JP3030331B1 - キシロ―スを生成しない改変キシラナ―ゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクタ―及び形質転換体 - Google Patents

Abstract

【要約】 【課題】 機能性食品素材、化粧品用保水材等の製造に
有用な、キシロースを生成しないキシラナーゼを提供す
ると共に、当該キシラナーゼをコードする遺伝子を提供
すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
する改変キシラナーゼの遺伝子、該改変キシラナーゼの
遺伝子を含むプラスミドおよび該プラスミドで形質転換
された大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３０１）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キシランに作用
し、キシランを加水分解した際に、分解産物としてキシ
ロースを生成しない改変キシラナーゼに関するものであ
る。すなわち、改変キシラナーゼ遺伝子、該遺伝子を含
むプラスミドベクターおよび形質転換体に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】キシラナーゼは、植物細胞壁中のヘミセ
ルロースの主要成分であるβ−１，４−Ｄ−キシランを
ランダムに分解する酵素であり、正式な名称はエンド−
１，４−β−キシラナーゼ（EC 3.2.1.8. ）である。本
酵素は、木材、稲ワラ等に含まれるキシランを分解する
作用を有していることから、広葉樹キシランからキシロ
オリゴ糖を生産する技術で活用されているほか、パルプ
の漂白に用いる塩素の消費量を減らすためのパルプ漂白
用酵素としても活用が検討されている。得られたキシロ
オリゴ糖は、機能性食品素材、化粧品用保水材として使
用されている。

【０００３】キシラナーゼがキシランに作用して生産さ
れるキシロオリゴ糖には、通常、キシロビオース（２
糖）、キシロトリオース（３糖）等のキシロオリゴ糖の
他に、単糖であるキシロースも含まれている。こうした
キシロオリゴ糖から単糖であるキシロースを除くことに
より、オリゴ糖としての特性が優れたものとすることが
できる。そのため、キシロースを生成しないように酵素
反応条件を工夫したり、生成したキシロースを分離除去
するなど、キシロースを含まないキシロオリゴ糖を調製
するために種々の手法が提案されている。

【０００４】キシラナーゼは、そのアミノ酸配列に基づ
き、糖加水分解酵素のファミリー１０と１１に分類され
ている。ファミリー１０と１１では酵素の分子構造が全
く異なり、酵素の性質も異なるることが知られている。
ファミリー１０のキシラナーゼは糖質分解酵素によく見
られるα−ヘリックスとβ−シートが交互に８回繰り返
される構造（Ｔｉｍバレルとも呼ばれる）である。ファ
ミリー１０のキシラナーゼが、キシランに作用した場
合、その分解産物としてキシロースをよく生成する。こ
れに対して、ファミリー１１のキシラナーゼは２つのβ
−シートと１つのα−へリックスで構成され、ゼリーロ
ール構造をとっている。ファミリー１１のキシラナーゼ
はキシランに作用した場合に、あまりキシロースを生成
しない。

【０００５】上記したように、キシランの分解に、ファ
ミリー１０のキシラナーゼを使用すると、キシロースと
キシロオリゴ糖が生成する。そのため、キシロオリゴ糖
の生産を目的とした際には、キシロースが生成すること
は、キシロースの分離除去操作が加わり、不利である。
また、オリゴ糖の収率も低下することが予想される。一
方、ファミリー１１のキシラナーゼをキシランに作用さ
せた場合、キシロースを生成し難いという特性がある
が、ファミリー１１の酵素の安定性は、ファミリー１０
の酵素と比べ、一般的に悪い。例えば、ストレプトマイ
セス・オリバセオビリディスＥ−８６の生産するファミ
リー１０と１１のキシラナーゼを比較すると、ファミリ
ー１０は６０℃程度まで安定であるのに対し、ファミリ
ー１１のの熱安定性は４０℃程度である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、機能
性食品素材、化粧品用保水材等の分野での利用が期待さ
れるキシロースを生成しないキシラナーゼを提供するこ
とである。また、別の目的は、当該キシラナーゼをコー
ドする遺伝子を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、キシロー
スを生成しないキシラナーゼを創出すべく鋭意研究を行
った結果、ストレプトマイセス属微生物とセルロモナス
属微生物由来のキシラナーゼ遺伝子をキメラ化し、本遺
伝子を大腸菌で発現させることにより、改変キシラナー
ゼを創出すると共に、この酵素の性質を解明し、本発明
を完成するに至った。

