CN114082222B

CN114082222B - 狭果茶藨子游离氨基酸纯化方法

Info

Publication number: CN114082222B
Application number: CN202111241256.8A
Authority: CN
Inventors: 叶英; 杨芳; 王虹; 刘哲; 石世薇
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: CN114082222A

Abstract

本发明提供了狭果茶藨子氨基酸纯化方法，狭果茶藨子乙醇提取物，过离子交换树脂，上样液浓度0.01～0.030g/mL，上样流速0.5～2.5mL/min，上样液pH 3～7，氨水洗脱液体积分数0.5～2.5％，洗脱流速0.5～2.5mL/min，洗脱液体积30～70mL。该研究可为青藏高原狭果茶藨子氨基酸成分的纯化提供技术支持。

Description

狭果茶藨子游离氨基酸纯化方法

技术领域

本发明涉及对天然植物有效成分的提取。

背景技术

狭果茶藨子(Ribes stenocarpum Maxim.)又名长果醋栗^[1]，是青藏高原地区特有的野生浆果资源。该属植物果实椭圆鲜亮，富含浆汁，其中含有丰富的生物活性成分，如氨基酸、维生素、酚类化合物等，不仅表现出很高的营养价值，而且具有清热解毒、抗菌等作用^[2]，长期以来被当地居民作为食物用来预防感冒，因此，被认为是潜在很高的药用价值。研究表明，增加可食性浆果的摄入，对降低糖尿病和高血压等多种慢性疾病具有防护作用^[3-5]。青藏高原茶藨子资源丰富，大多处于野生状态，其对其化学成分的研究尚处于起步阶段，因此，对狭果茶藨子中氨基酸成分研究具有重要意义。

氨基酸作为生命活动必需的物质基础，其中大部分以游离态或结合态形式存在于肽和蛋白质中^[6-7]。在天然植物资源中主要以游离态形式存在，且丰富的游离氨基酸是浆果中主要的营养成分^[8-9]，不仅可以参与人体新陈代谢，提高免疫机制，同时氨基酸的含量与种类也是评价食品营养价值的重要指标之一^[10]。目前，国内外研究多关注于蛋白质中结合态氨基酸的提取、纯化及成分分析^[11-14]，从而忽略了关于植物浆果鲜样中游离氨基酸的相关研究。现已证明，植物资源中游离氨基酸具有抗肿瘤、降血压及调节肠道菌群等多种生理功能^[15-17]，但是由于不同溶剂提取的游离氨基酸粗提液会伴随其他成分的溶出，影响其纯度，因而有必要对氨基酸粗提液进行纯化，以便下一步更加系统科学的分析其生物活性。如今，离子交换树脂通过离子间吸附、交换等功能，在稳定性、吸附能力、机械强度方面表现出了很好的优势^[18]，在天然产物氨基酸混合溶液提纯中得到了广泛的应用。因此，课题组在前期确定狭果茶藨子氨基酸最优提取工艺的基础上，通过考察5种不同类型离子交换树脂对狭果茶藨子鲜果中游离氨基酸静态动力学的试验，筛选出具有良好吸附、解吸性能的树脂，并结合动态吸附-解吸动力学单因素和响应面试验对狭果茶藨子鲜果中游离氨基酸进行纯化工艺研究，旨在为提高青藏高原狭果茶藨子的成分研究与后续开发提供理论科学依据。

发明内容

本发明提供了狭果茶藨子氨基酸纯化方法，狭果茶藨子乙醇提取物，过离子交换树脂，上样液浓度0.01～0.030g/mL，上样流速0.5～2.5mL/min，上样液pH 3～7，氨水洗脱液体积分数0.5～2.5％，洗脱流速0.5～2.5mL/min，洗脱液体积30～70mL。

其中，所述离子交换树脂选自SA-2、001*7、201*7、D61、D152。

进一步地，所述离子交换树脂选自001*7。

其中，上样浓度0.02-0.03mg/mL，上样流速0.8～1.0mL/min，上样液pH 4.6-4.7，氨水洗脱液体积分数1.-1.6％，洗脱流速1.4-1.6mL/min，洗脱液体积60～62mL。

进一步地，上样液浓度0.025mg/mL，上样流速0.9mL/min，上样液pH 4.66，氨水洗脱液体积分数1.54％，洗脱流速1.50mL/min，洗脱液体积61.67mL。

