CN1240477A - 肌醇六磷酸酶多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽,相应的克隆的DNA序列,制备这种多肽的方法,以及其在许多工业应用中的用途。尤其是,本发明涉及衍生自担子菌类群的肌醇六磷酸酶、特定共有序列的肌醇六磷酸酶和真菌6－肌醇六磷酸酶。

Description

肌醇六磷酸酶多肽
本发明涉及具肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，相应的克隆的DNA序列，产生这种多肽的方法，以及其在各种工业应用中的用途。尤其是，本发明涉及衍生自担子菌类群(phyllum Basidiomycota)的肌醇六磷酸酶，特定共有序列的肌醇六磷酸酶以及真菌6-肌醇六磷酸酶。
肌醇六磷酸或肌醇-1，2，3，4，5，6-六二氢磷酸盐(或简称为肌醇六磷酸盐)是植物种子中肌醇的主要来源和磷酸盐的主要贮藏形式。实际上，其是在种子和谷粒成熟过程中天然形成的。在豆类种子中其占了磷酸盐含量的约70％，并与蛋白体如肌醇六磷酸钙镁在结构上整合在一起，肌醇六磷酸钙镁是肌醇的钾、镁、钙的混合盐。种子、谷粒和豆类是食物和饲料制品的重要成分，尤其是动物饲料制品。而且在人类食品中，谷物和豆类已变得越来越重要了。
肌醇六磷酸中的磷酸部分螯合二价或三价的阳离子例如金属离子，即营养基本离子钙、铁、锌和镁以及微量矿物质锰、铜和钼。
此外，在某种程度上肌醇六磷酸还通过静电作用与蛋白质结合在一起。在蛋白质等电点pI以下的pH中，带正电的蛋白质与肌醇六磷酸直接结合。在pI以下的pH中，带负电的蛋白质通过金属离子与肌醇六磷酸结合。
肌醇六磷酸及其盐肌醇六磷酸盐常常是非代谢性的，原因是其不能从胃肠系统吸收，即其三价磷形式，螯合的金属离子，结合蛋白都不是营养上有用的。
因此，由于磷对所有有机体的生长都是必需的因子，那么就有必要对食物和饲料制品补充以无机磷酸盐。极常见的情况是也必须加入营养基本离子例如铁和钙。而且此外，给定的食物的营养价值降低了，因为蛋白质被肌醇六磷酸结合了。因此肌醇六磷酸常被称之为一种抗营养因子。
而且，既然肌醇六磷酸是非代谢性的，肌醇六磷酸磷经过这种动物的胃肠道并与粪便一同排泄，导致了所不期望的环境的磷酸污染，例如导致了水环境的营养化或藻类的广泛生长。
肌醇六磷酸或肌醇六磷酸盐，这两个所说的术语除非另外指出，在本发明范围内是作为同义词或随机使用的，都是可被肌醇六磷酸酶降解的。
在含有肌醇六磷酸的绝大部分植物种子中也发现了内源的肌醇六磷酸酶。这些酶是在种子萌发过程中形成的并可释放磷酸盐而且释放植物生长过程中所需的终产物-游离的肌醇。
消化时，食品或饲料成分的肌醇六磷酸盐在理论上是可被所讨论的种子中的内源植物肌醇六磷酸酶水解的，被来源于肠中的微生物菌落的肌醇六磷酸酶和被肠粘膜肌醇六磷酸酶所水解。但在实践中，如果存在有内源的植物肌醇六磷酸酶和肠粘膜肌醇六磷酸酶的水解能力的话，是远远不足以显著地增加肌醇六磷酸盐的结合或组成成分的生物有效性的。然而当制备食品或饲料的过程涉及萌发，发酵和浸泡时，内源的肌醇六磷酸酶就有可能对肌醇六磷酸的降解产生更大的作用。
在反刍或复胃动物例如马和牛中，胃肠系统中存在着大量的能够降解肌醇六磷酸的微生物。但是，在单胃的动物例如人、家禽和猪中并非如此。因此，上述的问题对这类单胃的动物是非常重要的。
已经有用植物以及微生物来生产肌醇六磷酸酶的报道。在微生物中，生产肌醇六磷酸酶的细菌和真菌是已知的。
从植物界来说，例如麦麸肌醇六磷酸酶是已知的(Thomlinson等，生物化学(Biochemistry)，1(1962)，166-171)。Barrientos等(Plant Physiol.，106(1994)，1489-1495)也描述了来自于百合花粉的碱性肌醇六磷酸酶。
在细菌中，已经有来自枯草芽孢杆菌(Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 151：1102-1108)和假单孢菌(Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences 23：1207-1220)的肌醇六磷酸酶的报导。而且，Greiner等(Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993)已经纯化和表征了来自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶。但是该酶可能是一种酸性磷酸酶。
对产生肌醇六磷酸酶的酵母也已有描述，例如啤酒糖酵母(Nayini等，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17：24-26)。但是，这种酶可能是一种肌醇单磷酸酶(Wodzinski等，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303)。AU-A-24840/95描述了酵母菌西方许旺氏酵母的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。
对产生肌醇六磷酸酶的丝状真菌也有一些描述，但仅是属于子囊菌类(ascomycotes)的真菌群。尤其是，有几篇参考文献涉及了产生肌醇六磷酸酶的曲霉属的子囊菌类，例如土曲霉(Yamada等，1986，Agric.Biol.Chem.322：1275-1282)。而且，也已经描述了来自于黑色曲霉泡盛变种的肌醇六磷酸霉基因的克隆和表达(Piddington等，1993，基因(Gene)133：55-62)。EP0 420 358描述了无花果(黑色)曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。EP 0684 313描述了子囊菌类嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)和大曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表达。
在本说明书范围内，肌醇六磷酸酶是催化肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)其单-、二-、三-、四-和/或五-磷酸盐及(3)无机磷酸盐的酶。在下文中，上述的化合物有时分别被简写为IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P。这就意味着通过肌醇六磷酸酶的作用，IP6被降解为P+一个或多个IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I成分。可替代地，带有在位置p、q、r...上总共结合有n个磷酸根的肌醇被称之为Ins(p、q、r....)Pn。为了简便起见，Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)被简写为PA。
根据酶命名数据库ExPASy(一个主要根据生物化学和分子生物学国际联合会(IUBMB)命名委员会的推荐的描述已提供了EC(酶委员会)编号的各种已表征的酶的关于酶的命名的信息库)，已知有两种不同类型的肌醇六磷酸酶：所谓的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和所谓的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶EC 3.1.3.26)。3-肌醇六磷酸酶首先在第3位上水解酯键，而6-肌醇六磷酸酶首先在第6位上水解酯键。肌醇磷酸命名
考虑到肌醇六磷酸酶作用于肌醇六磷酸的一级水解产物，所得到的酯有些是非对映体，而有一些是对映体。一般而言，区分非对映体更容易一些，因为它们有不同的物理特性，但是要区分互为镜象的对映体就更加困难一些。
因此，Ins(1，2，4，5，6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(1，2，3，4，5)P5(除去了6-磷酸)是非对映体而易于区分，而Ins(1，2，4，5，6)P5(除去了3-磷酸盐)和Ins(2，3，4，5，6)P5(除去了1-磷酸盐)是对映体。对Ins(1，2，3，4，5)P5(除去了6-磷酸盐)和Ins(1，2，3，5，6)P5(除去了4-磷酸盐)这一对来说同样也是正确的。因此，对来自于肌醇六磷酸的肌醇六磷酸酶催化水解的第一步所得的6个五磷酸酯中，人们可以很容易地区分已除去了2-，3-，5-和6-磷酸盐，即人们可仅得到4个非对映体，所得的余下的两个酯都是这些化合物中的一个对映体(4-和6-是对映体，如1-和3-一样)。最低位次原则的应用
此处应当注意到，当使用Ins(2，3，4，5，6)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5的命名时，放宽了先前对肌醇原子编号的推荐。这种最低位次原则的放宽是由国际生化联合会命名委员会推荐的(Biochem.J.(1989)258，1-2)，其在作者意欲引入结构关系的任何时候均可应用。
在此最低位次原则中，推荐了L-和D-命名：肌醇磷酸盐、肌醇的磷酸酯常常被命名为1D-(或1L-)-InS(r，s，t，u，w，x)Pn，n指磷酸根的数目，位次r，s，t，u，w，x指其位置。位置的编号是根据上述引述(及其中的参考文献)的国际生物化学联合会命名委员会(NC-IUB)而来的，1D或1L用来形成具有最低可能的位次或编号的取代基(“最低位次原则”)。因此，1L-肌醇-1-磷酸(1L-Ins(1)P，肌醇生物合成的中间产物)和1D-肌醇-1-磷酸盐(1D-Ins(1)P，磷脂的成分)，是按图38所显示的那样来编号的。肌醇六磷酸酶特异性
如上所述，肌醇六磷酸酶是根据其在起初水解步骤中的特异性区分的，即根据其首先水水解哪一个磷酸酯基团。
关于已知肌醇六磷酸酶的特异性，植物肌醇六磷酸酶一般被称之为6-肌醇六磷酸酶。然而百合花粉肌醇六磷酸酶据说是5-肌醇六磷酸酶。衍生自微生物的肌醇六磷酸酶主要称为3-肌醇六磷酸酶。例如上述的ExPASy数据库所指的3-肌醇六磷酸酶是泡盛曲霉(ALK 0243株)和黑色曲霉(NRRL3135株)(基因(Gene)133：55-62(1993)和基因127：87-94(1993))的四种肌醇六磷酸酶。
现在使用D-/L-记号(其中D-和L-构象指的是1位)，麦麸肌醇六磷酸酶首先水解L-6位的磷酸酯基团，而3-肌醇六磷酸酶首先水解的是D-3位的磷酸酯基团。
可以通过各种方法例如HPLC或NMR质谱来测定其特异性。但这些方法并不能立即区分D-6和L-6位上磷酸酯基团的水解，由于水解产物D-Ins(1，2，3，4，5)P5和L-Ins(1，2，3，4，5)P5是对映体(镜像)，因此具有相同的NMR谱。
换言之，本文中6-肌醇六磷酸酶指L-6-或D-6-肌醇六磷酸酶或指二者，即为L-6-肌醇六磷酸酶、D-6-肌醇六磷酸酶或((D-6-)+(L-6-))-肌醇六磷酸酶(具两种活性)的肌醇六磷酸酶。后者有时也被命名为D/L-6-肌醇六磷酸酶。
本发明的目的之一是提供一种可替代的肌醇六磷酸酶，尤其是具有优良特性例如增加了的热稳定性或磷酸从肌醇六磷酸中更快的释放，并能以商业有用量来生产的肌醇六磷酸酶。
本发明人意外地发现了具有有趣特征的整个亚族的真菌肌醇六磷酸酶。该亚族的肌醇六磷酸酶的特征在于具有一个高度保守的区域或部分相同的序列(共有序列)。该亚族的代表与已知肌醇六磷酸酶在各种酶特性，例如位置特异性和比活性等方面相比被证明是优异的。
现在考虑本发明的肌醇六磷酸酶共有序列对所有的担子菌肌醇六磷酸酶都是相同的。
本文中担子菌纲指的是担子菌类(phyllum Basidiomycota)的微生物。该类群的担子菌与例如子囊菌类(Ascomycota)一起属于真菌界。参考文献有Julich，1981，Higher Taxa of Basidiomycetes；Ainsworth&Bisby，1995，Dictionary of the Fungi；Hansen&Knudsen(Eds.)，NordicMacromycetes，Vol.2(1992)和3(1997)。另外，真菌分类学数据库(NIH DataBase(Entrez))可通过国际互联网上下列网址的internet上得到：
http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxanomy/tax.html。
另外也给出了用PCR筛选这种肌醇六磷酸酶的方法，以及利用重组DNA技术分离和纯化这些肌醇六磷酸酶的基本程序。
首先，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性且衍生自担子菌类群的分离的多肽。
其次，本发明涉及具肌醇六磷酸酶活性且包含几个共有序列中的至少一个的分离的多肽。
第三，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性并由在中度到高度严紧条件下与用合适的引物由此处公开的序列排列和靶序列例如DNA文库衍生的PCR反应产物杂交的DNA编码的分离的多肽。
第四，本发明涉及具6-肌醇六磷酸酶活性并衍生自真菌的分离的多肽。
第五，本发明涉及具肌醇六磷酸酶活性并与五个特异序列同源的分离的多肽。
另一方面，本发明提供了编码上述多肽的克隆的DNA序列，以及含有这些克隆的DNA序列的载体和宿主细胞。
在本发明范围内，在又一方面是本发明的肌醇六磷酸酶从肌醇六磷酸中释放无机磷酸盐的用途，以及一些更特定的用途和组合物，尤其是含有本发明的肌醇六磷酸酶的食品和饲料制品和添加剂。
一般而言，此处所用的名词和短语都是按本领域习惯解释的。但如有疑问，则应当使用本说明书的定义。
短语“具有/表现出肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽/酶”或“分离的肌醇六磷酸酶”意指具肌醇六磷酸酶活性(参看下文)的任何多肽或蛋白质并且其基本上没有其它非肌醇六磷酸酶多肽，例如由SDS-PAGE测定时至少为约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，进一步优选约80％纯，再优选约90％纯，最优选约95％纯。有时这种多肽可替代地被称之为“纯化的”肌醇六磷酸酶。
“分离的多肽”的定义还包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中另外一个多肽被融合到该多肽的或其片段的N端或C端。融合的多肽是由将编码另一多肽的核酸序列(或其部分)融合到本发明的核酸序列(或其部分)上而产生的。生产融合多肽的技术是本领域已知的，且包括将编码该多肽的编码序列连接起来从而其位于框内并且该融合多肽的表达是在同一启动子和终止子的控制之下。
短语“表现出肌醇六磷酸酶活性的多肽或酶”或“肌醇六磷酸酶”意在包括任何能使无机磷酸盐或三价磷从各种肌醇磷酸盐中释放出来的酶。这种肌醇磷酸盐(肌醇六磷酸酶底物)是肌醇六磷酸及其任何盐，例如肌醇六磷酸钠和肌醇六磷酸钾或其混合盐。同样地，任何肌醇的单-、二-、三-、四-或五-磷酸盐均有可能作为肌醇六磷酸酶的底物。
根据上述定义，可在使用这些底物中的某一个的任何实验中测定肌醇六磷酸酶活性。在本文(除非另作规定)中，肌醇六磷酸酶活性是按FYT的单位确定的，一个FYT指的是每分钟释放1μmol无机正硫酸盐的酶量，释放条件如下：pH5.5；温度37℃；底物：肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)的浓度为0.0050mol/l。实验部分描述了合适的肌醇六磷酸酶实验。
“多肽同源性”或“氨基酸同源性”是定义为两个序列之间相同的程度。同源性可通过本领域已知的适当的计算机程序如GCG第8版程序包(Wisconsin包程序手册，第8版，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)所提供的GAP来确定。使用GAP时，以下述设定来进行多肽比较：GAP创新补偿(Creation Penalty)为5.0而GAP延展补偿(extenson Penalty)为0.3。
本文中“6-肌醇六磷酸酶”指的是在肌醇六磷酸中首先在6位进行水解的肌醇六磷酸酶或偏爱这些位置的肌醇六磷酸酶(由于此术语包括两个位置所以用了复数)。尤其是，超过50％的第一步的水解产物是Ins(1，2，3，4，5)P5和/或Ins(1，2，3，5，6)P5。优选这两种化合物组成至少60％，更优选至少至少70％，再优选80％，尤其优选至少90％以及最优选超过95％的PA的起始水解步骤的产物。
其它的特异性术语例如像“3-肌醇六磷酸酶”，“(3+6)-肌醇六磷酸酶”“6D-肌醇六磷酸酶”和“6L-肌醇六磷酸酶”都作相应的解释，包括相同的优选实施方案。
术语“克隆到在保藏的E.coli菌株中存在的质粒中的编码肌醇六磷酸酶的DNA序列部分”以及“在序列表中的编码肌醇六磷酸酶的相应的DNA序列部分”目前据认为是相同的，因此它们可以互换使用。
首先，与DNA序列一起使用的术语“编码肌醇六磷酸酶的部分”指的是翻译成具肌醇六磷酸酶活性的多肽序列的DNA序列的区域。常常这是一个位于第一个“ATG”起始密码子(mRNA中的“AUG”密码子)和其后第一个终止密码子(“TAA”、“TAG”或“TGA”)之间的区域。
但是，按上述翻译的多肽常常在表现肌醇六磷酸酶活性的成熟序列之外包括一个N-末端信号序列和/或前肽序列。一般而言，该信号肽指导了多肽的分泌，而前肽则指导该多肽的折叠。进一步的资料请参见Egnell，P.等.Molecular Microbiol.6(9)：1115-19(1992)或Stryer，L.，“Biochemistry”W.H.，Freeman和Company/New York，ISBN 0-7167-1920-7。因此，术语“编码肌醇六磷酸酶的部分”还意在包括相应于翻译后的多肽的成熟部分的或如果有多个的话，每个这种成熟部分的DNA序列。
而且，编码仍然保留某些肌醇六磷酸酶活性的多肽片段的这种序列的任何片段都将包括在本定义之内。
分离的DNA分子或者，可替代地，“克隆的DNA序列”“DNA构建体”、“DNA片段”或“分离的DNA序列”指的是根据遗传工程中所用的标准克隆方法可以克隆的DNA分子或者序列，其中将该DNA片段从其天然位置重新放置到一个不同的位点上，而在该位点上其将被复制。该术语一般指的是基本不含其它核酸序列的核酸序列，例如，以琼脂糖电泳测定，其至少约为20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，再优选约80％纯，还优选约90％纯，最优选约95％纯。这种克隆方法可能会涉及包括编码多肽的核酸序列的所需核酸片段的切除和分离，涉及该片段在载体分子中的插入，以及重组载体在宿主细胞中的掺入，而在宿主细胞中该核酸序列的重复拷贝或克隆将会被复制。该核酸序列可能是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成的或其任何组合。
在两个核酸序列之间的一致性或“同源性”程度可通过本领域已知的计算机程序如GCG程序包(Wisconsin程序包手册，第8版，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needlenan，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)Journal of Molecular Biology，48，443-453)所提供的GAP来确定，使用GAP时，以下述设定来进行多肽比较：GAP新生补偿(Creation Penalty)为5.0而GAP延展补偿(extensionPenalty)为0.3。
用于确定给定的DNA或RNA序列是否与特定的核苷酸或寡核苷酸探针“杂交”的合适的实验条件涉及将含有用以测定杂交的DNA片段或RNA的滤膜预先浸泡在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)，(J.Sambrook，E.F.Fritsch，以及T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor，New York)10分钟、在5×SSC溶液、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml变性的超声波破碎的鲑鱼精DNA(Sambrook等，1989)中将膜进行预杂交，随后在含有浓度为10ng/ml的随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)And.Biochem.132：6-13)、32P-dCTP-标记(比活性＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中在约45℃下杂交12小时。
然后将膜在2×SSC、0.5％SDS、至少55℃(低严紧度)至少60℃(中度严紧度)、至少65℃(中/高严紧度)、至少70℃(高严紧度)、至少75℃(极高严紧度)下洗涤两遍。
用X-光膜可以检测到在这些条件下寡核苷酸探针杂交的分子。
已发现有可能在理论上来预测两个给定的DNA序列是否会在确定的条件下杂交。
因此，作为上述实验方法的替代手段，对类似的DNA序列是否会与上述的核苷酸探针杂交的确定可以根据在特定条件下(例如于阳离子浓度和温度)两个具有已知序列的异源DNA序列将会杂交时的Tm(解链温度)关的理论计算而得。
为了测定异源DNA序列的解链温度(Tm(异))，首先需要测同源DNA序列的解链温度(Tm(同))。
在两条完全互补的DNA链(同源双链形成)之间的解链温度(Tm(同))可用下列公式确定：
Tm(同)＝81.5℃+16.6(logM)+1.41(％GC)-0.61(％form)-500/L
(“现代分子生物学技术”(Current Protocols in Molecular Biology”。JohnWiley&Sons，1995)，其中
“M”指的是洗涤缓冲液中的阳离子摩尔浓度，
“％GC”DNA序列中碱基总数里鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的百分数，
“％form”洗涤缓冲液中甲酰胺的百分数，以及
“L”DNA序列的长度。
通过上述公式确定的Tm是两条完全互补的DNA序列间同源双链形成的Tm(Tm(同))。为了将该Tm值适合于两个异源的DNA序列，可以假定两条异源序列之间1％的核苷酸差异等于Tm下降1℃(现代分子生物学技术.John Wiley&Sons，1995)。因此，发现异源的链形成的Tm(异)是从Tm(同)上减去所研究的类似序列和上述的核苷酸探针之间的差异百分数。所要减去的DNA同源百分数是按此处所述(参见上文)来计算的。
术语“载体”意在包括这类术语/物质例如“核酸构建体”、“DNA构建体”、“表达载体”或“重组载体”。
核酸构建体包括本发明的核酸序列，其可操作地连到一个或更多个在与控制序列相容的条件下在适当的宿主细胞中能指导编码序列表达的控制序列上。
此处所确定的“核酸构建体”是单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离到，或者其已被修饰为含有在自然界中不存在的方式结合和并列的核酸区段。
术语核酸构建体可以与表达盒同义，其条件是当核酸构建体含有本发明的编码序列的表达所必须的全部控制序列。
此处定义的术语“编码序列”主要包括当置于上述控制序列的控制之下时转录成mRNA并翻译成本发明的多肽的序列。编码序列的边界一般通过5′末端的翻译起始密码子ATG和3′末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
此处所说的“控制序列”包括对核酸序列的编码序列的表达是必需或有益的所有组分。每个对照序列对编码多肽的核酸序列而言，可能是天然也可能是外源的。这种控制序列包括但不限于，前导序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。控制序列可能包括用于导入帮助将控制序列和编码多肽的核酸序列连接起来的特定限制性位点的接头。
在表达载体中，编码肌醇六磷酸酶的DNA序列应当可操作地连到适当的启动子和终止子序列上。启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中表现出了转录活性的DNA序列，而且可能会是衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于连接编码肌醇六磷酸酶的DNA序列的方法、启动子和终止子及将它们插入到的适当的载体对本领域的人是熟知的(参见例如Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约)。
重组表达载体可以是能够方便地用于重组DNA程序并可使得核酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。
不止一个拷贝的编码本发明的多肽的核酸序列可插入到宿主细胞中以扩增核酸序列的表达。核酸序列的稳定扩增可通过本领域熟知的方法将至少一个该序列的额外拷贝整合到宿主细胞基因组中并选择转化体而获得。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，同上)。
“宿主细胞”或“重组体宿主细胞”包括由于在复制期间发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
细胞优选以包含本发明的核酸序列的载体转化然后将载体整合到宿主染色体中。
“转化”意指将含有本发明的核酸序列的载体导入到宿主细胞中，从而载体可保留为染色体整合体或染色体外自我复制载体。整合常被认为是有利的，因为该核酸序列更易于稳定地保持在细胞中。载体在宿主染色体上的整合可按上述通过同源或非同源重组而实现。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或者非单细胞微生物，例如，真核生物。真核细胞的实例是哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，海拉(Hela)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或者任何其它可获得的例如来自于美国典型培养物保藏中心无限增殖化细胞系的成员。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。此处所用的“真菌”包括担子菌类群、子囊菌类群、壶菌类(Chytridiomycota)和接合菌类(Zygomycota)(如Hawksworth等定义，见Ainsworth and Bisby′s Dictionary ofthe Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌类(Hawksworth等引用，1995，同上，第171页)以及所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
可通过以本身已知的方式涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法来转化真菌细胞。
本发明还涉及转基因植物、植物部分，例如植物种子或植物细胞，其已用编码本发明的肌醇六磷酸酶的DNA序列转化以来表达或产生该酶。同样，这类植物或植物部分的成分和用途也包括在本发明的范围内，尤其是其作为饲料或食品或添加剂，按照本发明的用途和食品/饲料权利要求所述。
该转基因植物可以是双子叶也可以是单子叶的，简称为单子叶或双子叶。最大的兴趣是这类植物是潜在的食品或饲料成分并包含肌醇六磷酸。饲料成分中正常的肌醇六磷酸水平是0.1-100g/kg，或更常见为0.5～50g/kg，最常见为0.5～20g/kg。单子叶植物的实例是草，例如草坪草(早熟禾属Poa)，饲料草例如羊茅属、黑麦草属、温和草(temperate grass)，例如剪股积属以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高梁和玉米(玉蜀黍)。
双子叶植物的实例是豆类、例如羽扇豆属、豌豆属、大豆和十字花科(十字花科)、例如花椰菜、油菜和紧密相关的模式生物拟南芥。
例如这些转基因植物能降解其本身的肌醇六磷酸，因此在含有这些植物的食品或饲料中就有必要减少这些酶的加入量。优选地，植物或植物部分例如种子是碾磨碎的，并且在其被加入到食品或饲料中或使用例如摄取之前还有可能经过浸泡，目的是使酶解的速率调节到实用的程度。
如果需要，也可从植物中回收植物产生的酶。在特定的情况下，从植物中的回收在考虑到随后可能的压丸过程中保证热稳定成分时是优选的。
植物的部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、块茎等。而且任何植物组织也包括在本定义中。
不管其组织来源如何，任何植物细胞都包括在上述植物细胞的定义之中。
还包括在本发明的范围之内的是这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
本领域的技术人员知道如何构建DNA表达载体用于插入到所研究的植物中，尤其注意的是是否该酶应当以组织特异性的方法来分泌。与此评价相关的是肌醇六磷酸酶在植物的表达区室中的稳定性(pH稳定性、通过内源蛋白酶等的可降解性)。本领域的技术人员还应当选择适当的调控序列例如启动子和终止子序列，以及，有必要，还有信号和转运序列(Tague等，Plant Phys.86，506，1988)。
植物、植物部分等可使用任何已知的方法以本DNA构建体转化。这类方法的一个实例是通过病毒或细菌载体例如通过遗传手段制备的含有编码本发明的肌醇六磷酸酶的基因的土壤杆菌属的细菌转化。直接将肌醇六磷酸酶DNA导入植物细胞或植物组织的方法也是本领域已知的，例如微注射和电穿孔(Gasser等，Science，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto等，Nature，338，274，1989))。
在转化之后，转化体用任何本领域技术人员已知方法筛选，随后再生为整个植株。
这些植物等以及其后代于是就携带上了作为其遗传成分的一部分的编码肌醇六磷酸酶的DNA。
一般而言，参考文献见于WO 91114782A和WO 9114772A。
根瘤土壤杆菌介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶的方法(综述见Hooykas&Schilperoort，1992.Plant Mol.Biol.19：15-38)。由于宿主范围的限制，一般而言不可能用根瘤土壤杆菌的帮助来转化单子叶。所选的用于产生转基因的单子叶的方法是粒子轰击法(微粒金或钨粒，用转化DNA包裹)胚愈伤组织或发育的胚(Christou，1992.Plant J.2：275-281；Shimamoto，1994.Curr.Opin.Biotechnol.5：158-162；Vasil等.，1992.Bio/Technology 10：667-674)。
还有其它的系统也可用于将游离的DNA运输到这些植物中，包括病毒载体(Joshi&Joshi，1991.FEBS Lett.281：1-8)，通过聚乙二醇或电穿孔的原生质体转化(综述见Potyrkus，1991.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.42：205-225)，DNA到叶肉原生质体中的微注射(Crossway等，1986.Mol.Gen.Genet.202：79-85)，DNA到禾谷植物幼嫩成花分蘖中的宏注射(macroinjection)(de la Pena等，1987.Nature 325：274-276)为优选方法。
一般而言，编码本发明的肌醇六磷酸酶的cDNA或基因是置于一个表达盒(例如Pietrzak等，1986-Nucleic Acids Res.14：5857-5868)中的，该盒由在靶植物中有活性的一个合适的启动子以及一个合适的终止子(转录的终止)组成。这个盒(当然包括合适的选择性标记，见下)转入植物中的方法与单子叶植物通过粒子轰击转化的方法类似。在双子叶的情况下，首先将表达盒置于合适的提供T-DNA边界和合适的选择性标记的载体中，然后将该载体转入根瘤土壤杆菌中。通过标准方法(例如Akama等，1992。Plant CellReports 12：7-11)通过携带表达盒和侧面带有T-DNA的选择性标记的土壤杆菌转化双子叶。最近已综述了T-DNA从农杆菌到植物细胞的转化(Zupan&Zambryski，1995.Plant Physiol.107：1041-1047)。用于通过土壤杆菌进行植物转化的载体是市场上可以买到的并且可以从构建这类载体的许多实验室获得(例如Deblaere等，1985，Nucleic Acids Res.13：4777～4788；综述参见Klee等，1987。Annu.Rev.Plant Physiol.38：467-486)。
可获得的植物启动子：取决于所使用的方法，可能需要器官和/或细胞特异性表达以及适当的发育和环境对照。例如，期望在玉米胚乳等中表达肌醇六磷酸酶cDNA。最常用的启动子是组成型的35S-CaMV启动子(Franck等，1980.Cell 21：285-294)。在整个植株中表达将大体上是平均的。该启动子已成功地用于制备抗除草剂或抗病原植物(综述于Stitt&Sonnewald，1995.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46：341-368)。已有报道说可将特异性的启动子用于保藏贮存光合产物的植株部分组织，例如种子、马铃薯块茎和水果(Edwards&Coruzzi，1990.Annu.Rev.Genet.24：275-303)，以及用于代谢贮存光合产物的植株部分组织例如分生组织(Ito等，1994.PlantMol.Biol.24：863-878)。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适于所研究的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的肌醇六磷酸酶可以方便地分泌到培养基中并且可能通过熟知的方法回收，这些方法包括离心或过滤、用盐例如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，随后进行色谱分析，例如离子交换色谱、亲和色谱，诸如此类。
优选的宿主细胞是镰孢属、木霉属和曲霉属的菌株，尤其是禾谷镰孢、Fusarium Venenatum、Fusarium Cerealis、具有与镰孢属ATCC 20334相同的特征的镰孢菌，其进一步描述于PCT/US/95/01743中，Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei，黑色曲霉或米曲霉。
附图简要描述
在下面的本发明的详细描述中，参考见附图，其中
图1为phy AcDNA的核苷酸序列以及来自于Peniophora lycii(信号肽带框，用于cDNA克隆的限制性位点有下划线)的PHYA肌醇六磷酸酶的推断的一级结构；
图2为来自于平田头菇(Agrocybe pediades)的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，如图1；
图3为第一个肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，该酶为PHYA1，来自于Paxillus involtus，如图1，不过框表示的是信号肽的Signal PV1.1预测；
图4为第二个肌醇六磷酸酶PHYA2的核苷酸序列，其来自于Paxillusinvoltus，如图3；
图5为来自于绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，如图3；
图6为图1～5编码的肌醇六磷酸酶的推断的氨基酸序列的序列对比，在至少三个序列中的相同残基以灰色方框示之；
图7为图6的5个肌醇六磷酸酶与全部属于子囊菌的真菌类群5个已知肌醇六磷酸酶的序列对比，在至少七个序列中相同的残基用灰色方框示之；
图8为隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶的pH活性曲线；
图9为其pH稳定性曲线；
图10为其温度活性曲线；
图11为其温度稳定性曲线；
图12为其差示扫描量热法(DSC)曲线；
图13～14 NMR谱，堆积图(stacked plot)(至24小时)，分别显示了黑色曲霉和隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶的产品分布(product profiling)；
图15～16如上的NMR谱，但堆积绘图至4.5小时；
图17～19分别为20分钟(pH5.5)，24小时(pH5.5)和20分钟(pH3.5)后观察所得的NMR曲线；
图20为分别显示了Ins(1，2)P2和Ins(2)P的浓度对时间的曲线；
图21～22为分别显示了在pH5.5和pH3.5时无机磷酸从玉米中的释放对时间的曲线；
图23为田头菇属肌醇六磷酸酶的pH活性曲线；
图24为其pH稳定性曲线；
图25为其温度活性曲线；
图26为其温度稳定性曲线；
图27为其差示温度量热法(DSC)曲线；
图28-29为分别显示黑色曲霉和田头菇属肌醇六磷酸酶的产品分布的NMR谱，堆积图(至24小时)；
图30～31为上述的NMR谱，但层积图为至4.5小时；
图32-33分别为20分钟和24小时后观察所得的NMR曲线；
图34～35分别为显示Ins(1，2)P2和Ins(2)P的浓度对时间的曲线；
图36-37分别为显示无机磷酸在pH5.5和pH3.5下从玉米中的释放对时间的曲线；以及
图38 1D-和1L-肌醇-1-磷酸盐(P＝-OPO3 -2)的结构。
保藏
得到的本发明的肌醇六磷酸酶的Peniophora lycii，平田头菇(Agrocybepediades)、Paxillus involtus和绒毛栓菌(Tranetes pubescens)菌株的分离物已根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》保存于真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，P.O.Box 273，3740 AGBaarn，荷兰)，(CBS)，如下所示：
保藏日：1996年12月4日
保藏人号：NN 006113
CBS编号：Peniophora lycii CBS No.686.96
保藏日：1996年12月4日
保藏人号：NN 009289
CBS编号：平田头菇(Agrocybe pediades)CBS号900.96
保藏日：1997年11月28日
保藏人号：NN 005693
CBS编号：Paxillus involtus CBS No.100231
保藏日：1997年11月28日
保藏人号：NN 009343
CBS编号：绒毛栓菌(Trametes pubescens)CBS No.100232
而且，含有编码本发明的这些肌醇六磷酸酶的全长cDNA序列的表达质粒(穿梭载体)pYES 2.0已被转化到大肠杆菌菌株中，而此菌株已根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》保存于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikcroorganismen und Zellkulturen GmbH.Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，(DSM)，分别如下(Paxillus involtus的两个肌醇六磷酸酶)；
保藏日：1996年12月2日
保藏人号：NN 049282
DSM编号：大肠杆菌DSM No.11312
保藏日：1996年12月2日
保藏人号：NN 049283
DSM编号：大肠杆菌DSM No.11313
保藏日：1997年11月12日
保藏人号：NN 049342
DSM编号：大肠杆菌DSM No.11842
保藏日：1997年11月12日
保藏人号：NN 049343
DSM编号：大肠杆菌DSM No.11843
保藏日：1997年11月12日
保藏人号：NN 049344
DSM编号：大肠杆菌DSM No.11844发明详述
