CN106946830A - 七彩竹秆中黄酮类化合物的提取分离和组织化学定位方法 - Google Patents

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Abstract

一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，利用回流提取法从七彩虹竹秆原料中进行总成分提取，并利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的6种化合物，并进一步进行含量测定。本发明对黄酮类化合物的组织化学定位进行更全面的了解竹类植物中类黄酮化合物的合成分布提供了有效方法。首先利用徒手切片技术对竹类植物的茎中的黄酮类化合物进行组织化学定位。通过该发明，了解竹类植物茎中类黄酮化合物的分布情况，从而为各类物质代谢过程的研究提供基础。其次从蒲竹子茎中提取化学成分，利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的化合物；并利用高效液相色谱法得到七彩虹竹3个时期中化学成分图谱，精确确定各个时期中黄酮类化合物的含量和种类。

Description

七彩竹秆中黄酮类化合物的提取分离和组织化学定位方法
技术领域：
本发明属于竹类植物化学成分领域，具体涉及一种七彩竹秆中黄酮类化合物的提取分离和组织化学定位方法。
背景技术：
竹类植物有着广泛的分布，其在化学成分、营养保健、药理作用、食品开发等方面已经做了初步的研究，竹类植物具有生态和经济的双重效益的树种，具有很高的开发价值。近年的研究表明，竹类植物中含有大量的类黄酮化合物，也是竹类植物中主要的生理活性成分。黄酮类化合物具有清除自由基、抗炎、预防心血管疾病、抗衰老和降血脂等生理功能，在保健品、医药、食品等领域具有广阔的应用前景。目前，对竹类植物资源分布的调查，竹类植物的繁殖技术，竹类植物的鉴定和化学成分均有研究；但仍有较多问题有待解决。如：对竹类植物化学成分的研究较多，但是对针对黄酮类化合物在竹类植物中的分布与定位的研究十分缺乏；对竹类植物中黄酮类化合物在不同部位成分含量存在差别也缺少较全面的研究；有关竹类植物中黄酮类化合物的合成规律和合成部位及生理胁迫对其形成的影响，至今未见有关报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供涉及一种七彩竹秆中黄酮类化合物的提取分离和组织化学定位方法。基于以上现有技术中存在的问题，本发明对黄酮类化合物的组织化学定位进行更全面的了解竹类植物中类黄酮化合物的合成分布提供了有效方法。首先利用徒手切片技术对竹类植物的茎中的黄酮类化合物进行组织化学定位。通过该发明，了解竹类植物茎中类黄酮化合物的分布情况，从而为各类物质代谢过程的研究提供基础。其次从蒲竹子茎中提取化学成分，利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的化合物；并利用高效液相色谱法得到七彩虹竹3个时期中化学成分图谱，精确确定各个时期中黄酮类化合物的含量和种类。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，利用回流提取法从七彩虹竹秆原料中进行总成分提取，并利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的6种化合物，并进一步进行含量测定。
如所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其中所述的总成分提取采用回流提取法，将七彩虹竹秆粉碎，用70％的乙醇在容器中水浴加热冷却回流提取3次，每次1-2小时，重复3次，过滤，合并滤液，丢弃秆渣；用旋转蒸发器仪65℃左右对初提液进行旋蒸，蒸出溶液中的乙醇，得到七彩虹竹秆浸膏。
如所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其中所述的分离晶体化合物采用石油醚与水提液共同萃取上一步骤回流提取所得浸膏，萃取24小时后用分液漏斗分离，分别用石油醚萃取4次，下层为水提物，上层为石油醚萃取物，把4次萃取上层混合，然后上层用旋转蒸发仪旋蒸，把石油醚蒸出，得到石油醚浸膏，把剩下的下层水提物和乙酸乙酯共同混合萃取24小时后用分液漏斗分离，同样用乙酸乙酯萃取4次，下层为水提物，上层为乙酸乙酯萃取物，把五次萃取上层混合，再用旋转蒸发仪旋蒸，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，再把剩下的水提物用正丁醇萃取，分别用正丁醇萃取4次，把上层正丁醇萃取物混合，用旋转蒸发仪蒸出正丁醇，得到正丁醇浸膏，最后把水提物层用旋转蒸发仪蒸出蒸馏水，得到水层浸膏；乙酸乙酯萃取部分16.0g用200-300目硅胶柱层析色谱法分离，以100∶-1∶1的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱甲柱，称取硅胶，称10倍于上样量；洗脱出的干物质重量、结晶情况待合并完成后，观察并记录洗脱出的干物质重量、结晶情况；
将甲柱18-37馏分用乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，采用200-300目硅胶柱层析装柱分离，采用10:1石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，得到馏分，通过TLC薄层色谱法鉴定，合并相同馏分，并观察结晶情况；
