しかしながら、微量のI
ns（1,2）P₂も双方の態様において検出され、対応のピ
ークはアスペルギルスの態様のみにおいて表示された。

顕著な差の観察： アスペルギルス：初期主要産物はIns（1,2,4,5,6）P₅
（Ａ）として同定され、それに３−,4−及び５−位にお
けるリン酸基の連続除去に相当するIns（1,2,5,6）P
₄（Ｃ）及びIns（1,2,6）P₃（Ｄ）（1 1/2時間後のδ3.
49（dd）にてＨ−３）が続く。Ins（1,2）P₂（Ｅ）の濃
度は４時間後にゆっくりと上昇し始め、そして12〜14時
間の間に非常に急降下し、同時にIns（２）Ｐ（Ｆ）レ
ベルが急上昇した。これはIns（1,2）P₂及びIns（２）
Ｐの時間依存性濃度をそれぞれ示す図11でわかる。これ
はIns（1,2）P₂（δ3.25（ｔ））及びIns（２）Ｐ（δ
3.18（ｔ））のＨ−５に対応するシグナルの下の面積
を、基質に対応するシグナルの下の面積（ｔ＝０）と対
比して測定することにより決定される。

ペニオフォラ:pH5.5では、６位のみが攻撃される。特
徴的な事項はPAがアスペルギルスフィターゼと比べて速
い速度で消化されることにある。更なる特徴的な事項は
最終産物Ins（２）Ｐ（Ｆ）が非常に早く出現し（３時
間）、そしてゆっくりと上昇することにあり、それに対
してアスペルギルスフィターゼについては反応の終了に
向ってIns（２）Ｐ−レベルは非常に急上昇する。

図10cは図10aと似たプロットであるが、pH3.5であ
る。驚くべきことに、このpHでは、ペニオフォラフィタ
ーゼはPA ６−及び３−位に対し、おそらくは６−位を
やや優先して高い初期親力を有するようになる（Ｂ及び
Ａが観察）。

作製したデータはとりわけ下記の所見をもたらす： pH5.5及び3.5においてアスペルギルスフィターゼは高
度の選択性をもってPAを３位で攻撃し、一方ペニオフォ
ラフイターゼはpH5.5で高度の選択性をもってPAを６位
で攻撃し、ところがpH3.5ではそれは３−及び６−位に
て同等の率でリン酸基を分解するようである。

pH5.5ではペニオフォラフィターゼはアスペルギルス
・フィターゼと比べて速い速度でPAを消化する。

最終産物は、pH3.5及び5.5において、適用した条件下
で、Ins（２）Ｐ（Ｆ）である。

総合的な反応速度（PA→Ins（２）Ｐ）は同等であ
り、約20時間である（図11;pH5.5）。

従って、アスペルギルスフィターゼは本質的に純粋な
３−フィターゼであり、一方ペニオフォラフイターゼは
pH5.5で本質的に純粋な６−フィターゼであり、そしてp
H3.5では今までに未知のタイプのフィターゼ、即ち３＋
６−フィターゼであてることが証明された。

実施例６ 比較例 アスペルギルス及びペニオフォラフィターゼ トウモロコシからの無機リン酸の遊離 本例はpH3.5及び5.5でのトウモロコシからのフィター
ゼ触媒式リン遊離についての簡単なアッセイを供する。
Ｐ−遊離の速度及びレベルの二通りのパラメーターを焦
点とする。

材料及び方法： トウモロコシをノース・キャロライナ州立大学から入
手し（サンプルNo.R27）、そしててミル（Ｂhler Uni
versal）でポイント6.8で粉砕した。

トウモロコシ懸濁物（16.7％w/w）は20gの粉砕トウモ
ロコシを250mlのブルーキャップボトルに秤量し、そし
て100mlのバッファーを加えることにより調製した。

以下のバッファーを使用した： pH5.5:0.22M酢酸バッファー 8NのHCl/NaOHによりpH3.5に調整した。

試験酵素:2種類のフィターゼを試験した：アスペルギル
ス・ニガーの市販のフィターゼ（Phytase Novo（登録商
標））及び本発明のペニオフォラ・フィターゼを実施例
３及び４に記載の通りに精製した。