衍生自担子菌纲的本发明的肌醇六磷酸酶优选衍生自腹菌类(Gasteromycetes)、层菌类(Hymenomycetes)、Urediniomycetes、Ustilaginomycetes或来自于未分类的担子菌类(Basidiomycota)，更优选来自于层菌纲类(Hymenomycetes)。
衍生自层菌纲的肌醇六磷酸酶优选来自以下各目中的菌株：蘑菇目、Aphyllophorales、木耳目(Auriculatiales)、Boletales、Cantharellales、Ceratobasidiales、Dacrymycetales、Echinodontiaceae、Hericiales、Stereales、Thelephorales、Tremellales、Tulasnellales或来自于有丝分裂孢子的层菌纲。
其它优选的目是Coriolales、Hyphodermatales、Schizophyllales、Hymeno chaetales和Phanerochaetales。
在下文中列举了这些目中一些优选的科，在每个科名后面的括号中还附加了各科中的优选的属的实例。
优选的Aphyllophorales目的科有多孔菌科(polyporaceae)(例如栓菌属、烟管菌属、耙菌属、锐孔菌属、Trichaptum、迷孔菌属、层孔菌属)，粉孢革菌科(Coniophoraceae)(例如粉孢革菌属)、伏革菌科(例如hyphoderma属、trechispora属、Steccherinum属Merulius属、隔孢伏革菌属)，裂褶菌科(例如裂褶菌属)。
优选的蘑菇目的科有Bolbitiaceae(例如田头菇属、Conocybe属、Bolbitius属)、Coprinaceae(例如Coprinus属、Panacolus属)、Pluteaceae(例如Volvariella属)、蓑蕈菌科(例如Podaxis属)、口蘑菌科(Tricholomataceae)(例如Marasmiellus属、Strobilurus属、Lyophyllum属、Cystoderma属、Merismodes属)、Strophariaceae科(例如Stropharia属、Hypholoma属)。
优选的Auriculariales目的科有Exidiaceae科(例如Exidia属)。
优选的Dacrymetales目的科有Dacrymycetaceae科(例如Femsjonia属)。
优选的Stereales目的科是Hyphodermataceae(例如Hyphodontia属)和Stereaceae科(例如Amylostereum和Stereum属)。
优选的Boletales目的科是Paxillaceae(例如Paxillus属和Hygrophoropsis属)。
优选的Thelophorales目的科是Thelephoraceae(例如Typhula属)。
上述属中一些优选菌株的实例为Stropharia cubensis(尤其是ATCC13966)，平田头菇(尤其是CBS 900.96)，黑刺烟管菌(尤其是CBS 580.95)，Trametes Zonatella，绒毛栓菌(尤其CBS100232)，Paxillus involtus(尤其CBS100231)，Trametes hirsuta(尤其是DSM 2987)，栎隔孢伏革菌，Hyphoderma argillaceum，裂褶菌(尤其是CBS 443.97)，Peniphora lycii(尤其是CBS 686.96)，Amylostereum Chailletii，锐孔菌(尤其是CBS 422.97)。优选菌株的进一步的实例列于实施例5，表6中。
权利要求2的肌醇六磷酸酶有14个相同的部分氨基酸序列中至少一个，即所谓的共有序列，即在序列表中为序列号：1-14。
在序列表中，使用三字母的氨基酸编码，一些氨基酸被命为Xaa，其基本意义为“任何氨基酸”，解释如下。然而在一些这种Xaa位置上，在序列表中使用了标注以用例如在NN位置上的X表明任何两个氨基酸，参见下文。名
在权利要求中，在这些序列中使用了氨基酸单字母编码，“X”代表任何氨基酸，包括任何非天然的氨基酸以及包括任何其结构或功能上的相似变体。编号例如“[A/E]”意指氨基酸A和E中的任何一个。因此，如果在任何给定的式子的部分序列中有两个这种的多重选择存在，式子覆盖的序列数为22。类似地，如果在一个给定的式子中有“N”这样的多重选择，这种式子数为覆盖的序列数为2N。
序列号：1-9从多肽的N端到C端的顺序排列。序列号10到14为相应于实施例5中具体所列的PCR探针的氨基酸序列(即分别相应于522有义和540反义；537有义；538有义；525反义和539反义引物)。
在优选实施方案中，分离的多肽包括序列号1-14的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或所有十四个序列，其优选在权利要求3中所显示的位置上。权利要求3也可参考图6的序列对比。
权利要求4的氨基酸序列对涉及实施例5和6的PCR实验(即所建议的那些引物对)。
另外，有些缺失看起来是此肌醇六磷酸酶亚群的特征。在权利要求5中列出了一些特定缺失的区域。该权利要求也可参见图6的序列对比。
尤其根据图7所示的序列对比鉴定了这些部分序列。在这些序列对比中，上面的5个肌醇六磷酸酶，即phyA1_P.involtus，phyA2_P.involtus，phyA_T.pubescens，phyA_A.pediades和phyA_P.lycii都衍生自担子菌纲并如此处的实验部分所述进行克隆。在序列对比的底部所列的5个肌醇六磷酸酶均衍生自子囊菌纲并且其序列在前面所提到的现有技术中是已知的。有关此序列对比的进一步的细节和解释请参见实施例4，筛选此亚群的肌醇六磷酸酶的一种方法请参见实施例5。实施例8-18描述了本发明的5个肌醇六磷酸酶的纯化和表征，即Peniophora lycii，平田头菇、Paxillus involtus和Trametes Pubescens的肌醇六磷酸酶。
权利要求6-8涉及实施例5、6和7的实验。相应于术语“中到高度严紧度”的条件可见于上述的基本定义中，即洗涤条件为2×SSC及65℃的温度。优选地，洗涤温度为65℃或更高，例如70、75、80或甚至85℃，相当于高严紧度、相当高的严紧度和极高严紧度。
优选地，PCR反应可用模板或靶序列，例如核苷酸序列，其可以是例如基因组DNA或cDNA。然而，例如也可将mRNA用作模板。基因组DNA不必进行分离，PCR反义也可直接在例如真菌菌丝体上进行。
可替换地，PCR反应也可用其任何PE变体的野生型基因进行。尤其是，在野生型基因上用至少一个引物对得到了至少一条PCR带。
在实验部分建议了用于PCR反应的一些特定引物。但是，本领域技术人员首先能够从图6的序列对比(担子菌纲肌醇六磷酸酶)中提出其它特定的引物，其引物看起来是担子菌纲肌醇六磷酸酶的特征，即他也必须考虑图7的序列对比(表明了担子菌纲肌醇六磷酸酶以及已知的子囊菌纲肌醇六磷酸酶)。因此，权利要求6一般指的是这些引物，即根据其基本常识及图6和7的序列对比，本领域技术人员将会提出的对子囊菌肌醇六磷酸酶特异性的引物。
关于6-肌醇六磷酸酶，本发明涉及这类衍生自任何真菌的肌醇六磷酸酶。“真菌的”根据上面描述而且该术语包括尤其是担子菌纲。在此文的一般定义部分有如何理解该特异性的解释。在本文中应注意到“6-肌醇六磷酸酶”的概念意指D6-、L6-或D/L-6-肌醇六磷酸酶。令人惊奇的是，已证明这类真菌6-肌醇六磷酸酶与已知的真菌3-肌醇六磷酸酶相比具有极优异的表现，此处对实施例10-12的参考文献揭示了隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶是一种6-肌醇六磷酸酶以及与已知的曲霉属肌醇六磷酸酶相比具极优异的表现。尤其是，例如PA水解的起始速率上升了并且此事实的一个相当令人信服的解释是这种肌醇六磷酸酶是一种6-肌醇六磷酸酶，其原因是这些位置(PA的4-和6-位)比任何其它位置的空间阻碍都要少。
优选地，真菌6-肌醇六磷酸酶是担子菌类肌醇六磷酸酶，更优选是标题为“发明详述”的本部分开始时中所描述的纲、亚纲、目、种和菌株的。在另外的优选的实施方案中该肌醇六磷酸酶是D6-肌醇六磷酸酶。在另外再一个实施方案中该肌醇六磷酸酶是L6-肌醇六磷酸酶。
如权利要求32-36所明确的一样，该申请也涉及例如真菌6-肌醇六磷酸酶在饲料和食物中的用途，含有这类真菌6-肌醇六磷酸酶的组合物，尤其是食物和饲料添加剂，以及在从肌醇六磷酸和肌醇六磷酸盐中释放无机磷酸盐中这种真菌6-肌醇六磷酸酶的用途。
在权利要求1-8的优选实施方案中，该肌醇六磷酸酶为(3+6)-肌醇六磷酸酶，即任何D3-/D6-；L3-/L6-；D3-/L6-；L3-/D6-肌醇六磷酸酶，参考尤其见于本文中涉及田头菇属肌醇六磷酸酶的实施例15～17，该酶与已知的曲霉肌醇六磷酸酶相比也有更优越的表现。
优选地，(3+6)-肌醇六磷酸酶为担子菌类肌醇六磷酸酶，更优选地为标题为“发明详述”的本部分开始时的纲、亚纲、目、种和菌株的。
更优选地，(3+6)-肌醇六磷酸酶稍优选这些位置中的一个，尤其是6-位。
权利要求11、14、17、19和21的肌醇六磷酸酶分别与平田头菇、Peniophora lycii、Paxillus involtus(phyA1和phyA2)以Trametes pubescens的分离的肌醇六磷酸酶，分别相应于序列号：22，24，26，28和30(或其成熟的多肽或仍然保留了肌醇六磷酸酶活性的任何片段)有50％同源性。“同源的”定义请参见标题为“基本定义”的部分。与已知肌醇六磷酸酶的同源性可尤其从实施例4中的表1中显现出来了。优选地，参见上文的片段的氨基酸的数目至少为50％，更优选为至少60％，还优选至少为70％，又优选至少80％，尤其至少为90％的序列表中所列的序列的氨基酸数目。这也用于公开于本文的任何多肽片段。
优选地，本申请的所有氨基酸同源性至少为55％，或至少为60％，或至少为65％，尤其为至少为70％。优选地，同源性的程度至少为80％，更优选至少90％，再优选至少95％，尤其至少97％。
权利要求12涉及衍生自田头菇属的序列号22的氨基酸序列的特定片段，然而这些片段仍然表现了肌醇六磷酸酶活性。如在下面的实施例部分(实施例13-15)描述了更多的细节，当在酵母中表达时，约80％的田头菇属肌醇六磷酸酶具有Val的N端氨基酸(序列号22的氨基酸号27)，然而约有20％的N端氨基酸为Thr(序列号22的氨基酸号25)。当在曲霉属中表达时，约2/3的N端氨基酸为Phe(序列号22中的氨基酸号31)，然而约1/3具有Gln的N端氨基酸(序列号22中的氨基酸28)。因此，至少有这些四个可能的成熟的氨基酸序列。
类似地，权利要求15涉及衍生自隔孢伏革菌属的序列号24的氨基酸的片段，然而还表现出了肌醇六磷酸酶活性。如同下文的实施例所描述的细节一样，当在曲霉中表达时，隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶的N端氨基酸序列为Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-(序列号24中氨基酸号31-37)。因此序列号24氨基酸号31-439的序列目前据信是成熟的肌醇六磷酸酶序列。
权利要求13、16、18、20和22涉及分别与平田头菇、Peniophoralycii、Paxillus involtus(phyA1和phyA2)和Trametes pubescens的分离的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。
这些肌醇六磷酸酶此处定义是被肌醇六磷酸酶编码部分所编码的，这些部分为
i)分别为序列表中序列号为21、23、25、27和29(Paxillus involtus的phyA1和phyA2)的DNA序列；或者
ii)分别克隆到大肠杆菌DSM 11313、11312、11842、11843和11844中存在的质粒pYES 2.0中的DNA序列；或至少与其有50％同源性的其类似物或衍生物。
有关“肌醇六磷酸酶编码部分”的定义请参见基本定义部分。
该5个DNA序列可直接得自于保藏的亲本菌株或得自保藏大肠杆菌，方法为通过本领域已知的方法从质粒DNA中提取(Sambrook等(1989)分子克隆：实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。
权利要求23-26涉及编码本发明的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，尤其涉及DNA分子。
权利要求24的DNA分子包括至少一个此处暗示的特定引物。在优选的实施方案中，其包括至少两个、三个、四个、五个或六个这些序列。
此处通过编码肌醇六磷酸酶定义的权利要求25的DNA分子，选自：
(a)田头菇属、Peniophora、Paxillus和Trametes肌醇六磷酸酶(Paxillus的phyA1和phyA2)的特定的核苷酸序列，例如在序列表中所示的具有所示的序列号的DNA(或它们的互补链)；
(b)与(a)所示的相同的序列但通过保藏的质粒克隆表达；
(c)与这些序列至少有55％同源性的序列；
(d)在低严紧条件下与(a)或(b)的序列杂交的序列；
(e)由于遗传密码的简并性不杂交但编码特定多肽或其肌醇六磷酸酶活性片段的序列。
对于“杂交”的定义，请参考标题为“基本定义”的部分，其中也列举了一些优选的杂交条件。
对于特征(c)中的同源部分，其与标题(a)和(b)下所确定的核酸序列的同源性程度至少约为55％(还编码一条展现肌醇六磷酸酶活性的多肽)。尤其是，该同源性至少为60％，或至少为65％，尤其至少为70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，再优选至少约95％，最优选至少约97％。尤其是，同源性的程度是根据与所列的全序列或它们的互补链或其相应于“成熟”肌醇六磷酸酶的任何亚序列相比较而来的。
本发明的所选择的肌醇六磷酸酶的DNA与已知肌醇六磷酸酶的同源性尤其显示于实施例4的表1中。
核苷酸权利要求26涉及多肽权利要求6-8，而且关于这些权利要求的相应的优选实施方案也在此处并入涉及此DNA权利要求(参考实施例5、6和7；“中到高严紧度”指的是洗涤条件为2×SSC和65℃的温度，优选为65℃或更高，例如70、75、80或甚至85℃；PCR反应优选以靶核苷酸序列进行，例如DNA，像基因组DNA或cDNA(或mRNA)；任何其PE变体的野生型基因)。
本发明的DNA序列也可通过任何基本的方法克隆，这些方法涉及
·从任何期望可产生所研究的肌醇六磷酸酶的生物体中将cDNA文库克隆到适当的载体中，
·用所说载体转化适当的酵母宿主细胞，
·在适当条件下培养宿主细胞以表达cDNA文库中的克隆所编码的所研究的任何酶，
·通过测定由这类克隆所产生的酶的任何肌醇六磷酸酶活性而筛选阳性克隆，以及
·从这类克隆中分离编码该酶的DNA。
在WO 93/11249和WO 94/14953中已公开了基本的分离方法，其内容在此处用作参考。在实验部分给出了筛选方法的详细描述。
权利要求27涉及可衍生自图6的序列对比的引物、探针、寡核苷酸分子/DNA分子。只有特异于或独特于本发明的新的肌醇六磷酸酶当然包括于本文中，即人们也必须考虑图7的序列对比(参见上述权利要求6-8的标注)。
鉴定进一步产生肌醇六磷酸酶的细胞，尤其是微生物的方法公开于权利要求31中。尤其是该方法也是一种选择或筛选产生肌醇六磷酸酶的微生物的方法。此处的“细胞”的概念一般被定义为基本定义部分的术语“宿主细胞”。优选的细胞是微生物细胞，尤其是真菌细胞，优选是担子菌类。更优选的担子菌细胞列于本发明的详述的最开始部分。
任何来源，尤其是任何微生物能被选择以提供模板或靶序列，通常以基因组DNA、cDNA或mRNA的形式。
有关PCR反应的一般参考包括标准反应条件可见于实验部分。关于适当的引物的选择可参考上述对权利要求6-8的标注。
优选地，必须确证衍生自模板的扩增的PCR片段是特异性的。
适当的鉴定程序的一些实施例为：
a)在琼脂糖凝胶中的电泳表明相应于扩增的PCR片段的PCR带的存在；以及，如果有必要，还有
b)按预期控制扩增的PCR片段的大小；以及如果有必要，还有
c)分离并测序该PCR片段或带以表明与亲本序列的高度同源性，而引物衍生于该亲本序列。
增b)：内含子的潜在存在(一个实例：300个碱基中的50个)是使得序列大小不完全一致的原因之一。优选地，所扩增的PCR片段(包括内含子)例如通过碱基的数目测定大小，该数目在亲本序列的引物之间的碱基/核苷酸数目的50-150％、60-140％、70-130％、80-120％、85-115％、90-110％、95-105％的范围内(图6)，引物衍生自该亲本序列。在另外的优选实施方案中(除去了内含子)，所扩增的PCR片段的大小在亲本序列的引物之间的碱基数目的80-120％、85-115％、90-110％、95-105％的范围内(图6)，引物衍生自该亲本序列。
增c)：优选同源性的程度超过50、60、70、75、80、85、90、95％的同源性(如上述所确定)。可替换地，还要检定所扩增的PCR片段是否包括引物对间的至少一个保守区域，所说的保守区域示于图6中的灰色阴影。优选地，该片段包括至少两个、三个、四个、五个等或所有这些保守区域。检测同源性的其它方法是通过检测作为图6的亲本序列的特征的缺失区域的存在。另一种检测同源性的方法是检测保守区域之间的特征距离，参见例如权利要求5。
权利要求34涉及制备肌醇六磷酸酶的多肽的方法，所说的方法逻辑上类似于权利要求31的筛选方法。
权利要求34的步骤a)+d)涉及从野生型细胞，尤其是微生物菌株中制备肌醇六磷酸酶。
步骤b)+d)涉及从a)鉴定的生产肌醇六磷酸酶的细胞，尤其是微生物克隆编码全长肌醇六磷酸酶的基因，并将此基因转入到异源或同源宿主细胞中，其可以使用任何传统的重组DNA技术，例如此前所述的和一般所指的例如Maniatis(上面引用)。
步骤c)+d)涉及使用扩增的PCR片段作为杂交探针来识别和分离编码肌醇六磷酸酶的DNA分子(编码肌醇六磷酸酶的基因或基因的编码肌醇六磷酸酶的部分)的用途。这种DNA分子可从任何来源(靶序列，模板)，包括多核苷酸，例如基因组DNA，cDNA，mRNA中分离。
杂交实验尤其是杂交条件，包括优选条件，以及分离程序基本描述于前文中。
一旦分离出来，就将该DNA分子转到宿主细胞中，并且也基本描述于前文中。
最后，本发明还一般涉及根据权利要求1-22中任一项的多肽从任何肌醇六磷酸酶底物中释放(或催化其释放)三价磷，尤其是从肌醇六磷酸盐或肌醇六磷酸中释放无机磷酸盐的用途；可替换地将肌醇六磷酸转化为无机磷酸本发明的肌醇六磷酸酶盐和(肌醇和/或其单、二、三、四、五磷酸酯)的用途。该权利要求包括其中能表现如前述的肌醇六磷酸酶活性的任何方法。
根据本发明的更具体的用途是人类食品或动物饲料制品或用于此类制品的添加剂，其中肌醇六磷酸酶尤其用于以下目的
(i)降低粪尿中的肌醇六磷酸水平；
(ii)增进消化、刺激生长，或促进食品和饲料的利用或其转化效率，尤其是通过制备可获得的蛋白质，否则其已被肌醇六磷酸结合，
(iii)预防营养不良或疾病例如由缺乏必需离子和磷酸盐引起的贫血，即促进矿物质的生物利用率或增加其吸收，使其不再有必要加入额外的磷酸盐和离子等。
尤其是，本发明的肌醇六磷酸酶也可用于鸡食中以提高蛋壳质量(减少由于破裂引起的损失)，参见例如The Merk Veterinary Manual，(第七版，Merck&CO.，Inc.，Rahway，N.J.，U.S.A.，1991；第1268页)；Jeroch等；Bodenkultur第45卷，第4册第361-368页(1994)；Poultry Science，第75卷，第一册，第62-68页(1996)；Canadian Journal of Animal Science第75卷，第3册，第439-444页(1995)；Poultry Science第74卷，第5册，第784-787页(1995)和Poultry Science第73卷，第10册，第1590-1596页(1994)。
“饲料”或“食品”分别意指任何天然或人工的食物、饮食等或饮食成分，其分别被动物或人打算或适于食用、吸收、消化。
肌醇六磷酸酶可在体外或体内发生作用，即分别在个体的摄入前或胃中发挥作用。同样，结合的作用也是可能的。
根据本发明的肌醇六磷酸酶组合物总是包括至少一个本发明的肌醇六磷酸酶。
一般而言，肌醇六磷酸酶组合物是液体或干物质。
液体组合物不必含有任何肌醇六磷酸酶之外的物质，优选以高纯的形式。然而常常也会加入稳定剂例如甘油、山梨醇或单丙二醇。该液体组合物还可能包括其它添加剂，例如盐、糖、防腐剂、pH调节剂、蛋白质、肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸酶底物)。典型的液体组合物是基于水或油的浆料。在食品或饲料的一个可选的压片过程后可在其中加入该液体组合物。
干物质组合物可以是喷雾干燥的组合物，其中该组合物无需含有除干燥形式的酶之外的任何其它物质。然而干燥组合物是所谓的颗粒，其常常可方便地与例如食品或饲料成分混合，或更优选地，形成预混物的组分。酶颗粒的颗粒大小优选与混合物中的其它成分相容。这提供了一种方便安全的方法来将酶掺到例如动物饲料中。
在高切力混合器(例如Lodige)中用附聚技术制备附聚颗粒，其中填充材料和酶共聚在一起形成颗粒。通过将载体材料核心来吸收或以酶包被制备吸收颗粒。
典型的填充材料是盐例如硫酸二钠。其它的填充剂为高岭土、滑石、硅铝酸镁和纤维素纤维。可选地，结合剂例如糊精也包括在附聚颗粒中。
典型的载体材料是淀粉，例如以木薯、玉米、马铃薯、水稻和小麦的形式。也可以使用盐。
可选地，颗粒以包被混合物包裹。这类混合物包括包被剂、优选憎水包被剂、例如氢化棕榈油和牛脂，而且如果有必要，其它添加剂，例如碳酸钙或高岭土。
额外地，肌醇六磷酸酶组合物可包含其它取代成分，例如着色剂、香味化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其它饲料或食品增进酶等。这就是特别地所谓的预混物。
“食品或饲料添加剂”是基本上纯的化合物或多成分组合物，其打算或适于加到食品或饲料中。尤其硫是其为一种其目的是作为食品或饲料产品的成分或影响食品或饲料产品的任何特征的物质。其制备如上述的肌醇六磷酸酶组合物。典型的添加剂常常含有一种或多种化合物例如维生素、矿物质或饲料增进酶并有适当的载体和/或赋形剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶组合物额外包括有效量的一种或更多的饲料增进酶，尤其是选自包括下列组中的酶的饲料增进酶，这些酶包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶、β-葡聚糖酶、尤其内-β-1，4-葡聚糖酶和内-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶(Xylosidases)，半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖内-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内-1，3-β-半乳糖苷酶，内葡聚糖酶，尤其是内-1，2-β-匍聚糖酶，内-1，3-α-葡聚糖酶，以及内-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶，尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果胶酸酯裂解酶，以及α-半乳糖醛苷酶(galacturonisidases)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶及脂解酶例如脂酶、磷脂酶及角质酶(Cutinases)。
本发明的动物饲料添加剂在进食之前或同时补充到单胃动物。优选地，本发明的动物饲料添加剂是在进食的同时添加给单胃动物的。在一个更优选的实施方案中，加到饮食中的动物饲料添加剂的形式是颗粒或稳定的液体。
食品或饲料中有效量的肌醇六磷酸酶从约10～20.000；优选从约10到15.000，更优选从约10到10.000，尤其从约100到5.000，特别从约100到约2.000FYT/kg饲料或食品。
本发明的肌醇六磷酸酶的其它特定用途的实例是在大豆加工和在肌醇或其衍生物生产之中。
本发明还涉及降低动物粪尿中肌醇六磷酸酶水平的方法，其中用含有有效量的本发明的肌醇六磷酸酶的饲料来喂养动物。如在本申请开头时所指出的，其一个重要的效应是减少环境中的磷酸盐污染。
也在本发明的范围内的是本发明的肌醇六磷酸酶在制备食品或饲料制品或添加剂时的用途，即肌醇六磷酸酶仅在制备时发挥其肌醇六磷酸酶活性而在成品食品或饲料产品中是无活性的。这方面涉及例如生面团制备和烘烤。
本发明还涉及所保藏的微生物的基本纯净的生物培养物和包含作为其遗传部件一部分的编码本发明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的菌株。包括在基本纯净的生物培养物的定义范围内的保持了编码肌醇六磷酸酶的能力的所说菌株的任何突变体。
在下面的实施例中进一步描述了本发明的细节，实施例在任一方面都并非意在限制本发明的范围。实施例
材料和方法
培养基：是
肌醇六磷酸复制板：
加到200ml融化的SC琼脂上
20ml 20％半乳糖
800μl 5％苏氨酸
25ml溶液A
25ml溶液B
200μl微量元素溶液(DSM目录141)
溶液A：
6克CaCl2，2H2O
8克MgCl2，6H2O
加入ddH2O到1升
pH＝6.5
溶液B：
35.12克肌醇六磷酸钠
加入H2O到1升
pH＝6.5培养基A：酵母氮碱基W/O氨基酸(Difco 0919)    7.5g/l琥珀酸(Merck 822260)               11.3g/lNaOH(Merck 6498)                   6.8g/l酪蛋白水解物W/O维生素(Difco 0288)  5.6g/l色氨酸(Merck 8374)                 0.1g/l苏氨酸                             1.0g/l肌醇六磷酸钠(35.12g/l pH6.5)       125ml/l半乳糖                             20.0g/l微量金属(DSM 141)                  1.0ml/l加H2O至1升微量金属溶液次氮基三乙酸            1.50gMgSO4，7H2O          3.00gMnSO4·2H2O          0.50gNaCl                    1.00gFeSO4，7H2O          0.10gCoSO4·7H2O          0.18gCaCl2，2H2O          0.10gZnSO4，7H2O          0.18gCuSO4，5H2O          0.01gKAl(SO4)2，12H2O    0.02gNa2MoO4，2H2O       0.01gNiCl2，6H2O          0.025gNa2Se3O，5H2O       0.30g无菌水                  至1升pH7.0
首先溶解次氮基三乙酸并用KOH调至pH6.5，然后加入矿物质。终pH7.0(用KOH)。培养基B：
除了所加的碳源为葡萄糖而非半乳糖之外，类似于培养基A。YPD：
10克酵母提取物，20克胨，加H2O至900ml。高压灭菌，加入100ml20％葡萄糖(无菌过滤过的)。
YPM：
10克酵母提取物，20g胨，加H2O到900ml。高压灭菌，加入100ml 20％麦牙糖糊精(天菌过滤的)10×Basal盐：
75克酵母氮碱，113克琥珀酸，68克NaOH，加H2O到1000ml，无菌过滤。SC-URA：
100ml 10×Basal盐，28ml 20％无维生素酪蛋白水解物，10ml 1％色氨酸，加水至900ml，高压灭菌，3.6ml 5％苏氨酸和100ml 20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-琼脂：
SC-URA，20g/l琼脂加入。
SC-变体琼脂
20g琼脂，20ml 10×Basal盐、H2O加至900ml，高压灭菌肌醇六磷酸酶活性测试
可通过下述试验来测定肌醇六磷酸酶活性：
将10μl稀释过的酶样品(稀释于0.1M乙酸钠，0.01％Tween 20，pH5.5)加到溶于0.1M乙酸钠、0.01％Tween 2.0、pH5.5(溶于肌醇六磷酸钠后调节pH，底物先预热)的250μl 5mM肌醇六磷酸钠(Sigma)中并于37℃预热30分钟。加入250μl 10％TCA终止反应并加入溶于100ml钼酸盐试剂(2.5g(NH4)6Mo7·4H2O，溶于8ml H2SO4中，稀释至250ml)中的500μl7.3克FeSO4来测定游离的磷酸根。在96孔微滴板上测定200μl样品在750nm处的吸收。包括底物和酶的空白。也包括磷酸的标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1FYT等于在给定条件下释放1μmol磷酸/分钟的酶量。一般分子生物学方法
除非另外提及，DNA操作和转化使用分子生物学标准方法进行(Sambrook等.(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等(编)“现代分子生物学方法”。John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物学方法”。John Wileyand Sons，1990)。
除非另作说明，所有用于DNA操作，例如限制性内切酶、连接酶等酶都得自于New England Biolabs，Inc.。酶的使用根据产商建议。实施例1
源于Peniophora lycii CBS No.686.96的肌醇六磷酸酶的克隆和表达保藏的微生物
Peniophora lycii CBS No.686.96含有编码肌醇六磷酸酶的本发明的DNA序列。
大肠杆菌DSM NO 11312含有在穿梭载体pYES 2.0中包含的编码本发明的肌醇六磷酸酶的全长cDNA序列的质粒。
其它菌株：
酵母菌菌株：所用的啤酒糖酵母菌株是W3124(Van den Hazel，H.B.；Kielland-Brandt，M.C.；Winther，J.R.Eur.J.Biochem.，207，277-283，1992；(MATa；ura 3-52；leu2-3，112；his 3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大肠杆菌菌株：DH10B(Life Technologies)
质粒：
曲霉属表达载体pHD 414是质粒p775的衍生物(描述于EP 238 023中)。pHD 414的构建进一步描述于WO 93/1249。
pYES 2.0(Invitrogen)
pA2phy2(见实施例1)酵母中表达克隆
酵母中表达克隆根据H.Dalboege等的描述(H.Dalboege等Mol.Gen.Genet(1994)243：253-260；WO 93/11249；WO 94/14953)进行；其在此处用作参考。所有的各步骤：总RNA提取、cDNA合成、绿豆核酸酶处理、用T4 DNA聚合酶平端化以及文库构建均按照上述文献进行。用于mRNA分离的Peniophora lycii CBS No.686.96的发酵程序：
从长有菌丝体的板中将Peniophora lylii 686.96接种到含100ml培养基B(大豆30g/l、麦芽糖糊精15g/l，细菌胨5g/l，Pluronic 0.2g/l)。该培养物26℃下静止温育15天。所得的培养基肉汤通过miracloth过滤将将霉菌丝在液氮中冷冻。
如H.Dalboege等Mol.Gen.Genet(1994)243：253-260.；WO 93/11249；WO 94/14953所述从该培养物中自菌丝提取mRNA。
总RNA提取以硫氰酸胍进行然后在5.7M CsCl垫层中超离心，用WO94/14953所述方法通过寡聚(dT)-纤维素亲和层析分离Poly(A)+RNA。cDNA合成：
通过RNase H法(Gubler和Hoffman(1983)Gene 25；263-269，Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)从5mg polyA+RNA合成双链cDNA。该Poly A+RNA(在5μl DEPC-处理过的水中5μg)70℃加热8分钟，反应体系为预先硅烷化的无RNase的Eppendorph管，在冰上猝灭，将其以终体积为50μl与反转录酶缓冲液(50mM Tris-Cl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)，其含有1mM的dATP，dGTP和dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)，40单位的人胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)，1.45μg Oligo(dT)18-Not I引物(Pharmacia)和1000单位的SuperScript II RNase H反转录酶(BethesdaResearch Laboratories)。将反应混合物在45℃温育1小时合成第一链cDNA。合成后，根据产商建议通过MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)旋转柱将mRNA：cDNA杂交混合物进行凝胶过滤。
凝胶过滤后，将杂交物稀释于250μl的第二链缓冲液(20mMTris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.16mMbNAD+)中，其含200μl的每种dNTP，60个单位的大肠杆菌DNA聚合酶I(Pharmacia)，5.25单位的RNase H(Promega)和15单位的大肠杆菌DNA连接酶(BoehringerMannheim)。第二链的cDNA合成是将反应管在16℃温育2小时额外再在25℃15分钟完成的。加入EDTA至终浓度20mM终止反应，然后以酚/氯仿抽提。绿豆核酸酶处理：
加入2倍体积的96％EtOH，0.2体积的10M NH4Ac，于-20℃将双链cDNA进行12小时沉淀，通过离心回收，在70％EtOH中洗涤，干燥并悬浮于含有25个单位的绿豆核酸酶(Pharmacia)的30μl绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc，pH4.6，300mM NaCl，1mM ZnSO4，0.35 mM DTT，2％甘油)中。通过在30℃温育该反应物30分钟，接着，加入70μl 10mM Tris-cl，PH7.5，1mM EDTA，酚抽提并用2倍体积的96％EtOH和0.1体积3MNaAc，PH5.2在冰上30分钟沉淀。用T4 DNA多聚酶平端化：
双链cDNA通过离心回收，并在含有0.5mM每种dNTP和5个单位的T4 DNA多聚酶(New England Biolabs)的30ml T4 DNA多聚酶缓冲液(20mMTris-乙酸盐，pH7.9，10mM MgAc，50mM KAc，1mM DTT)中通过在16℃下将反应混合物温育1小时进行平端化。通过加入EDTA至终浓度为20mM终止反应，随后以酚和氯仿提取，加入2体积的96％EtOH和0.1体积的3MNaAc pH5.2以沉淀之。衔接头连接，NotI消化和长度选择
补平反应后，通过离心回收cDNA，在70％EtOH中洗涤并干燥。将cDNA沉淀重新悬浮于含2.5μg非回文BstXI接头(Invitrogen)和30单位T4连接酶(Promega)的25μl连接缓冲液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中并在16℃下温育12小时。在65℃下加热20分钟中止反应，然后在冰上冷却5分钟。加入20μl水、5μl 10×Not I限制性酶缓冲液(New England Biolabs)和50单位Not I(New England Biolabs)以Not I限制酶消化接头后的cDNA，随后在37℃温育2.5小时。通过65℃加热10分钟中止反应。在1×TBE的0.8％ SeaPlaque GTG低融点琼脂胶(FMC)上通过凝胶电泳分离未连接的衔接头和小cDNA。在0.7kb处切除选择cDNA长度，并根据产商建议使用b-Agarase(New England Biolabs)从凝胶中回收，然后通过加入2体积的96％EtOH和0.1体积的3M NaAc pH5.2在-20℃下沉淀12小时。文库构建：
离心回收经定向的、长度选择过的cDNA，在70％EtOH中洗涤，干燥并重悬浮于30μl 10mM Tris-Cl，pH7.5，1mM EDTA中。根据产商建议通过Microspin S-300 HR(Pharmacia)旋转柱凝胶过滤将cDNA脱盐。在含5μl双链cDNA(反应管#1和#2)，15单位T4连接酶(Promega)和30ng(试管#1)；40ng(试管#2)和40ng(试管#3，载体背景对照)Bst XI-Not I切割的pYES 2.0载体的10μl连接缓冲液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中进行三项试验连接。连接反应在16℃温育12小时，在70℃加热20分，并在每个试管中加入10μl水。将1μl每种连接混合物电穿孔至40μl电感受态的大肠杆菌DH 10B细胞(Bethesda researchLaboratories)，方法如所述(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。用最佳条件在由集合体(pool)组成的大肠杆菌中建立文库。每个集合体(pool)通过在LB+氨苄青霉素琼脂板上在37℃下温育24小时扩展转化的大肠杆菌得到15.000-30.000克隆/板。将20ml LB+氨苄青霉素加到板中，并且在其中悬浮该细胞。细胞悬浮液在50ml试管中于37℃振荡1小时。利用QIAGEN质粒试剂盒根据产商建议从细胞中分离质粒DNA。
将从单独的集合体(pool)中得到1μl份的纯化的质粒DNA(100ng/ml)的通过电穿孔(Becker和Guarante(1991)Methods Enzymol.194：182-187)转化到S.Cerevisiae W 3124，并且将转化体涂于含2％葡萄糖的SC琼脂上并在30并℃下温育。阳性菌落的鉴定：
生长3-5天之外，将琼脂板复制涂于一套肌醇六磷酸酶复制板，并于30℃温育3-5天。将含0.2M CaCl2的1％LSB-琼脂糖(Sigma)倾于板上，1-4天之后，鉴定肌醇六磷酸酶阳性菌落，即那些由透明区包围的菌落。
从酶阳性菌落得到的细胞在琼脂上扩展单菌落分离，并且对所鉴定的每种产生肌醇六磷酸酶的菌落选择产生酶的单菌落。在曲霉中表达的cDNA基因的分离
将产生肌醇六磷酸酶的酵母菌落接种到50ml玻璃试管中的20ml YPD肉汤中。将试管在30℃振荡2天。在3000rpm离心10分钟收获细胞。
根据WO 94/14953分离DNA并溶于50ml水中。通过标准方法将DNA转化到大肠杆菌中。以标准方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并通过限制酶分析来分析。
用限制酶Hind IIT和Xba I切除cDNA插入片段，并且连接到曲霉表达载体pHD414中得到质粒pA2phy2。
将pA2phy2的Qiagen纯化的质粒DNA的cDNA插入物用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer，USA)，同时使用合成寡核苷酸引物，根据产商建议用Applied Biosystems ABI PRISMTM 377 DNA测序仪测序。米曲霉和黑色曲霉的转化
如WO 95/02043，第16页，第21行-第17页，第12行所述制备原生质体。