同时，将甲柱中石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱部分得到馏分合并，干燥称重g，用甲醇溶解，用100-200目硅胶拌样，进行200-300目硅胶柱层析分离，采用8:1氯仿-甲醇系统梯度洗脱，得到各馏分，观察结晶情况。
如所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其中所述的晶体化合物含量测定采用280nm为检测波长，流动相用乙腈∶水。
如所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其中用七彩虹竹秆幼嫩未见光部分为原料，以所含化合物牡荆苷和异牡荆苷作为七彩虹竹含量测定的指标成分进行定量分析。
如所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其中所述的从七彩竹秆中提取分离到的黄酮类化合物为化合物1木犀草素、化合物2木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、化合物3荭草苷、化合物4β-谷甾醇、化合物5牡荆苷、化合物6胡萝卜苷。
七彩竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，以七彩虹竹的健康新鲜的竹秆为材料，取新鲜的竹秆，将竹秆上的竹叶去净，经风干后，粉碎至20目，避光贮存，运用在组织切片的拟检成分起化学反应，形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，用以定位七彩竹秆中黄酮类化合物在组织或细胞内的分布含量，测定七彩竹中黄酮类化合物在不同部位成分的含量。
如所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，七彩虹竹中黄酮类化合物组织化学定位方法采用：
(1)5％NaOH溶液染色法：新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴5％NaOH水溶液，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，5min后用在自然光下观察并照相，黄酮类化合物经5％NaOH水溶液染色会产生特征性的显色反应，变色范围从淡黄色至橙色；
(2)1％醋酸镁溶液染色法：
新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴1％醋酸镁甲醇溶液，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的蓝色激发光450-490nm为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相，黄酮类化合物经1％醋酸镁甲醇溶液染色，发出绿色荧光；
(3)1％NA甲醇溶液染色法：
新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴含1％NaCl的磷酸缓冲液，片刻后滴加NA甲醇溶液试剂一滴，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的紫外光激发光330-380nm为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相，在紫外光下，1％NA甲醇溶液与黄酮类化合物反应呈黄色荧光；
如所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，七彩虹竹中木质素的组织化学定位法采用新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后用2％的间苯三酚酒精95％溶液浸泡5min，再用6mol·L-1HCL进行封片，在自然光下观察，Wiesner反应对木质素产生颜色反应呈现暗红色。
如所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，其中不同时期七彩虹竹秆中黄酮类化合物的组织化学定位采用取当年生枝的七彩虹竹秆，根据七彩虹竹秆的成熟程度和光照对秆的影响分为三个时期，时期Ⅰ为未见光的秆，秆均呈淡黄色，时期Ⅱ为见光的幼秆，竹秆整体或者上端出现淡红色，时期为Ⅲ成熟秆，竹秆出现淡红色至暗红色，从表皮层、表皮层内方的机械组织、维管束进行观察，并分析组织化学定位荧光的变化来确定含量的变化。
本发明以七彩虹竹的健康新鲜的竹秆为材料，运用在组织切片的拟检成分起化学反应，形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，用以定位七彩竹秆中黄酮类化合物在组织或细胞内的分布含量，能精确测定七彩竹中黄酮类化合物在不同部位成分的含量，对七彩虹竹植物中黄酮类化合物的合成规律和合成部位及生理胁迫对其形成的影响具有重要价值。本发明对七彩虹竹秆在不同时期的黄酮类化合物的变化进行了确定。根据七彩虹竹秆的成熟程度和光照对秆的影响可以分为三个时期，时期Ⅰ(未见光的秆，秆均呈淡黄色)，Ⅱ(见光的幼秆，竹秆整体或者上端出现淡红色)、Ⅲ(成熟秆，竹秆出现淡红色至暗红色)。得出时期Ⅰ(未见光的秆，秆均呈淡黄色)的七彩虹竹黄酮类化合物合成量最高，为本发明方法的优化提供依据和指导。