用量：酵素は全て25FYT/20gのトウモロコシで適用した
（1250FYT/kgに相当）。

トウモロコシ懸濁物の入ったボトルをキャップで閉
じ、そして直ちに37℃の水浴に入れ、そして定常撹拌し
た。この段階で及び再度24時間後にpHを測定した。30分
の撹拌後、5mlのサンプルを回収した。

次にフィターゼ酵素を25FYT/20gのトウモロコシの用
量で加えた。

フィターゼを添加して5,10,15,20,25,30,40,50,60及
び120分後にサンプルを回収し、そして遊離したＰの含
量を下記の通りに決定した： フィターゼ含有サンプルをバッファーで１＋４で希釈
した。次いでサンプルを3,000rpmで5min遠心分離し、そ
して1.0mlの上清液を回収した。2.0mlのバッファー及び
2.0mlのMoV停止溶液（実施例６のFYTアッセイ参照）を
加えた。これらのサンプルを冷蔵庫の中に３〜５℃で、
全てのサンプルを光度計で415nmで測定するまで入れて
おいた。

pHは０及び20時間目に測定した。

決定のため、リン酸標準品又は50mMのストック溶液を
調製した。0.5,1.0,1.5及び2.0mlのストック溶液を50ml
の全容量にバッファーを用いて希釈した。3.0mlづつの
溶液を2.0mlのMoV停止溶液に加えた。

pH5.5及びpH3.5で二通りの実験を行った。この分析結
果は図12及び13に示す（それぞれpH5.5及び3.5）。これ
らの図面で、記号「◆」はコントロール実験、「▲」は
ペニオフォラ・フィターゼ、そして「■」はアスペルギ
ルス・フィターゼを表わす。

結果及び考察： 図12（pH5.5）は、このpHでペニオフォラフィターゼ
がトウモロコシからＰを、アスペルギルスフィターゼと
比べ有意に高い速度で遊離させることを示す。

図13（pH3.5）から、このpHでペニオフォラ・フィタ
ーゼはアスペルギルス・フィターゼ（０〜120分）と比
べ粉砕トウモロコシからリンをはるかに速い速度で遊離
させることが明らかである。

ニワトリ／ブロイラーについての消化系の通過時間は
通常30分〜２時間程度であり、この観察される差はどの
ようなpHであろうとも確実に重要である。にもかかわら
ず、これとの関連で3.5のpH値はpH5.5値よりも適切であ
る。

このことは、ペニオフォラ酵素が例えばブロイラーの
消化系におけるｐ−遊離剤として、既知のアスペルギル
スフィターゼよりも驚くべきほどに効率的であることを
意味する。

配列表 SEQ ID No.1はフィターゼ活性を示す酵素をコードす
るDNA配列を含んで成る本発明のクローン化DNA配列を示
す。

（２）SEQ ID NO:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ:1320塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:cDNA （vi）起 源： （Ａ）生物：ペニオフォラ・ライチイ （Ｂ）株 :CBS 686.96 （ix）特 徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..1320 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1: SEQ ID No.2は本発明のフィターゼのアミノ酸配列を示
す。