将100μl的原生质体悬浮液与10μl中的STC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，100mM CaCl2)的5-25μg的适当的DNA混合。将原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉amds基因的质粒)混合(Tove Christensen等，Bio/Technology，第1419-1422页，第6卷，1988年12月)。将混合物置于室温下25分钟。将0.2ml的60％PEG 4000(BDH 29576)，10mM CaCl2和10mMTris-HCl，pH7.5加入并小心混合(两次)并最终加入0.85ml的相同溶液，同时小心混合。将混合物置于室温下25分钟，在2500g旋转15分，将沉淀重新悬浮于2ml的1.2M山梨醇中。再沉淀一次后将原生质体平展于含1.0M蔗糖，pH7.0，10mM作为氮源的乙酰胺和20mM CsCl的极限板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1996)51-56)上抑制背景生长。在37℃温育4-7天后排出孢子并扩展单菌落。重复该程序并将第二轮再分离的单菌落的孢子保存为确定的转化体。米曲霉转化体测试
将每个米曲霉转化体接种于10ml YPM(参见下文)中并增殖。30℃温育2-5天后除去上清。
将20μl的上清加到在含0.1M乙酸钠pH4.5和0.1％肌醇六磷酸的1％LSB琼脂糖凝胶中打出的直径为4mm的孔中以鉴定肌醇六磷酸酶活性。将板于37℃放置过夜。将含有0.1M CaCl2和0.2M乙酸钠pH4.5的缓冲液倾于板上并将板置于室温1小时。将该肌醇六磷酸酶活性定为透明区域。批量进料发酵：
在含作为碳源的麦芽糖糊精、作为氮源的尿素和酵母提取物的培养基中进行批量进料发酵。将所研究的米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种到含3.5％该碳源和0.5％该氮源的培养基中进行批量进料发酵。于34℃和pH7.0培养24小时后，开始连续地供给额外的碳和氮源。将碳源作为限制因子，并保证氧是过量的。批量进料培养持续4天。SEQ ID No.23所示的DNA序列的分离：
SEQ ID No.23所示的编码本发明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的肌醇六磷酸酶编码部分可通过本领域已知的方法提取质粒DNA而从保藏的微生物大肠杆菌DSM 11312中得到(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。
以上述在酵母中表达克隆技术进行了克隆和表达。
从Peniophora lycii，CBS No.686.96中分离mRNA，其如上进行培养。
生长15天后收获菌丝(Mycelia)，立即冷冻于液氮中并保存于-80℃。来自于Peniophora lycii，CBS No.686.96，由约9×105单独克隆组成的文库在有1％载体背景的情况下于大肠杆菌中构建。将来自于一些集合体(pool)的质粒DNA转化到酵母中，并从每个集合体(pool)中得到了含250-400个酵母菌落的50～100个板。
如上所述鉴定和分离肌醇六磷酸酶阳性菌落并接种于50ml玻璃试管中的20mlYPD肉汤中。将试管在30℃振荡2天。于300rpm离心10分收获细胞。根据WO 94/14953分离DNA并溶于50μl水中。通过标准方法将DNA转化到大肠杆菌中。用标准方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并根据产商建议用Applied Biosystems ABI PRISMTM 377 DNA测序仪以Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin Elmer，USA)和合成的寡核苷酸引物对编码肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列进行测序。SEQ ID No.23中显示了编码肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列，相应的氨基酸序列示于SEQ ID No.24中。在SEQ ID No.23中从第1至第1320的核苷酸确定了编码肌醇六磷酸酶的区域。
SEQ ID NO 23中的DNA序列的部分，其编码肌醇六磷酸酶的成熟部分，是位置91至1320，其相应于SEQ ID NO 24的氨基酸位置31-439。
该cDNA可得自于DSM 11312的质粒。
总DNA可分离自酵母菌落，并且质粒DNA可如上述通过大肠杆菌的转化拯救。为了在曲霉中表达该肌醇六磷酸酶，用适当的限制酶消化该DNA，片段长度于凝胶上分离，并纯化相应于肌醇六磷酸酶基因的片段。随后将基因连到pHD414上，以适当的限制酶消化，得到了质粒pA2phy2。
DNA在大肠杆菌中扩增后，如上述将质粒转化到米曲霉中。米曲霉转化体测试
如上述将每个转化体进行酶活性测试。一些转化体其肌醇六磷酸酶活性明显大于米曲霉的背景。这证实了在米曲霉中肌醇六磷酸酶的有效表达。实施例2
来自于平田头菇CBS No.900.96的肌醇六磷酸酶的克隆和表达
保藏的微生物：
平田头菇CBS No.900.96含有本发明的编码肌醇六磷酸酶的DNA序列。
大肠杆菌DSM No 11312在穿梭载体pYES 2.0中含有包括编码本发明的肌醇六磷酸酶的全长cDNA序列的质粒。SEQ ID No 21所示的DNA序列的分离：
SEQ ID No.21所示的编码本发明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的肌醇六磷酸酶编码部分可用本领域已知的质粒DNA的提取方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)从保藏的微生物大肠杆菌DSM 11313中得到。
用实施例1所述的在酵母中表达克隆的技术进行克隆和表达。
mRNA从平田头菇，CBS No.900.96中分离，其生长如上述并搅拌以保证足够的通气。
3-5天生长之后收获菌丝体(mycelia)，立刻冷冻于液氮中并保存于-80℃。将来自平田头菇，CBS No.900.96，由约9×105个单独克隆组成的文库如上述以1％的载体背景构建于大肠杆菌中。将来自于一些集合体(pool)的质粒DNA转化至酵母中，并从每个集合体(pool)中得到了含250-400个酵母菌落的50～100个板。
肌醇六磷酸酶阳性菌落如上所述进行鉴定和分离。cDNA插入物的从酵母中的直接克隆和表征如上述的材料和方法部分所述。编码肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列示于SEQ ID No.21中，相应的氨基酸序列示于SEQID No.22中。在SEQ ID No.21中，从第1号至第1362号的DNA核苷酸确定了肌醇六磷酸酶编码区。
编码肌醇六磷酸酶的成熟部分的SEQ ID NO 21中的DNA序列部分是位置79到1362，其相应于SEQ ID NO 22中的氨基酸位置27-453。
cDNA可得自于DSM 11313的质粒。
总DNA从酵母菌落中分离并通过如上述的大肠杆菌的转化拯救质粒DNA。为了在曲霉中表达肌醇六磷酸酶，该DNA用适当的限制酶消化，片段大小在凝胶上分离，纯化相应于肌醇六磷酸酶基因的片段。随后将该基因连到pHD 414，并用适当的限制酶消化，得到了质粒pA3phy3。
该DNA在大肠杆菌中扩增后，如实施例1所述将质粒转化到米曲霉中。米曲霉转化体测试
如实施例1所述测试每个转化酶的酶活性。具有肌醇六磷酸酶活性的一些转化体其活性明显高于米曲霉背景。这证实了肌醇六磷酸酶在米曲霉中有效表达。实施例3
源于Paxillus involtus CBS 100231和绒毛栓菌CBS 100232的肌醇六磷酸酶的克隆和表达保藏的微生物：
Paxillus involtus CBS No.100231包括本发明的两个编码肌醇六磷酸酶的DNA序列，绒毛栓菌CBS 100232包括本发明的肌醇六磷酸酶。
大肠杆菌DSM编号11842，11843和11844在穿梭载体pYES 2.0中含有包含全长cDNA序列的质粒，该序列编码本发明的这些肌醇六磷酸酶，尤其是分别为Paxillus involtus的phyA1，phyA2和绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶。SEQ ID Nos.25，27和29所示的DNA序列的分离：
SEQ ID Nos.25，27和29所示的编码本发明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的编码肌醇六磷酸酶的部分可通过本领域已知的质粒DNA提取技术(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)分别得自于保藏的微生物大肠杆菌DSM 11842，11843和11844。
以实施例1所述的在酵母中表达和克隆的技术进行克隆和表达。
mRNA从各个微生物中分离，该微生物生长于产生肌醇六磷酸酶的条件下，例如上面所述的以搅拌确保足够的通气。
3-5天生长后收获菌丝体，立刻于液氮上冷冻并保存于-80℃。文库，包含约9×105个单独的菌落组成，以1％的载体背景按所述构建于大肠杆菌中。将来自于一些集合体(pool)的质粒DNA转化到酵母中，并且从每个集合体(pool)中得到含250-400个酵母菌落的50～100个板。
如上述鉴定和分离肌醇六磷酸酶阳性菌落。cDNA插入物从酵母克隆中直接克隆，并如上面材料和方法进行表征。编码肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列示于SEQ ID Nos.25，27和29，并且相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID Nos 26，28和30。
该cDNA可得自于DSM 11842、11843和11844的质粒。
总DNA分离自酵母菌落，并通过如上所述大肠杆菌的转化拯救质粒DNA。为了在曲霉中表达肌醇六磷酸酶，DNA以适当的限制酶消化，片段大小在凝胶上分离，并纯化相应于肌醇六磷酸酶基因的片段。随后将该基因连到pHD 414上，并用适当的限制酶消化。
在DNA在大肠杆菌中扩增后，将该质粒转化到实施例1所述的米曲霉中。米曲霉转化体的测试
如实施例1所述测试每个转化体的酶活性。一些转化体的肌醇六磷酸酶活性明显高于米曲霉背景。这证实了肌醇六磷酸酶在米曲霉中的有效表达。
Paxillus involtus CBS 100231(phyA1P.i.和phyA2P.i.)的两个肌醇六磷酸酶以及绒毛栓菌CBS 100232(phy AT.P.)的肌醇六磷酸酶具有下述特征：
 氨基酸数目 计算而得的分子量(MW)   等电点(pI)
  phy A1 P.i.     423     46K     6.4
  phy A2 P.i.     423     45K     4.5
  phy AT.p.     426     46K     4.3
实施例4
来自4个担子菌纲平田头菇、Peniophora lycii、Paxillus involtus和绒毛栓菌的5个肌醇六磷酸酶(phyA)cDNA的表达克隆和表征。
如前面实施例所述，从来自4个担子菌纲平田头菇、P.lycii，P.involtus和绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶诱导的菌丝体在酵母表达载体pYES 2.0中构建定向cDNA文库。
筛选这些cDNA文库的肌醇六磷酸酶活性，所得到了5种不同的肌醇六磷酸酶cDNA，phy A P.lycii，phyA A.Pediades，phyA1 P.involtus，phyA2P.involtus，and phyA T.pubescens的分离。
来自这些克隆的phy A cDNA的表征揭示保守区域似乎是担子菌肌醇六磷酸酶特异性的。这表明担子菌肌醇六磷酸酶属于真菌肌醇六磷酸酶中的自身亚族。
为了方便地纯化和表征该重组酶，将该5种新的肌醇六磷酸酶在米曲霉中转化和超量表达。
通过在酵母菌中的表达克隆分离phyAcDNA
将真菌菌株平田头菇、P.lycii、P.involtus和绒毛栓菌固定培养于FG-4培养基(30g/l大豆面、15g/l麦芽糖糊精、15g/l细菌胨、0.2g/l Pluronic)。
如实施例1“米曲霉转化体测试”部分所述在平板测试检测培养上清中总肌醇六磷酸酶活性的累积。
生长5到15天之后检测到了最高水平的肌醇六磷酸酶活性，从而，根据此收获的菌丝体中分离的poly(A)+RNAs被用于在酵母表达载体pYES2.0中构建4个cDNA文库。将这些文库的等分试样转化到S.CerevisiaeW3124中，并将转化体涂平板至含2％葡萄糖的SC琼脂上并于30℃温育。
根据实施例1中所述的进行poly(A)+RNA的分离和cDNA文库的构建(“用于mRNA分离的Peniophora lycii CBS号686.96的发酵程序”部分到“黑色曲霉或米曲霉的转化”部分)。阳性菌落的鉴定
如实施例1相同标题下的描述鉴定阳性克隆。
将从每个文库所得的20000到30000个酵母克隆筛选其肌醇六磷酸酶活性并在每个文库中发现了1到4个肌醇六磷酸酶阳性酵母克隆。该阳性菌落相应于5个不同的肌醇六磷酸酶基因，phyA P.lycii(pC1phy2)，phyAA.pediades(pC1phy3)，phy A1 P.involtus(pC1phy5)，phy A2P.involtus(pC1phy7)，以及phy A T.pubescens(pC1phy6)。phyAcDNAs的表征：
图1显示了Peniophora lycii的编码PhyA的phyAcDNA的一级结构。来自于pC1phy2的1593bp的cDNA含有1320bp的开放阅读框(ORF)，编码439残基的多肽，计算的分子量为47560。该phyAcDNA编码一个30个氨基酸的信号肽。该成熟的蛋白质具有计算为44473的分子量以及pI 4.15的等电点。该cDNA和氨基酸序列分别包括于序列表中的SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24中。
图2中显示了得自平田头菇的phyA的cDNA序列和PHYA的推定序列。得自pC1phy3的1501bp的cDNA含有编码有带31氨基酸长信号肽的453残基的1362 ORF。该422氨基酸成熟蛋白质的计算分子量为46781，其等电点为pI 4.82。该cDNA和氨基酸序列分别包括于序列表SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22中。
图3和图4分别显示了从Paxillus involtus克隆的phy A1和phy A2cDNA的核苷酸序列和PHY1和PHY2的推定序列。
pC1phy5(phyA1)中的1522bp的插入物含有编码442氨基酸多肽的1329bp的ORF。根据Signal P V1.1预测(Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Stren Brunak和Gunnar Von Heijine：“真核和原核信号肽的鉴定及其切割位点的预测”，蛋白质工程(Protein Engineering)10，1-6(1997))，该信号肽由19个氨基酸组成。因此该成熟的蛋白质的预测的分子量为45932；pI为6.39。该cDNA和氨基酸序列分别包括于序列表的SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：26中。
质粒pC1phy7(phy A2)含有1642bp的插入物，并同时有编码442个残基的多肽的1329bp的ORF。上文提到的Signal P V1.1程序预测其假定的信号肽酶切割位点位于phy A2编码的前蛋白的Ala-19和Ala-20中，并且该成熟蛋白质的预测的分子量为45466以及预测的等电点为4.50。该cDNA和氨基酸序列分别包括于序列表的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中。
图5中显示了来自绒毛栓菌的phyAcDNA序列和PHYA的推断序列。pC1phy6中的1536bp的插入物含有编码一个443残基多肽的1332bp的ORF。根据上述的Signal P V1.1预测，该信号肽由17个残基构成。因此该成熟蛋白质由426个氨基酸构成，并具有预测分子量45905和pI 4.34。其cDNA和氨基酸序列分别包含于序列表SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30中。保守的担子菌肌醇六磷酸酶区域
下面的表1中显示了子囊菌类群已知的的肌醇六磷酸酶和本发明的担子菌类群的肌醇六磷酸酶的总的一致性(“X/Y”意指由GAP GCG v8确定的“DNA/多肽”一致性)。
此表中，最左边的栏的头5个肌醇六磷酸酶为担子菌肌醇六磷酸酶，剩余的为子囊菌肌醇六磷酸酶。
表1
子囊菌和担子菌肌醇六磷酸酶的同源性(比较了完全的cDNA)
Figure A9718079300511
在本实验中比较了完全的cDNA序列。根据表1，担子菌类群(basidiomycetes group)内的肌醇六磷酸酶的DNA同源性是在81％到56％范围的一致性，子囊菌类群(ascomycetes group)内的肌醇六磷酸酶的为在约65％到55％的范围内的一致性。因此，与子囊菌类群的肌醇六磷酸酶相比，担子菌类群的肌醇六磷酸酶的组内同源性更高。
但是，担子菌类群的肌醇六磷酸酶对子囊菌类群的肌醇六磷酸酶的CNA同源性公在从大约54％到48％的范围内。因此，这两个类群互相之间的差异性比各自类群内所观察到的差异性要大，而且以这点来区分子囊菌肌醇六磷酸酶和担子菌肌醇六磷酸酶是合理的。
这种关系也可从图6和图7的序列对比中看出来。
对表1的一些肌醇六磷酸酶，下面的表2显示了ORF的cDNA序列和成熟蛋白质(信号肽已切除)的肽序列的对比结果。
表2
所选择的子囊菌和担子菌肌醇六磷酸酶的同源性(比较了ORF cDNA和成熟肽)
Figure A9718079300521
在本表中，肽的同源性在表的右上半部标出，而DNA同源性在左下半部标出(二者的一致性百分数均根据GAP GCGv8)。
图6和7的序列对比表明一些序列的基序在5个担子菌肌醇六磷酸酶内是保守的。根据此序列对比衍生了几个保守的部分序列(SEQ ID NO：1-14)。而且，一些在担子菌肌醇六磷酸酶中也是保守的缺失区域也已被推出(参见例如权利要求5)。
一些特别高度保守的序列的实例是下文中所谓的共有序列I、II和III，其相应的序列对比见下文的表3和4。在这些表中，以灰色方块指出这些在至少9个序列中相同的残基，来自于担子菌类的肌醇六磷酸酶的相同序列以白色方块表示。共有序列I：I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R
(SEQ ID NO：3)共有序列II：N-W-T-[A/E]-G-F-X-X-A-S
(SEQ ID NO：5)共有序列III：
F-V-E-S-Q-X-[Y/F]-A-R-X-X-G-X-G-D-F-[E/A]-K-C
(SEQ ID NO：9)
表3
相应于共有序列I和II的部分序列对比
Figure A9718079300531
表4
相应于共有序列III的部分序列对比
Figure A9718079300541
下面的表5还显示了一些图7的序列对比的共有序列，尤其分别是SEQID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9。
表5
序列对比中的担子菌肌醇六磷酸酶共有序列
图7中PHYAP.lycii的残基位置的编号为68到83的在共有序列I(SEQID NO：3)位于活性位点附近，而且所有五个担子菌肌醇六磷酸酶都有此共有序列I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R及13个保守残基。而且，五个肌醇六磷酸酶中的四个都有一个第14位的共有残基F75。这与子囊菌肌醇六磷酸酶形成对比，其在相同的区域仅有8个保守残基。
当将P.lycii的  氨基酸位置162-171共有序列II(SEQ ID NO：5)与子囊菌肌醇六磷酸酶进行比较时，可看出担子菌肌醇六磷酸酶缺乏P.lyciiF167(A.nigerF177)到P.lycii P177(A.niger P194)(参见图7)之间的6到7个残基，而且总体而言担子菌纲肌醇六磷酸酶具有更高程度的保守性，其在10个残基中有7个相同残基(表3)。在相同区域，子囊菌纲肌醇六磷酸酶在17个残基中只有3个保守残基。
P.lycii的氨基酸位置415-433的共有序列III(SEQ ID NO：9)在担子菌纲肌醇六磷酸酶由19个残基组成，其中13个残基是保守的。在所有的真菌肌醇六磷酸酶中的共有序列中有3个残基是保守的。在P.lycii序列中，该残基是A422，G428和C433，对黑色曲霉而言，是A454、G458和C463。所有的担子菌肌醇六磷酸酶都具有保守的丙氨酸和甘氨酸之间的5个残基，而在全部的子囊菌肌醇六磷酸酶中仅有3个(表4)。PHYA在米曲霉中的表达
为了得了用于蛋白质的进一步纯化和表征的米曲霉中PHYA肌醇六磷酸酶的高水平表达，将来自平田头菇、P.lycii，P.involtus和绒毛栓菌的5个phy AcDNA亚克隆到pHD 414中(pHD 414为一真菌表达载体)。此处的phyA cDNA被插入到TAKA-淀粉酶启动子序列的3′和polyA的5′以及黑色曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子序列中。该pHD 414 phyA构建体被转化到米曲霉中，转化时使用amdS选择质粒进行共转化(参见实施例1的“米曲霉或黑色曲霉的转化”部分)。在上清中选择转化体的肌醇六磷酸酶活性，选出最高产的转化体用于发酵。结论
在担子菌肌醇六磷酸酶类群内的高度保守的区域表明其属于真菌肌醇六磷酸酶类群内其自身的亚族。
根据这些区域，可以设计用于相关肌醇六磷酸酶的分子筛选特异性的PCR引物(实施例5)。实施例5分子筛选(引物对522/538)
已经设计了用于分子筛选的编码五个担子菌肌醇六磷酸酶内的高度保守区域的下述简并核苷酸引物：
522有义引物：
5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′
(SEQ ID NO：15)
相应于氨基酸N-W-T-[A，E，D]-G-[F，L]，其带有CCC和Hind III位点5′尾；
537有义引物：
5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′
(SEQ ID NO：16)
相应于氨基酸D-K-[F，Y]-Y-G-T，其有CCC和Hind III位点5′尾；
538反义引物：
5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′
(SEQ ID NO：17)
相应于氨基酸D-[F，L]-D-K-[F，Y]-Y-G，其有一GC和Xba I位点5′尾；
525反义引物
5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′
(SEQ ID NO：18)
相应于氨基酸G-D-F-[A，D，E]-K，其带有GC及XbaI位点5′尾；
539有义引物：
5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′
(SEQ ID NO：19)
相应于氨基酸Q-V-[N，H]-[I，L，M]-I-[Q，H]，其带一个CCC和Hind III位点5′尾(SEQ ID NO：15)；
540反义引物：
5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′
(SEQ ID NO：20)
相应于氨基酸N-W-T-[A，D，E]-G-F，其带一个GC和XbaI位点5′尾；
其中N＝A，C，G或T；R＝A或G；Y＝C或T；M＝A或C；W＝A或T。
引物的设计根据图7的序列对比。
关于PCR反应的基本参考文献可见于Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第2版；或Lubert Stryer：生物化学，第4版；Freeman&Company，New York，1995，例如第132-134页。
首先，在下文的表6中所示的选出的子囊菌纲和担子菌纲得到的基因组DNA上测试522/538引物对。
根据下述程序分离基因组DNA：
真菌基因组DNA的分离程序：
1.在研钵中将菌丝体于液氮中研磨
2.将菌丝体转移至2.0ml Eppendorf管中至0.5ml刻度处
3.加入1.0ml裂解缓冲液并混合
4.加入10μl 4mg/ml无DNase的RNase A(New England Bislabs)
5.于37℃温育30分
6.加入40μl 16mg/ml蛋白酶K(New England Biolabs)
7.于50℃下温和振荡温育1小时
8.于微量离心机中全速离心15分
9.将上清加至QIAprep-旋转柱上。旋转1分钟并弃去滤过物
10.以0.5ml缓冲液PB洗涤，旋转1分钟弃去滤过物
11.以0.75ml缓冲液PE洗涤，旋转1分钟并弃去滤过物
12.快速旋转抽除任何存留的PE缓冲液并使之完全干燥
13.将旋转柱置于洁净的微量离心管(microfuge tube)中并加入125μlH20。静置5分钟，然后旋转3分
裂解缓冲液：
100mM EDTA
10mM Tris pH8
1％Triton X-100
200mMNaCl
500mM盐酸胍
更多的有关QIAprep旋转柱、PB缓冲液和PE缓冲液的信息请参考购自QIAGEN GmbH的QIAPrepTM质粒手册。实验程序
将约100到200ng基因组DNA或10～20ng双链cDNA用作模板用于PCR扩增，PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl)含200μM每种dNTP，3.5mM MgCl2，2.5单位AmpliTaq GoldTM，以及100pmol每种简并引物522和538。总体积为50μl。PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400上进行。所用的PCR反应的循环程序为：
94℃-10分；1循环
94℃-1分，60℃-1分，72℃-30秒；2循环
94℃-1分，59℃-1分，72℃-30秒；2循环
94℃-1分，58℃-1分，72℃-30秒；2循环
94℃-1分，52℃-1分，72℃-30秒；2循环
94℃-1分，50℃-1分，72℃-30秒；14循环
72℃-7分；1循环
在1.5％琼脂胶上通过电泳分析5μl的扩增样品的等分试样。
下文的表6显示了这套引物的试验结果，尤其是检测或未检测到了特定的PCR带。表6用522/538引物套对子囊菌和担子菌的基因组DNA的试验
微生物 类群(phyllum) 菌株收集号 检测到的PCR带
Cladorinum sp. 子囊菌 CBS 427.97 无
壳囊孢属sp. 子囊菌 CBS 424.97 无
壳囊孢属sp. 子囊菌 CBS 425.97 无
麻孢壳属 子囊菌 NN 040455 无
平田头菇sp. 担子菌 CBS 900.96 有
Amylostereum Chailletii 担子菌 NN菌株收集 有
黑刺烟管菌 担子菌 CBS 580.95 有
烟管菌属sp. 担子菌 NN菌株收集 有
Bolbitius aleuritus 担子菌 do 有
Cerrena unicolor 担子菌 do 有
干粉孢革菌 担子菌 do 有
Conocybe sp. 担子菌 do 有
Coprinus cinereus 担子菌 IFO 30116 有
Cystoderma carcharias 担子菌 NN菌株收集 有
栎迷孔菌 担子菌 NN 005877 有
Exidia glandulosa 担子菌 CBS 277.96 有
Femsjonia sp. 担子菌 NN菌株收集 有
木蹄层孔菌 担子菌 CBS 276.96 有
Hygrophoropsis pallida 担子菌 NN菌株收集 有
Hyphoderma argillaceum 担子菌 do 有
Hyphodontia pallidula 担子菌 do 有
Hypholoma fasciculare 担子菌 do 有
乳色耙菌 担子菌 do 有
Laetisaria arvalis 担子菌 do 有
Lyophyllum sp. 担子菌 do 有
Marasmiellus ramealis 担子菌 do 有
Merismodes sp. 担子菌 do 有
胶质干朽菌 担子菌 do 有
oxyporus corticola 担子菌 do 有
锐孔菌属sp. 担子菌 CBS 422.97 有
Panaeolus semiovatus 担子菌 CBS 819.95 有
Paxillus involtus 担子菌 CBS 100231 有
Peniophora cinerea 担子菌 NN 007373 有
Peniophora lycii 担子菌 CBS 686.96 有
栎隔孢伏革菌 担子菌 NN 009335 有
Podaxis pistillaris 担子菌 ATCC 38868 有
Scizophyllum commune 担子菌 NN菌株收集 有
Scizophyllum sp. 担子菌 CBS 443.97 有
Skeletocutis sp. 担子菌 NN菌株收集 有
Steccherinum ochraceum 担子菌 do 有
Stereum subtomentosum 担子菌 do 有
Strobilurus tenacellus 担子菌 do 有
Stropharia cubensis 担子菌 ATCC 13966 有
Trametes hirsuta 担子菌 DSM 2987 有
绒毛栓菌 担子菌 CBS 100232 有
Trametes zonatella 担子菌 NN菌株收集 有
Trechispora farinaceae 担子菌 do 有
Trichaptum fuscoviolaceum 担子菌 do 有
Typhula setipes 担子菌 do 有
Volvariella speciosa 担子菌 do 有
实施例6分子筛选(其它引物对)
引物对522/525，539/540，539/538，539/525和537/525按实施例5中描述的方法进行检测，每一个有义和反义的简并引物的量为100pmol。用针对于AmpliTaq Gold(TM)进行改进的Touchdown PCR进行扩增(参见R.H.Don等(1991)，Nucleic Acid Research，Vol.19，No.14)。PCR反应程序如下：
94℃-10分钟；1个循环
94℃-1分钟，60℃-1分钟，72℃-1.5分钟；2个循环
94℃-1分钟，59℃-1分钟，72℃-1.5分钟；2个循环
94℃-1分钟，58℃-1分钟，72℃-1.5分钟；2个循环
94℃-1分钟，52℃-1分钟，72℃-1.5分钟；2个循环
94℃-1分钟，50℃-1分钟，72℃-1.5分钟；14个循环
72℃-7分钟；1个循环实施例7PCR条带纯化和测序
根据生产商的指导，PCR片段可以用Jet Sorb凝胶提取试剂盒(Genomed GmbH，Germany)进行纯化和测序。以200-300ng纯化的PCR产物为模板，使用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，美国)，荧光标记的终止子和5pmol测序引物在Perkin-Elmer的ABI PRISMt 377 DNA测序仅，扩增PCR片段的核苷酸序列可以直接测定。
由引物对522/538，用10-20ng来自Schizophyllum sp.CBS 443.97的双链cDNA做模板产生的PCR片段，按以上描述进行纯化和测序，所推定的DNA序列如下(5′-到3′-)：TCTGCCGCATCTGACGGTGTCTATAACCCCGTCCTCAACCTGATTATATCAGAAGAGCTTAACGACACCCTCGATGATGCGATGTGCCCGAACGTCGGCGAATCGGACGCCCAAACGGACGAATGGACGTCTATTTACGCAGCGCCCATCGCTGAGCGTCTGAACAACAACGCCGTGGGCGCTAACCTGACCACCACGAACGTTTACAACCTCATGTCTTTATGCCCCTTCGACACGCTTGCGAAGGAGACGCCGAGCCCCTTCTGCGATCTCTTT(SEQ ID NO：31)
将所得DNA序列翻译成氨基酸序列为：SAASDGVYNPVLNLIISEELNDTLDDAMCPNVGESDAQTDEWTSIYAAPIAERLNNNAVGANLTTTNVYNLMSLCPFDTLAKETPSPFCDLF(SEQ ID NO：32)。
双链cDNA的合成按实施例1进行。实施例8在米曲霉中表达的来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶的纯化和鉴定
Peniophora lycii肌醇六磷酸酶在米曲霉IFO 4177中表达并分泌。
加入助滤剂到肉汤培养物中，而其培养物已用一个滤布进行过滤。这个溶液进一步用Seitz深层过滤平板过滤，就得到了澄清的溶液。滤液在3kDa排阻聚醚砜膜上进行超滤，使其浓缩，然后用蒸馏水进行渗滤以减少导电率。浓缩后的酶的pH值调整到7.5。浓缩酶的导电率为1.2mS/cm。
将肌醇六磷酸酶通过用20mM Tris/CH3COOH，pH7.5平衡Q-琼脂糖FF柱，然后用渐增的线形NaCl梯度(0→0.5M)洗脱。肌醇六磷酸酶活性按单峰洗脱。将峰收集起来，加入(NH4)2SO4使终浓度达到1.5M。将Phenyl Toyopearl650S柱用1.5M(NH4)2SO4、10mM琥珀酸/NaOH(pH6.0)平衡，然后将肌醇六磷酸酶加入，再用逐渐降低的线性(NH4)2SO4梯度(1.5→0M)洗脱。将包含肌醇六磷酸酶的分馏物合并，并将缓冲液在一个葡聚糖凝胶G25柱上交换为20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。在一个用20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)平衡的Q-琼脂糖FF柱上加入G25滤液。用平衡缓冲液充分洗柱，然后把肌醇六磷酸酶在逐渐增加的线性NaCl梯度(0→0.5M)上洗脱。将肌醇六磷酸酶活性收集，通过透析，将缓冲液交换为20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)，透析的肌醇六磷酸酶加到用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上。仔细用平衡缓冲液洗柱之后，用逐渐增加的线性NaCl梯度(0→0.3M)洗脱肌醇六磷酸酶。来自SOURCE 30Q的分馏物用SDS-PAGE分析，将纯的肌醇六磷酸酶分馏物收集。
Peniophora肌醇六磷酸酶在胶上迁移为带，Mr＝67kDa，67kDa组分的N端氨基酸序列测定通过SDS-PAGE，然后电印迹到PVDF膜上进行。推定的N端氨基酸序列如下Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-
此序列相当于由cDNA得到的氨基酸序列中的氨基酸残基31-37。
由此，一个成熟的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，当在曲霉属中表达时，可假定为SEQ ID no 24的no.31-439。实施例9Peniophora lycii的纯化肌醇六磷酸酶的进一步鉴定
Peniophora lycii肌醇六磷酸酶在曲霉属中的表达和纯化按实施例8的描述进行。
肌醇六磷酸酶活性按如下分析进行测定：将10μl稀释的酶样品(用0.1M乙酸钠、0.01％吐温20，pH5.5稀释)加到250μl 5mM肌醇六磷酸钠(sigma)溶液中，该肌醇六磷酸钠溶液用0.1M乙酸钠、0.01％吐温20，pH5.5(在乙酸钠溶解后调节pH值，底物预热)配制，然后将含有酶样品的肌醇六磷酸钠溶液在37℃保温30分钟。加入250μl 10％TCA使反应停止，通过加入500μl在100ml钼酸盐试剂(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O加在8ml H2SO4中，稀释到250ml)中溶解7.3g FeSO4，测定游离磷酸盐。将96孔微滴平板中的200μl样品，测定750nm的吸收值。底物和酶空白被包括在内。磷酸盐标准曲线也被包括在内(0-2mM磷酸盐)。1FYT等于在指定条件下每分钟释放1μmol磷酸盐的酶量。
通过在不同温度下(预热底物)进行检测得到了温度曲线。
通过在检测残留活性前对0.1M磷酸钠(pH5.5)中的肌醇六磷酸酶在不同温度下进行预保温，对温度稳定性进行了检测。
在检测残基活性前，将酶在pH3(25mM甘氨酸-HCl)，pH4-5(25mM乙酸钠)，pH6(25mM MES)，pH7-9(25mM Tris-HCl)中于40℃下保温1小时，进行pH稳定性的检测。
使用相同的缓冲液系统(50mM，底物溶解时重新调整pH值)，在不同pH值的条件下进行检测，得到pH曲线。
以上pH曲线，pH稳定性、温度曲线和温度稳定性的研究结果分别见图8、9、10和11。从图9可以看出，在pH3-9的整个范围内40℃1小时，Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶是非常稳定的(即超过了80％的最大活性仍有保留)。关于温度稳定性的结果见图11，图中表明在60-80℃，有50-60％的残基活性仍有保留。这个结果是可以认为是因为热变性之后令人惊奇地能重新折叠的酶。重新折叠的程度与精确的条件(pH、酶浓度)有关。
图12表明了对Peniophora肌醇六磷酸酶进行差示扫描热量测定(DSC)的结果。在DSC中，通过热量消耗使样品池中保持一个恒定的温度增长，这个热量相对于一个参照池来测定。保持恒定的加热速率(例如90℃/小时)。为了保持恒定温度增长，吸热过程(热量消耗过程-例如酶/蛋白的伸展)被检测为转移到池中的热量的增加。DSC使用MicroCal的MC2设备来进行。在以扫描速率为90/小时扫描到90℃前，将池在20℃平衡20分钟。约2.5mg/mlPeniophora肌醇六磷酸酶(0.1M乙酸钠，pH5.5中)的样品被负载。实施例10Peniophora肌醇六磷酸酶的比活性的鉴定
比活性通过肌醇六磷酸酶一个高度纯化的样品来测定(纯度预先在SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测，表明仅一个组分的存在)。
肌醇六磷酸酶样品的蛋白浓度按如下氨基酸分析决定：肌醇六磷酸酶样品的等分试样在含有6N HCl、0.1％酚的一个抽真空的玻璃试管内于110℃下水解16小时。由此而得氨基酸由Applied Biosystems 420A氨基酸分析系统进行定量，操作按操作指导进行。从氨基酸的量中，水解的等分试样中蛋白质的总量-及浓度-可以计算出。
活性可以按FYT单位来测定。一个FYT相当于在pH5.5、37℃条件下每分钟自肌醇六磷酸(5mM肌醇六磷酸)释放1微摩尔无机磷酸的酶量；分析见如例11中的描述。
比活性计算为987 FYT/mg酶蛋白。实施例11通过1H NMR光谱学测定的肌醇六磷酸酶催化的肌醇六磷酸水解的时间-分解产物曲线
被Peniophora肌醇六磷酸酶和一个商品黑色曲霉肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶NovoR)催化的肌醇六磷酸(PA)水解可通过24小时的过程中1H NMR测定产物混合物进行检测(27mM肌醇六磷酸，1FYT/ml，pH5.5和3.5，27℃)。
如下，(Ins(p，q，r，...)Pn代表myo-肌醇，它携带着分别结合在p、q、r...位置上的总共n个磷酸根。为方便起见，Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)简写为PA。但是请参见这一申请中综述部分中的“肌醇六磷酸酶命名和位置特异性”一节。
本技术提供关于在PA分子上酶攻击的起始位点的特定信息，同时也提供关于终产物鉴定的信息。另一方面，反应中间产物的混合物组成的峰演化模式提供了一个定性检测，一个指纹，其适合于进行不同酶个体间的相似性和差异性鉴定。
NMR，像大多数其它分析方法一样，能区分非对映体的立体异构体，但不能区分是对映体的一系列异构体，因为它们显示相同的NMR光谱。
因此，由于该异构体是非对映体，Ins(1，2，4，5，6)P5(除去3-磷酸)显示的NMR光谱不同于Ins(1，2，3，4，5)P5(除去6-磷酸)。