其中，狭果茶藨子乙醇提取物，是以30～50％乙醇提取所得。

进一步地，乙醇提取物的提取方法：超声时间30min、料液比1:35g/mL、超声温度55℃、超声功率300W、乙醇浓度40％、提取次数2次，即得。

为建立狭果茶藨子鲜果氨基酸纯化工艺，提高青藏高原狭果茶藨子天然资源的利用价值。本研究通过静态吸附-解吸动力学试验对SA-2、201*7、001*7、D61、D152共5种不同类型的离子交换树脂进行筛选，并结合动态吸附-解吸动力学单因素试验和响应面设计优化狭果茶藨子鲜果氨基酸纯化工艺。结果表明，001*7离子交换树脂对狭果茶藨子鲜果氨基酸有较好的吸附和解吸效果，吸附率达70.73±0.47％，解吸率达91.29±2.60％。最优纯化条件为：狭果茶藨子氨基酸质量浓度0.025g/mL，上样液流速0.9mL/min，上样液pH 4.66，氨水洗脱液体积分数1.54％，洗脱流速1.50mL/min，洗脱液体积61.67mL，此条件下狭果茶藨子氨基酸纯度从23.26％提高到77.50％，提高了54.24％。该研究可为青藏高原狭果茶藨子氨基酸成分的纯化提供技术支持。

附图说明

图1上样液浓度对吸附效果的影响

图2上样液流速对吸附效果的影响

图3上样液的pH值对吸附效果的影响

图4洗脱液体积分数对解吸效果的影响

图5洗脱液体积对吸附效果的影响

图6洗脱流速对解吸效果的影响

图7吸附工艺优化试验响应面模型及等高线图

图8解吸工艺优化试验响应面模型及等高线图

具体实施方式

实施例1本发明纯化工艺研究

1材料与方法

1.1材料与试剂

狭果茶藨子：青海省互助，采集地海拔3029米，经度101° 50.926，纬度36°57.670，采摘后于-20℃冰箱冻藏备用。

SA-2、001*7、201*7、D61、D152型树脂(批号:HC210409，郑州和成新材料科技有限公司)；无水乙醇、水合茚三酮、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氨水、盐酸(分析纯，天津永大化学试剂)。

1.2仪器与设备

YM-031S型超声波清洗机(深圳市福洋科技有限公司)；R-1001VN型旋蒸仪(郑州长城科技工贸有限公司)；SPH-304型新型脱色摇床(上海世平试验设备有限公司)；HL-2B恒流泵(上海驰唐电子有限公司)；UV-1780型紫外可见分光光度计(苏州岛津仪器有限分公司)。

1.3实验方法

1.3.1狭果茶藨子游离氨基酸的提取

取适量成熟饱满且无机械损伤的狭果茶藨子鲜果，室温下解冻，洗净、沥干水分，用多样品组织研磨仪研磨成浆状。采用超声波辅助提取法提取狭果茶藨子游离氨基酸，工艺参数为：超声时间30min、料液比1:35(g/mL)、超声温度55℃、超声功率300W、乙醇浓度40％、提取次数2次，得游离氨基酸粗提取液，于4℃冰箱冷藏备用。

1.3.2狭果茶藨子游离氨基酸的测定^[19]

量取5mg/mL的谷氨酸标品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL于试管，蒸馏水补至10mL，移取上述溶液各2mL于10mL容量瓶，分别加入磷酸盐缓冲液2mL，茚三酮溶液1mL，摇匀，沸水浴20min，冷却后定容，于566nm处测定吸光度值，以谷氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程y＝1.6491x-0.0116，R2＝0.9957。准确移取稀释到一定浓度的狭果茶藨子游离氨基酸溶液2mL，按上述标准曲线操作方法，依次加入各试剂，在566nm处测定吸光度，按照回归方程计算狭果茶藨子中的游离氨基酸含量：

