CN109444288A - 一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，包括：将采集‘凤丹’牡丹幼嫩叶为原料，真空干燥，粉碎得到处理粉末；将处理粉末在不同工艺条件下酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提后离心，得到上清液，混合两次上清液，定容得到多酚提取液；选取酶浓度、酶解温度、酶解时间、pH为考察因素做单因素变量试验，以多酚提取液的多酚提取率(Y)为响应值，进行响应面设计，得到最优提取工艺；用HPLC法分析测定叶片多酚提取液的多酚主要化学成分。本发明是一种提取效率高、工艺条件准确且操作简便的响应面优化‘凤丹’牡丹叶片多酚的提取工艺，建立了凤丹叶片多酚的HPLC检测方法，明确了多酚的主要化学成分及含量。
Description
技术领域
本发明涉及木本油料资源利用技术领域，尤其涉及一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法。
背景技术
牡丹是芍药科芍药属牡丹组，多年生落叶小灌木。‘凤丹’牡丹是由牡丹野生原种杨山牡丹经过长期栽培演化形成的观赏、食用兼药用的品种群，是我国油用牡丹栽培的主要类型，目前在山东、河南、河北、陕西、陕西、安徽、湖北、四川、江苏、湖南等十多个省区广泛栽培。‘凤丹’牡丹是传统的中药材，其花、果实、根、叶均具有较高的开发利用价值。‘凤丹’牡丹叶富含蛋白、维生素、矿物质、多酚、黄酮、多糖等多种营养、活性成分，是开发功能保健茶、食品添加剂的良好原料，具有较好的市场开发应用前景。‘凤丹’牡丹叶资源量大，但其开发利用不充分，建立其多酚高效提取工艺，对深入挖掘资源价值，提高产业附加值具有重要的意义。
植物多酚具有良好的生物活性，具有抗氧化、防衰老、消除人体自由基、抗辐射、降血糖、防治心血管疾病等保健功能，在食品、保健、医药等有广泛的应用。多酚提取方法主要有有机溶剂萃取法、超声辅助提取法、微波提取法、生物酶解提取法等。有机溶剂萃取法是最早使用和使用最为广泛的多酚提取方法，不需要特殊的仪器、操作简便，但该法存在溶剂使用量大、耗时长、提取效率低等缺点。已有的关于凤丹叶片多酚的提取为传统的溶剂浸提等方法，提取效率不高，仅为15mg/g左右，此外凤丹叶片多酚的主要成分尚不清楚，也没有建立相关的检测技术。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，针对现有的关于‘凤丹’牡丹叶片多酚的提取为传统的溶剂浸提方法，提取效率不高，且‘凤丹’牡丹多酚的主要成分尚不清楚，也没有建立相关的检测技术等问题，提出了一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，该基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法包括以下步骤：
(1)将采集‘凤丹’牡丹幼嫩叶为原料，真空干燥，粉碎成粉末状，得到处理粉末；
(2)将处理粉末在不同工艺条件下酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提后离心，得到上清液，混合两次上清液，定容至100ml，得到多酚提取液；
(3)选取酶浓度、酶解温度、酶解时间、pH为考察因素，做单因素变量试验，在单因素实验结果的基础上，以多酚提取液的多酚提取率(Y)为响应值，通过Design-Expert 7.0软件进行响应面设计，对各因素进行多项式拟合回归，得到回归方程：
Y＝34.45+0.11A+1.07B+4.01C+0.50D-0.66AB-0.032AC-4.55AD+0.95BC-0.62BD-0.78CD-3.82A2-6.14B2-7.01C2-4.48D2
式中A代表酶浓度，B代表酶解时间，C代表酶解温度，D代表pH值，Y代表多酚得率；
(4)对上述回归方程进行计算得到‘凤丹’牡丹多酚的最优提取工艺：条件纤维素酶浓度为149.34U/mL，pH值为5.05，酶解时间为105.83min，酶解温度为50.30℃，在此条件下提取多酚含量为35.097mg/g；
(5)用HPLC法分析测定叶片多酚提取液的多酚主要化学成分；
(6)通过对比峰面积可知提取液中没食子酸的含量约为3.27mg/L，原儿茶酸的含量约为0.52mg/L，儿茶素和绿原酸的含量约为2.54mg/L，表儿茶素的含量约为0.02mg/L，咖啡酸的含量约为0.37mg/L，阿魏酸的含量约为4.53mg/L，根皮苷的含量约为10.86mg/L。
其中，步骤(1)中，真空干燥的条件为：温度50℃，干燥时间24小时。
其中，步骤(2)中，对沉淀物进行水提离心，料液比1:20，温度50℃，搅拌1h。
其中，步骤(5)中，选取10种多酚标准品：没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、山奈酚。