用黄酮类化合物在七彩竹秆中组织或细胞内的分布含量指导提取方法最佳时机：黄酮类化合物经1％NA甲醇溶液染色法染色后，并用荧光显微镜的紫外光激发光激发可产生黄色荧光。新鲜的七彩虹竹秆切片经1％NA甲醇溶液染色法染色后，在荧光显微镜的紫外激发光下观察发现在表皮层中和表皮层内方的机械组织之中含有大量的黄色荧光，而维管束周围呈现的比较强烈的黄色荧光，在基本组织中也出现了黄色荧光。
利用高效液相色谱法对七彩虹竹秆中四种黄酮类化合物不同时期的含量进行测定。结果表明未见光幼秆中黄酮类含量较高，见光幼秆居中，成熟秆中的黄酮类化合物含量急剧减少，说明在七彩虹竹秆的生长发育过程中黄酮物质含量较高的部位是幼嫩未见光部分。四种标准品的含量测定结果表明，牡荆苷和异牡荆苷的含量最高，最高能达到10.2％，用作为七彩虹竹含量测定的指标成分进行定量分析。
附图说明：
图1七彩虹竹样品，1号为荭草苷；2号为牡荆苷；3号为异牡荆苷；4号为木犀草素；
图2混合标准品色谱图，1号为荭草苷；2号为牡荆苷；3号为异牡荆苷；4号为木犀草素；
图3 1号标准曲线；
图4 2号标准曲线；
图5 3号标准曲线；
图6 4号标准曲线；
图7化合物提取流程图；
图8化合物提取流程图。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
试验材料：
七彩虹竹(Indosasa hispida McClure“rainbow”)为禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)大节竹属(Indosasa)植物。秆高2‐3m，直径1～3cm幼时表面被有小刺毛，后脱落变为无毛，节下方有白粉；秆中部每节多3分枝，枝直立开展，竹秆中下部呈现不同程度的红色至紫红色。叶片呈现淡黄条纹，带状披针形或披针形，外长9～23cm，宽1.5～4cm，先端长渐尖，基部楔形或宽楔形，下表面常被有短柔毛，稀可无毛，两边缘有小锯齿，次脉5～6对，小横脉明显。分布于滇南边缘热带及南亚热带山地。竹秆上呈现不同程度的红色至紫红色和叶片呈现淡黄条纹的性状。
2.黄酮类化合物在七彩虹竹秆中的分布状况：
实验材料采集和处理：
组织化学定位材料：以七彩虹竹的健康新鲜的竹秆为材料。
植物化学材料：取新鲜的竹秆，先将竹秆上的竹叶去净，经风干后，粉碎至20目，避光贮存，备用。
实验方法：组织化学定位方法。
实验原理：运用组织化学定位的基本原理,其原理是在组织切片的拟检成分起化学反应，形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，用以研究糖类.脂类.蛋白质.酶类和核酸等物质在组织或细胞内的分布含量。
仪器与试剂：
荧光显微镜(尼康E800)，载玻片，盖玻片，刀片，吸管。
醋酸镁，甲醇，氢氧化钠，磷酸二氢钾，氯化钠，NA(diphenylboric acid 2‐aminoethyl ester二苯基硼酸‐2‐氨基乙酯)，间苯三酚，95％酒精，盐酸，去离子水。以上药品均为分析纯。
黄酮类化合物组织化学定位方法：
(1)5％NaOH溶液染色法：
新鲜材料经徒手切片后滴加一滴5％NaOH水溶液(取5gNaOH，加水溶解并定容到100ml)，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，5min后用在自然光下观察并照相。黄酮类化合物经5％NaOH水溶液染色会产生特征性的显色反应，变色范围从淡黄色至橙色(谭玲玲，2007；陈婧，2012)。
(2)1％醋酸镁溶液染色法：
新鲜材料经徒手切片后滴加一滴1％醋酸镁甲醇溶液(取醋酸镁1g，用甲醇溶解并定容到100ml)，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的蓝色激发光(450‐490nm)为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相。黄酮类化合物经1％醋酸镁甲醇溶液染色，发出绿色荧光(中国科学院上海药物研究所植物化学研究室，1981；谭玲玲，2007)。
(3)1％NA甲醇溶液染色法：
新鲜材料经徒手切片后滴加一滴含1％NaCl的磷酸缓冲液(pH＝6.5，溶液中另含NaCl的质量浓度为1％)，片刻后滴加NA甲醇溶液试剂(称取NA1g，加甲醇溶解并定容到100ml)一滴，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的紫外光激发光(330‐380nm)为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相。在紫外光下，1％NA甲醇溶液与黄酮类化合物反应呈黄色荧光(Peter Hutzler，1998；Murphy A，2000；谭玲玲，2007；李晓丹，2008)。
木质素的组织化学定位法：
新鲜材料经徒手切片后用2％的间苯三酚酒精(95％)溶液浸泡5min，再用6mol·L‐1HCL进行封片，在自然光下观察，Wiesner反应对木质素产生颜色反应呈现暗红色(Lin JX，2002)。
七彩虹竹秆的解剖结构及其维管束的结构：
竹类植物的茎秆自外而内由表皮、机械组织、基本组织、维管束组成。
七彩虹竹秆中黄酮类化合物的组织化学定位：