但是，由于异构体是对映体，Ins(1，2，3，4，5，6)P5和Ins(2，3，4，5，6)P5(除去1-磷酸)的NMR光谱是相同的。Ins(1，2，3，4，5)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5(除去4-磷酸)的光谱也是相同的。
因此，通过NMR不能区分3-和1-磷酸，同样也不能区分6-和4-磷酸(或使用最低位点规则的L-6-和D-6-磷酸)。
由于文献中3-和6-磷酸的描述的偏颇，我们对我们的酶使用了术语3-和6-肌醇六磷酸酶，但是，虽然不太可能，我们实际上并不知道我们是否使用的是1-和4-肌醇六磷酸酶。实验
NMR光谱用一个装有5mm选择性反探头的Bruker DRX 400在300K(27℃)下进行记录。在4个模拟扫描后的16扫描用一个被8K数据点覆盖的2003Hz(5ppm)的扫描宽度进行积累。通过一个3秒的预饱和时期达到残余HDD共振衰减。光谱参见HOD信号(δ4.70)。
NMR分析的PA样品按如下制备：将PA(100mg，肌醇六磷酸二钾盐，Sigma P-5681)溶于去离子水(4.0ml)中，用液体NaOH(4N)调节pH值至5.5或3.5。加入约5ml去离子水并将每一个相应于20mg肌醇六磷酸的1ml的部分转移到螺旋盖小瓶中，将溶剂蒸发(真空离心机)。干燥的样品溶于重水(2ml，Merck 99.5％D)，然后再次干燥(使用前贮藏在-18℃)。
进行NMR分析时，每20mg肌醇六磷酸样品溶于重水(1.0ml，Merck99.95％D)。将溶液转移到一个NMR试管中，计录1H NMR光谱。加入酶溶液(1FTU，溶解/适当稀释于重水中)，仔细混匀(1分钟)。加入酶溶液后立刻开始记录1H NMR光谱(t＝0)，然后5、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210分钟(＝3.5小时)、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、11.5、13.5、15.5、17.5、19.5、21.5和23.5小时。测量NMR试管中的pH值。在48和120小时(5天)后获得了其它光谱，此时加一部分底物(PA，6mg)以探测酶是否保留催化活性。
通过由对PA部分消化所得的肌醇磷酸盐混合物的2D NMR分析，以及公开的NMR数据(Scholz，P.；Bergmann，G.，和Mayr，G.W.；Methods inInositide Research(Ed.Irvine，R.F.)，第65-82页，Reven Press，Ltd.，NewYork(1990))，可归于Ins(1，2，3，4，5，6)P6(PA)，Ins(1，2，4，5，6)P5，Ins(1，2，3，4，5，6)P5，Ins(1，2，5，6)P4，Ins(1，2，6)P3、Ins(1，2)P2和Ins(2)P的特征性的1H NMR信号被鉴定，并可在反应过程中对这些种进行相对定量。
曲霉属肌醇六磷酸酶和隔孢伏革菌属(Peniophora)肌醇六磷酸酶在pH5.5中反应24小时的产物分布的堆积图分别见图13和图14。
δ3.25(t)的信号代表Ins(1，2)P2的H-5，δ3.18(t)的信号代表Ins(2)P的H-5。与曲霉属肌醇六磷酸酶反应约4小时后Ins(1，2)P2开始积累，而在与Peniophora肌醇六磷酸酶反应约1小时后Ins(1，2)P2开始积累。在与曲霉属肌醇六磷酸酶反应10小时后可观察到Ins(2)P，而在Peniophora肌醇六磷酸酶反应中是3小时后。反应24小时后，两种肌醇六磷酸酶的Ins(1，2)P2量水平都很低，而反应24小时后，两种肌醇六磷酸酶的Ins(2)P量都达到最高值。
因此，反应24小时后观察到的曲线表明这两种肌醇六磷酸酶都将PA降解为Ins(2)P。
这两种酶24小时后的反应混合物中除Ins(2)P外还含有少量的Ins(1，2)P2。延长反应时间(几天)导致了残余Ins(1，2)P2的消失，但完全脱磷酸的肌醇(Ins)却根本没有发现。这个发现不能用酶的不可逆抑制/变性来解释，因为酶在延长的时期内仍保留有催化活性，就象如下实验证明的一样：在室温放置5天后，将新的一部分PA加入NMR试管中，酶仍能对其进行消化。
图15和16详细地描述了在起始4.5个小时内pH5.5的条件下变化的曲线。从图10可推论Ins(1，2，4，5，6)P5(命名为A)的H-3表现出在δ 3.66(dd)的一个信号，Ins(1，2，3，4，5)P5(B)的H-6表现出在δ3.87(t)的一个信号，而Ins(1，2，5，6)P4(C)的H-3表现出在δ3.56(dd)的一个信号。现在，化合物A相应于位置3被水解的磷酸盐，B相应于位置6的，C相应于位置3和4的。
从图15可明显发现，当使用曲霉肌醇六磷酸酶时，组合物A是主要的初级产物(t＝5分钟)，而组合物B并未出现。组合物C在20-25分钟之后出现。
图16(Peniophora肌醇六磷酸酶)表明，当使用Peniophora肌醇六磷酸酶时，组合物B是主要的初级产物(t＝5分钟)。
δ4.82(dt，H-2)，4.38(q，H-4/H-6)，4.13(q，H-5)和4.11(dt，H1/H3)的信号可归因于底物、肌醇六磷酸、PA。对图15和16进行比较，可明显地发现，对于Peniophora肌醇六磷酸酶，这些峰消失的要比曲酶属肌醇六磷酸酶的快。
这些差异在图17中很显著，图17显示了在pH5.5条件下20分钟后被观察到的用如上所指的诊断信号(A，B，C)标记的曲线。
图18表明了肌醇六磷酸在pH5.5条件下(即相应于图13和14的上线)水解的最终结果(在这些条件下)。在上部Peniophora实施方案的所有标记信号代表了化合物Ins(2)P，尤其是其质子，从右到左为：H-5，H1和H3，H4和H6及最终的H-2。相对强度：1∶2∶2∶1。相应的信号在下部的Aspergillus的实施方案中被发现。这就表明Ins(2)P实施方案中都有终产物。但是，在两个实施方案中还同时都发现了一小部分的Ins(1，2)P2，相应的峰只在曲霉属实施方案中有发现。观察到的显著差异：曲霉属：最初的主产物被鉴定为Ins(1，2，4，5，6)P5(A)，然后出现Ins(1，2，5，6)P4(C)和Ins(1，2，6)P3(D)(H-3在δ3.49(dd)，1.5小时后)，相应于连续除去3-，4-和5-位置的磷酸根。Ins(1，2)P2(E)的浓度从4小时后开始缓慢增加，在12到14小时之间徒然减少，在12到14小时之间同时还有Ins(2)P(F)水平的迅速增加。这从图11可以看出，它分别代表了时间依赖的Ins(1，2)P2和Ins(2)P的浓度，这由分别相应于Ins(1，2)P2(δ3.25(t))和Ins(2)P(δ3.18(t))的信号的面积相对于相应于底物信号(t＝0)的面积测定来决定。隔孢伏革菌属：在pH5.5条件下，最初仅有位置6被攻击。一个典型特征是相对于Aspergillis肌醇六磷酸酶，PA以更快的速率被消化。另一个典型特征是终产物Ins(2)P(F)出现很早(3小时)，并且缓慢增加，这相对于曲霉属肌醇六磷酸酶所观察到的反应终点中Ins(2)P水平的非常急剧的增长。
图19是与图17相同的曲线，但是在pH3.5条件下。但令人惊讶的是，在此PH下Peniophora肌醇六磷酸酶既对PA的位置6有很高的启始亲和力，又对位置3有同样的亲和力(B和A都被观察)，可能对位置6有轻微的优先选择。
产生的数据可得到例如如下结论：
在pH5.5和pH3.5的条件下，曲霉属肌醇六磷酸酶以高度选择性攻击PA的位置3，而隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶在pH5.5条件下以高度选择性攻击PA的位置6，但在pH3.5的条件下，它似乎以类似的速率水解位置3和6的磷酸基。
在pH5.5条件下，隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶以比曲霉属肌醇六磷酸酶更快的速度消化PA。
在pH3.5和5.5，在所用的条件下终产物为Ins(2)P(F)。
总反应速度是类似的，约20小时(图20；pH5.5)。
于是，曲霉肌醇六磷酸酶被认为是基本上纯净的3-肌醇六磷酸酶，而隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶在pH5.5条件下表现为基本上纯净的6-肌醇六磷酸酶，在pH3.5条件现表现为迄今为止的未知类型，即一个3+6-肌醇六磷酸酶。
由隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸部分水解得到的肌醇四磷酸盐可按如下概述决定其准确构型，而且也可以确定隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶是D-，L-或D/L-6-肌醇六磷酸酶。
其它对准确特性的确定方法可以通过旋光度或使用一个手性HPLC柱来确定。1.隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸部分降解产生的肌醇四磷酸盐的HPLC-分离。脱盐(铁交换，透析，(2)，(4)和(9)及本文的参考文献)。2.通过NMR分析检查纯度(i)，决定是否产生了几个非对映体四磷酸(ii)，决定产生了其中的哪一个(iii)3.使用相应的碳水化物(10)的氢化硼(BH)的还原而进行相关多元醇的合成。4.用高碘酸进行分解，按(2)用氢化硼进行还原和脱磷酸作用。用HPLC进行多元醇的鉴定。5.用L-艾杜糖醇脱氢酶进行多元醇的氧化，使用HPLC最终鉴定碳氢化物。参考文献：(2)Van der Kaay等，Biochem.J.，312(1995)，907-910(4)Irving等，J.Bacteriology，112(1972)，434-438(9)Stevens，L.R.，见“Methods in Inositide Research”(Irvine R.F.编)，9-30(1990)，Raven Press，Ltd.，New York(10).Stephens，L.等，Biochem.J.，249(1988)，271-282实施例12曲霉和隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶从谷物中释放无机磷酸盐的比较分析
本实施例对于在pH3.5和5.5条件下肌醇六磷酸酶对谷物中三价磷的催化释放进行了一个简单的分析。分析集中于两个参数-P-释放的速度和水平。材料和方法：
谷物来自北卡罗莱那州立大学(样品号R27)，在6.8点的磨粉器(BuhlerUniversal)中研磨。称取20g研磨的谷物，将其加入1个250ml的蓝色有盖瓶中，加入100ml缓冲液，从而得到了谷物悬浮液(16.7％，w/w)。
所用缓冲液为：pH5.5；0.22M乙酸盐缓冲液。
用8N HCl/NaOH调节pH到3.5。
测定的酶：测定了两个肌醇六磷酸酶：一个黑色曲霉(肌醇六磷酸酶Novo)的商品肌醇六磷酸酶(phytase Novo)和一个本发明的隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶，按实施例2进行纯化。
剂量：所有的酶都以25FYT/20g谷物(相应于1250FYT/kg)应用。
用瓶盖封上装有谷物悬浮液的瓶，立即放入37℃水浴中，持续搅拌。此时测定pH，并于24小时后再次测定。搅拌30分钟后可收集到一个5ml的样品。
然后将肌醇六磷酸酶按25FYT/20g谷物的剂量加入。
在加入肌醇六磷酸酶后，分别在5，10，1 5，20，25，30，40，50，60和120分钟时收集样品，释放的P的含量按如下进行测定：
含有肌醇六磷酸酶的样品按1+4用缓冲液稀释。然后将样品在3000rpm下离心5分钟，收集1.0ml上清液。加入2.0ml缓冲液和2.0ml MoV终止溶液(参阅实施例6中的FYT分析)。样品放在3-5℃冰箱中，直至所有样品都能用分光光度计在415nm下进行分析。
在0和20小时中测定pH值。
用于测定，使用50mM的标准磷酸盐溶液或贮存溶液。0.5，1.0，1.5和2.0ml贮存溶液用缓冲液稀释到总体积50ml。在每一个溶液中取3.0ml，加入2.0ml MoV终止溶液。
进行了两个实验：在pH5.5和pH3.5的条件下。分析结果见图21和22(分别是pH5.5和3.5)。在这些图中，符号“◆”代表对照实验，“▲”代表隔孢伏革菌属肌醇六磷酸酶和“■”代表曲霉属肌醇六磷酸酶。结果和讨论：
图21(pH5.5)表明，在这个pH值条件下，隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶相对于曲霉肌醇六磷酸酶以显著增加的速度释放谷物中的P。
图22(pH5.5)明显地表示，在这一pH值条件下，对于研磨的谷物中磷的释放，隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶明显快于曲霉肌醇六磷酸酶(0-120分钟)。
例如小鸡/童子鸡(broiler)的消化系统的经历时间通常在30分钟到2小时的数量级，因而无论pH值是多少，观察到的差异是真正重要的。尽管如此，pH3.5在此方面仍比pH5.5更合适。
这暗示作为在如童子鸡消化系统中的P-释放者，隔孢伏革菌酶令人惊讶地比已知的曲霉肌醇六磷酸酶更高效。实施例13在酵母中表达的平田头菇的肌醇六磷酸酶的发酵、纯化和鉴定
通过将酵母菌株在100ml培养基A中，250rpm，30℃过夜培养来准备种子培养。100ml培养基B接种入2ml种子培养物，菌株在30℃，250rpm下培养7到12天。
按照实施例2的描述，平田头菇肌醇六磷酸酶在酵母中表达。酵母克隆中含有一个编码本发明中含有氨基酸序列SEQ ID No 22的肌醇六磷酸酶的克隆序列。
向用滤布过滤的培养的上清液中加入助滤剂。这一溶液进一步用Seitz深度过滤板过滤，得到一个澄清溶液。滤液在3kDa排阻聚醚砜膜上通过超过滤进行浓缩，然后在一个微生物过滤平板上重新过滤。将滤液的pH值调到pH7.5，通过用蒸馏水稀释将导电率调节到2ms/cm。
将肌醇六磷酸酶加在用20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)平衡的Q-琼脂糖FF柱上，然后用递增的线性NaCl梯度(0→0.5M)把酶洗脱。合并来自Q-琼脂糖的含有肌醇六磷酸酶的馏分，加入(NH4)2SO4，使终浓度达到1.3M。将Phenyl Toyopearl 650S柱用1.3M(NH4)2SO4、10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，把该酶加在这个柱上，用递减线性(NH4)2SO4梯度(1.3→0M)洗脱。合并含有肌醇六磷酸酶的馏分，在一个葡聚糖凝胶G25柱上将缓冲液交换为pH7.5的20mM Tris/CH3COOH。在用由pH7.5的20mMTris/CH3COOH平衡的SOURCE Q柱上进一步纯化肌醇六磷酸酶，并用线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱。最后，合并来自SOURCE Q柱的包含肌醇六磷酸酶的馏分。在一个10kDa排阻再生纤维素膜上浓缩，然后加到用25mMCH3COOH/NaOH，100mM NaCl，pH5.0平衡的葡聚糖凝胶200柱上。
来自葡聚糖凝胶200柱的馏分用SDS-PAGE分析。肌醇六磷酸酶在胶上迁移形成一个非常宽而且扩散的条带，大约为Mr＝150kDa，表明这个酶是高度糖基化的。
150kDa组分的N-端氨基酸测序以SDS-PAGE，然后电转到一个PVDF膜上进行。
两个N-端序列可被推断为大约比率4∶1(上部序列：下部序列)的相对量Val-Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Val-Gln-
和Thr-Phe-Val-Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-
在SEQ ID NO 22中，分别在位置27和25上发现了两个N-端氨基酸“Val”和“Thr”。这表明当在酵母中表达时本发明中成熟的肌醇六磷酸酶，在SEQ ID NO 22的位置27或25开始。
因此，当在酵母中表达时，肌醇六磷酸酶的成熟氨基酸序列被假定为SEQ ID no 22的no.27-453或25-453实施例14在米曲霉中表达的来自平田头菇的肌醇六磷酸酶的纯化和鉴定
平田头菇肌醇六磷酸酶在米曲霉IFO 4177中表达并分泌。
将培养的肉汤在滤布上过滤，加入助滤剂。溶液进一步用一个Seitzdepth过滤平板过滤，从而得到一个澄清的溶液。将滤液在3kDa排阻聚醚砜膜上通过超过滤进行浓缩，然后用蒸馏水进行渗滤，以降低导电率。将浓缩酶的pH值调到pH7.5。
把肌醇六磷酸酶加到一个用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH平衡的Q-琼脂糖FF柱上，然后用递增线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱。肌醇六磷酸酶活性洗脱为单峰。收集此峰并加入(NH4)2SO4，使终浓度达到1.3M。一个Phenyl Toyopearl 650S柱用1.3M(NH4)2SO4，10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，将肌醇六磷酸酶加在此柱上，并用递减的线性(NH4)2SO4梯度(1.3→0M)洗脱。收集包含肌醇六磷酸酶的馏分，用透析将缓冲液交换为pH7.5的20mM Tris/CH3COOH。将酶加到一个用pH7.5的2mMTris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上，并用递增线性NaCl梯度(0→0.25M)洗脱。收集肌醇六磷酸酶活性，加入(NH4)2SO4，使终浓度达到1.6M。将SOURCE Phenyl柱用1.6M(NH4)2SO4，25mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，把肌醇六磷酸酶加到此柱上，然后用一个递减线性(NH4)2SO4梯度(1.6→0M)洗脱。来自SOURCE Phenyl柱的部分用SDS-PAGE分析，收集纯的肌醇六磷酸酶馏分。肌醇六磷酸酶合并液用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH进行透析，然后加到用相同缓冲液平衡的HighTrap Q柱上，再用20mMTris/CH3COOH，0.5M NaCl，pH7.5逐步洗脱。
田头菇肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上迁移成一条带，其Mr＝60kDa。
60kDa组分的N-端氨基酸测序在SDS-PAGE并电转到一个PVDF膜上进行。两个N-端氨基酸序列的相对量可推定为大约2∶1(上部序列：下部序列)。Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Val-Gln-
和Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-
上部序列相应于由cDNA得到的氨基酸序列中的氨基酸残基31-49，而下部序列则相应于氨基酸残基28-46。
因此，当在曲霉中表达时，肌醇六磷酸酶成熟的氨基酸序列可被假定为SEQ ID no 22中的no.31-453或28-453。
因此，总结实施例13和本实施例的结果，可发现在SEQ ID NO 21中，以下序列是编码肌醇六磷酸酶的亚序列：位置79到1362，73-1362，91-1362或82-1362(如在SEQ ID NO 22中分别相应于氨基酸位置27-453，25-453，31-453或28-453)。
于是，成熟肌醇六磷酸酶的N-端序列有轻度的可变性。这种可变性可在当酶在一个单菌株上表达时被发现，也可在当在不同菌株上表达时被发现。在酵母中，成熟肌醇六磷酸酶在氨基酸no.27或25处开始(相对丰度分别为约80％∶20％)；在曲霉属中，成熟肌醇六磷酸酶开始在氨基酸no.31或28(相对丰度分别约65％∶35％)。实施例15平田头菇的纯化肌醇六磷酸酶的鉴定
平田头菇肌醇六磷酸酶在曲霉中表达，并按实施例14的描述进行纯化。
肌醇六磷酸酶活性按如下分析进行测定：将10μl稀释的酶样品(在0.1M乙酸钠，0.01％吐温20，pH5.5中稀释)加入在0.1M乙酸钠、0.01％吐温20，pH5.5(在肌醇六磷酸钠溶解后调整pH值；底物预热)中的250μl 5mM肌醇六磷酸钠中，37℃保温30分钟。通过加入250μl10％TCA使反应终止，然后加入在100ml钼酸盐试剂(8ml H2SO4中2.5g(NH4)6Mo7O24稀释到250ml)中500μl 7.3g FeSO4以测定游离磷酸基。在750nm的吸收在96孔微滴定平板上的200μl样品测定。一个磷酸盐标准曲线也包括进来(0-2mM磷酸盐)。1FYT相当于在指定条件下释放1μmol磷酸/分钟的酶量。
温度曲线可通过在不同温度(预热底物)下分析样品而得到。
在测量残留活性前，通过在0.1M磷酸钠，pH5.5中于不同温度下对肌醇六磷酸酶进行预温育检测了温度稳定性。
在测定残留活性前，将酶在pH3(25mM甘氨酸-HCl)，pH4-5(25mM乙酸钠)，pH6(25mM MES)，pH7-9(25mM Tris-HCl)条件下，40℃保温1小时，可检测pH稳定性。
在相同的缓冲液系统(50mM，在底物溶解时调节pH)，于不同pH条件下分析样品，获得了pH曲线。
以上pH曲线，pH稳定性，温度曲线和温度稳定性的研究结果分别见图23、24、25和26。
图23表明，平田头菇肌醇六磷酸酶在pH3-6具有相当好的活性(即超过最高活性50％)。在pH4-6超过最高活性的70％，在pH5-6超过90％。适宜的pH似乎在pH5.5-6之间。
从图24可明显发现，平田头菇肌醇六磷酸酶在pH3-9的整个范围内于40℃下1小时，40℃是非常稳定(即保留了超过最高活性的80％的)。
关于温度曲线，从图25可明显发现，平田头菇肌醇六磷酸酶在35-55℃间有很好的活性(例如超过最高活性的60％)，而在40-52℃间，活性超过最高活性的70％，最适温度接近于50℃。
最后，关于温度稳定性的结果见图26，肌醇六磷酸酶在0到约55℃(例如超过60％的残余活性)的条件下非常稳定。在60℃预保温后可发现残余活性急剧下降。无论如何，在60℃时至少20％，优选25％，更优选30％残余活性仍保留。在预保温温度超过60℃，如70℃和80℃时，令人惊讶的是，残余活性仍保留惊人地高，尤其是超过20％，优选超过30％，更特别的是保留超过40％的残余活性。
这一事实经思考被认为是由于酶在热变性之后仍能令人惊讶的重新折叠。重新折叠的程度依靠于精确的条件(pH、酶浓度)。
图27表明对田头菇属肌醇六磷酸酶的差异扫描热量仪(DSC)进行测定的结果。
在DSC中，用于保持样品室恒定温度增长所消耗的热量相对于一个参照室进行测定。保持恒定的加热速率(如90℃/小时)。当转移到室中以保证恒定温度增长的热量增加时，可发现吸热过程(热消耗过程-例如酶/蛋白的解折叠)也增长。
DSC用来自Microcal的MC2-仪进行。在扫描速度90℃/h，扫描到90℃前，室在20℃平衡20分钟。所负载样品是在pH5.5的0.1M乙酸钠中约2.5mg/ml田头菇肌醇六磷酸酶。
DSC证明了温度稳定性的研究，因为在图5中显而易见的是，田头菇肌醇六磷酸酶在pH5.5，约58℃下有一个变性或“解链”温度。对田头菇肌醇六磷酸酶的重新扫描呈现在58℃的一个小峰，这也可以表明，酶的一部分确实重新折叠，折叠了第一次扫描中的热失活。实施例16通过1H NMR光谱测定的肌醇六磷酸酶催化的肌醇六磷酸水解的时间-分解产物曲线
对由田头菇肌醇六磷酸酶和一个商业黑色曲霉肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶Novo)催化的肌醇六磷酸(PA)水解进行研究(27mM肌醇六磷酸酶，1FYT/ml，pH5.5，27℃)，研究通过24小时过程中产物混合物的1H NMR曲线进行。
如下(Ins(p，q，r...)Pn代表共携带n个依附在位置p，q，r，...上的磷酸基的肌醇，为方便起见，将Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)简写为PA。但是，请参照本申请中通论部分的“肌醇六磷酸酶的命名和位置特异性”。
本技术提供了关于酶在PA分子上攻击的起始位点的具体信息，此外还有关于终产物鉴定的信息。另一方面，反映中间产物混合物的组成的峰的演化模式，提供了一个定量测定，一个指纹，其适合于不同酶个体之间相似性和差异性的鉴定。
NMR，像大多数其它分析方法一样，能区别非对映体的立体异构体，但不能区分是对映体的异构体，因为它们显示相同的NMR光谱。
因此，由于异构体是非对映体，Ins(1，2，4，5，6)P5(除3-磷酸)显示的NMR光谱不同于Ins(1，2，3，4，5)P5(除6-磷酸)。
但是，由于异构体是对映体，Ins(1，2，4，5，6)P5和Ins(2，3，4，5，6)P5(除1-磷酸)的NMR光谱是相同的。Ins(1，2，3，4，5)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5(除4-磷酸)的也相同。
因此，通过NMR不能区分3-和1-肌醇六磷酸酶，也不能区分6-和4-肌醇六磷酸酶(或L-6-和D-6-肌醇六磷酸酶，使用最低位点规则)。
鉴于参考文献中3-和6-肌醇六磷酸酶的描述的偏颇，我们对我们的酶使用术语3-和6-肌醇六磷酸酶，但是，尽管可能性不大，实际上，我们却不知道我们是否有替代的1-和4-肌醇六磷酸酶。实验
在一个有5mm选择性反向探针头的Bruker DR×400仪器上，300K(27℃)，记录NMR光谱。使用一个8K数据点覆盖的扫描宽度2003Hz(5ppm)，在4模拟扫描后积累16次扫描。残余HOD共振的衰减可通过一个3秒的预饱和时期达到。光谱参照HOD信号(δ4.70)。
NMR分析的PA样品按如下准备：PA(100mg，肌醇六磷酸二钾盐，Sigma P-5681)溶于去离子水(4.0ml)，用液体NaOH(4N)调节pH至5.5。加入去离子水(5ml)并将每一个相应于20mg肌醇六磷酸的1ml部分转移到螺旋盖的小瓶中，蒸发溶剂(真空离心)。干燥的样品溶于重水(2ml，Merck 99.95％D)，并再次蒸发干燥(使用前贮藏在-18℃)。
为进行NMR分析，将1个20mg的肌醇六磷酸样品溶于重水(1.0ml，Merck 99.95％D)。将溶液转移到一个NMR管中，记录1H NMR光谱。后加入酶溶液(1FTU，按适宜方式溶解/稀释在重水中)并充分混合(1分钟)。加入酶后立即开始记录1H NMR光谱(t＝0)，然后是5，10，1 5，20，25，30，45，60，75，90，105，120，135，150，165，180，190，210分钟(＝3.5小时)，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，11.5，13.5，15.5，17.5，19.5，21.5和23.5小时。测定NMR管内的pH值。48和120小时(5天)后获得额外光谱，此时加入一份底物(PA，6mg)以探测酶是否保留催化活性。
通过对由PA部分消化获得的肌醇磷酸混合物的2D NMR分析，及公布的NMR数据(Scolz，P.；Bergmann，G.，和Mayr，G.W.；Methods inInositide Research(Invine，R.F.编)，pp.65-82，Raven Press，Ltd.，NewYork(1990))，可归于Ins(1，2，3，4，5，6)P6(PA)，Ins(1，2，4，5，6)P5，Ins(1，2，3，4，5)P5，Ins(1，2，5，6)P4，Ins(1，2，6)P3，Ins(1，2)P2和Ins(2)p的特征性的1H NMR信号可被鉴定，并可在此反应过程中对这些种进行相关定量分析。
24小时反应时间内，曲霉和田头菇肌醇六磷酸酶产物分布的堆积图分别见图28和图29。
δ3.25(t)的信号代表Ins(1，2)P2的H-5，而δ3.18(t)的信号代表Ins(2)P的H-5。在与曲霉肌醇六磷酸酶反应4小时后Ins(1，2)P2开始积累，对于田头菇肌醇六磷酸酶则是2小时后。与曲霉肌醇六磷酸酶反应大约10小时，田头菇肌醇六磷酸酶反应大约5小时后，可观察到Ins(2)P。反应24小时后，Ins(1，2)P的量对两种酶都很低，而此时Ins(2)P量对两种酶为最高。
于是，反应24小时后观察到的曲线表明两种肌醇六磷酸酶都能将PA降解为Ins(2)P。完全脱磷酸的种类，肌醇(Ins)，根本没有被发现。
对于两种酶来说，反应24小时的反应混合物中除Ins(2)P外，还有少量的Ins(1，2)P2。延长反应时间(几天)导致了残余Ins(1，2)P2的消失，但未发现完全脱磷酸的种类，肌醇(Ins)。这个发现不能用酶的不可逆抑制/变性来解释，因为酶在延长期仍保留其催化活性，这可通过在室温保持5天后在NMR试管加入新的PA而酶仍能将其消化而得到证明。
图30和31详细描述了在起始4.5小时内变化的曲线。从图32可得到，Ins(1，2，4，5，6)P5(命名为A)的H-3在δ3.66(dd)有一个信号，Ins(1，2，3，4，5)P5(B)的H-6在δ3.87(t)有一个信号，Ins(1，2，5，6)P4(C)的H-3在δ3.56(dd)有一个信号。现在，化合物A相应于位置3上被水解的磷酸盐，B相应于位置6，C相应于3和4。
从图30可明显看到，使用曲霉肌醇六磷酸酶时，化合物A呈现为主要初产物(t＝5分钟)，而化合物B并未出现。化合物C在20-25分钟后出现。
从图31(田头菇肌醇六磷酸酶)可发现，化合物A及B出现很早，即在最初的15分钟，可能化合物B多于A。
δ4.82(dt，H-2)，4.38(q，H-4/H-6)，4.13(q，H-5)和4.11(dt，H1/H3)的信号可归于底物，肌醇六磷酸，PA。比较图30和31可明显发现，对于田头菇属肌醇六磷酸酶，这些峰比曲霉肌醇六磷酸酶的更快地消失。
这些差异在图32中很显著，图32显示了20分钟后观察到的用上述诊断信号(A，B，C)标记的曲线。
图33表明了植酸水解(例如，相应于图28和29的上线)的最终结果(在这些条件下)。所有在上部田头菇实施方案中标记的信号都代表化合物Ins(2)P，也就是质子，其从右到左为：H-5，H1和H3，H4和H6及最后的H-2。相对强度：1∶2∶2∶1。相应信号在下部的曲霉属的实施方案中被发现。这意味着终产物在所有两个实施方案中都是Ins(2)P。但是，在两个实施方案中还检测有少量的Ins(1，2)P2，相应的峰仅在曲霉属中出现。观察到的明显差异：
曲霉属：起始主要产物被鉴定为Ins(1，2，4，5，6)P5(A)，然后出现Ins(1，2，5，6)P4(C)和Ins(1，2，6)P3(D)(1.5小时后在δ3.49(dd)的H-3)，相应于连续除去位置3，4，5上的磷酸基。Ins(1，2)P2(E)的浓度在2小时时开始缓慢增加，在12小时到14小时间急剧降低，同时伴随着Ins(2)P(F)水平的快速增长。在图34和35中可看到这一点，该图分别代表依赖于时间的Ins(1，2)P2和Ins(2)P浓度，并分别绘制于图28-29中沿着时间轴的Ins(1，2)P2和Ins(2)P中H-5的化学位移值(δ)处的块(slices)(说明时间比例仅在节段中是线性的)。
田头菇属：位置3和6在最初都被攻击，对位置6有一些优先选择。一个典型特点是PA的消化速度比曲霉肌醇六磷酸酶快。其它典型特征是终产物Ins(2)P(F)出现很早(5小时)，并且缓慢增长，这正与曲霉肌醇六磷酸酶所测的反应末端的Ins(2)P水平的急剧增长相反。
通过产生的数据尤其可得如下结论：
曲霉肌醇六磷酸酶以高度选择性攻击PA的位置3，而田头菇肌醇六磷酸酶没有这么专一。
相对于曲霉肌醇六磷酸酶，田头菇肌醇六磷酸酶对PA的消化速度更快。
在所使用的条件下，两种情况的终产物都是Ins(2)P(F)。
总反应速度(PA→Ins(2)P)是相当的，约20小时(图35)。
因此，曲霉肌醇六磷酸酶被证明是一个基本纯净的3-肌醇六磷酸酶，而田头菇肌醇六磷酸酶则专一性较小，但是有些倾向于位置6。
应用2D-同和异核(1H，13C)相关性技术，通过利用13C-核的较大的化学位移色散以及合适的计算机软件，带有严重重叠的1H-共振的后者占优势的问题，从理论上可以鉴定和定量在任何时间存在的中间物，因此可完全做出反应顺序图。换句话说，象图34和35的反映浓度时间函数的曲线理论上能用于其它中间体肌醇磷酸的构建。实施例17曲霉属和田头菇属肌醇六磷酸酶从谷物释放无机磷酸的比较分析
本实施例对在pH3.5和5.5的条件下肌醇六磷酸酶催化谷物释放三价磷进行了一个简单分析。研究集中于两个参数-P-释放速度和水平。材料和方法：
谷物来自北卡罗莱那大学(样品号R27)，在研磨器(Buhler Universal)内于点6.8研磨。
将称取20g研磨的谷物放入一个250ml的蓝色有盖瓶中，加入100ml缓冲液，形成谷物悬浮液(16.7％w/w)。
所使用的缓冲液见下：
pH5.5：0.22M乙酸盐缓冲液
pH3.5：0.05M柠檬酸盐缓冲液测定的酶：对两种肌醇六磷酸酶进行测定：一个商品黑曲霉肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶Novo)和一个本发明的田头菇属肌醇六磷酸酶，按实施例3和4的描述进行纯化。剂量：所有的酶用量都为250FYT/20g谷物(相应于1250FYT/kg)。
盖上装有谷物悬浮液的瓶子的盖，立即放入37℃水浴中，持续搅拌。在此时测定pH值，并在24小时后再次测定。搅拌30分钟后收集5ml样品。
然后以25FYT/20g谷物的剂量加入肌醇六磷酸酶。
在加入肌醇六磷酸酶后，分别在10，20，30，40，50，60，120分钟和约20小时时收集样品，而其释放的磷的量按如下测定：
包含肌醇六磷酸酶的样品在缓冲液中按1+4稀释。然后样品在3000rpm离心5分钟，收集1.0ml上清液。加入2.0ml缓冲液和2.0ml MoV终止溶液(参照实施例15的FYT分析)。把样品放在3-5℃冰箱中，直至所有样品都能用分光光度计在415nm进行测定。
在0和20小时时测定pH值。
为测定，使用制备50mM的磷酸盐标准或贮存液。用缓冲液将0.5，1.0、1.5和2.0ml贮藏溶液稀释到总体积50ml。每一个溶液取3.0ml，加入2.0mlMoV终止溶液。
进行了两个实验：pH5.5和pH3.5的条件下。分析结果见图36和37(分别是pH5.5和pH3.5)。在这些图中，符号“◆”代表对照实验，“▲”代表田头菇属肌醇六磷酸酶，“■”代表曲霉属肌醇六磷酸酶。结果和讨论：
图36和37清楚地表明，在pH5.5和3.5的条件下，田头菇属肌醇六磷酸酶从研磨的谷物中起始释放三价磷的速度比曲霉属快。
但是，在pH5.5的条件下40分钟后(图36)和在pH3.5的条件下120分钟后(图37)，曲霉属肌醇六磷酸酶和田头菇属肌醇六磷酸酶释放磷酸的水平大致相同。
但是考虑到诸如小鸡/童子鸡的消化系统的通过时间，其正常在30分钟到2小时的数量级，这一差异确实是很重要的。除此之外，还应提到，在这一方面pH3.5比pH5.5更合适。
这意味着在如童子鸡的消化系统中，作为P-释放者，田头菇属酶令人惊讶地比已知的曲霉属酶更有效。实施例18来自Paxillus involtus和Trametes pubescens的肌醇六磷酸酶的纯化和鉴定
Paxillus involtus PhyAl肌醇六磷酸酶按实施例3和1的描述在米曲霉IFO 4177中表达和分泌。
对培养的肉汤通过滤布过滤并加入助滤剂。进一步用一个Seitz depth滤板过滤，从而得到一个澄清的溶液。滤液用3kDa排阻聚醚砜膜超过滤而得到浓缩，然后将肌醇六磷酸酶转到一个葡聚糖G 25柱上的10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0。将G25滤液的pH调到pH7.0。
将肌醇六磷酸酶加到用20mM HEPES/NaOH，pH7.0平衡的一个Q-琼脂糖FF柱上。发现该酶在该柱的洗脱液中把(NH4)2SO4加入洗脱液中，所终浓度达到2.0M。将Butyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mMCH3COOH/NaOH，pH7.5平衡，把酶加到此柱上，用递减线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱。合并包含肌醇六磷酸酶的馏分，在葡聚糖G25柱上将缓冲液交换为pH7.5的20mM HEPES/NaOH。将G25滤液加在用pH7.5的20mM HEPES/NaOH平衡的Q-琼脂糖FF柱上。用平衡缓冲液充分洗柱后，用递增线性NaCl梯度(0→0.5M)把肌醇六磷酸酶洗脱。收集肌醇六磷酸酶活性，并在一个葡聚糖G25柱上将缓冲液交换为pH8.0的20mMTris/CH3COOH。把G25滤液加到一个用pH8.0的20mM Tris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上。仔细用平衡缓冲液冲洗柱后，将肌醇六磷酸酶用递增线性NaCl梯度(0→0.3M)洗脱。收集包含肌醇六磷酸酶的馏分，加入(NH4)2SO4使终浓度达到2.0M。把Phenyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡，将肌醇六磷酸酶加到这个柱上，用递减线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱。收集包含肌醇六磷酸酶的馏分，加入(NH4)2SO4以终浓度达到2.0M后重新加到相同的Phenyl Toyopearl柱上。来自第二个Phenyl Toyopearl柱的馏分用SDS-PAGE分析，合并纯的肌醇六磷酸酶馏分。
Paxillus involtus PhyAl肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上迁移一条为Mr＝65kDa的带。65kDa组分的N-端氨基酸测序在SDS-PAGE，然后电转移到一个PVDF膜上后进行。可得到如下N-端氨基酸序列：
Ser-Val-Pro-Lys-Asn-Thr-Ala-Pro-Thr-Phe-Pro-Ile-Pro
此序列相应于来自cDNA的氨基酸序列中的氨基酸残基21-33。
因此，当在曲霉属表达时，一个肌醇六磷酸酶的成熟氨基酸序列可被假定为SEQ ID no.26的no.21-442。于是，当这个肌醇六磷酸酶在曲霉属中表达时，预测的图3中的信号肽并不相应于实际的信号肽。这对于序列表中标题SEQ ID NOs：25和26下的成熟肽序列的说明也是同样的。来自Paxillus involtus的PhyA2肌醇六磷酸酶按实施例3和1的描述，Paxillus involtus PhyA2肌醇六磷酸酶在米曲霉IFO4177中表达并分泌。
对培养的肉汤用滤布过滤并加入助滤剂。将此溶液进一步用一个Seitzdepth滤板过滤，从而得到一个澄清的溶液。滤液在一个3kDa排阻聚醚砜膜上进行超过滤以浓缩，然后加入(NH4)2SO4使终浓度达到2.0M。
将肌醇六磷酸酶加到一个用2.0M(NH4)2SO4，20mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡的Phenyl琼脂糖FF柱上，然后把酶用一个递减线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱。肌醇六磷酸酶活性按单峰洗脱。收集此峰，加入(NH4)2SO4使终浓度达到2.0M。把Butyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡，把肌醇六磷酸酶加入此柱，然后用一个递减线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱。收集包含肌醇六磷酸酶的馏分，将缓冲液在一个Q-琼脂糖FF柱上交换为pH7.0的20mM HEPES/NaOH。把G25滤液加到用pH7.0的20mM HEPES/NaOH平衡的Q-琼脂糖FF柱上。用缓冲液充分洗柱后，用增加的线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱肌醇六磷酸酶。收集肌醇六磷酸酶活性，并将缓冲液通过透析交换为20mM HEPES/NaOH，pH7.0。透析过的肌醇六磷酸酶置于平衡于20mM HEPES/NaOH，pH7.0的SOURCE 30Q柱上。以平衡缓冲液彻底洗涤该柱之后，以增加的线性NaCl梯度(0→0.3M)洗脱肌醇六磷酸酶。以SDS-PAGE分析来自SOURCE 30Q柱的馏分并合并纯净的肌醇六磷酸酚馏分。