【０００８】請求項１記載の本発明は、配列表の配列番
号１記載の塩基配列を有する改変キシラナーゼの遺伝子
である。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の改変
キシラナーゼの遺伝子を含むプラスミドである。請求項
３記載の本発明は、請求項２記載のプラスミドで形質転
換された大腸菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３０１）である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明者らは、キシロースを生成せず、キシロオ
リゴ糖のみを生成する改変キシラナーゼを作出すべく、
キメラ酵素の構築を試みた。まず、親酵素としてストレ
プトマイセス・オリバセオビリディス（Streptomyces
olivaceoviridis)Ｅ−８６株の生産するキシラナーゼ
（以下、ＳＯという。）を選択し、もう一方の親酵素と
してセルロモナス・ヒミ（Cellulomonas fimi) のＣｅ
ｘと呼ばれるキシラナーゼ（以下、Ｃｅｘという。）を
用いた。これら２つの酵素は、いずれも糖加水分解酵素
のファミリー１０に属し、前者は活性ドメインとキシラ
ン結合ドメインと両者を繋ぐリンカー配列から構成され
ており、後者は活性ドメインとセルロース結合ドメイン
と両者を繋ぐリンカー配列から構成されている。キメラ
酵素の構築にあたり、両酵素の活性ドメインのみを用い
た。

【００１０】なお、Ｃｅｘの代わりに、ストレプトマイ
セス・ハルステディー（Streptomyces halstedii)のキ
シラナーゼを用いることができる。また、ＳＯの代わり
に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces l
ividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Strepto
myces coelicolar）、ストレプトマイセス・ビオラセオ
ルバー（Streptomyces violaceoruber)、ストレプトマ
イセス・サーモビオラセウス（Streptomyces thermovio
laceus)、アクチノマジュラ属（Actinomadura sp.）の
微生物のキシラナーゼを利用することができる。

【００１１】上記したように、本発明では、改変キシラ
ナーゼを構築するに際して、ストレプトマイセス・オリ
バセオビリディス Ｅ−８６株の生産するキシラナーゼ
（ＳＯ）の活性ドメイン（配列表の配列番号２に記載）
およびセルロモナス・ヒミ IFO 15513株の生産するキシ
ラナーゼ（Ｃｅｘ）の活性ドメイン（配列表の配列番号
５に記載）を用いている。ＳＯやＣｅｘをキシランに作
用させると、キシロースを生成する。キメラ酵素の作成
にあたり、ＳＯとＣｅｘの酵素遺伝子から、アミノ酸配
列を基にして、種々の領域で繋ぎ変えを行った。

【００１２】上記操作においては、プライマーとしてス
トレプトマイセス・オリバセオビリディス Ｅ−８６株
やセルロモナス・ヒミ IFO 15513株等の放線菌の遺伝子
をもとにデザインしたプライマーを用いるが、これらス
トレプトマイセス属やセルロモナス属の放線菌の遺伝子
は、一般にＧＣ含量が高い（約７０％）。そのため、二
次構造をとりやすく、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣ
Ｒ）では扱いにくい。そこで、これらの放線菌の遺伝子
に関するＰＣＲの操作性を改善するために、以下のよう
な既知の手法を採ることが望ましい。

【００１３】まず、ＰＣＲ用のプライマーをデザインす
るにあたり、遺伝子が二次構造を採らないようにするた
めの手段を採ることが好ましい。例えば、Ｇの代わりに
Ａを入れたプライマーを作成するなどの対策を講じるこ
とができる。

【００１４】また、ＧＣ含量が高いことから、ＤＮＡの
変性温度を高めに設定する必要があり、例えば通常の９
４℃では不十分であるので、９８℃程度に設定する。し
かし、変性温度を高くすると、通常のＤＮＡポリメラー
ゼでは、酵素機能が失活してしまうことから、耐熱性の
高いＤＮＡポリメラーゼを用いるべきである。耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしては、例えば市販のLA taq（TAKA
RA) がある。このLA taq（TAKARA) は、高温下での使用
が可能で、ＧＣリッチなＰＣＲに適するＤＮＡポリメラ
ーゼである。

【００１５】また、ＰＣＲプライマーの長さを長くする
ことも有効で、例えば２６ｂｐから３０ｂｐ程度とする
ことにより、ＰＣＲ反応のアニール温度を通常の５０℃
付近から伸張反応と同じ温度である７２℃まで上げるこ
とができる。その結果、アニールと伸張反応を同時に行
うことが可能である。すなわち、９８℃と７２℃の２段
階の温度変化でＰＣＲを行うことができ、ＤＮＡが二次
構造をとりにくくすることが可能である。

【００１６】ＳＯとＣｅｘの酵素遺伝子から、アミノ酸
配列に基づいて種々の領域で繋ぎ変えを行うにあたり、
本発明では、オーバーラッピングＰＣＲ法を採用した。
オーバーラッピングＰＣＲ法とは、遺伝子の任意の部位
でのつなぎ替えを可能とする技術であり、その内容は以
下の通りである。