黄酮类化合物经5％NaOH水溶液染色后会立即产生显色反应，即显淡黄色至橙色。在新鲜的七彩虹竹秆切片上滴加5％NaOH水溶液后，在显微镜的自然光下观察表明，在表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围的均有明显的淡黄色至橙色显色。黄酮类化合物经1％醋酸镁甲醇溶液染色法染色后，并用荧光显微镜的蓝色激发光激发可产生绿色荧光。新鲜的七彩虹竹秆切片经1％醋酸镁甲醇溶液染色法染色后，在荧光显微镜的蓝色激发光下观察发现在表皮层中和表皮层内方的机械组织之中均分布着大量的绿色荧光，而维管束周围呈现的比较强烈的绿色荧光，在基本组织中也出现了绿色荧光。黄酮类化合物经1％NA甲醇溶液染色法染色后，并用荧光显微镜的紫外光激发光激发可产生黄色荧光。新鲜的七彩虹竹秆切片经1％NA甲醇溶液染色法染色后，在荧光显微镜的紫外激发光下观察发现在表皮层中和表皮层内方的机械组织之中含有大量的黄色荧光，而维管束周围呈现的比较强烈的黄色荧光，在基本组织中也出现了黄色荧光。
不同时期七彩虹竹秆中黄酮类化合物的组织化学定位：
上述已经概括了黄酮类化合物的在七彩虹竹秆中的分布位置，但是黄酮类化合物在竹类植物中的分布并非是一成不变的，下面对七彩虹竹秆在不同时期的黄酮类化合物的变化进行了进一步的研究。取当年生枝，根据七彩虹竹秆的成熟程度和光照对秆的影响可以分为三个时期，时期Ⅰ(未见光的秆，秆均呈淡黄色)，Ⅱ(见光的幼秆，竹秆整体或者上端出现淡红色)、Ⅲ(成熟秆，竹秆出现淡红色至暗红色)。主要的探索方向是从已经确定的三大方面(表皮层、表皮层内方的机械组织、维管束)进行观察、分析、总结。
1％醋酸镁甲醇溶液显色结果：
黄酮类化合物经1％醋酸镁甲醇溶液染色法染色后，并用荧光显微镜的蓝色激发光激发可产生绿色荧光。七彩虹竹新鲜材料秆经1％醋酸镁甲醇溶液染色后，时期Ⅰ染色结果显示，表皮层呈现很薄一层绿色荧光，维管束周围呈现绿色荧光，基本组织中也呈现出了绿色荧光；时期Ⅱ染色结果显示，表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围呈现绿色荧光，与时期Ⅰ相比较，表皮层和维管束周围的绿色荧光较为强烈，而基本组织中分布的绿色荧光面积相对减少了；时期Ⅲ染色结果显示，表皮层呈现绿色荧光，表皮层内方的机械组织和维管束周围呈现强烈的绿色荧光，与时期Ⅱ相比，表皮层内方的机械组织的绿色荧光强度增加了，而维管束周围和基本组织中呈现的绿色荧光变化并不是明显。
1％NA甲醇溶液显色结果：
黄酮类化合物经1％NA甲醇溶液染色法染色后，并用荧光显微镜的紫外光激发光激发可产生黄色荧光。七彩虹竹新鲜材料秆经1％NA甲醇溶液染色后，时期Ⅰ染色结果显示，表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围均呈现黄色荧光，在基本组织中也呈现了黄色荧光；时期Ⅱ染色结果显示，表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围均呈现黄色荧光，与时期Ⅰ相比较表皮层内方的机械组织和维管束周围的荧光变的更为强烈，表皮层和基本组织中的黄色荧光并没有多大变化；时期Ⅲ染色结果显示，表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围均呈现黄色荧光，与时期Ⅱ相比，表皮层内方的机械组织和维管束周围的黄色荧光变得更为强烈，而表皮层和基本组织中的黄色荧光并没有多大变化。
不同时期七彩虹竹秆中木质素的变化：
木质素经2％的间苯三酚酒精染色，再用6mol·L‐1HCL进行封片，在自然光下观察，木质素产生颜色反应呈现暗红色.七彩虹竹新鲜材料秆经2％间苯三酚酒精溶液染色后，时期Ⅰ染色结果显示，在维管束周围呈现淡红色；时期Ⅱ染色结果显示，在表皮层内方的机械组织呈现淡红色，维管束周围呈现红色，与时期Ⅰ相比维管束周围红色的区域加大了；时期Ⅲ染色结果显示，在表皮层内方的机械组织和维管束周围均呈现深红色，与时期Ⅱ相比较，表皮层内方的机械组织与维管束周围所呈现的红色均比时期Ⅱ更为强烈，而且表皮层内方的机械组织和维管束周围的红色区域加大了。
2.黄酮类化合物的提取分离：
仪器与试剂：
旋转蒸发仪(RE‐52)(上海亚荣生化仪器厂)、高压灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱(DH‐9140A型)(上海恒科技有限公司)、数显恒温水浴锅(HH‐2)(国华电器有限公司)、冰箱、冷凝管、小安瓶、正相硅胶板、展开槽、结晶刀、5ml量筒、100ml量筒、1/10000分析天平、1000ml分液漏斗、1000ul移液枪、枪头、500ml烧杯、250ml锥形瓶、1000ml圆底烧瓶、500ml圆底烧瓶、培养皿、5ml，20ml容量瓶、胶头滴管、定性滤纸。
三氯甲烷、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、10％硫酸—乙醇显色剂、三氯化铝、三氯化铁、蒸馏水。
(1)七彩虹竹秆中总成分提取和不同极性成分的分离：
七彩虹竹秆中总成分提取采用回流提取法。将竹秆粉碎样品称量得2.15kg，用70％的乙醇在10升容器中水浴加热冷却回流提取3次，每次1‐2小时，重复3次，过滤，合并滤液为初提液，丢弃秆渣。
用旋转蒸发器仪65℃左右对初提液进行旋蒸，蒸出溶液中的乙醇，得到七彩虹竹秆浸膏0.39kg。