Paxillus involtus PhyA2肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上迁移的带为Mr＝52kDa。在SDS-PAGE并电转至PVDF膜上之后进行52kDa组分的N端氨基酸序列分析。下面的N-端氨基酸序列可进行推定。Asn-Ile-Ala-Pro-Lys-Phe-
该序列相应于由cDNA衍生的氨基酸序列的氨基酸残基25-30。
因此，当在曲霉中表达时成熟的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列据认为是SEQ ID no.28的no.25-442。因此，当该肌醇六磷酸酶在曲霉中表达时，图4中所预测的信号肽并不相应于实际的信号肽。对有关序列表中标题为SEQID NOs：27和28的成熟肽的说明也是一样的。
来自于绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶
绒毛栓菌肌醇六磷酸酶在米曲霉IFO 4177中表达并自其中分泌。
将自滤布滤过的培养肉汤中加入过滤助剂。该溶液进一步通过Seitz滤板过滤得到了澄清的溶液。将过滤物通过10kDa排阻聚醚砜膜超滤进行浓缩，然后以蒸馏水渗滤以降低其导电率。将浓缩酶的pH调至pH6.0，将导电率以无离子水调至10mM琥珀酸/NaOH、pH6.0的导电率。
将肌醇六磷酸酶置于以10mM琥珀酸/NaOH、pH6.0平衡的Q-琼脂糖凝胶FF柱上，并将酶以渐增的线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱。肌醇六磷酸酶活性作为单峰洗脱。收集该峰，并加入(NH4)2SO4至终浓度为2.0M。将Butyl Toypoearl 650S柱于2.0M(NH4)2SO4、10mM CH3COOH/NaCl、pH5.5中平衡并将该肌醇六磷酸酶置于该柱上并以降低的线性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脱。含肌醇六磷酸酶的馏分被收集起来并于Q-琼脂糖凝胶FF柱上将缓冲液交换为10mM琥珀酸/NaOH、pH6.5。将柱用平衡缓冲液充分洗涤之后，用渐增的线性NaCl梯度(0→0.3M)收集肌醇六磷酸酶活性并将缓冲液在Sephadex G25柱上交换为10mM琥珀酸/NaOH、pH7.0。将G25过滤物置于平衡于10mM琥珀酸/NaOH、pH7.0的SOURCE 30Q柱上。用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，将增加的线性NaCl梯度(0→0.2M)洗脱总肌醇六磷酸酶。以SDS-PAGE多析洗脱自SOURCE 30Q柱的馏分并收集纯的肌醇六磷酸酶馏分。
绒毛栓菌肌醇六磷酸酶于SDS-PAGE上迁移的带为Mr＝57kDa。在SDS-PAGE并电转至PVDF膜上之后将该57kDa组分进行N端氨基酸测充。可推断如下的N端氨基酸序列。
Xxx-Ala-Cys-Leu-Asp-Val-Thr-Arg-Asp-(Ala/Val)-Gln-
该序列相应于由cDNA衍生的氨基酸序列的氨基酸残基31-41。
因此，当在曲霉中表达时，该肌醇六磷酸酶的成熟的氨基酸序列据信是SEQ ID no.30的no.31-443。因此图5中的预测的信号肽当在曲霉中表达时并不相应于实际的信号肽。当涉及到序列表中标题为SEQ ID NOs：20和30的成熟肽的说明时，也是如此。
绒毛栓菌的三个肌醇六磷酸酶和Paxillus involtus的PhyA2和PhyA1的分子量(kDa)分别是65、55和65kDa。
这三个肌醇六磷酸酶的pH曲线类似于图8和23中的隔孢伏革菌和田头菇肌醇六磷酸酶的(最佳pH约为5-6左右；pH高于7时有很小的活性)。与已知的无花果曲霉的肌醇六磷酸酶(在本实验中其最佳温度约为50℃左右)相比，Paxillus involtus的PhyA1具有一个稍高一些的最佳温度，约为60℃左右，而PhyA2的最佳温度却在40℃左右。Paxillus involtus的PhyA1肌醇六磷酸酶的热稳定性(termostability)与无花果曲霉肌醇六磷酸酶的活性是相当的，并且优于Paxillus involtus的PhyA2肌醇六磷酸酶和绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶的热稳定性。分别在70℃和80℃温育10分钟后，PhyA1的残余活性分别为60％和40％左右。
在DSC中，发现在48℃、59℃和55℃左右的Td’s分别是Paxillusinvoltus的肌醇六磷酸酶PhyA和PhyA1以及绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶的。
对所有的这些肌醇六磷酸酶而言，其比活性都是出乎意料的高，即对绒毛栓菌的肌醇六磷酸酶、Paxillus involtus PhyA2和PhyA1分别是1450、1370和810FYT/mg酶蛋白(A280为3.58；5.72和3.08；FYT/ml分别为5184、7808和2497；假定消光系数分别为1升(g×cm))。
                序列表(1)基本信息：(i)申请人：
(A)姓名：Novo Nordisk A/S
(B)街道：Novo Alle
(C)城市：DK-2880 Bagsvaerd
(D)州名：Denmark
(E)国家：Denmark
(F)邮编：2880
(G)电话：+45 4444 8888
(H)传真：+45 4449 3256(ii)发明名称：肌醇六磷酸酶多肽(iii)序列数：32(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)序列号1的信息(i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：2
(D)其它信息：/产品＝“其它”/注＝“位置2上的X是Y或F”  (ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/产品＝“其它”/注＝“位置3上的X是F或Y”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Pro Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro
1               5                   10(2)序列号2的信息(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注＝“位置3上的是N或H”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是I或L”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注＝“位置12上的X是F或W”(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Gln Val Xaa Xaa Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Xaa Pro Thr Ser Gly
1               5                   10                  15
Ala(2)序列号3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：8
(D)其它信息：/注＝“位置8上的X是F或W”(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Xaa Pro Thr Ser Gly Ala Xaa Xaa Arg
1               5                   10              15(2)序列号4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：13个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是D或A”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它信息：/注＝“位置5上的X是S或T”  (ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：6
(D)其它信息：/注＝“位置6上的X是A或S”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注＝“位置7上的X是T或N”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：11
(D)其它信息：/注＝“位置11上的X是A或E”(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Arg Val Val Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Trp Thr Xaa Gly Phe
1               5                   10(2)序列号5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是A或E”(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Asn Trp Thr Xaa Gly Phe Xaa Xaa Ala Ser
1               5                   10(2)序列号6的信息：  (i)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Gly Phe Xaa Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro
1               5                   10(2)序列号7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：2
(D)其它信息：/注＝“位置2上的X是N或D”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注＝“位置3上的X是P或E”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：6
(D)其它信息：/注＝“位置6上的X是T或L”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注＝“位置7上的X是W或F”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：10
(D)其它信息：/注＝“位置10上的X是S或K”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：13
(D)其它信息：注＝“位置13上的X是V或T”(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Pro Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Phe Ser
1               5                   10              15(2)序列号8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：2
(D)其它信息：/注＝“位置2上的X是Q或A”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注＝“位置3上的X是V或L”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：11
(D)其它信息：/注＝“位置11上的X是G或A”(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Asp Xaa Xaa Gln Pro Leu Xaa Phe Cys Gly Xaa
1               5                   10(2)序列号9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注＝“位置7上的X是Y或F”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：17
(D)其它信息：/注＝“位置17上的X是E或A”(xi)序列描述：SEQ TD NO：9：
Phe Val Glu Ser Gln Xaa Xaa Ala Arg Xaa Xaa Gly Xaa Gly Asp Phe
1               5                   10                  15
Xaa Lys Cys(2)序列号10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是A或E”(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Asn Trp Thr Xaa Gly Phe
1               5(2)序列号11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注＝“位置3上的X是F或Y”(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Asp Lys Xaa Tyr Gly Thr
1               5(2)序列号12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性  (ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它信息：/注＝“位置5上的X是F或Y”(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
Asp Leu Asp Lys Xaa Tyr Gly
1               5(2)序列号13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是A或E”(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Gly Asp Phe Xaa Lys
1               5(2)序列号14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽  (v)片段类型：内部(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注＝“位置3上的X是N或H”(ix)特征：
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注＝“位置4上的X是I或L”xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
Gln Val Xaa Xaa Ile Gln
1               5(2)序列号15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“有义引物”(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CCCAAGCTTA AYTGGACNGM NGGNTT(2)序列号16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反义引物”  (iv)反义：有(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：CCCAAGCTTG AYAARTWYGG NAC(2)序列号17的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反义引物”(iv)反义：有(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GCTCTAGACR TARWAYTTRT CNARRTC(2)序列号18的信息：(i)序列特征：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反义引物”(iv)反义：有(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GCTCTAGACA YTTNKCRAAR TCNCC(2)序列号19的信息：(i)序列特征：
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性  (ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“有义引物”(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：CCCAAGCTTC ARGTNMAYMT NATHCA(2)序列号20的信息：(i)序列特征：
(A)长度：27碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc＝“反义引物”(iv)反义：有(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：GCTCTAGACR AANCCNKCNG TCCARTT(2)序列号21的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1501碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：
(A)微生物：平田头菇
(B)菌株：CBS 900.96(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：17..1375(ix)特征：
(A)名称/关键词：信号-肽(sig-peptide)
(B)位置：17..94(ix)特征：
(A)名称/关键词：成熟-肽(mat-peptide)
(B)位置：95..1375(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：GGATCCGAAT TCACTT ATG TCC CTC TTC ATC GGC GGC TGT TTG CTC GTG      49
              Met Ser Leu Phe Ile Gly Gly Cys Leu Leu Val
              -26 -25                 -20TTT TTA CAG GCG AGC GCA TAC GGC GGC GTC GTG CAG GCC ACA TTC GTG    97Phe Leu Gln Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Val Val Gln Ala Thr Phe Val-15                 -10                  -5                   1CAG CCG TTT TTC CCT CCA CAG ATT CAG GAC TCT TGG GCA GCT TAT ACA   145Gln Pro Phe Phe Pro Pro Gln Ile Gln Asp Ser Trp Ala Ala Tyr Thr
          5                  10                  15CCA TAT TAT CCT GTT CAG GCG TAC ACG CCT CCC CCG AAG GAT TGC AAG   193Pro Tyr Tyr Pro Val Gln Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Lys Asp Cys Lys
     20                  25                  30ATC ACA CAA GTT AAC ATT ATT CAA CGA CAT GGT GCC CGC TTT CCG ACA   241Ile Thr Gln Val Asn Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr
 35                  40                  45TCG GGG GCA GGC ACA AGG ATC CAA GCA GCT GTG AAG AAG CTT CAA TCA   289Ser Gly Ala Gly Thr Arg Ile Gln Ala Ala Val Lys Lys Leu Gln Ser50                  55                  60                  65GCT AAA ACC TAT ACG GAT CCT CGT CTC GAC TTT CTG ACC AAC TAT ACC   337Ala Lys Thr Tyr Thr Asp Pro Arg Leu Asp Phe Leu Thr Asn Tyr Thr
             70                  75                  80TAT ACC CTT GGT CAC GAC GAT CTC GTA CCG TTT GGA GCG CTT CAA TCA   385Tyr Thr Leu Gly His Asp Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Leu Gln Ser
         85                  90                  95TCA CAA GCT GGA GAG GAA ACG TTT CAA CGA TAC TCG TTT CTG GTG TCC   433Ser Gln Ala Gly Glu Glu Thr Phe Gln Arg Tyr Ser Phe Leu Val Ser
    100                 105                 110AAA GAG AAC TTA CCT TTT GTA AGA GCT TCG AGT TCC AAT CGA GTC GTC   481Lys Glu Asn Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Ser Ser Asn Arg Val Val
115                 120                 125GAC TCA GCT ACC AAC TGG ACG GAA GGT TTT TCT GCG GCC AGT CAC CAC   529Asp Ser Ala Thr Asn Trp Thr Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ser His His130                 135                 140                 145GTC TTG AAT CCC ATT CTC TTT GTA ATC CTC TCA GAA AGT CTC AAT GAC   577Val Leu Asn Pro Ile Leu Phe Val Ile Leu Ser Glu Ser Leu Asn Asp
            150                 155                 160ACG CTT GAC GAT GCC ATG TGC CCT AAC GCG GGC TCC TCC GAC CCG CAG   625Thr Leu Asp Asp Ala Met Cys Pro Asn Ala Gly Ser Ser Asp Pro Gln
        165                 170                 175ACT GGT ATC TGG ACC TCG ATA TAC GGG ACG CCT ATT GCC AAC CGA CTA   673Thr Gly Ile Trp Thr Ser Ile Tyr Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Leu
    180                 185                 190AAT CAG CAG GCT CCG GGT GCA AAT ATT ACA GCT GCC GAT GTG TCG AAC   721Asn Gln Gln Ala Pro Gly Ala Asn Ile Thr Ala Ala Asp Val Ser Asn
195                 200                 205CTT ATA CCG CTT TGC GCA TTC GAG ACG ATA GTA AAG GAG ACG CCA AGT   769Leu Ile Pro Leu Cys Ala Phe Glu Thr Ile Val Lys Glu Thr Pro Ser210                 215                 220                 225CCT TTC TGT AAT TTG TTC ACC CCC GAA GAG TTC GCA CAG TTT GAA TAT        817Pro Phe Cys Asn Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Ala Gln Phe Glu Tyr
            230                 235                 240TTC GGT GAC CTG GAC AAG TTC TAT GGG ACA GGT TAT GGA CAA CCG TTA        865Phe Gly Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro Leu
        245                 250                 255GGA CCT GTG CAA GGT GTC GGC TAC ATC AAT GAA CTT CTT GCC CGA CTC        913Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu
    260                 265                 270ACA GAA ATG CCA GTT CGA GAT AAC ACC CAG ACG AAC AGG ACA CTC GAC        961Thr Glu Met Pro Val Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp
275                 280                 285TCT TCT CCG CTT ACA TTT CCC CTC GAC CGC AGT ATC TAC GCT GAC CTC       1009Ser Ser Pro Leu Thr Phe Pro Leu Asp Arg Ser Ile Tyr Ala Asp Leu290                 295                 300                 305TCG CAC GAT AAC CAA ATG ATC GCG ATA TTT TCA GCG ATG GGT CTT TTC       1057Ser His Asp Asn Gln Met Ile Ala Ile Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe
            310                 315                 320AAC CAG AGT TCA CCT TTG GAT CCG TCC TTC CCC AAC CCC AAG CGT ACT       1105Asn Gln Ser Ser Pro Leu Asp Pro Ser Phe Pro Asn Pro Lys Arg Thr
        325                 330                 335TGG GTC ACC AGT CGG CTT ACG CCT TTC AGC GCG AGA ATG GTC ACT GAG       1153Trp Val Thr Ser Arg Leu Thr Pro Phe Ser Ala Arg Met Val Thr Glu
    340                 345                 350CGG TTG CTG TGT CAA AGG GAT GGG ACA GGG AGC GGT GGA CCA TCC AGG       1201Arg Leu Leu Cys Gln Arg Asp Gly Thr Gly Ser Gly Gly Pro Ser Arg
355                 360                 365ATC ATG CGG AAT GGA AAT GTG CAG ACG TTT GTG AGG ATT CTT GTC AAC       1249Ile Met Arg Asn Gly Asn Val Gln Thr Phe Val Arg Ile Leu Val Asn370                 375                 380                 385GAT GCT TTA CAG CCT TTG AAG TTC TGC GGA GGG GAC ATG GAT AGT TTG       1297Asp Ala Leu Gln Pro Leu Lys Phe Cys Gly Gly Asp Met Asp Ser Leu
            390                 395                 400TGT ACT CTG GAA GCG TTC GTC GAG AGC CAG AAG TAT GCA CGA GAG GAT       1345Cys Thr Leu Glu Ala Phe Val Glu Ser Gln Lys Tyr Ala Arg Glu Asp
        405                 410                 415GGT CAA GGC GAT TTT GAA AAA TGT TTT GAT TAAATATTGC AGTATGCTCA         1395Gly Gln Gly Asp Phe Glu Lys Cys Phe Asp
    420                 425GTGAGTAGAC TACAGTGCAG GCCCTGTAAC TCTTGTATTG TGTTTCTGGA ATTCCTCGGA     1455GCGTAGTTTG TAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAATTCCTGC GGCCGC                    1501(2)序列号22的信息：  (i)序列特征：
 (A)长度：453个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：Met Ser Leu Phe Ile Gly Gly Cys Leu Leu Val Phe Leu Gln Ala Ser-26 -25                 -20                 -15Ala Tyr Gly Gly Val Val Gln Ala Thr Phe Val Gln Pro Phe Phe Pro-10                  -5                   1               5Pro Gln Ile Gln Asp Ser Trp Ala Ala Tyr Thr Pro Tyr Tyr Pro Val
         10                  15                  20Gln Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Lys Asp Cys Lys Ile Thr Gln Val Asn
     25                  30                  35Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Gly Thr
 40                  45                  50Arg Ile Gln Ala Ala Val Lys Lys Leu Gln Ser Ala Lys Thr Tyr Thr55                  60                  65                  70Asp Pro Arg Leu Asp Phe Leu Thr Asn Tyr Thr Tyr Thr Leu Gly His
             75                  80                  85Asp Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Leu Gln Ser Ser Gln Ala Gly Glu
         90                  95                 100Glu Thr Phe Gln Arg Tyr Ser Phe Leu Val Ser Lys Glu Asn Leu Pro
    105                 110                 115Phe Val Arg Ala Ser Ser Ser Asn Arg Val Val Asp Ser Ala Thr Asn
120                 125                 130Trp Thr Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ser His His Val Leu Asn Pro Ile135                 140                 145                 150Leu Phe Val Ile Leu Ser Glu Ser Leu Asn Asp Thr Leu Asp Asp Ala
            155                 160                 165Met Cys Pro Asn Ala Gly Ser Ser Asp Pro Gln Thr Gly Ile Trp Thr
        170                 175                 180Ser Ile Tyr Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Leu Asn Gln Gln Ala Pro
    185                 190                 195Gly Ala Asn Ile Thr Ala Ala Asp Val Ser Asn Leu Ile Pro Leu Cys
200                 205                 210Ala Phe Glu Thr Ile Val Lys Glu Thr Pro Ser Pro Phe Cys Asn Leu215                 220                 225                 230Phe Thr Pro Glu Glu Phe Ala Gln Phe Glu Tyr Phe Gly Asp Leu Asp
            235                 240                 245Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly
        250                 255                 260Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Glu Met Pro Val
    265                 270                 275Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Ser Pro Leu Thr
280                 285                 290Phe Pro Leu Asp Arg Ser Ile Tyr Ala Asp Leu Ser His Asp Asn Gln295                 300                 305                 310Met Ile Ala Ile Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Asn Gln Ser Ser Pro
            315                 320                 325Leu Asp Pro Ser Phe Pro Asn Pro Lys Arg Thr Trp Val Thr Ser Arg
        330                 335                 340Leu Thr Pro Phe Ser Ala Arg Met Val Thr Glu Arg Leu Leu Cys Gln
    345                 350                 355Arg Asp Gly Thr Gly Ser Gly Gly Pro Ser Arg Ile Met Arg Asn Gly
360                 365                 370Asn Val Gln Thr Phe Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Ala Leu Gln Pro375                 380                 385                 390Leu Lys Phe Cys Gly Gly Asp Met Asp Ser Leu Cys Thr Leu Glu Ala
            395                 400                 405Phe Val Glu Ser Gln Lys Tyr Ala Arg Glu Asp Gly Gln Gly Asp Phe
        410                 415                 420Glu Lys Cys Phe Asp
    425(2)序列号23的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：1593碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：