其中，步骤(5)中，色谱条件为：流动相中溶剂A为三氟乙酸，pH＝2.5，溶剂B为乙腈，梯度洗脱：10％-50％溶剂B，0-20min，50％-100％溶剂B，20-22min，100％溶剂B，22-30min，10％溶剂B，30-40min，流速为1mL/min，进样量为20μL，柱温30℃，检测器为紫外检测器，在波长280nm条件下检测。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：本基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法是一种提取效率高、工艺条件准确且操作简便的响应面优化‘凤丹’牡丹叶片多酚的提取工艺，建立了‘凤丹’牡丹叶片多酚的HPLC检测方法，明确了多酚的主要化学成分及含量，并评价了其抗氧化性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的酶浓度对多酚提取液的影响图；
图2为本发明提供的酶解温度对多酚提取率的影响图；
图3为本发明提供的酶解时间对多酚提取量的影响图；
图4为本发明提供的pH对多酚提取量的影响图；
图5为本发明提供的酶浓度和pH值因素间交互作用对响应值的影响图；
图6为本发明提供的酶浓度和酶解时间因素间交互作用对响应值的影响图；
图7为本发明提供的酶浓度和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图；
图8为本发明提供的pH和酶解时间因素间交互作用对响应值的影响图；
图9为本发明提供的pH和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图；
图10为本发明提供的酶解时间和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图；
图11为本发明提供的多酚标准品混合标液的液相色谱图；
图12为本发明提供的‘凤丹’牡丹叶片多酚粗提液与多酚标准品混合标液的液相色谱对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
‘凤丹’牡丹多酚提取方法：
仪器：ME203E型电子天平，i8型双光束紫外/可见分光光度计，EMS-50-双列十孔恒温水浴锅，TGL-20M高速离心机，TGCXN-2B超声循环提取机，E2695高效液相色谱仪。
试剂：没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、山奈酚标准品购自上海源叶生物科技有限公司；乙醇，AR级，购自国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶，购自日本Yakult工业股份有限公司；其他试剂未加说明皆为分析纯。
对照品溶液的制备及标曲的绘制：取2.5mg没食子酸标准品溶于1000mL的超纯水中，用容量瓶定容，充分混匀后得到其母液。分别吸取上述母液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL体积于25mL具塞试管中，分别加入1.0mL的福林酚试剂，然后加入3.0mL 10％Na2CO3溶液，用超纯水定容至25mL，常温下避光反应1h。以超纯水为空白样，在745nm处分别测定其吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:Y＝94.75X+0.07821，r＝0.9991。
供试品溶液的制备与测定：取‘凤丹’牡丹叶粉末1g，在不同工艺下进行酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提(料液比1:20，温度50℃，搅拌1h)后离心，混合两次上清液，定容至100ml。取稀释一定倍数的待测样品，取1mL样品于25mL具塞试管，超纯水定容至25mL，按照上述方法测量样品中的多酚含量。
单因素考察试验：
实施例1
考察酶浓度对‘凤丹’牡丹叶片多酚提取量的影响：称取‘凤丹’牡丹叶粉末5份，每份1g，分别在50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的纤维素酶溶液中酶解，酶解温度50℃、酶解时间100min、pH值5.0，按照前述的多酚提取方法测定并计算多酚含量，如图1所示，结果表明纤维素酶浓度为150U/mL时，多酚提取率最高。
实施例2
考察酶解温度对‘凤丹’牡丹叶片多酚提取量的影响：称取‘凤丹’牡丹粉末5份，每份1g，在150U/mL的纤维素溶液中酶解，酶解时间100min，pH值5.0，酶解的温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，按照前述的多酚提取方法测定并计算多酚含量，如图2所示，结果表明酶解温度为50℃时，多酚提取率最高。
实施例3
考察酶解时间对‘凤丹’牡丹叶片多酚提取率的影响：称取‘凤丹’牡丹叶粉末5份，每份1g，在150U/mL的纤维素溶液中酶解，酶解温度为50℃，pH值5.0，酶解的时间分别为40min、60min、80min、100min、120min，按照前述的多酚提取方法测定并计算多酚含量，如图3所示，结果表明酶解时间100min时，多酚提取率最高。
实施例4
考察pH值对‘凤丹’牡丹叶片多酚提取率的影响：称取‘凤丹’牡丹叶粉末5份，每份1g，在150U/mL的纤维素溶液中酶解，酶解温度为50℃，酶解时间100min，pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，按照前述的多酚提取方法测定并计算多酚含量，如图4所示，结果表明酶解时间5.0时，多酚提取率最高。