用石油醚与水提液共同萃取上述所得浸膏24小时后，用分液漏斗分离，再分别用石油醚萃取4次，下层为水提物，上层为石油醚萃取物，把4次萃取上层混合，然后上层用旋转蒸发仪旋蒸，把石油醚蒸出，得到石油醚浸膏8g。把剩下的下层水提物和乙酸乙酯共同混合萃取24小时后用分液漏斗分离，同样用乙酸乙酯萃取4次，下层为水提物，上层为乙酸乙酯萃取物，把五次萃取上层混合，再用旋转蒸发仪旋蒸，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏16g。再把剩下的水提物用正丁醇萃取，分别用正丁醇萃取4次，把上层正丁醇萃取物混合，用旋转蒸发仪蒸出正丁醇，得到正丁醇浸膏20.4g(图7)。最后把水提物层用旋转蒸发仪蒸出蒸馏水，得到水层浸膏。贴签，储存，备用。
(2)乙酸乙酯层浸膏的分离：
乙酸乙酯萃取部分16.0g用硅胶柱层析色谱法分离(200‐300目硅胶)，以石油醚‐乙酸乙酯系统(100∶‐1∶1)梯度洗脱(甲柱)。称取硅胶，称10倍于上样量；准备上样16g，称取硅胶160g。洗脱出的干物质重量、结晶情况：待合并完成后，观察并记录洗脱出的干物质重量、结晶情况。
将甲柱18‐37馏分5.2g用乙酸乙酯溶解，用硅胶(100‐200目)5g拌样，采用硅胶柱层析(200‐300目)50g装柱分离，采用石油醚‐乙酸乙酯系统(10:1)进行梯度洗脱，得到馏分，通过TLC薄层色谱法鉴定，合并相同馏分，并观察结晶情况。
甲柱中石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱部分得到馏分合并，干燥称重为2.6g，用甲醇溶解，用硅胶(100‐200目)5g拌样，进行硅胶柱(200‐300目)层析分离，采用氯仿‐甲醇系统(8:1)梯度洗脱，得到各馏分，观察结晶情况。
七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量测定：
仪器与试剂：
超声波清洗器(西班牙FUNGILAB)；Agilent 1200高效液相色谱仪(自动进样器，二极管阵列检 测器，Agilent化学工作站，色谱柱为Eclipse XDB‐C18)；数显恒温水浴锅HH–2型(国华电器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱DHG‐9140A型(上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器有限公司)；赛特路斯万分之一电子天平BS210S型；蒸发皿；三角瓶(50ml)；量筒(50ml)；漏斗；滤纸。
甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯，美国fisher公司)、乙腈(色谱纯，美国fisher公司)超纯水(自制)。对照品木犀草素、荭草苷、异牡荆苷、牡荆苷均购于sigma公司。
溶液的制备：
对照品储备液：分别称取对照品1号、2号、3号、4号各10mg，精密称定，置于同一10mL量瓶中，加甲醇(色谱纯)溶解，定容，摇匀，即得。
供试品溶液：取七彩虹竹秆粉碎样本5g，精密称定，用70％乙醇30mL回流提取40min，滤液挥干，溶于水中，加10mL甲醇溶解，过滤，即得。
色谱条件：
色谱仪：安捷伦1200系列；色谱柱：Eclipse XDB‐C18(4.6*150mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：甲醇：水；紫外检测波长：280nm；进样量：10μl；
样品测定：准确吸取制备液样品10μl，注入高效液相色谱仪进行色谱测定。
七彩虹竹秆中黄酮类化合物的提取分离：
利用回流提取法从七彩虹竹秆原料中进行总成分提取，并利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的6种化合物。
植物的有效成分的提取有溶剂法，水蒸气蒸馏法和升华法等。溶剂提取法是选择适当的溶剂将植物中的化学成分从中提取出来，可将固体样品按极性递增方式，用不同溶剂，如石油醚提游离甾体，氯仿或乙酸乙酯提生物碱，有机酸等。得到各个馏分经活性测试确定有效部位后再进一步分离。
采用硅胶吸附柱色谱分离时，吸附剂用量一般为样品量的30‐60倍，应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，以利样品在吸附柱上形成狭窄的原始谱带。洗脱用溶剂的极性宜逐步增大，多用混合溶剂，通过调节比例以改变极性，达到梯度洗脱分离物质的目的。溶剂系统可通过TLC进行筛选，一般TLC展开时使组分Rf值达到0.2‐0.3的溶剂系统可选用为最佳溶剂系统。
初始洗脱剂的选择：选择合适的洗脱剂是分离成败的关键因素，正确的选择洗脱剂能大大提高组分分离效果，对正相硅胶板来讲，洗脱剂极性越大，其洗脱能力越强，如果选择大极性的溶剂作为洗脱剂，很可能一下子把所有的组分都冲下来，因此应选择极性较小的溶剂作为洗脱剂，洗脱剂采用石油醚、乙酸乙酯，通过改变各种溶剂的配比来改变其极性，直到摸索到一个能使组分在正相薄层色谱法(TLC)展开，并且能将各个主要斑点分开，无重叠现象，有效成分的比移值小于0.2。经过多次试验，通过将乙酸乙酯层溶液用薄层分析法分析，用5％硫酸乙醇显色剂显色。
七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量：
利用高效液相色谱法对七彩虹竹秆中四种黄酮类化合物不同时期的含量进行测定。结果表明未见光幼秆中黄酮类含量较高，见光幼秆居中，成熟秆中的黄酮类化合物含量急剧减少，说明在七彩虹 竹秆的生长发育过程中黄酮物质含量较高的部位是幼嫩未见光部分。四种标准品的含量测定结果表明，牡荆苷和异牡荆苷的含量最高，最高能达到10.2％，用作为七彩虹竹含量测定的指标成分进行定量分析。