 (A)微生物：Peniophora lycii
 (B)菌株：CBS 686.96(ix)特征：
 (A)名称/关键词：信号-肽(sig-peptide)
 (B)位置：123..212(ix)特征：
 (A)名称/关键词：成熟-肽(mat-peptide)
 (B)位置：213..1439(ix)特征：
 (A)名称/关键词：CDS
 (B)位置：123..1439(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：GGATCCGAAT TCCATCTTCT GCTCTGACCT CCATCTCGCT GAGCGGCCGA CGAGAACCTA        60GGGGCTCTAA GTCCACGTAC TATCGCCGCG CCTGTGAAGG CCCCATACCA GCCCTTATCG       120AT ATG GTT TCT TCG GCA TTC GCA CCT TCC ATC CTA CTT AGC TTG ATG          167Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met-30                 -25                 -20TCG AGT CTT GCT TTG AGC ACG CAG TTC AGC TTT GTT GCG GCG CAG CTA         215Ser Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu-15                 -10                  -5                   1CCT ATC CCC GCA CAA AAC ACA AGT AAT TGG GGG CCT TAC GAT CCC TTC         263Pro Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe
          5                  10                  15TTT CCC GTC GAA CCG TAT GCA GCT CCG CCG GAA GGG TGC ACA GTG ACA         311Phe Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr
     20                  25                  30CAG GTC AAC CTG ATT CAG AGG CAC GGC GCG CGT TGG CCC ACA TCC GGC         359Gln Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly
 35                  40                  45GCG CGG TCG CGG CAG GTC GCC GCC GTA GCG AAG ATA CAA ATG GCG CGA        407Ala Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg50                  55                  60                  65CCA TTC ACG GAT CCC AAG TAT GAG TTC CTC AAC GAC TTC GTG TAC AAG        455Pro Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys
             70                  75                  80TTC GGC GTC GCC GAT CTG CTA CCG TTC GGG GCT AAC CAA TCG CAC CAA        503Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln
         85                  90                  95ACC GGC ACC GAT ATG TAT ACG CGC TAC AGT ACA CTA TTT GAG GGC GGG        551Thr Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly
    100                 105                 110GAT GTA CCC TTT GTG CGC GCG GCT GGT GAC CAA CGC GTC GTT GAC TCC        599Asp Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser
115                 120                 125TCG ACG AAC TGG ACG GCA GGC TTT GGC GAT GCT TCT GGC GAG ACT GTT        647Ser Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val130                 135                 140                 145CTC CCG ACG CTC CAG GTT GTG CTT CAA GAA GAG GGG AAC TGC ACG CTC        695Leu Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu
            150                 155                 160TGC AAT AAT ATG TGC CCG AAT GAA GTG GAT GGT GAC GAA TCC ACA ACG        743Cys Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr
        165                 170                 175TGG CTG GGG GTC TTT GCG CCG AAC ATC ACC GCG CGA TTG AAC GCT GCT        791Trp Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala
    180                 185                 190GCG CCG AGT GCC AAC CTC TCA GAC AGC GAC GCG CTC ACT CTC ATG GAT        839Ala Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp
195                 200                 205ATG TGC CCG TTC GAC ACT CTC AGC TCC GGG AAC GCC AGC CCC TTC TGT        887Met Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys210                 215                 220                 225GAC CTA TTT ACC GCG GAG GAG TAT GTG TCG TAC GAG TAC TAC TAT GAC        935Asp Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp
            230                 235                 240CTC GAC AAG TAC TAT GGC ACG GGC CCC GGG AAC GCT CTC GGT CCT GTC        983Leu Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val
        245                 250                 255CAG GGC GTC GGA TAC GTC AAT GAG CTG CTT GCA CGC TTG ACC GGC CAA       1031Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln
    260                 265                 270GCC GTT CGA GAC GAG ACG CAG ACG AAC CGC ACG CTC GAC AGC GAC CCT       1079Ala Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro
275                 280                 285GCA ACA TTC CCG CTG AAC CGT ACG TTC TAC GCC GAC TTC TCG CAT GAT       1127Ala Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp290                 295                 300                 305AAC ACC ATG GTG CCC ATC TTT GCG GCG CTC GGG CTC TTC AAC GCC ACC       1175Asn Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr
            310                 315                 320GCC CTC GAC CCG CTG AAG CCC GAC GAG AAC AGG TTG TGG GTG GAC TCT       1223Ala Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser
        325                 330                 335AAG CTG GTA CCG TTC TCT GGA CAT ATG ACG GTC GAG AAG CTG GCA TGT       1271Lys Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys
    340                 345                 350TCT GGG AAG GAG GCG GTC AGG GTG CTC GTG AAC GAC GCG GTG CAG CCG       1319Ser Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro
355                 360                 365CTG GAG TTC TGC GGA GGT GTT GAT GGG GTG TGC GAG CTT TCG GCT TTC       1367Leu Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe370                 375                 380                 385GTA GAG AGC CAG ACG TAT GCG CGG GAG AAT GGG CAA GGC GAC TTC GCC       1415Val Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala
            390                 395                 400AAG TGC GGC TTT GTT CCG TCG GAA TAGCGGGAGA CCGTCTATGC TACACAGTAA      1469Lys Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu
        405TTGTGTACTC TATAGCACTG TAGCTGTACT TACAAGTCGT AGGGTACGAT CGTACTTACG     1529CTCGTTTATT GATCCTTCCT TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATTCCTGCGG     1589CCGC                                                                  1593(2)序列号24的信息：(i)序列特征：
(A)长度：439个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser-30                 -25                 -20                 -15Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro
            -10                 -5                    1Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe
      5                  10                  15Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln
 20                  25                  30Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala35                  40                  45                  50Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro
             55                  60                  65Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe
         70                  75                  80Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr
     85                  90                  95Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp
100                 105                 110Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser115                 120                 125                 130Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu
            135                 140                 145Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys
        150                 155                 160Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp
    165                 170                 175Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala
180                 185                 190Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met195                 200                 205                 210Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp
            215                 220                 225Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu
        230                 235                 240Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln
    245                 250                 255Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala
260                 265                 270Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala275                 280                 285                 290Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn
            295                 300                 305Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala
        310                 315                 320Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys
    325                 330                 335Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser
340                 345                 350Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu355                 360                 365                 370Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val
            375                 380                 385Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys
        390                 395                 400Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu
    405(2)序列号25的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：1522碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：
 (A)微生物：Paxillus involtus
 (B)菌株：CBS 100231(ix)特征：
 (A)名称/关键词：CDS
 (B)位置：58..1383(ix)特征：
 (A)名称/关键词：成熟-肽(mat-peptide)
 (B)位置：115..1383(ix)特征：
 (A)名称/关键词：信号-肽(sig-peptide)
 (B)位置：58..114(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：GGATCCGAAT TCGGCACTCG TACGGTCCCC CGGTCTACCC TCTGCTCGCC TTGGAAG          57ATG CTC TTC GGT TTC GTC GCC CTC GCC TGT CTC TTG TCC CTC TCC GAG        105Met Leu Phe Gly Phe Val Ala Leu Ala Cys Leu Leu Ser Leu Ser Glu-19             -15                 -10                  -5GTC CTT GCG ACC TCC GTG CCC AAG AAC ACA GCG CCG ACC TTC CCC ATT        153Val Leu Ala Thr Ser Val Pro Lys Asn Thr Ala Pro Thr Phe Pro Ile
          1               5                  10CCG GAG AGT GAG CAG CGG AAC TGG TCC CCG TAC TCG CCC TAC TTC CCT   201Pro Glu Ser Glu Gln Arg Asn Trp Ser Pro Tyr Ser Pro Tyr Phe Pro
 15                  20                  25CTT GCC GAG TAC AAG GCT CCT CCG GCG GGC TGC CAG ATC AAC CAG GTC   249Leu Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Pro Ala Gly Cys Gln Ile Asn Gln Val30                  35                  40                  45AAC ATC ATC CAA AGA CAT GGT GCC CGG TTC CCG ACC TCT GGC GCG ACC   297Asn Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Thr
             50                  55                  60ACC CGT ATC AAG GCG GGT TTG ACC AAG TTG CAA GGC GTC CAG AAC TTT   345Thr Arg Ile Lys Ala Gly Leu Thr Lys Leu Glu Gly Val Gln Asn Phe
         65                  70                  75ACC GAC GCC AAA TTC AAC TTC ATC AAG TCG TTC AAG TAC GAT CTC GGT   393Thr Asp Ala Lys Phe Asn Phe Ile Lys Ser Phe Lys Tyr Asp Leu Gly
     80                  85                  90AAC TCG GAC CTC GTT CCG TTC GGT GCA GCA CAG TCC TTC GAC GCT GGT   441Asn Ser Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Ala Gln Ser Phe Asp Ala Gly
 95                 100                 105CAG GAG GCC TTC GCC CGC TAC TCG AAG CTT GTC AGC AAG AAC AAC CTG   489Gln Glu Ala Phe Ala Arg Tyr Ser Lys Leu Val Ser Lys Asn Asn Leu110                 115                 120                 125CCG TTC ATT CGT GCC GAT GGA AGT GAT CGT GTT GTG GAT TCT GCT ACA   537Pro Phe Ile Arg Ala Asp Gly Ser Asp Arg Val Val Asp Ser Ala Thr
            130                 135                 140AAC TGG ACT GCG GGT TTC GCT TCG GCA AGT CAC AAC ACG GTC CAG CCC   585Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala Ser Ala Ser His Asn Thr Val Gln Pro
        145                 150                 155AAG CTG AAC CTG ATT CTC CCG CAA ACT GGC AAT GAT ACC CTG GAA GAT   633Lys Leu Asn Leu Ile Leu Pro Gln Thr Gly Asn Asp Thr Leu Glu Asp
    160                 165                 170AAT ATG TGC CCT GCT GCT GGC GAT TCT GAC CCC CAG GTC AAC GCG TGG   681Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly Asp Ser Asp Pro Gln Val Asn Ala Trp
175                 180                 185TTG GCT GTT GCT TTC CCT TCC ATC ACT GCA CGG CTC AAC GCC GCC GCG   729Leu Ala Val Ala Phe Pro Ser Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala190                 195                 200                 205CCC TCT GTC AAC CTC ACC GAC ACG GAC GCG TTC AAC CTC GTC AGT CTC   777Pro Ser Val Asn Leu Thr Asp Thr Asp Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu
            210                 215                 220TGC GCT TTC TTG ACA GTC TCG AAG GAG AAG AAG AGT GAC TTC TGC ACC   825Cys Ala Phe Leu Thr Val Ser Lys Glu Lys Lys Ser Asp Phe Cys Thr
        225                 230                 235CTG TTC GAG GGC ATC CCT GGC TCT TTC GAG GCG TTC GCC TAT GGT GGC   873Leu Phe Glu Gly Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Phe Ala Tyr Gly Gly
    240                 245                 250GAC CTT GAC AAG TTC TAC GGT ACC GGT TAC GGT CAG GAA CTC GGA CCC   921Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Glu Leu Gly Pro
255                 260                 265GTT CAA GGC GTC GGC TAC GTC AAC GAG CTC ATC GCC CGC CTC ACC AAC        969Val Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Asn270                 275                 280                 285TCC GCC GTC CGC GAC AAC ACC CAG ACG AAC CGC ACA CTC GAC GCC TCG        1017Ser Ala Val Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ala Ser
            290                 295                 300CCC GTA ACC TTC CCG TTG AAC AAG ACG TTC TAC GCC GAT TTC TCC CAC        1065Pro Val Thr Phe Pro Leu Asn Lys Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His
        305                 310                 315GAC AAC CTC ATG GTC GCC GTC TTC TCC GCC ATG GGC CTC TTC CGC CAG        1113Asp Asn Leu Met Val Ala Val Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Arg Gln
    320                 325                 330CCC GCG CCG CTC AGC ACG TCC GTG CCG AAC CCA TGG CGC ACG TGG CGC        1161Pro Ala Pro Leu Ser Thr Ser Val Pro Asn Pro Trp Arg Thr Trp Arg
335                 340                 345ACG AGC TCC CTC GTC CCC TTC TCC GGA CGC ATG GTC GTG GAA CGC CTC        1209Thr Ser Ser Leu Val Pro Phe Ser Gly Arg Met Val Val Glu Arg Leu350                 355                 360                 365AGC TGT TTC GGC ACG ACC AAG GTT CGC GTC CTC GTG CAG GAC CAG GTG        1257Ser Cys Phe Gly Thr Thr Lys Val Arg Val Leu Val Gln Asp Gln Val
            370                 375                 380CAG CCG CTC GAG TTC TGC GGG GGT GAT AGG AAC GGG CTG TGC ACG CTT        1305Gln Pro Leu Glu Phe Cys Gly Gly Asp Arg Asn Gly Leu Cys Thr Leu
        385                 390                 395GCT AAG TTT GTG GAG AGC CAG ACG TTT GCG AGG AGT GAT GGT GCG GGG        1353Ala Lys Phe Val Glu Ser Gln Thr Phe Ala Arg Ser Asp Gly Ala Gly
    400                 405                 410GAC TTT GAG AAG TGC TTC GCG ACC TCG GCG TGAGGATGGA CGAACAAAAT          1403Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr Ser Ala
415                 420TAAATTGGGG TATTTTATCG TATAATTATG GTGTGTGTAG AACATGGGCT CGGGGTCGAT      1463GGTGAAAAGC AAAGGTTTAT CGTCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTCC TGCGGCCGC       1522(2)序列号26的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：442个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Met Leu Phe Gly Phe Val Ala Leu Ala Cys Leu Leu Ser Leu Ser Glu-19             -15                 -10                  -5Val Leu Ala Thr Ser Val Pro Lys Asn Thr Ala Pro Thr Phe Pro Ile
          1               5                  10Pro Glu Ser Glu Gln Arg Asn Trp Ser Pro Tyr Ser Pro Tyr Phe Pro
 15                  20                  25Leu Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Pro Ala Gly Cys Gln Ile Asn Gln Val30                  35                  40                  45Asn Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Thr
             50                  55                  60Thr Arg Ile Lys Ala Gly Leu Thr Lys Leu Gln Gly Val Gln Asn Phe
         65                  70                  75Thr Asp Ala Lys Phe Asn Phe Ile Lys Ser Phe Lys Tyr Asp Leu Gly
     80                  85                  90Asn Ser Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Ala Gln Ser Phe Asp Ala Gly
 95                 100                 105Gln Glu Ala Phe Ala Arg Tyr Ser Lys Leu Val Ser Lys Asn Asn Leu110                 115                 120                 125Pro Phe Ile Arg Ala Asp Gly Ser Asp Arg Val Val Asp Ser Ala Thr
            130                 135                 140Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala Ser Ala Ser His Asn Thr Val Gln Pro
        145                 150                 155Lys Leu Asn Leu Ile Leu Pro Gln Thr Gly Asn Asp Thr Leu Glu Asp
    160                 165                 170Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly Asp Ser Asp Pro Gln Val Asn Ala Trp
175                 180                 185Leu Ala Val Ala Phe Pro Ser Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala190                 195                 200                 205Pro Ser Val Asn Leu Thr Asp Thr Asp Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu
            210                 215                 220Cys Ala Phe Leu Thr Val Ser Lys Glu Lys Lys Ser Asp Phe Cys Thr
        225                 230                 235Leu Phe Glu Gly Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Phe Ala Tyr Gly Gly
    240                 245                 250Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Glu Leu Gly Pro
255                 260                 265Val Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Asn270                 275                 280                 285Ser Ala Val Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ala Ser
            290                 295                 300Pro Val Thr Phe Pro Leu Asn Lys Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His