（２）SEQ ID NO:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長 さ:439アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:2:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 フグルサン，クラウス クローネ デンマーク国，デーコー―2880 バグス バエルト，ノボ アレ，ノボ ノルディ スク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ブレインホルト，イェンス デンマーク国，デーコー―2880 バグス バエルト，ノボ アレ，ノボ ノルディ スク アクティーゼルスカブ (72)発明者 オーマン，アンダース デンマーク国，デーコー―2880 バグス バエルト，ノボ アレ，ノボ ノルディ スク アクティーゼルスカブ (72)発明者 エスターガールト，ペーター，ラーベク デンマーク国，デーコー―2880 バグス バエルト，ノボ アレ，ノボ ノルディ スク アクティーゼルスカブ (56)参考文献 Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ，2001年，67（10），4701− 4707 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/16 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フィターゼ活性を示す単離されたポリペプ
   チドであって： ａ）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列； ｂ）SEQ ID NO:2のアミノ酸番号31〜439のアミノ酸配
   列； ｃ）GCGバージョン８プログラムパッケージに供されて
   いるコンピュタープログラムGAPによる、ポリペプチド
   配列の対比のための設定条件として5.0のGAP構築ペナル
   ティー及び0.3のGAP伸長ペナルティーを利用する決定に
   従い、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列もしくはそのアミノ
   酸番号31〜439のアミノ酸配列に対して少なくとも90％
   の同一性を有するアミノ酸配列；及び／又は ｄ）２×SSC、0.5％SDS中、65℃以上にて30分の洗浄を
   ２回行う高ストリンジェンシー条件下で、SEQ ID NO:1
   もしくはそのヌクレオチド91〜1320位とハイブリダイズ
   することができるDNA配列によりコードされるアミノ酸
   配列； を含んで成る単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】請求項１のｃ）に規定する同一性が ｉ）少なくとも90％、 ii）少なくとも95％、もしくは iii）少なくとも97％ である；及び／又は 請求項１のｄ）に規定するハイブリダイズの条件が ２×SSC、0.5％SDS中、75℃以上にて30分の洗浄を２回
   行う超高ストリンジェンシー条件 である、請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】フィターゼ活性を示すポリペプチドをコー
   ドする、 ａ）SEQ ID NO:1のフィターゼコード部分； ｂ）SEQ ID NO:1のヌクレオチド91〜1320位； ｃ）GCGバージョン８プログラムパッケージに供されて
   いるコンピュタープログラムGAPによる、DNA配列の対比
   のための設定条件として5.0のGAP構築ペナルティー及び
   0.3のGAP伸長ペナルティーを利用する決定に従い、前記
   ａ）もしくはｂ）の配列に対して少なくとも90％の同一
   性を有するDNA配列； ｄ）２×SSC、0.5％SDS中、65℃以上にて30分の洗浄を
   ２回行う高ストリンジェンシー条件下で、前記ａ）もし
   くはｂ）のDNA配列とハイブリダイズすることができるD
   NA配列；及び ｅ）遺伝子コードの縮重性を理由に前記ａ）もしくは
   ｂ）の配列とはハイブリダイズしないが、SEQ ID NO:2
   に示すアミノ酸配列もしくはそのアミノ酸31〜439を含
   んで成るポリペプチドをコードするDNA配列； から成る群から選ばれる、クローン化DNA配列。
4. 【請求項４】請求項３のｃ）に規定する同一性が ｉ）少なくとも90％、 ii）少なくとも95％、もしくは iii）少なくとも97％ である；及び／又は 請求項３のｄ）に規定するハイブリダイズの条件が ２×SSC、0.5％SDS中、75℃以上にて30分の洗浄を２回
   行う超高ストリンジェンシー条件 である、請求項３記載のDNA配列。
5. 【請求項５】請求項３又は４記載のクローン化DNA配列
   を含んで成るベクター。
6. 【請求項６】請求項３もしくは４記載のクローン化DNA
   配列又は請求項５記載のベクターを含んで成る宿主細
   胞。
7. 【請求項７】フィターゼ活性を示すポリペプチドを調製
   するための方法であって、請求項６記載の細胞を当該ポ
   リペプチドの産生が可能となる条件下で培養し、そして
   当該ポリペプチドをその培養液から回収することを含ん
   で成る方法。
8. 【請求項８】請求項１又は２記載の少なくとも一種のポ
   リペプチドを含んで成る食品又は飼料。
9. 【請求項９】請求項８記載の食品又は飼料を調製するた
   めの方法であって、少なくとも一種の前記ポリペプチド
   を食品又は飼料成分に加える方法。
10. 【請求項１０】請求項１又は２記載のポリペプチドを含
    んで成る組成物。
11. 【請求項１１】食品又は飼料調製品において利用するの
    に適切な請求項10記載の組成物。
12. 【請求項１２】動物飼料添加物である請求項10又は11記
    載の組成物。
13. 【請求項１３】動物性肥料のフィテートレベルを下げる
    ための方法であって、有効な量の請求項８記載の飼料又
    は請求項９に従って得られる飼料を動物に供給すること
    を含んで成る方法。
14. 【請求項１４】フィチン酸から無機リン酸を遊離するた
    め、請求項１又は２記載のポリペプチドを利用する方
    法。
15. 【請求項１５】食品又は飼料利用率を高めるため、請求
    項１もしくは２記載のポリペプチド又は請求項10〜12の
    いずれか１項記載の組成物を利用する方法。