波长的选择：荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷和木犀草素的紫外吸收光谱分别具有多个吸收峰，在200‐900nm范围进行全波长扫描，选择波长要既能兼顾所有标准品的检测敏感度，又能将外源干扰降低到最小限度，因此，选择了280nm作为检测波长，并收到较好的实验效果。
HPLC条件的选择：曾试图用固定甲醇‐水为流动相，但分离效果不佳。采用甲醇‐水梯度洗脱的方法，获得了较好的分离效果。同时测定七彩虹竹中的四个指标成分荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷和木犀草素，分离度好，杂质峰干扰少，完全出峰时间在32min内。该方法快速、准确、可靠。
溶液的稳定性：详细考察了样品和对照品的稳定性，结果表明：二者在室温、普通光照的条件下24h稳定，不需要特殊保存。
七彩虹竹秆中黄酮类化合物乙酸乙酯层提取分离结果：
化合物的结构鉴定：
化合物1：
淡黄色针状结晶，淡黄色针状结晶，在三种展开系统中的Rf值为(氯仿：丙酮＝5：1，0.36；氯仿：甲醇＝9：1，0.23；石油醚：乙酸乙酯＝2：1，0.21)，均为单一黄色斑点，推断为单体化合物，具体结构亦需进一步通过光谱解析得到。黄色粉末，盐酸‐镁粉反应呈阳性，UVλmax 253.3、349.2nm，显示为黄酮类化合物的吸收峰。与木犀草素标准品进行TLC对照，在3种不同展开溶剂中Rf值和显色一致，且混合熔点不下降。综合上述特征，故鉴定该化合物为木犀草素(Luteolin)。
化合物2：黄色粉末，盐酸‐镁粉反应呈阳性，Molish反应阳性，酸水解后只检测出葡萄糖。UVλmax253.3、349.2nm，提示该化合物为黄酮苷类化合物，且所连糖为葡萄糖。与木犀草素‐7‐O‐β‐D‐葡萄糖苷标准品进行TLC对照，在多种溶剂中Rf值和显色一致，且混合熔点不下降，可确定该化合物为木犀草素‐7‐O‐β‐D‐葡萄糖苷(Luteolin‐7‐O‐β‐D‐glucopyranoside)。
化合物3：淡黄色片状结晶，盐酸镁粉反应呈阳性，Molish反应呈阳性，证明是黄酮类化合物。与荭草苷和异荭草苷标准品对照，采用三种不同展开系统进行展开，TLC薄层色谱法鉴别，与荭草苷具有相同Rf值，且混合熔点不下降，确定该化合物为荭草苷(orientin)。
化合物4：白色针状结晶，mp 132～134℃。Liebermann‐Burchard反应阳性。与β‐谷甾醇对照品对照，在三种展开系统中的Rf值一致(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，环己烷：丙酮＝6：1，纯氯仿)，混熔点不下降。故确定该化合物为β‐谷甾醇(β‐sitosterol)。
化合物5：黄色结晶，mp 260～262℃，三氯化铁反应呈阳性，Smith降解反应生成葡萄糖，显示其中含有葡萄糖的黄酮苷类，对对照品牡荆苷共同薄层色谱鉴别，Rf值一致，故鉴定该化合物为5,7,4’‐ 三羟基黄酮‐8‐β‐D‐葡萄糖，即牡荆苷(vitexin)
化合物6：白色粉末，在三种展开系统中的Rf值为(氯仿：丙酮＝4：1，0.50；氯仿：甲醇＝9：1，0.19；石油醚：乙酸乙酯＝2：1，0.23)，均为单一斑点，推断该化合物为单一化合物。与β‐胡萝卜苷对照，TLC结果确定该化合物为为胡萝卜苷(Daucosterol)。
七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量测定：
色谱条件：
在200～900nm波长范围内选择不同波长进行分析测试，发现在280nm处最高，因此选择280nm为最佳检测波长。流动相用乙腈：水，待测物的分离效果最好。柱温对样品测定有很大影响，温度低时，出峰时间长，而且峰严重拖尾；温度太高，则出峰太快，待测峰有部分重叠，实验发现，恒定柱温为35℃，待测峰的重现性和保留时间都比较理想。对照品、样品色谱图(见图1和图2)。
结果表明，在现行色谱条件下4个标准品与其他组分得到了很好的分离，4个指标成分色谱峰理论塔板数均不小于2000，各指标成分的色谱峰与其他峰分离度均大于1.5。
线性关系考察：
分别精密吸取“2.3.3.3”项下制备的对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置100mL量瓶中，加甲醇定容,摇匀，配制成系列浓度的对照品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，以色谱峰面积Y为纵坐标，样品浓度X(mg·mL‐1)为横坐标，绘制标准曲线(如下表1‐4；图3，4，5，6)。
表1 1号标准品峰面积与浓度关系表
表2 2号标准品峰面积与浓度关系表
表3 3号标准品峰面积与浓度关系表
表4 4号标准品峰面积与浓度关系表
经线性回归，得标准品1号、2号、3号、4号回归方程为：
Y＝29830X+78.3 r＝0.9993
Y＝120430X+37.1 r＝0.9998
Y＝152330X‐12.3 r＝0.9996
Y＝69660X+31 r＝0.9998
对照品1号荭草苷；2号牡荆苷；3号异牡荆苷；4号木犀草素在0.01～0.05mg·mL‐1范围内线性关系良好。
精密度试验：
吸取“2.3.3.3”项下制备的对照品储备液，重复进样5次，结果黄酮标准品峰面积的RSD(Relative Standard Deviation)分别为3.0％，0.8％，2.5％，2.8％。
重复性试验：