式中：c-狭果茶藨子氨基酸质量浓度，mg/mL；v-提取液总体积，mL；n-稀释倍数；m-狭果茶藨子鲜果浆液的质量，g。

1.3.3树脂的预处理和再生

分别称取适量型号为SA-2、001*7、201*7、D61、D152的离子交换树脂按照文献^[20]进行预处理。

1.3.4最佳树脂类型的筛选

吸附率的计算：分别称取4.0g预处理好的SA-2、001*7、201*7、D61和D152共5种不同型号的离子交换树脂，依次加入25mL的狭果茶藨子氨基酸提取液于三角瓶内，25℃、200r/min下恒温振荡12h，抽滤，取滤液测定狭果茶藨子游离氨基酸的含量^[21]。根据公式(2)(3)计算树脂吸附量、吸附率。

式中：C₀-提取液初始氨基酸浓度，mg/mL；C₁-吸附后滤液中氨基酸浓度，mg/mL；V₀-为狭果茶藨子提取液体积，mL；m-为树脂质量，g。

解吸率的计算：将抽滤后的树脂加入3％的氨水溶液(50mL)，同等条件解吸12h，抽滤，测定解吸后滤液中游离氨基酸的含量。根据公式(4)计算树脂解吸率。

式中：V₂-洗脱溶液体积，mL；V₁-上样液体积，mL；C₂-解吸后滤液中氨基酸浓度，mg/mL。

1.3.5阳离子交换树脂纯化游离氨基酸动态吸附及解吸的单因素实验

根据静态吸附研究结果，取预处理好的树脂(约20g)，装柱，以吸附率为指标，固定上样量体积为80mL，考察不同上样液浓度(0.010、0.015、0.020、0.025、0.030g/mL)、不同上样液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min)、不同上样液pH(3、4、5、6、7)对狭果茶藨子氨基酸吸附效果的影响。

根据静态吸附研究结果，取预处理好的树脂(约20g)，装柱，固定上样量为80mL，以解吸率为指标，考察不同洗脱液体积(30、40、50、60、70mL)、不同洗脱液体积分数(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)、不同洗脱液流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min)对狭果茶藨子氨基酸解吸效果的影响。

1.3.6响应面试验优化游离氨基酸纯化工艺

根据单因素结果，以吸附率、解吸率为响应值，分别以上样浓度、上样流速及上样pH；洗脱液体积分数、洗脱流速及洗脱体积为自变量设计响应面试验，因素水平见表1和表2^[22]。

表1吸附试验自变量因素编码及水平

表2解吸试验自变量因素编码及水平

1.3.7狭果茶藨子游离氨基酸纯化最佳工艺验证

按上述纯化工艺最佳条件重复3次试验，取100g狭果茶藨子鲜果进行纯化，收集洗脱液，浓缩至一定体积V，紫外分光光度法测定氨基酸浓度C(以谷氨酸为标准品)，按公式(5)计算氨基酸纯度。

式中:C-洗脱液中氨基酸浓度，mg/mL；V-洗脱液体积，mL；m-纯化后样品质量，mg。

1.4数据处理

采用Excel软件处理数据和图表绘制，采用Design-Expert 8.0进行响应面设计与分析。

2结果与分析

2.1狭果茶藨子游离氨基酸离子交换树脂的筛选

离子交换树脂法是根据不溶性高分子化合物对样品吸附能力的差异，对混合物形成吸附作用，再通过溶剂洗脱进行解吸，从而实现对目标物的分离纯化^[23]。由图2可知，5种树脂对狭果茶藨子氨基酸的吸附率大小依次为：001*7>D61>SA-2>D152>201*7，解吸率大小依次为：001*7>SA-2>D152>D61>201*7。其中001*7型树脂对狭果茶藨子氨基酸的吸附率和解吸率均为最高，吸附率可达70.73％，解吸率可达91.29％。D61型树脂吸附率为69.51％，虽与001*7型树脂相差不大，但其解吸率却较001*7型树脂偏低。此研究结果与提取加纳籽提取液中5-羟基色氨酸的研究结果一致^[24]。因此，综合考虑选用对狭果茶藨子游离氨基酸吸附和解吸性能均较好的阳离子交换树脂001*7进行动态动力学纯化工艺的研究。

表3不同类型离子交换树脂筛选结果

2.2 001*7型阳离子树脂纯化狭果茶藨子氨基酸动态吸附单因素试验结果

2.2.1上样液质量浓度的选择

由图1可知，当上样液浓度范围在0.01～0.025g/mL之间时，随着上样液浓度的增加，吸附率逐渐升高，并在0.025g/mL时，树脂的吸附率达到最高值69.71％，继续增大浓度时，吸附率开始略有降低，故选择上样液浓度0.020、0.025、0.030g/mL为中心组合，进行动态吸附响应面优化试验。