【００１７】まず、ＳＯの活性ドメイン（配列表の配列
番号２に記載）を持つプラスミドをテンプレートとし
て、制限酵素分解部位を有するフォーワードプライマー
（配列表の配列番号３に記載）およびＣｅｘの活性ドメ
インの接合部分のＤＮＡ塩基配列の一部を取り入れたリ
バースプライマー（配列表の配列番号４に記載）を用い
たＰＣＲを行う。その結果、配列表の配列番号２のアミ
ノ酸番号１から２４４をコードする７４４ｂｐのＤＮＡ
フラグメントが増幅産物として得られた。

【００１８】また、Ｃｅｘの活性ドメイン（配列表の配
列番号５に記載）を持つプラスミドをテンプレートとし
て、ＳＯの接合部分のＤＮＡ塩基配列の一部を取り入れ
たフォーワードプライマー（配列表の配列番号６に記
載）と制限酵素分解部位を有するリバースプライマー
（配列表の配列番号７に記載）を用いて、ＰＣＲを行
う。その結果、配列表の配列番号５のアミノ酸番号２４
４から３５４をコードする３４９ｂｐのフラグメントを
得た。

【００１９】ここで、ＰＣＲの条件は、先述のLA taqの
如く耐熱性に優れたＤＮＡポリメラーゼを用いる他に、
アニール条件を６０℃−３０分前後とする必要がある。
また、通常のＰＣＲの場合、得られる増幅物の末端にＡ
（アデニン）が付加される。オーバーラッピングＰＣＲ
においては、これを避けるため、アニール条件を上記範
囲内とし、LA taqのプルーフリーディング活性を生かし
てＡを欠落させ、３’末端にＡの挿入を起こらなくする
よう工夫した。

【００２０】増幅した２つのフラグメント（７４４ｂｐ
フラグメントと３４９ｂｐフラグメント）を用いて、プ
ライマーを添加しないＰＣＲ反応を実施し、２つのフラ
グメントを接続し、キメラキシラナーゼ遺伝子を作成し
た。本ＰＣＲで得られたキメラキシラナーゼ遺伝子の量
は極めて僅かであった。

【００２１】そこで、以下に示すＰＣＲ反応を行うこと
により、プラスミドへのクローニングに必要な量の遺伝
子を得た。２つの接続したフラグメントを含むＰＣＲ溶
液をテンプレートとし、フォーワードプライマープライ
マー（配列表の配列番号３）とリバースプライマー（配
列表の配列番号７）を用いて、ＰＣＲを行い、キメラキ
シラナーゼ遺伝子の全長を増幅した。すなわち、本ＰＣ
Ｒにより１０７３ｂｐの明瞭なバンドが得られた。

【００２２】次いで、得られた１０７３ｂｐのバンドを
制限酵素分解した。これを、同じ制限酵素で分解してあ
るプラスミドｐＱＥ６０と接合し、プラスミドｐＱＥ６
０／ＯＣ−１４−１５を調製した。

【００２３】このプラスミドのＤＮＡ塩基配列を解読
し、解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせた結果、Ｄ
ＮＡ塩基配列（配列表の配列番号１に記載）が得られ
た。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ，
改変キシラナーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１
に記載）が認められたことから、改変キシラナーゼをコ
ードする遺伝子であることが判明した。すなわち、この
遺伝子が請求項１記載の本発明の改変キシラナーゼ遺伝
子である。

【００２４】請求項１記載の本発明の改変キシラナーゼ
遺伝子は、配列表の配列番号１に示すとおり、１０６５
塩基からなり、３５５個のアミノ酸配列に対応するもの
である。このような改変キシラナーゼ遺伝子について、
従来見出されている配列との相同性を確認したところ、
７２％以上の相同性を示すものはなかった。また、プラ
スミドｐＱＥ６０／ＯＣ−１４−１５は、上記請求項１
記載の本発明の改変キシラナーゼ遺伝子を有することが
明らかである。すなわち、これが請求項２記載の本発明
のプラスミドである。

【００２５】さらに、請求項２記載の本発明であるプラ
スミドｐＱＥ６０／ＯＣ−１４−１５を用いて、Sambro
ok，J.，Fritsch, E.F. and Maniatis, T.“Molecular
Cloning, A Laboratory Manual" 第２版、1.74章 Vo1.1
(1989）に記載された方法に従い、大腸菌に形質転換し
た。形質転換された大腸菌は、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１７３０１である。この形質転換された大腸菌が
請求項３記載の本発明の大腸菌である。

【００２６】請求項３記載の形質転換大腸菌を、常法に
より培養し、培養物から得た酵素を精製することによ
り、精製改変キシラナーゼを得ることができる。この精
製改変キシラナーゼは、後記実施例において示すよう
に、親酵素であるＳＯやＣｅｘと同等のレベルでキシラ
ンに作用するが、キシロースを生産することなくキシロ
オリゴ糖のみを効率よく生産することができる。