取同一批七彩虹竹样品溶液5份，分别按样品含量测定方法操作，测定峰面积，计算得混合标准品含量的RSD分别为1.5％，1.7％，2.5％，2.3％，1.9％。
稳定性试验：
取七彩虹竹供试品溶液，分别在0，4，8，12，16h，进样测定峰面积，结果混合标准品含量RSD分别为0.9％，1.2.％，2.2％，1.0％，2.5％，表明供试品溶液在16h内基本稳定。
回收率试验：
精密称取已知含量的七彩虹竹样品9份，每份约1.5g，分别加入对照品溶液，按供试品溶液制备方法操作，并按上述色谱条件测定峰面积，计算5种成分的回收率，测定结果，平均加样回收率均在95％‐105％置性区间，符合要求。
七彩虹竹秆在不同生长发育时期中黄酮类化合物的含量测定：
取不同生长发育时期的七彩虹竹样本，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，每次进样10μL，按照色谱条件测定峰面积，以外标法计算含量。结果见表5。
表5不同生长发育时期七彩虹竹黄酮的含量测定结果(％，n＝3)
含量测定结果表明，未见光幼秆黄酮类化合物含量较高，见光幼秆居中，成熟秆的黄酮类化合物含量急剧减少，说明在七彩虹竹秆在生长发育过程中黄酮类化合物含量较高的部位是幼嫩未见光部分。四种标准品的含量测定结果表明，牡荆苷和异牡荆苷的含量最高，最高能达到10.2％，可作为七彩虹竹含量测定的指标成分进行定量分析。
黄酮类化合物在七彩虹竹秆中的分布状况：
利用3种黄酮类化合物显色试剂对七彩虹竹的秆进行的组织化学定位，探求黄酮类化合物的分布状况，同时也为七彩虹竹的合理利用提供基础。显色结果为：黄酮类化合物分布于表皮层、表皮层内方的机械组织和维管束周围；在基本组织中也有零散的分布，在维管束原生韧皮部和原生木质部中也有黄酮化类合物分布。前人谭玲玲等人对北柴胡营养器官中主要化学成分作了组织化学定位，结果表明，柴胡的黄酮类化合物在茎中分布在表皮、棱角处的厚角组织、皮层、髓射线和髓鞘细胞中(谭玲玲，2007)。李晓丹对药用石韦的黄酮化合物的组织化学定位，结果表明药用石韦的黄酮类化合物基本分布于叶柄的皮层厚壁组织、髓细胞、维管束鞘及韧皮部；在根状茎中主要分布在表皮、髓细胞及韧皮部(李晓丹，2008)。这些前人的研究结果与本研究的结果相似，通过该研究能为探索竹类植物中黄酮类化合物的合成分布提供有效的理论基础。
利用2种黄酮类化合物显色试剂对七彩虹竹不同生长期秆中黄酮类化合物进行染色，以探求黄酮类化合物在不同生长期秆中的分布和含量变化。七彩虹竹秆在不同时期中黄酮类化合物染色结果显示，幼嫩的秆生长变为成熟秆的过程中，表皮层中的荧光变化并不大，表皮层内方的机械组织和维管束周围的荧光均呈现一定的增长趋势。由于竹类植物是木本植物，所以在用组织化学定位法对秆不同时期中黄酮类化合物的分布和含量的研究中，需要考虑到木质素对其的影响。木质素具有自发荧光特点和荧光染色现象，对黄酮类化合物的组织化学定位有很大的干扰。因此，也对七彩虹竹不同生长期秆中木质素进行组织化学定位，染色结果显示：幼嫩的秆生长变为成熟秆的过程中，表皮层内方的机 械组织和维管束周围的木质素均呈现一定的增长趋势，但是木质素组织化学定位后产生的红色的增长趋势比黄酮类化合物组织化学定位后的产生的荧光是增长趋势更大。由此可以初步断定，幼嫩的秆生长变为成熟秆的过程中，七彩虹竹秆中的黄酮类化合物也在逐渐减少。
由于本实验之中涉及到荧光显微镜观察技术，在该实验中出现了荧光淬灭的现象。荧光淬灭又称荧光熄灭：是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光淬灭的原因有很多，主要的有如下几类：因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的的配位化合物；溶解氧的存在，使得荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子转变至三重态；当荧光物质浓度过大时,会产生自淬灭现象。因此，在切片制好后，应随即观察。

Claims (10)

1.一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，利用回流提取法从七彩虹竹秆原料中进行总成分提取，并利用硅胶柱色谱分离，分离出晶体化合物，再经TLC薄层鉴别和光谱解析，得到该植物所含的6种化合物，并进一步进行含量测定。
2.如权利要求1所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其特征在于所述的总成分提取采用回流提取法，将七彩虹竹秆粉碎，用70％的乙醇在容器中水浴加热冷却回流提取3次，每次1-2小时，重复3次，过滤，合并滤液，丢弃秆渣；用旋转蒸发器仪65℃左右对初提液进行旋蒸，蒸出溶液中的乙醇，得到七彩虹竹秆浸膏。
3.如权利要求1所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其特征在于所述的硅胶柱色谱分离晶体化合物是采用石油醚与水提液共同萃取上一步骤回流提取所得浸膏，萃取24小时后用分液漏斗分离，分别用石油醚萃取4次，下层为水提物，上层为石油醚萃取物，把4次萃取上层混合，然后上层用旋转蒸发仪旋蒸，把石油醚蒸出，得到石油醚浸膏，把剩下的下层水提物和乙酸乙酯共同混合萃取24小时后用分液漏斗分离，同样用乙酸乙酯萃取4次，下层为水提物，上层为乙酸乙酯萃取物，把五次萃取上层混合，再用旋转蒸发仪旋蒸，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，再把剩下的水提物用正丁醇萃取，分别用正丁醇萃取4次，把上层正丁醇萃取物混合，用旋转蒸发仪蒸出正丁醇，得到正丁醇浸膏，最后把水提物层用旋转蒸发仪蒸出蒸馏水，得到水层浸膏；乙酸乙酯萃取部分16.0g用200-300目硅胶柱层析色谱法分离，以100∶-1∶1的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱甲柱，称取硅胶，称10倍于上样量；洗脱出的干物质重量、结晶情况待合并完成后，观察并记录洗脱出的干物质重量、结晶情况；