        305                 310                 315Asp Asn Leu Met Val Ala Val Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Arg Gln
    320                 325                 330Pro Ala Pro Leu Ser Thr Ser Val Pro Asn Pro Trp Arg Thr Trp Arg
335                 340                 345Thr Ser Ser Leu Val Pro Phe Ser Gly Arg Met Val Val Glu Arg Leu350                 355                 360                 365Ser Cys Phe Gly Thr Thr Lys Val Arg Val Leu Val Gln Asp Gln Val
            370                 375                 380Gln Pro Leu Glu Phe Cys Gly Gly Asp Arg Asn Gly Leu Cys Thr Leu
        385                 390                 395Ala Lys Phe Val Glu Ser Gln Thr Phe Ala Arg Ser Asp Gly Ala Gly
    400                 405                 410Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr Ser Ala
415                 420(2)序列号27的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：1642碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(Vi)来源：
 (A)微生物：Paxillus involtus
 (B)菌株：CBS 100231(ix)特征：
 (A)名称/关键词：CDS
 (B)位置：48..1373(ix)特征：
 (A)名称/关键词：成熟-肽(mat-peptide)
 (B)位置：105..1373(ix)特征：
 (A)名称/关键词：信号-肽(sig-peptide)
 (B)位置：48..104(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：GGATCCGAAT TCCAGTCCCC AAGCTAATCC TCTGCTCGCC TTGGAAG ATG CAC CTC         56
                                                Met His Leu
                                                -19GGC TTC GTC ACC CTC GCT TGT CTC ATA CAC CTC TCC GAG GTC TTC GCG        104Gly Phe Val Thr Leu Ala Cys Leu Ile His Leu Ser Glu Val Phe Ala
-15                 -10                  -5GCA TCC GTG CCC CGG AAT ATT GCT CCG AAG TTC TCA ATT CCG GAA AGC        152Ala Ser Val Pro Arg Asn Ile Ala Pro Lys Phe Ser Ile Pro Glu Ser1               5                  10                  15GAG CAG CGA AAC TGG TCG CCT TAC TCT CCT TAC TTT CCC CTA GCC GAA        200Glu Gln Arg Asn Trp Ser Pro Tyr Ser Pro Tyr Phe Pro Leu Ala Glu
         20                  25                  30TAC AAG GCT CCT CCA GCA GGC TGC GAG ATT AAC CAA GTC AAT ATT ATC        248Tyr Lys Ala Pro Pro Ala Gly Cys Glu Ile Asn Gln Val Asn Ile Ile
     35                  40                  45CAA CGG CAT GGC GCA CGG TTC CCA ACC TCG GGT GCG GCC ACT CGC ATC        296Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Ala Thr Arg Ile
 50                  55                  60AAG GCT GGT TTA AGC AAG CTG CAA TCC GTC CAG AAT TTC ACC GAC CCC        344Lys Ala Gly Leu Ser Lys Leu Gln Ser Val Gln Asn Phe Thr Asp Pro65                  70                  75                  80AAA TTC GAC TTC ATC AAG TCG TTC ACA TAC GAT CTT GGT ACT TCC GAC        392Lys Phe Asp Phe Ile Lys Ser Phe Thr Tyr Asp Leu Gly Thr Ser Asp
             85                  90                  95CTC GTG CCA TTC GGC GCA GCA CAA TCA TTC GAT GCC GGC CTG GAG GTC        440Leu Val Pro Phe Gly Ala Ala Gln Ser Phe Asp Ala Gly Leu Glu Val
        100                 105                 110TTC GCT CGC TAT TCG AAG CTC GTC AGC TCG GAC AAC CTG CCT TTC ATT        488Phe Ala Arg Tyr Ser Lys Leu Val Ser Ser Asp Asn Leu Pro Phe Ile
    115                 120                 125CGC TCA GAT GGT AGC GAT CGT GTA GTC GAC ACT GCT ACG AAC TGG ACT        536Arg Ser Asp Gly Ser Asp Arg Val Val Asp Thr Ala Thr Asn Trp Thr
130                 135                 140GCA GGT TTT GCT TCC GCG AGC CGC AAC GCG ATC CAA CCC AAG CTC GAC        584Ala Gly Phe Ala Ser Ala Ser Arg Asn Ala Ile Gln Pro Lys Leu Asp145                 150                 155                 160TTG ATA CTT CCA CAA ACT GGC AAT GAC ACC CTC GAG GAC AAC ATG TGT        632Leu Ile Leu Pro Gln Thr Gly Asn Asp Thr Leu Glu Asp Asn Met Cys
            165                 170                 175CCA GCT GCT GGC GAA TCC GAC CCT CAG GTC GAT GCG TGG TTG GCG TCC        680Pro Ala Ala Gly Glu Ser Asp Pro Gln Val Asp Ala Trp Leu Ala Ser
        180                 185                 190GCC TTC CCA TCT GTC ACC GCG CAG CTC AAC GCT GCA GCG CCT GGT GCC        728Ala Phe Pro Ser Val Thr Ala Gln Leu Asn Ala Ala Ala Pro Gly Ala
    195                 200                 205AAT CTC ACA GAC GCC GAC GCC TTC AAC CTC GTC AGC CTG TGT CCC TTC        776Asn Leu Thr Asp Ala Asp Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Cys Pro Phe
210                 215                 220ATG ACA GTT TCG AAG GAG CAG AAG AGC GAC TTC TGC ACG TTG TTC GAG        824Met Thr Val Ser Lys Glu Gln Lys Ser Asp Phe Cys Thr Leu Phe Glu225                 230                 235                 240GGA ATC CCT GGA TCG TTC GAG GCG TTT GCC TAT GCC GGC GAC CTT GAC        872Gly Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Phe Ala Tyr Ala Gly Asp Leu Asp
            245                 250                 255AAG TTC TAT GGG ACC GGC TAT GGC CAA GCC CTC GGA CCG GTC CAA GGC        920Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Ala Leu Gly Pro Val Gln Gly
        260                 265                 270GTC GGC TAC ATC AAC GAG CTC CTT GCA CGC CTG ACC AAC TCC GCA GTG        968Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Asn Ser Ala Val
    275                 280                 285AAC GAC AAC ACA CAG ACG AAC CGC ACA CTC GAC GCC GCA CCA GAC ACG       1016Asn Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ala Ala Pro Asp Thr
290                 295                 300TTC CCG CTC AAC AAG ACC ATG TAC GCC GAT TTC TCA CAC GAC AAC CTC       1064Phe Pro Leu Asn Lys Thr Met Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Leu305                 310                 315                 320ATG GTC GCC GTG TTC TCC GCC ATG GGC CTC TTC CGC CAA TCC GCA CCG       1112Met Val Ala Val Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Arg Gln Ser Ala Pro
            325                 330                 335CTC AGC ACG TCC ACA CCG GAT CCG AAC CGC ACG TGG CTC ACG AGC TCT       1160Leu Ser Thr Ser Thr Pro Asp Pro Asn Arg Thr Trp Leu Thr Ser Ser
        340                 345                 350GTC GTT CCG TTC TCC GCG CGC ATG GCC GTC GAA CGC CTC AGC TGT GCT       1208Val Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Ala Val Glu Arg Leu Ser Cys Ala
    355                 360                 365GGT ACC ACG AAG GTG CGC GTC CTG GTG CAG GAC CAG GTC CAG CCA CTC       1256Gly Thr Thr Lys Val Arg Val Leu Val Gln Asp Gln Val Gln Pro Leu
370                 375                 380GAG TTC TGC GGC GGC GAC CAG GAT GGG TTG TGC GCG CTA GAC AAG TTC       1304Glu Phe Cys Gly Gly Asp Gln Asp Gly Leu Cys Ala Leu Asp Lys Phe385                 390                 395                 400GTC GAG AGC CAG GCG TAT GCA CGG AGT GGT GGC GCA GGT GAC TTT GAG       1352Val Glu Ser Gln Ala Tyr Ala Arg Ser Gly Gly Ala Gly Asp Phe Glu
            405                 410                 415AAG TGT CTT GCG ACG ACG GTG TGAGATGGGG TAATCTACGG TGAAGCAGCG          1403Lys Cys Leu Ala Thr Thr Val
        420GAGAGCCTCT CAACGAATGC AAAGGATAGG TTCGAGGCTT ACTTCATCAA CCTATATCAT     1463CATAGGACAA GCCCCCCAAT AGCCAGACTC GTCGTTTGAC ATCGTGTATG AAAATAACCC     1523ACCCACGCAC TCCGCTGCCA CTATTCGCGT GTATCGCATA CTAGGCGTTT TCGCCCAGTT     1583GAACATGAGC CCATTCTGTC CCCAGTGAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTCC TGCGGCCGC      1642(2)序列号28的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：442个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Met His Leu Gly Phe Val Thr Leu Ala Cys Leu Ile His Leu Ser Glu-19             -15                 -10                  -5Val Phe Ala Ala Ser Val Pro Arg Asn Ile Ala Pro Lys Phe Ser Ile
          1               5                  10Pro Glu Ser Glu Gln Arg Asn Trp Ser Pro Tyr Ser Pro Tyr Phe Pro
 15                  20                  25Leu Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Pro Ala Gly Cys Glu Ile Asn Gln Val30                  35                  40                  45Asn Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Ala
             50                  55                  60Thr Arg Ile Lys Ala Gly Leu Ser Lys Leu Gln Ser Val Gln Asn Phe
         65                  70                  75Thr Asp Pro Lys Phe Asp Phe Ile Lys Ser Phe Thr Tyr Asp Leu Gly
     80                  85                  90Thr Ser Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Ala Gln Ser Phe Asp Ala Gly
 95                 100                 105Leu Glu Val Phe Ala Arg Tyr Ser Lys Leu Val Ser Ser Asp Asn Leu110                 115                 120                 125Pro Phe Ile Arg Ser Asp Gly Ser Asp Arg Val Val Asp Thr Ala Thr
            130                 135                 140Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala Ser Ala Ser Arg Asn Ala Ile Gln Pro
        145                 150                 155Lys Leu Asp Leu Ile Leu Pro Gln Thr Gly Asn Asp Thr Leu Glu Asp
    160                 165                 170Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly Glu Ser Asp Pro Gln Val Asp Ala Trp
175                 180                 185Leu Ala Ser Ala Phe Pro Ser Val Thr Ala Gln Leu Asn Ala Ala Ala190                 195                 200                 205Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Ala Asp Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu
            210                 215                 220Cys Pro Phe Met Thr Val Ser Lys Glu Gln Lys Ser Asp Phe Cys Thr
        225                 230                 235Leu Phe Glu Gly Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Phe Ala Tyr Ala Gly
    240                 245                 250Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Ala Leu Gly Pro
255                 260                 265Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Asn270                 275                 280                 285Ser Ala Val Asn Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ala Ala
            290                 295                 300Pro Asp Thr Phe Pro Leu Asn Lys Thr Met Tyr Ala Asp Phe Ser His
        305                 310                 315Asp Asn Leu Met Val Ala Val Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Arg Gln
    320                 325                 330Ser Ala Pro Leu Ser Thr Ser Thr Pro Asp Pro Asn Arg Thr Trp Leu
335                 340                 345Thr Ser Ser Val Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Ala Val Glu Arg Leu350                 355                 360                 365Ser Cys Ala Gly Thr Thr Lys Val Arg Val Leu Val Gln Asp Gln Val
            370                 375                 380Gln Pro Leu Glu Phe Cys Gly Gly Asp Gln Asp Gly Leu Cys Ala Leu
        385                 390                 395Asp Lys Phe Val Glu Ser Gln Ala Tyr Ala Arg Ser Gly Gly Ala Gly
    400                 405                 410Asp Phe Glu Lys Cys Leu Ala Thr Thr Val
415                 420(2)序列号29的信息：(i)序列特征：
 (A)长度：1536碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线性  (ii)分子类型：cDNA(vi)来源：
 (A)微生物：绒毛栓菌
 (B)菌株：CBS 100232(ix)特征：
 (A)名称/关键词：CDS
 (B)位置：79..1407(ix)特征：
 (A)名称/关键词：成熟-肽(mat-peptide)
 (B)位置：130..1407(ix)特征：
 (A)名称/关键词：信号-肽(sig-peptide)
 (B)位置：79..129(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：GGATCCGAAT TCGCCCCCAC ATTCGTTCCA TCTTAGCAGC CGTCCGCGCC CAGGTCTTCG         60ATAACCCCCC GCGTGACT ATG GCC TTC TCA ATC TTG GCC TCG CTG CTC TTC          111
                Met Ala Phe Ser Ile Leu Ala Ser Leu Leu Phe
                -17     -15                 -10GTG TGT TAT GCA TAC GCC AGG GCT GTG CCC CGT GCA CAT ATC CCG CTC          159Val Cys Tyr Ala Tyr Ala Arg Ala Val Pro Arg Ala His Ile Pro Leu
 -5                   1               5                  10CGC GAC ACC TCC GCG TGT CTA GAT GTA ACA CGC GAT GTG CAG CAG AGC          207Arg Asp Thr Ser Ala Cys Leu Asp Val Thr Arg Asp Val Gln Gln Ser
             15                  20                  25TGG TCC ATG TAC TCT CCC TAT TTC CCG GCA GCA ACT TAT GTG GCT CCG          255Trp Ser Met Tyr Ser Pro Tyr Phe Pro Ala Ala Thr Tyr Val Ala Pro
         30                  35                  40CCC GCG AGT TGC CAG ATC AAT CAG GTC CAC ATC ATC CAA CGT CAT GGT          303Pro Ala Ser Cys Gln Ile Asn Gln Val His Ile Ile Gln Arg His Gly
     45                  50                  55GCA CGC TTT CCC ACG TCT GGC GCA GCA AAG CGC ATC CAG ACA GCA GTA          351Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Ala Lys Arg Ile Gln Thr Ala Val
 60                  65                  70GCG AAG CTG AAG GCC GCG TCC AAC TAC ACC GAT CCC CTG CTC GCG TTC          399Ala Lys Leu Lys Ala Ala Ser Asn Tyr Thr Asp Pro Leu Leu Ala Phe75                  80                  85                  90GTT ACG AAC TAC ACC TAC AGC TTA GGT CAG GAC AGC CTC GTT GAA CTC          447Val Thr Asn Tyr Thr Tyr Ser Leu Gly Gln Asp Ser Leu Val Glu Leu
             95                 100                 105GGT GCG ACT CAG TCC TCC GAA GCG GGC CAG GAG GCA TTC ACG CGG TAC          495Gly Ala Thr Gln Ser Ser Glu Ala Gly Gln Glu Ala Phe Thr Arg Tyr
        110                 115                 120TCA TCC CTC GTG AGC GCG GAC GAG CTT CCC TTC GTT CGG GCG TCG GGC          543Ser Ser Leu Val Ser Ala Asp Glu Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly
    125                 130                 135TCA GAT CGC GTC GTT GCG ACT GCC AAC AAC TGG ACT GCA GGT TTC GCG        591Ser Asp Arg Val Val Ala Thr Ala Asn Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala
140                 145                 150CTT GCG AGC TCA AAC AGC ATC ACG CCC GTG CTC TCA GTC ATC ATT TCC        639Leu Ala Ser Ser Asn Ser Ile Thr Pro Val Leu Ser Val Ile Ile Ser155                 160                 165                 170GAA GCG GGC AAT GAC ACC CTC GAC GAC AAC ATG TGC CCC GCT GCA GGC        687Glu Ala Gly Asn Asp Thr Leu Asp Asp Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly
            175                 180                 185GAT TCG GAT CCC CAG GTC AAT CAA TGG CTC GCG CAG TTC GCA CCG CCG        735Asp Ser Asp Pro Gln Val Asn Gln Trp Leu Ala Gln Phe Ala Pro Pro
        190                 195                 200ATG ACT GCT CGC CTC AAC GCA GGC GCG CCC GGC GCG AAC CTC ACG GAC        783Met Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gly Ala Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp
    205                 210                 215ACG GAC ACC TAC AAC CTG CTC ACG CTA TGC CCG TTC GAG ACT GTA GCC        831Thr Asp Thr Tyr Asn Leu Leu Thr Leu Cys Pro Phe Glu Thr Val Ala
220                 225                 230ACC GAG CGG CGT AGT GAA TTC TGC GAC ATC TAC GAG GAG CTG CAG GCG        879Thr Glu Arg Arg Ser Glu Phe Cys Asp Ile Tyr Glu Glu Leu Gln Ala235                 240                 245                 250GAA GAC GCC TTC GCG TAC AAT GCC GAT CTC GAC AAG TTC TAC GGC ACT        927Glu Asp Ala Phe Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr
            255                 260                 265GGA TAC GGC CAG CCC CTC GGA CCC GTG CAA GGC GTC GGG TAC ATC AAC        975Gly Tyr Gly Gln Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn
        270                 275                 280GAG CTC ATC GCG CGC CTC ACC GCG CAG AAC GTG TCC GAC CAG ACG CAG       1023Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Ala Gln Asn Val Ser Asp His Thr Gln
    285                 290                 295ACG AAC AGC ACA CTC GAC TCC TCG CCC GAG ACG TTC CCG CTG AAC CGG       1071Thr Asn Ser Thr Leu Asp Ser Ser Pro Glu Thr Phe Pro Leu Asn Arg
300                 305                 310ACG CTC TAC GCG GAC TTC TCG CAC GAC AAC GAG ATG GTC GCG ATC TTC       1119Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gln Met Val Ala Ile Phe315                 320                 325                 330TCG GCC ATG GGT CTC TTC AAC CAG TCC GCG CCG CTC GAC CCG ACG ACG       1167Ser Ala Met Gly Leu Phe Asn Gln Ser Ala Pro Leu Asp Pro Thr Thr
            335                 340                 345CCC GAC CCC GCG CGC ACG TTC CTC GTC AAG AAG ATC GTG CCG TTC TCC       1215Pro Asp Pro Ala Arg Thr Phe Leu Val Lys Lys Ile Val Pro Phe Ser
        350                 355                 360GCG CGC ATG GTC GTC GAG CGC CTC GAC TGC GGC GGT GCG CAG AGC GTG       1263Ala Arg Met Val Val Glu Arg Leu Asp Cys Gly Gly Ala Gln Ser Val
    365                 370                 375CGC CTG CTC GTG AAC GAC GCA GTG CAG CCG CTG GCG TTC TGC GGG GCG       1311Arg Leu Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu Ala Phe Cys Gly Ala
380                 385                 390GAC ACG AGC GGG GTG TGC ACG CTG GAC GCG TTT GTC GAG AGC CAG GCG       1359Asp Thr Ser Gly Val Cys Thr Leu Asp Ala Phe Val Glu Ser Gln Ala395                 400                 405                 410TAC GCG CGG AAC GAT GGC GAG GGC GAC TTC GAG AAG TGC TTC GCG ACA       1407Tyr Ala Arg Asn Asp Gly Glu Gly Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr
            415                 420                 425TAGTTCCAGG TGTAGATACC CGGGGAAGAT GTACTCTCTA GACACCTCGC ATGTACTTAT     1467CGATTAGAAA GAGACCCTGG CTGCTCTGCC CTCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTCC     1527TGCGGCCGC                                                             1536(2)序列号30的信息：(i)序列特征：
(A)长度：443个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Met Ala Phe Ser Ile Leu Ala Ser Leu Leu Phe Val Cys Tyr Ala Tyr-17     -15                 -10                  -5Ala Arg Ala Val Pro Arg Ala His Ile Pro Leu Arg Asp Thr Ser Ala
  1               5                  10                  15Cys Leu Asp Val Thr Arg Asp Val Gln Gln Ser Trp Ser Met Tyr Ser
             20                  25                  30Pro Tyr Phe Pro Ala Ala Thr Tyr Val Ala Pro Pro Ala Ser Cys Gln
         35                  40                  45Ile Asn Gln Val His Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr
     50                  55                  60Ser Gly Ala Ala Lys Arg Ile Gln Thr Ala Val Ala Lys Leu Lys Ala