【００２７】本発明において、改変キシラナーゼを作成
するための素材として用いたストレプトマイセス・オリ
バセオビリディス Ｅ−８６株のファミリー１０に属す
るキシラナーゼ並びにセルロモナス・ヒミのＣｅｘと呼
ばれるファミリー１０に属するキシラナーゼは、いずれ
もキシランに作用させた場合には、キシロビオース、キ
シロトリオースの他にそれぞれ１４％と１２％のキシロ
ースを生成する。この事実と比較すると、本発明により
得られる改変キシラナーゼは、これらの親酵素にはない
キシロオリゴ糖を生産する特異的性質を有していること
が明らかである。この優れた特質を有する改変キシラナ
ーゼは、食品産業をはじめとする各分野で有用である。

【００２８】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ストレプトマイセス・オリバセオビリディス Ｅ−８６
株のファミリー１０に属するキシラナーゼの活性ドメイ
ン（配列表の配列番号２に記載）を持つプラスミドをテ
ンプレートとして、フォーワードプライマー（配列表の
配列番号３に記載；Nco I の切断部位を作るため５’側
にＣＣを付加。プライマーが二次構造をつくり難くする
ため１１番目をＧからＣ、２９番目をＣからＡへ変異を
入れた。）とリバースプライマー（配列表の配列番号４
に記載；５’側１０塩基はセルロモナス・ヒミのキシラ
ナーゼの配列。プライマーが二次構造をつくり難くする
ため５’側から１４番目をＧからＡへ、２６番目をＣか
らＴへ変異を入れた。）を用いて、配列表の配列番号２
のアミノ酸番号１から２４４をコードする７４４ｂｐの
ＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ
は、９８℃、５分間の前処理でＤＮＡを変性させた後、
LA taq(TAKARA)を加え、直ちに９８℃−１分，７２℃−
１分で２５サイクル行ったのち、さらに７２℃で１０分
間の伸長反応を行った。

【００２９】また、セルロモナス・ヒミ ＩＦＯ１５５
１３株のＣｅｘと呼ばれるファミリー１０に属するキシ
ラナーゼの活性ドメイン（配列表の配列番号５に記載）
を持つプラスミドをテンプレートとして、フォーワード
プライマー（配列表の配列番号６に記載；５’側の１０
塩基は、ストレプトマイセス・オリバセオビリディスＥ
−８６株のキシラナーゼの配列）とリバースプライマー
（配列表の配列番号７に記載；５’側にBam HIの切断配
列６塩基を付加。プライマーが二次構造を作り難くする
ため５’側１３番目をＣからＴへ変異を入れた。）を用
いて、配列表の配列番号５のアミノ酸番号２４４から３
５４をコードする３４９ｂｐのフラグメントをＰＣＲに
より増幅した。ＰＣＲは、９８℃，５分間の前処理でＤ
ＮＡを変性させた後、LA taq(TAKARA)を加え、直ちに９
８℃−１分，７２℃−１分で２５サイクル行ったのち、
さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。

【００３０】増幅した２つのフラグメント（７４４ｂｐ
フラグメントと３４９ｂｐフラグメント）を用いて、プ
ライマーを添加しないＰＣＲ反応を実施し、２つのフラ
グメントを接続し、キメラキシラナーゼ遺伝子を調製し
た。ＰＣＲは、LA taq(TAKARA)を用い、９８℃−１分，
６０℃−２５分，７２℃−５分を２０サイクル行った。
その結果、調製されたキメラキシラナーゼ遺伝子の量は
極く僅かであった。

【００３１】そこで、次のＰＣＲ反応により、多量にキ
メラキシラナーゼ遺伝子を得た。すなわち、２つの接続
したフラグメントを含むＰＣＲ溶液をテンプレートと
し、フォーワードプライマープライマー（配列表の配列
番号３）とリバースプライマー（配列表の配列番号７）
を用いて、ＰＣＲを行い、キメラキシラナーゼ遺伝子の
全長を増幅した。その結果、１０７３ｂｐの明瞭なバン
ドが得られた。ＰＣＲは、９８℃、５分間の前処理でＤ
ＮＡを変性させた後、LA taq(TAKARA)を加え、直ちに９
８℃−１分，７２℃−１分で２５サイクル行ったのち、
さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。

【００３２】得られた１０７３ｂｐのバンドを、制限酵
素Nco I とBam HIで分解した後、プラスミドｐＱＥ６０
を制限酵素Nco I とBam HIで分解した。次に、ＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて、先
の制限酵素切断ＤＮＡ断片と制限酵素切断プラスミドを
接合し、プラスミドｐＱＥ６０／ＯＣ−１４−１５を調
製した。