2.2.2上样流速的选择

由图2可知，当上样液流速范围在0.5～2.5mL/min时，狭果茶藨子氨基酸吸附率随流速的增大先上升后减小。这可能是由于上样速度较小时，样品溶液能够长时间停留在树脂间缝，从而使氨基酸与树脂充分接触，而随着上样流速的增大，氨基酸还未完全与树脂接触吸附就已经流出，从而降低了树脂的吸附率，但同时流速过低，会导致吸附时间延长，因此选择上样液流速0.5、1.0、1.5mL/min为中心组合，进行动态吸附响应面优化试验。

2.2.3上样液pH的选择

由图3可知，当上样液pH在3～7范围时，随着上样液pH的增加，吸附率呈现出先上升后下降的趋势，当pH为5时，氨基酸吸附率达到最高91.57％，这可能是由于狭果茶藨子果实中含有大量有机酸而表现出弱酸性环境，从而提高了氨基酸的吸附能力，因此选择上样液pH 4、5、6为中心组合，进行动态吸附响应面优化试验。

2.3 001*7型阳离子树脂纯化狭果茶藨子氨基酸动态解吸单因素试验结果^[25]

2.3.1洗脱液体积分数的选择

由图4可知，当氨水洗脱液体积分数在0.5～1.5％的浓度范围内，001*7树脂的解吸率随氨水体积分数的增加呈显著增加趋势，当达到1.5％时，树脂对狭果茶藨子中氨基酸的解吸率达到最大，之后当体积分数超过1.5％时，解吸率反而下降，根据相似相溶的原理，表明1.5％的氨水极性与氨基酸分子极性较为接近，因此，在该条件下解吸率最高，故选择洗脱液体积分数1％、1.5％、2％作为中心组合，进行解吸响应面优化试验。

2.3.2洗脱液体积的选择

由图5可知，当洗脱液体积在30～60mL时，解吸率呈现增加趋势，并在60mL时达到最大，说明少量的氨水洗脱液不足以将树脂中吸附的氨基酸完全洗脱下来。当洗脱液体积超过60mL时，解吸率显著下降，故选择洗脱体积50、60、70mL作为中心组合，进行解吸响应面优化试验。

2.3.3洗脱流速的选择

由图6可知，洗脱流速在0.5～1.5mL/min时，解吸率随洗脱流速的增加而升高，当洗脱流速1.5mL/min时，解吸率达最大，再增大流速，解吸率开始下降，可能是因为一定的洗脱流速使树脂与解吸液充分接触，从而更好地扩散到树脂颗粒内部，使氨基酸成分被交换出来。相反，洗脱流速过快，两者接触时间缩短，部分氨基酸不能被及时洗脱出，树脂的解吸率降低，故选择洗脱流速1、1.5、2mL/min作为中心组合，进行解吸响应面优化试验。

2.4 001*7型阳离子树脂纯化狭果茶藨子氨基酸响应面试验结果

2.4.1动态吸附响应面试验结果与分析

在单因素的试验基础之上，设计动态吸附优化试验，结果见表4，方差分析见表5。

表4吸附响应面试验结果

表5吸附试验回归模型方差分析结果

注：**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著。

对表4中动态吸附优化结果进行分析，得到001*7型阳离子交换树脂对狭果茶藨子游离氨基酸吸附率的二次多项式回归：Y(％)＝92.25-0.049A-0.21B-2.42C-0.12AB+0.46AC+0.67BC-1.47A²-1.07B²-3.80C²。方差分析结果如表5所示，该模型呈极显著性(P<0.01)，R²＝0.9832，R² _Adj＝0.9616，且失拟度不显著(P_失拟＝0.6183>0.05)，说明该吸附响应面试验模型拟合良好，可以用于对狭果茶藨子氨基酸动态吸附动力学试验的预测和分析。表中呈极显著的项有C、A²、B²、C²，显著的项有BC。通过对F值分析可知，各因素对吸附效果影响的主次顺序为：上样液pH>上样液流速>上样液浓度。