将甲柱18-37馏分用乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，采用200-300目硅胶柱层析装柱分离，采用10:1石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，得到馏分，通过TLC薄层色谱法鉴定，合并相同馏分，并观察结晶情况；
同时，将甲柱中石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱部分得到馏分合并，干燥称重g，用甲醇溶解，用100-200目硅胶拌样，进行200-300目硅胶柱层析分离，采用8:1氯仿-甲醇系统梯度洗脱，得到各馏分，观察结晶情况。
4.如权利要求1所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其特征在于所述的晶体化合物含量测定采用280nm为检测波长，流动相用乙腈∶水。
5.如权利要求1所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其特征在于用七彩虹竹秆幼嫩未见光部分为原料，以所含化合物牡荆苷和异牡荆苷作为七彩虹竹含量测定的指标成分进行定量分析。
6.如权利要求1所述的一种从七彩竹秆中提取分离黄酮类化合物的方法，其特征在于所述的从七彩竹秆中提取分离到的黄酮类化合物为化合物1木犀草素、化合物2木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、化合物3荭草苷、化合物4β-谷甾醇、化合物5牡荆苷、化合物6胡萝卜苷。
7.七彩竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，其特征在于以七彩虹竹的健康新鲜的竹秆为材料，取新鲜的竹秆，将竹秆上的竹叶去净，经风干后，粉碎至20目，避光贮存，运用在组织切片的拟检成分起化学反应，形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，用以定位七彩竹秆中黄酮类化合物在组织或细胞内的分布含量，测定七彩竹中黄酮类化合物在不同部位成分的含量。
8.如权利要求7所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，其特征在于七彩虹竹中黄酮类化合物组织化学定位方法采用：
(1)5％NaOH溶液染色法：新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴5％NaOH水溶液，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，5min后用在自然光下观察并照相，黄酮类化合物经5％NaOH水溶液染色会产生特征性的显色反应，变色范围从淡黄色至橙色；
(2)1％醋酸镁溶液染色法：
新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴1％醋酸镁甲醇溶液，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的蓝色激发光450-490nm为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相，黄酮类化合物经1％醋酸镁甲醇溶液染色，发出绿色荧光；
(3)1％NA甲醇溶液染色法：
新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后滴加一滴含1％NaCl的磷酸缓冲液，片刻后滴加NA甲醇溶液试剂一滴，盖上盖玻片，同时去掉多余的试液，随即用荧光显微镜的紫外光激发光330-380nm为激发光源观察黄酮类化合物发出的荧光并照相，在紫外光下，1％NA甲醇溶液与黄酮类化合物反应呈黄色荧光。
9.如权利要求7所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，其特征在于七彩虹竹中木质素的组织化学定位法采用新鲜七彩虹竹秆经徒手切片后用2％的间苯三酚酒精95％溶液浸泡5min，再用6mol·L-1HCL进行封片，在自然光下观察，Wiesner反应对木质素产生颜色反应呈现暗红色。
10.如权利要求7所述的七彩虹竹中黄酮类化合物的组织化学定位方法，其特征在于不同时期七彩虹竹秆中黄酮类化合物的组织化学定位采用取当年生枝的七彩虹竹秆，根据七彩虹竹秆的成熟程度和光照对秆的影响分为三个时期，时期Ⅰ为未见光的秆，秆均呈淡黄色，时期Ⅱ为见光的幼秆，竹秆整体或者上端出现淡红色，时期为Ⅲ成熟秆，竹秆出现淡红色至暗红色，从表皮层、表皮层内方的机械组织、维管束进行观察，并分析组织化学定位荧光的变化来确定含量的变化。
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