【００３３】次いで、ビッグダイ・ターミネーター・サ
イクルシークエンシング・キット（パーキンエルマー社
製）を用いて、そのＤＮＡ塩基配列を解読した。解読し
た塩基配列の情報をつなぎ合わせることによって、ＤＮ
Ａ塩基配列（配列表の配列番号１に記載）を得た。この
ＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ，改変キシ
ラナーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１に記載）
が認められたことから、改変キシラナーゼをコードする
遺伝子であることが判明した。

【００３４】さらに、このプラスミドｐＱＥ６０／ＯＣ
−１４−１５を用いて、Sambrook，J.，Fritsch, E．F.
and Maniatis, T.“Molecular Cloning, A Laboratory
Manual”第２版、1.74章 Vo1.1（1989）に記載された方
法に従い、大腸菌に形質転換した。形質転換された大腸
菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
おり、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７３０１であ
る。なお、プラスミドｐＱＥ６０／ＯＣ−１４−１５に
は改変キシラナーゼ遺伝子が含まれている。

【００３５】次に、この形質転換された大腸菌を１リッ
トルのＬＢ培地で３７℃で培養後、１ｍＭの濃度になる
ように発現誘導剤のＩＰＴＧを接種し、培養をさらに４
時間続けた。その後、菌体を遠心分離により集めた。集
めた菌体を５０ｍＬの５０ｍＭリン酸バッファーに懸濁
した後、超音波により破砕し、遠心分離して粗酵素液を
調製した。粗酵素液から、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐキレーティ
ングカラム（ファルマシア社製）を使用して、電気泳動
的に単一な精製改変キシラナーゼを得た。

【００３６】このようにして得た精製改変キシラナーゼ
の性質の検討を行った。その結果、至適ｐＨ、至適温
度、ｐＨ安定性、温度安定性においては、親酵素と大き
な違いは見られなかった。

【００３７】また、PNP(パラニトロフェニル)-Cellobio
side、PNP-Xylobioside に対する動力学定数（ミカエリ
ス定数Ｋｍおよびｋｃａｔ）を求めた。各基質に対する
結果を第１表、第２表に示す。

【００３８】

【表１】第１表〔PNP−セロビオシドに対する動力学定
数〕

【００３９】

【表２】第２表〔PNP−キシロビオシドに対する動力学
定数〕

【００４０】第１表および第２表より、以下のことが明
らかである。まず、精製改変キシラナーゼのＫｍは、PN
P-CellobiosideについてはＳＯよりも大幅に低く、Ｃｅ
ｘよりも若干高い値が示された。一方、PNP-Xylobiosid
eに対しては、親酵素の中間の値が示された。Ｋｍは、
酵素と基質との親和性を示すものであり、小さいほど親
和性が大きいことから、改変キシラナーゼは、いずれの
基質に対してもバランスのとれた親和性を示すことがわ
かる。

【００４１】また、ｋｃａｔの値は、PNP-Cellobioside
に対してはいずれの親酵素よりも高く、PNP-Xylobiosid
e に対しても親酵素ＳＯと比べてそれほど低下していな
かった。ｋｃａｔは、１分子の酵素が１秒間に分解可能
な基質の数を示す数値であることから、上記改変精製キ
シラナーゼのｋｃａｔの結果は、キメラ化によって酵素
の構造が歪んでおらず、酵素の機能としては親酵素と同
レベルであることを示すものである。

【００４２】さらに、ｋｃａｔ／Ｋｍは、いずれの基質
についても、両親酵素の中間の値をとっていた。ｋｃａ
ｔ／Ｋｍは、酵素の統合的な触媒能を示す値である。Ｓ
ＯおよびＣｅｘは、それぞれPNP-Cellobiosideのみ、PN
P-Xylobioside のみに対して高い触媒性を示すが、改変
精製キシラナーゼは、いずれの基質に対しても高い触媒
能を示すことが明らかである。

【００４３】この酵素を、０．５％の可溶性シラカバキ
シランに、５μｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ７．０、３０℃
にて２４時間作用させた。得られた酵素分解物をＨＰＥ
ＡＣ−ＰＡＤシステム（ダイオネックス）を用いて流速
１ｍＬ／分で０．１Ｍ ＮａＯＨで５分間流した後、０
〜４００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線濃度勾配（３０分
間）で溶出することにより分析した。その結果、分解産
物としてはキシロビオース、キシロトリオース、側鎖の
あるキシロオリゴ糖が確認され、それぞれの量比は７
０、１１、１９％であった。キシロースに相当するピー
クは検出されなかった。