 65                  70                  75Ala Ser Asn Tyr Thr Asp Pro Leu Leu Ala Phe Val Thr Asn Tyr Thr80                  85                  90                  95Tyr Ser Leu Gly Gln Asp Ser Leu Val Glu Leu Gly Ala Thr Gln Ser
            100                 105                 110Ser Glu Ala Gly Gln Glu Ala Phe Thr Arg Tyr Ser Ser Leu Val Ser
        115                 120                 125Ala Asp Glu Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly Ser Asp Arg Val Val
    130                 135                 140Ala Thr Ala Asn Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala Leu Ala Ser Ser Asn
145                 150                 155Ser Ile Thr Pro Val Leu Ser Val Ile Ile Ser Glu Ala Gly Asn Asp160                 165                 170                 175Thr Leu Asp Asp Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly Asp Ser Asp Pro Gln
            180                 185                 190Val Asn Gln Trp Leu Ala Gln Phe Ala Pro Pro Met Thr Ala Arg Leu
        195                 200                 205Asn Ala Gly Ala Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Thr Asp Thr Tyr Asn
    210                 215                 220Leu Leu Thr Leu Cys Pro Phe Glu Thr Val Ala Thr Glu Arg Arg Ser
225                 230                 235Glu Phe Cys Asp Ile Tyr Glu Glu Leu Gln Ala Glu Asp Ala Phe Ala240                 245                 250                 255Tyr Asn Ala Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro
            260                 265                 270Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Ile Ala Arg
        275                 280                 285Leu Thr Ala Gln Asn Val Ser Asp His Thr Gln Thr Asn Ser Thr Leu
    290                 295                 300Asp Ser Ser Pro Glu Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Leu Tyr Ala Asp
305                 310                 315Phe Ser His Asp Asn Gln Met Val Ala Ile Phe Ser Ala Met Gly Leu320                 325                 330                 335Phe Asn Gln Ser Ala Pro Leu Asp Pro Thr Thr Pro Asp Pro Ala Arg
            340                 345                 350Thr Phe Leu Val Lys Lys Ile Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Val Val
        355                 360                 365Glu Arg Leu Asp Cys Gly Gly Ala Gln Ser Val Arg Leu Leu Val Asn
    370                 375                 380Asp Ala Val Gln Pro Leu Ala Phe Cys Gly Ala Asp Thr Ser Gly Val
385                 390                 395Cys Thr Leu Asp Ala Phe Val Glu Ser Gln Ala Tyr Ala Arg Asn Asp400                 405                 410                 415Gly Glu Gly Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr
            420                 425(2)序列号31的信息：(i)序列特征：
(A)长度：276碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(vi)来源：
(A)微生物：Schizophyllum sp.
(B)菌株：CBS 443.97(ix)特征：
(A)名称/关键词：混杂(misc-)特征
(B)位置：1..276
(D)其它信息：/产物＝“由SEQ ID NOs 15和17产生的PCR片段”(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：TCTGCCGCAT CTGACGGTGT CTATAACCCC GTCCTCAACC TGATTATATC AGAAGAGCTT  60AACGACACCC TCGATGATGC GATGTGCCCG AACGTCGGCG AATCGGACGC CCAAACGGAC 120GAATGGACGT CTATTTACGC AGCGCCCATC GCTGAGCGTC TGAACAACAA CGCCGTGGGC 180GCTAACCTGA CCACCACGAA CGTTTACAAC CTCATGTCTT TATGCCCCTT CGACACGCTT 240GCGAAGGAGA CGCCGAGCCC CTTCTGCGAT CTCTTT                           276(2)序列号32的信息：(i)序列特征：
(A)长度：92个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(vi)来源：
(A)微生物：Schizophyllum sp.
(B)菌株：CBS 443.97(ix)特征：
(A)名称/关键词：区域
(B)位置：1..92
(D)其它信息：/注＝“SEQ ID NO：31的推定的氨基酸序列”Ser Ala Ala Ser Asp Gly Val Tyr Asn Pro Val Leu Asn Leu Ile Ile1               5                   10                  15Ser Glu Glu Leu Asn Asp Thr Leu Asp Asp Ala Met Cys Pro Asn Val
        20                  25                  30Gly Glu Ser Asp Ala Gln Thr Asp Glu Trp Thr Ser Ile Tyr Ala Ala
    35                  40                  45Pro Ile Ala Glu Arg Leu Asn Asn Asn Ala Val Gly Ala Asn Leu Thr
50                  55                  60Thr Thr Asn Val Tyr Asn Leu Met Ser Leu Cys Pro Phe Asp Thr Leu65                  70                  75                  80Ala Lys Glu Thr Pro Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe
            85                  90
                        关于微生物保藏的说明书
                           (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第24页，第31-33行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：真菌菌种保藏中心(CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES)
保藏单位地址(包括邮编和国家)Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰
保藏日  1996年12月4日   保藏号Peniopora lycii CBS No.686.96
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
            Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                   关于微生物保藏的说明书
                     (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第24页，第35-37行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：真菌菌种保藏中心(CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES)
保藏单位地址(包括邮编和国家)Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰
保藏日  1996年12月4日 保藏号 平田头菇(Agrocybe pediades)CBS No.900.96
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
            Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                  关于微生物保藏的说明书
                     (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第1-3行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：真菌菌种保藏中心(CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES)
保藏单位地址(包括邮编和国家)Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰
保藏日  1997年11月28日 保藏号Paxillus involtus CBS No.100231
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
             Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                    关于微生物保藏的说明书
                       (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第5-8行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：真菌菌种保藏中心(CENTRAALBUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES)
保藏单位地址(包括邮编和国家)Oosterstraat 1，Postbus 273，NL-3740 AG Baarn，荷兰
保藏日  1997年11月28日 保藏号绒毛栓菌(Trametes pubescens)CBS No.686.96
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                     关于微生物保藏的说明书
                        (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第20-23行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：德意志微生物保藏中心DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
保藏单位地址(包括邮编和国家)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweiy，德国
保藏日  1996年12月2日 编号  大肠杆菌DSM No.11312
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
              Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                    关于微生物保藏的说明书
                       (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第24-26行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：德意志微生物保藏中心DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
保藏单位地址(包括邮编和国家)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweiy，德国
保藏日  1996年12月2日 编号  大肠杆菌DSMNo.11313
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                      关于微生物保藏的说明书
                          (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第28-30行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：德意志微生物保藏中心DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
保藏单位地址(包括邮编和国家)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweiy，德国
保藏日  1996年11月12日 编号  大肠杆菌DSM No.11842
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                     关于微生物保藏的说明书
                        (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第32-34行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：德意志微生物保藏中心DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
保藏单位地址(包括邮编和国家)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweiy，德国
保藏日  1996年11月12日 编号  大肠杆菌DSM No.11843
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)
                         关于微生物保藏的说明书
                             (PCT第13条附则)
A.下面的说明涉及第25页，第36-38行的描述
B.保藏证明  进一步的保藏信息见于附页
保藏机构名称：德意志微生物保藏中心DEUTSCHE SAMMLUNG VONMIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH
保藏单位地址(包括邮编和国家)Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweiy，德国
保藏日  1996年11月12日 编号  大肠杆菌DSM No.11844
C.附加说明书(没有则留空)本信息续于附页
只有在所涉及的欧洲专利的授权被公开之后，或者如果适用，如果本申请被驳回，撤回或视为撤回时，在申请日起的20年内，本保藏的微生物只能被提供给一个由要求本样品的人所指定的一个独立的专家(参考EPC第28(4)条)。而且涉及到澳大利亚时，专家的选择也是类似要求的，参见澳大利亚法令1991第71号3.25的规定。另外，对加拿大我们要求仅由委员会指定的独立专家才能被授予权利得到所保藏的微生物样品。
D.关于指定国家的说明书(如果说明并不对所有指定国家)
E.单独的配套说明(没有则留成空白)
下面所列的说明以后将向国际局提交(指定了说明的基本特征如“保藏号”)
仅限受理机构使用本页与国际申请一起收致 仅限国际局使用本页由国际局于……收到
授权官员 授权官员
Form PCT/RO/134表格(1992年7月)

Claims (43)

1.分离的多肽，其表现出肌醇六磷酸酶活性并衍生自担子菌类群。
2.分离的多肽，其表现出肌醇六磷酸酶活性并包括至少一个下列氨基酸序列：
P-[Y/F]-[F/Y]-P-X-X-X-Y-X-X-P-P
                                            (SEQ ID NO：1)
Q-V-[N/H]-[I-L]-I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A
                                            (SEQ ID NO：2)
I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R
                                            (SEQ ID NO：3)
R-V-V-[D/A]-[S/T]-[A/S]-[T/N]-N-W-T-[A/E]-G-F
                                            (SEQ ID NO：4)
N-W-T-[A/E]-G-F-X-X-A-S
                                            (SEQ ID NO：5)
G-F-X-X-A-S-X-X-X-X-X-P
                                            (SEQ ID NO：6)
P-[N/D]-[P/E]-X-R-[T/L]-[W/F]-X-X-[S/K]-X-X-[V/T]-P-F-S
                                            (SEQ ID NO：7)
D-[Q/A]-[V/L]-Q-P-L-X-F-C-G-[G/A]
                                            (SEQ ID NO：8)
F-V-E-S-Q-X-[Y/F]-A-R-X-X-G-X-G-D-F-[E/A]-K-C
                                            (SEQ ID NO：9)
N-W-T-[A/E]-G-F
                                            (SEQ ID NO：10)
D-K-[F/Y]-Y-G-T
                                            (SEQ ID NO：11)
D-L-D-K-[F/Y]-Y-G
                                            (SEQ ID NO：12)
G-D-F-[A/E]-K
                                            (SEQ ID NO：13)
Q-V-[N/H]-[I/L]-I-Q
                                             (SEQ ID NO：14)
其中“X”代表任何氨基酸。
3.根据权利要求2的多肽，包括下列氨基酸序列中的至少一个，参考图7的序列对比，并使用相应于phyA_P_lycii的编号：
(SEQ ID NO：1)从位置46到57
(SEQ ID NO：2)从位置64到80
(SEQ ID NO：3)从位置68到83
(SEQ ID NO：4)从位置155到167
(SEQ ID NO：5)从位置162到171
(SEQ ID NO：6)从位置166到177
(SEQ ID NO：7)从位置358到373
(SEQ ID NO：8)从位置395到405
(SEQ ID NO：9)从位置415到433
(SEQ ID NO：10)从位置162到167
(SEQ ID NO：11)从位置273到278
(SEQ ID NO：12)从位置271到277
(SEQ ID NO：13)从位置428到432
(SEQ TD NO：14)从位置64到69
4.根据权利要求3的多肽，包括下列氨基酸序列对中的至少一个：
(SEQ ID NO：10)和(SEQ ID NO：12)
(SEQ ID NO：10)和(SEQ ID NO：13)
(SEQ ID NO：14)和(SEQ ID NO：10)
(SEQ ID NO：14)和(SEQ ID NO：12)
(SEQ ID NO：14)和(SEQ ID NO：13)
(SEQ ID NO：11)和(SEQ ID NO：13)
5.根据权利要求1-4任一项的多肽，包括满足下列条件中的一个或多个的氨基酸序列，参考图7的序列对比并使用相应于phyA_P_lycii的编号：
(a)有P46和P57之间的10个氨基酸残基；
(b)有F167和P177之间的9个氨基酸残基；
(c)有P177和N188之间的10个氨基酸残基；
(d)有C196和D203之间的6个氨基酸残基；
(e)有L353和P371之间的17个氨基酸残基。
6.表现肌醇六磷酸酶活性和由一个DNA序列编码的分离的多肽，该DNA序列在中到高度严紧条件下与用任何适当的特异性引物所得的PCR反应产物杂交，其中引物衍生自图6的序列对比。
7.根据权利要求6的多肽，其中引物对由一个有义引物和反义引物组成，这些引物选自：
5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′
                                         (SEQ ID NO：15)
作为有义引物；
5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′
                                         (SEQ ID NO：16)
作为有义引物；
5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′
                                         (SEQ ID NO：17)
作为反义引物；
5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′
                                         (SEQ ID NO：18)
作为反义引物；
5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′
                                         (SEQ ID NO：19)
作为有义引物；
5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′
                                         (SEQ ID NO：20)
作为反义引物，
其中N代表A，C，G，T中的任一个；
R代表A和G中任何一个；
Y代表C和T中任何一个；
M代表A和C中任何一个；以及
W代表A和T中任何一个；
8.根据权利要求6-7中任何一个的多肽，其中引物对选自包括下列配对：
(SEQ ID NO：15)和(SEQ ID NO：17)
(SEQ ID NO：15)和(SEQ ID NO：18)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：20)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：17)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：18)
(SEQ ID NO：16)和(SEQ ID NO：18)
9.表现肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其为真菌6-肌醇六磷酸酶。
10.根据权利要求1-8中任一项的多肽，其为(3-6)-肌醇六磷酸酶。
11.分离的多肽，其表现出肌醇六磷酸酶活性并包括SEQ ID NO 22的氨基酸序列或与此序列至少有50％同源性的氨基酸。
12.分离的多肽，其表现出肌醇六磷酸酶活性并包括SEQ ID NO.22的从氨基酸no.25、27、28或31到453的氨基酸序列或与这些序列中任一个至少有50％同源性的氨基酸序列。
13.表现出肌醇六磷酸酶活性并由编码肌醇六磷酸酶的部分所编码的分离的多肽，这些编码部分为
i)SEQ ID NO 21，或
ii)克隆到存在于大肠杆菌DSM 11313中的质粒pYES 2.0中的DNA序列，或
其与所说的多肽至少有50％同源性的类似物或衍生物。
14.表现出肌醇六磷酸酶活性的并包括SEQ ID NO 24的氨基酸序列或与该序列有至少50％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
15.表现出肌醇六磷酸酶活性的并包括SEQ ID NO 24的氨基酸号31到439的氨基酸序列或与此序列至少有50％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
16.表现出肌醇六磷酸酶活性的并由编码肌醇六磷酸酶的部分所编码的分离的多肽，这些编码部分为
i) SEQ ID NO 23，或
ii)克隆到存在于大肠杆菌DSM 11312中的质粒pYES 2.0中的DNA序列，或
其与所说的多肽至少有50％同源性的类似物或衍生物。
17.表现出肌醇六磷酸酶活性的并包括SEQ ID NO 26氨基酸序列或与该序列至少有50％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
18.表现出肌醇六磷酸酶活性的并由编码肌醇六磷酸酶的部分所编码的分离的多肽，这些编码部分为
i)SEQ ID NO 25，或
ii)克隆到存在于大肠杆菌11842中的质粒pYES 2.0中的DNA序列，或
其与所说的多肽至少有50％同源性的类似物或衍生物。
19.表现出肌醇六磷酸酶活性并包括SEQ ID NO 28的氨基酸序列或与此序列至少有50％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
20.表现出肌醇六磷酸酶活性并由编码肌醇六磷酸酶的部分所编码的分离的多肽，这些编码部分为
i) SEQ ID NO 27，或
ii)克隆到存在于大肠杆菌DSM11843中的质粒pYES 2.0中的DNA序列，或者
其与所说的多肽有至少50％同源性的类似物或衍生物。
21.表现出肌醇六磷酸酶活性并包括SEQ ID NO 30的氨基酸序列或与此序列至少有50％同源性的氨基酸序列的分离的多肽。
22.表现出肌醇六磷酸酶活性并由编码肌醇六磷酸酶的部分所编码的多肽，这些编码部分为
i) SEQ ID NO 29，或
ii)克隆到存在于大肠杆菌DSM11844中的质粒pYES 2.0中的DNA序列，或
其与所说的多肽有至少50％同源性的类似物或衍生物
23.编码根据权利要求1-22中任一项的多肽的DNA分子。
24.编码表现出肌醇六磷酸酶活性的多肽并含有下列DNA序列中至少一个的DNA分子：
5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′
                                        (SEQ ID NO：15)
5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′
                                        (SEQ ID NO：16)
5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′
                                          (SEQ ID NO：17)
5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′
                                          (SEQ ID NO：18)
5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′
                                          (SEQ ID NO：19)
5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′
                                          (SEQ ID NO：20)
其中N代表A，C，G，T中的任一个；
R代表A和G中的任一个；
Y代表C和T中的任一个；
M代表A和C中的任一个；以及
W代表A和T中的任一个。
25.编码表现出肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA分子，其具有选自下列的DNA序列
(a)SEQ ID NOs：21、23、25、27或29中任一个的编码肌醇六磷酸酶的部分；
(b)克隆到存在于大肠杆菌DSM 11313、11312、11842、11843或11844任一个中的质粒pYES 2.0中的编码肌醇六磷酸酶的部分；
(c)(a)或(b)中所确定的DNA序列的类似物，其与所说DNA序列至少有55％同源性；
(d)能与(a)或(b)的序列在低严紧条件下杂交的DNA序列；
(e)由于遗传密码的简并性而不与(a)或(b)的序列杂交，但编码包括SEQ ID NOs.22、24、26、28或30中任一所示的氨基酸序列的多肽或其片段的DNA序列。
26.编码表现肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA分子，该DNA分子在中度/高度严紧条件下可与使用任何衍生自图6的序列对比的合适的特定引物对或权利要求7或8中的引物对所得的PCR反应产物杂交。
27.适用于PCR反应并衍生自图6的序列对比的特定引物。
28.根据权利要求27的引物，其选自：
5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′
                                         (SEQ ID NO：15)
5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′
                                         (SEQ ID NO：16)
5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′
                                         (SEQ ID NO：17)
5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′
                                         (SEQ ID NO：18)
5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′
                                         (SEQ ID NO：19)
5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′
                                         (SEQ ID NO：20)
其中N代表A，C，G，T中任一个；
R代表A和G中任一个；
Y代表C和T中任一个；
M代表A和C中的任一个；以及
W代表A和T中任一个。
29.包括根据权利要求23-26中任一项的DNA分子的载体。
30.包括根据权利要求23-26中任一项的DNA分子或根据权利要求29的载体的宿主细胞。
31.鉴定产生肌醇六磷酸酶的细胞的方法，包括以下步骤：
i)选择细胞以提供模板；
ii)根据图6的序列对比选择适于PCR的特定引物对；
iii)用所说引物在该模板上进行PCR反应以得到衍生自所说模板的扩增的PCR片段；
iv)确证该PCR片段是特异性的；以及
v)鉴定提供该模板的细胞作为肌醇六磷酸酶产生者。
32.根据权利要求31的方法，其中的引物对由选自下列的一个有义引物和一个反义引物组成：
5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′
                                            (SEQ ID NO：15)
为有义引物；
5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′
                                          (SEQ ID NO：16)
为有义引物；
5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′
                                          (SEQ ID NO：17)
为反义引物；
5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′
                                          (SEQ ID NO：18)
为反义引物；
5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′
                                          (SEQ ID NO：19)
化为有义引物；
5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′
                                          (SEQ ID NO：20)
化为反义引物，
其中N代表A，C，G，T中任一个；
R代表A和G中的任一个；
Y代表C和T中的任一个；
M代表A和C中的任一个；以及
W代表A和T中的任一个。
33.根据权利要求32的方法，其中引物对选自下列配对：
(SEQ ID NO：15)和(SEQ ID NO：17)
(SEQ ID NO：15)和(SEQ ID NO：18)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：20)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：17)
(SEQ ID NO：19)和(SEQ ID NO：18)
(SEQ ID NO：16)和(SEQ ID NO：18)
34.制备表现肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，该方法包括下列步骤：
a)用权利要求31-33中任一项的方法鉴定产生肌醇六磷酸酶的细胞；或
b)实施步骤a)并从所说的产生肌醇六磷酸酶的细胞中克隆编码肌醇六磷酸酶的DNA分子并用所说的DNA分子转化宿主细胞；或
c)用根据权利要求31-33中任一项的方法所得的扩增的PCR片段作为杂交探针来分离编码肌醇六磷酸酶多肽的DNA分子，并用所说的DNA分子来转化宿主细胞；
以及
d)将上述a)、b)或c)所得的细胞在允许多肽产生的条件下培养并从培养肉汤中回收多肽。
35.制备表现肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，该方法包括将根据权利要求30的宿主细胞在允许多肽产生的条件下进行培养，并从培养肉汤中回收多肽。
36.包含权利要求1-22中任一项的至少一种多肽或根据权利要求33-34中任一项的可获得的至少一种多肽的饲料或食物。
37.制备根据权利要求36的饲料或食物的方法，其中将至少一种多肽加到食物或饲料组分中。
38.包含权利要求1-22中任一项的至少一种多肽或至少一种根据权利要求33-34中任一项可得的多肽的组合物。
39.根据权利要求38的适用于食品或饲料制品的组合物。
40.根据权利要求38-39中任一项的组合物，其作为动物饲料添加剂。
41.减少动物粪尿中肌醇六磷酸的水平的方法，包括用有效量的根据权利要求36的饲料或根据权利要求37的可得到的饲料对动物进行喂养。
42.权利要求1-22中任一项的多肽或根据权利要求34-35中任一项可获得的多肽或者权利要求38-39中任一项组合物  用于将三价磷从肌醇六磷酸酶底物中释放出来的用途。
43.根据权利要求1-22中任一项的多肽；或者根据权利要求34-35中任一项可获得的多肽；或者根据权利要求38-39中任一项的可获得的组合物用于改进食物或饲料的利用的用途。
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