研究表明，响应面图反映各因素间的交互作用对响应值的影响，等高线图反映了各因素间交互作用的强度，结合两者分析，可以更加直观地看出各因素间的作用效果^[26]。如图7所示，随着上样浓度、上样流速和上样pH水平的增加，001*7型树脂对氨基酸吸附率表现出先增加后下降的趋势，均能找到其最佳值，与上述显著性结果一致。根据吸附试验响应面模型预测结果可知：在狭果茶藨子氨基酸样品溶液浓度为0.025mg/mL、上样流速为0.9mL/min、上样液pH为4.66的最优工艺条件下，吸附率最大可达92.68％。

2.4.2动态解吸响应面试验结果与分析

在单因素的试验基础之上，设计动态解吸优化试验，结果见表6，方差分析结果见表7。

表6解吸响应面试验结果

表7解吸试验回归模型方差分析结果

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)

对表6中动态解吸优化试验数据进行分析，得到关于001*7型阳离子树脂对狭果茶藨子

氨基酸解吸率的二次多项式回归方程为：Y(％)＝93.71+0.37A-0.33B+0.39C+1.67AB+0.70AC+0.88BC-2.87A²-2.18B²-0.96C²。方差分析结果如表7所示，P模型<0.0001，该模型呈极显著性，R²＝0.9835，R² _Adj＝0.9622，且失拟度不显著(P＝0.5646>0.05)，说明该吸附响应面试验模型拟合良好，可以用于对狭果茶藨子氨基酸动态解吸率的预测和分析。模型中对解吸率影响极显著的有交互项AB、BC和二次项A²、B²、C²，对解吸率影响显著的项有一次性C和交互项AC。通过对F值分析可知，各因素对吸附效果影响的主次顺序为：洗脱液体积>洗脱液浓度>洗脱流速。

通过对各因素间响应面模型图和等高线图进行分析。如图8所示，所有响应面开口均向下，解吸率与三个考察因素呈明显的二次抛物关系，随着洗脱液体积分数、洗脱流速及洗脱液体积水平的增加，001*7型树脂对氨基酸解吸率表现出先增加后下降的趋势，均能找到其最佳值^[27]，与上述方差分析结果一致。根据解吸试验响应面模型分析结果可预测：在氨水溶液体积分数为1.54％、洗脱流速为1.50mL/min、洗脱液体积为61.67mL的最佳优化工艺条件下，解吸率最大可达到93.75％。

2.5狭果茶藨子氨基酸纯化工艺验证结果

以纯化最优工艺条件进行3次验证试验，结果见表8，该纯化工艺稳定，3次试验得到的氨基酸纯度结果无显著差异(P>0.05)，狭果茶藨子氨基酸纯度从23.26％提高到77.50％，提高了54.24％。说明001*7离子交换树脂可有效用于狭果茶藨子氨基酸的分离纯化，且优化的工艺条件在实验室级别稳定可行。

表8狭果茶藨子氨基酸纯化工艺验证结果

3结论

本试验通过考察5种(SA-2、001*7、201*7、D61、D152)不同型号的离子交换树脂对狭果茶藨子游离氨基酸的静态吸附-解吸动力学性能，确定了001*7离子交换树脂为纯化狭果茶藨子提取液中游离氨基酸的理想树脂。通过单因素试验及响应面试验进行优化，预测得到最优纯化工艺为：上样浓度0.025mg/mL，上样流速0.9mL/min，上样液pH 4.66，氨水洗脱液体积分数1.54％，洗脱流速1.50mL/min，洗脱液体积61.67mL，此条件下，狭果茶藨子氨基酸纯度从23.26％提高到77.50％，提高了54.24％。说明该纯化工艺操作简单、参数准确、经济环保，结果可为狭果茶藨子氨基酸后续研究提供一定的参考价值。

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Claims

1.狭果茶藨子氨基酸纯化方法，其特征在于：狭果茶藨子30～50％乙醇提取物，过离子交换树脂001*7，上样液浓度0.025g/mL，上样流速0.9mL/min，上样液pH 4.66，氨水洗脱液体积分数1.54％，洗脱流速1.50mL/min，洗脱液体积61.67mL。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：乙醇提取物的提取方法：超声时间30min、料液比1:35g/mL、超声温度55℃、超声功率300W、乙醇浓度40％、提取次数2次，即得。