【００４４】なお、本発明のキメラ酵素を作成するため
の素材として用いたストレプトマイセス・オリバセオビ
リディス Ｅ−８６株のファミリー１０に属するキシラ
ナーゼおよびセルロモナス・ヒミのＣｅｘと呼ばれるフ
ァミリー１０に属するキシラナーゼは、いずれもキシラ
ンに作用させた際には、キシロビオース、キシロトリオ
ースの他にそれぞれ１４％、１２％キシロースを生成す
る。

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、改変キシラナーゼの遺
伝子およびその大量発現系が提供される。これらを発現
させて得られる改変キシラナーゼは、キシランに作用さ
せた場合に、キシロースを全く生成せず、キシロオリゴ
糖のみを効率よく生産できることから、機能性食品素
材、化粧品用保水材等の製造などに利用でき、食品産業
をはじめとする各種の分野において有用である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> Gene of xylanase <130> P111030K <160> 7 <210> 1 <211> 1065 <212> DNA <213> Streptomyces olivaceoviridis, Cellulomonas fimi <400> 1 atg ggc tcg tac gcc ctt ccc aga tcc ggt atc cgc cgg aag atc cac 48 Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Ile Arg Arg Lys Ile His 1 5 10 15 ggc ctg ctg ctg acg ctg gtc gtc ggc gtc ctc ggc acg gtc acc gca 96 Gly Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Gly Val Leu Gly Thr Val Thr Ala 20 25 30 ctg gtg gcg ccg ccg acc gca cac gcc gcc gag agc acg ctc ggc gcc 144 Leu Val Ala Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala 35 40 45 gcg gcg gca cag agc ggc cgc tac ttc ggc acc gcc atc gcc tcg ggc 192 Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly 50 55 60 aag ctg ggc gac tcg gcg tac acg acg atc gcg agc cgt gag ttc aac 240 Lys Leu Gly Asp Ser Ala Tyr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Glu Phe Asn 65 70 75 80 atg gtg acg gcc gag aac gag atg aag atc gac gcc acc gaa ccg cag 288 Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln 85 90 95 cgg ggc cag ttc aac ttc tcc gcc ggt gac cgc gtc tac aac tgg gcg 336 Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala 100 105 110 gtg cag aac ggc aag cag gtg cgc ggc cac acc ctg gcc tgg cac tcc 384 Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser 115 120 125 cag cag ccc ggc tgg atg cag agc ctc agc ggc agc aca ctg cgc cag 432 Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Thr Leu Arg Gln 130 135 140 gcg atg atc gac cac atc aac ggc gtg atg ggc cac tac aag ggc aag 480 Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Val Met Gly His Tyr Lys Gly Lys 145 150 155 160 atc gcc cag tgg gac gtc gtg aac gag gcc ttc tcg gac gac ggt tcg 528 Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ser Asp Asp Gly Ser 165 170 175 ggc ggc cgc cgg gat tcc aac ctg cag cgc acc ggc aac gac tgg atc 576 Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile 180 185 190 gag gtc gcc ttc cgc acc gcg cgc gcc gcc gac ccg gcg gcc aag ctc 624 Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys Leu 195 200 205 tgc tac aac gac tac aac atc gag aac tgg acc tgg gcg aag acc cag 672 Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln 210 215 220 ggc gtg tac aac atg gtc cgc gac ttc aag cag cgc ggc gtg cca atc 720 Gly Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile 225 230 235 240 gac tgc gtc ggc ttc cag tcg cac ctc atc gtc ggc cag gtg ccg ggc 768 Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Leu Ile Val Gly Gln Val Pro Gly 245 250 255 gac ttc cgg cag aac ctg cag cgg ttc gcg gac ctg ggc gtg gac gtg 816 Asp Phe Arg Gln Asn Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly Val Asp Val 260 265 270 cgc atc acc gag ctc gac atc cgc atg cgg acg ccc tcc gac gcg acc 864 Arg Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Arg Thr Pro Ser Asp Ala Thr 275 280 285 aag ctc gcg acc cag gcg gcc gac tac aag aag gtc gtg cag gcc tgc 912 Lys Leu Ala Thr Gln Ala Ala Asp Tyr Lys Lys Val Val Gln Ala Cys 290 295 300 atg cag gtg acc cgc tgc cag ggc gtg acc gtc tgg ggc atc acc gac 960 Met Gln Val Thr Arg Cys Gln Gly Val Thr Val Trp Gly Ile Thr Asp 305 310 315 320 aag tac tcg tgg gtg ccg gac gtc ttc ccg ggc gag ggg gcc gcg ctg 1008 Lys Tyr Ser Trp Val Pro Asp Val Phe Pro Gly Glu Gly Ala Ala Leu 325 330 335 gtg tgg gac gcg agc tac gcc aag aag ccg gcc tac gcc gcc gtg atg 1056 Val Trp Asp Ala Ser Tyr Ala Lys Lys Pro Ala Tyr Ala Ala Val Met 340 345 350 gag gcc ttc 1065 Glu Ala Phe 355 <210> 2 <211> 1032 <212> DNA <213> Streptomyces olivaceoviridis <400> 2 atg ggc tcg tac gcc ctt ccc aga tcc ggt atc cgc cgg aag atc cac 48 Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Ile Arg Arg Lys Ile His 1 5 10 15 ggc ctg ctg ctg acg ctg gtc gtc ggc gtc ctc ggc acg gtc acc gca 96 Gly Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Gly Val Leu Gly Thr Val Thr Ala 20 25 30 ctg gtg gcg ccg ccg acc gca cac gcc gcc gag agc acg ctc ggc gcc 144 Leu Val Ala Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala 35 40 45 gcg gcg gca cag agc ggc cgc tac ttc ggc acc gcc atc gcc tcg ggc 192 Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly 50 55 60 aag ctg ggc gac tcg gcg tac acg acg atc gcg agc cgt gag ttc aac 240 Lys Leu Gly Asp Ser Ala Tyr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Glu Phe Asn 65 70 75 80 atg gtg acg gcc gag aac gag atg aag atc gac gcc acc gaa ccg cag 288 Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln 85 90 95 cgg ggc cag ttc aac ttc tcc gcc ggt gac cgc gtc tac aac tgg gcg 336 Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala 100 105 110 gtg cag aac ggc aag cag gtg cgc ggc cac acc ctg gcc tgg cac tcc 384 Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser 115 120 125 cag cag ccc ggc tgg atg cag agc ctc agc ggc agc aca ctg cgc cag 432 Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Thr Leu Arg Gln 130 135 140 gcg atg atc gac cac atc aac ggc gtg atg ggc cac tac aag ggc aag 480 Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Val Met Gly His Tyr Lys Gly Lys 145 150 155 160 atc gcc cag tgg gac gtc gtg aac gag gcc ttc tcg gac gac ggt tcg 528 Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ser Asp Asp Gly Ser 165 170 175 ggc ggc cgc cgg gat tcc aac ctg cag cgc acc ggc aac gac tgg atc 576 Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile 180 185 190 gag gtc gcc ttc cgc acc gcg cgc gcc gcc gac ccg gcg gcc aag ctc 624 Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys Leu 195 200 205 tgc tac aac gac tac aac atc gag aac tgg acc tgg gcg aag acc cag 672 Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln 210 215 220 ggc gtg tac aac atg gtc cgc gac ttc aag cag cgc ggc gtg ccg atc 720 Gly Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile 225 230 235 240 gac tgc gtc ggc ttc cag tcg cac ttc aac agc ggc agc ccc tac aac 768 Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn 245 250 255 agc aac ttc cgc acc acc ctc cag aac ttc gcc gcc ctc ggc gtc gac 816 Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gln Asn Phe Ala Ala Leu Gly Val Asp 260 265 270 gtg gcc atc acc gaa ctc gac atc cag ggc gcg tcg tcc tcg acc tac 864 Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala Ser Ser Ser Thr Tyr 275 280 285 gcc gcc gtg acc aac gac tgc ctg gcc gtc tcg cgc tgc ctg ggc atc 912 Ala Ala Val Thr Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys Leu Gly Ile 290 295 300 acc gtc tgg ggc gtg cgc gac acc gac tcc tgg cga tcg ggg gac acg 960 Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Thr Asp Ser Trp Arg Ser Gly Asp Thr 305 310 315 320 ccg ctg ctg ttc aac ggc gac ggc agc aag aag gct gcc tac acc gcc 1008 Pro Leu Leu Phe Asn Gly Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala 325 330 335 gtc ctc aac gca ctc aac ggc ggc 1032 Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly Gly 340 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Streptomyces olivaceoviridis <400> 3 ccatgggctc ctacgccctt cccagatcag 30 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Streptomyces olivaceoviridis <400> 4 gcgactggaa gccaacgcag tcgattggca cgcc 34 <210> 5 <211> 1062 <212> DNA <213> Cellulomonas fimi <400> 5 atg cct agg acc acg ccc gca ccc ggc cac ccg gcc cgc ggc gcc cgc 48 Met Pro Arg Thr Thr Pro Ala Pro Gly His Pro Ala Arg Gly Ala Arg 1 5 10 15 acc gct ctg cgc acg acg ctc gcc gcc gcg gcg gcg acg ctc gtc gtc 96 Thr Ala Leu Arg Thr Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Val Val 20 25 30 ggc gcc acg gtc gtg ctg ccc gcc cag gcc gcg acc acg ctc aag gag 144 Gly Ala Thr Val Val Leu Pro Ala Gln Ala Ala Thr Thr Leu Lys Glu 35 40 45 gcc gcc gac ggc gcc ggc cgg gac ttc ggc ttc gcg ctc gac ccc aac 192 Ala Ala Asp Gly Ala Gly Arg Asp Phe Gly Phe Ala Leu Asp Pro Asn 50 55 60 cgg ctc tcg gag gcg cag tac aag gcg atc gcc gac agc gag ttc aac 240 Arg Leu Ser Glu Ala Gln Tyr Lys Ala Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asn 65 70 75 80 ctc gtc gtc gcc gag aac gcg atg aag tgg gac gcc acc gag ccc tcg 288 Leu Val Val Ala Glu Asn Ala Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser 85 90 95 cag aac agc ttc tcc ttc ggc gcg ggc gac cgc gtc gcg agc tac gcc 336 Gln Asn Ser Phe Ser Phe Gly Ala Gly Asp Arg Val Ala Ser Tyr Ala 100 105 110 gcc gac acc ggc aag gag ctg tac ggc cac acg ctc gta tgg cac tcg 384 Ala Asp Thr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly His Thr Leu Val Trp His Ser 115 120 125 cag ctg ccc gac tgg gcg aag aac ctc aac ggc tcc gcg ttc gag agc 432 Gln Leu Pro Asp Trp Ala Lys Asn Leu Asn Gly Ser Ala Phe Glu Ser 130 135 140 gcg atg gtc aac cac gtg acg aag gtc gcc gac cac ttc gag ggc aag 480 Ala Met Val Asn His Val Thr Lys Val Ala Asp His Phe Glu Gly Lys 145 150 155 160 gtc gcg tcg tgg gac gtc gtc aac gag gcg ttc gcc gac ggc ggc ggc 528 Val Ala Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Gly Gly 165 170 175 cgc cgg cag gac tcg gcg ttc cag cag aag ctc ggc aac ggc tac atc 576 Arg Arg Gln Asp Ser Ala Phe Gln Gln Lys Leu Gly Asn Gly Tyr Ile 180 185 190 gag acc gcg ttc cgg gcg gca cgt gcg gcg gac ccg acc gcc aag ctg 624 Glu Thr Ala Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Thr Ala Lys Leu 195 200 205 tgc atc aac gac tac aac gtc gag ggc atc aac gcg aag agc aac tcg 672 Cys Ile Asn Asp Tyr Asn Val Glu Gly Ile Asn Ala Lys Ser Asn Ser 210 215 220 ctc tac gac ctc gtc aag gac ttc aag gcg cgc ggc gtc ccg ctc gac 720 Leu Tyr Asp Leu Val Lys Asp Phe Lys Ala Arg Gly Val Pro Leu Asp 225 230 235 240 tgc gtc ggg ttc cag tcg cac ctc atc gtc ggc cag gtg ccg ggc gac 768 Cys Val Gly Phe Gln Ser His Leu Ile Val Gly Gln Val Pro Gly Asp 245 250 255 ttc cgg cag aac ctg cag cgg ttc gcg gac ctg ggc gtg gac gtg cgc 816 Phe Arg Gln Asn Leu Gln Arg Phe Ala Asp Leu Gly Val Asp Val Arg 260 265 270 atc acc gag ctc gac atc cgc atg cgg acg ccc tcc gac gcg acc aag 864 Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Arg Thr Pro Ser Asp Ala Thr Lys 275 280 285 ctc gcg acc cag gcg gcc gac tac aag aag gtc gtg cag gcc tgc atg 912 Leu Ala Thr Gln Ala Ala Asp Tyr Lys Lys Val Val Gln Ala Cys Met 290 295 300 cag gtg acc cgc tgc cag ggc gtg acc gtc tgg ggc atc acc gac aag 960 Gln Val Thr Arg Cys Gln Gly Val Thr Val Trp Gly Ile Thr Asp Lys 305 310 315 320 tac tcg tgg gtg ccg gac gtc ttc ccg ggc gag ggg gcc gcg ctg gtg 1008 Tyr Ser Trp Val Pro Asp Val Phe Pro Gly Glu Gly Ala Ala Leu Val 325 330 335 tgg gac gcg agc tac gcc aag aag ccg gcc tac gcc gcc gtg atg gag 1056 Trp Asp Ala Ser Tyr Ala Lys Lys Pro Ala Tyr Ala Ala Val Met Glu 340 345 350 gcc ttc 1062 Ala Phe <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Cellulomonas fimi <400> 6 ctgcgtcggc ttccagtcgc acctcatcgt cggcc 35 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Cellulomonas fimi <400> 7 ggatccgaag gcttccatca cggcggcgta gg 32

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金子 哲 茨城県つくば市春日４丁目６−５ サン テラスＡ−202 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
   する改変キシラナーゼの遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の改変キシラナーゼの遺伝
   子を含むプラスミド。
3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドで形質転換さ
   れた大腸菌（ＦＥＲＭＰ−１７３０１）。