响应面优化试验：
因素水平的选取与实验设计，通过对单因素考察的结果，选取酶浓度(A)酶解温度(B)、酶解时间(C)、酶解pH值(D)四个因素，通过Design-Expert7.0软件进行响应面设计，以单因素实验最优点为中心，围绕最优点上下各取1个值为影响面水平，以‘凤丹’牡丹多酚提取率为考察指标，设计出4因素3水平29个实验点的响应面分析，响应面设计的因素和水平见表1，响应面设计组合和多酚提取率见表2。
表1响应面设计的因素和水平
表2响应面设计组合和多酚提取率
回归模型的建立及相关分析：
采用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行回归拟合，得到回归方程：
Y＝34.45+0.11A+1.07B+4.01C+0.50D-0.66AB-0.032AC-4.55AD+0.95BC-0.62BD-0.78CD-3.82A2-6.14B2-7.01C2-4.48D2
式中A代表酶浓度，B代表酶解时间，C代表酶解温度，D代表pH值，Y代表多酚得率，对上述回归方程进行计算得到‘凤丹’牡丹多酚的最优提取工艺条件。
表3回归模型的方差分析表
注:P<0.05，影响显著；P<0.01，影响极显著。
表4模型拟合分析表
由表3、4可知，该模型是显著的(P<0.01)，失拟合项方差分析表明，F值为3.814，p大于0.05，说明模型合理，无需拟合更高次项方程。模型决定系数为0.926，说明响应值的变化92.6％来源于所选因素，模型拟合良好；变异系数(coefficient variability，CV％)表示不同水平的处理组之间的变异程度。模型变异系数为8.48％，变异小，说明模型的可信度高，实验数据合理，可重复性较好。信噪比(adeq precision)是表示信号与噪声的比例，通常希望该值大于4。本模型中信噪比值为11.070，说明了模型的充分性和合理性，模型具有足够高的精确度，能准确地反映实验结果。
各因素影响多酚提取率的响应面分析，从回归模型可见，C2、B2、C-酶解时间、D2、A2、AD对多酚提取量影响在0.01水平显著，从F值大小可见，对多酚提取量影响由大到小是C2、B2、C-酶解时间、D2、A2、AD，说明实验因素对提取量的影响不是简单的线性关系，二次方的影响较大，同时AD还存在交互作用，C-酶解时间存在线性效应。
根据回归方程可绘制相应的响应面曲图，它是响应值在各因素交互作用下构成的一个三维空间曲图，可以较直观地分析两因素交互作用对响应值的影响情况。根据回归方程做出的响应曲面及其等高线见图5-10。图5为本发明提供的酶浓度和pH值因素间交互作用对响应值的影响图；图6为本发明提供的酶浓度和酶解时间因素间交互作用对响应值的影响图；图7为本发明提供的酶浓度和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图；图8为本发明提供的pH和酶解时间因素间交互作用对响应值的影响图；图9为本发明提供的pH和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图；图10为本发明提供的酶解时间和酶解温度因素间交互作用对响应值的影响图。
通过软件Design-Expert对响应面试验优化分析得知，当酶浓度为149.34U，pH值为5.05，酶解时间为105.83min，酶解温度为50.30℃，多酚含量提取量最大。在最优条件下，多酚含量的理论预测值35.097mg/g。根据响应面优化的最佳条件进行实测验证，重新测定多酚含量，所得多酚含量真实值为34.656mg/g，预测值与实际测量值吻合度为98.74％，接近模型预测值。因此，基于响应面设计的酶法提取‘凤丹’牡丹多酚的工艺条件合理可靠，具有实用价值。
用HPLC法分析测定‘凤丹’牡丹叶片提取液的多酚主要化学成分：
选择10种多酚标准品(没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、山奈酚)。
色谱条件：流动相中溶剂A为三氟乙酸(pH＝2.5)，溶剂B为乙腈，梯度洗脱：10％-50％溶剂B(0-20min)，50％-100％溶剂B(20-22min)，100％溶剂B(22-30min)，10％溶剂B(30-40min)，流速为1mL/min，进样量为20μL，柱温30℃，检测器为紫外检测器，在波长280nm条件下检测。
图11为本发明提供的多酚标准品混合标液的液相色谱图；(1没食子酸、2原儿茶酸、3儿茶素和绿原酸、4表儿茶素、5咖啡酸、6阿魏酸、7根皮苷、8槲皮素、9山奈酚图)。12为本发明提供的‘凤丹’牡丹叶片多酚粗提液与多酚标准品混合标液的液相色谱对比图；(1没食子酸、2原儿茶酸、3儿茶素和绿原酸、4表儿茶素、5咖啡酸、6阿魏酸、7根皮苷)。
结果表明：‘凤丹’牡丹叶片多酚粗提液在保留时间4.24、6.14、7.3、8.3、8.57、11.47、13.18min出峰，与多酚标准品混合标液相谱图相比，可知其中含有没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷。
通过对比峰面积，可知提取液中没食子酸的含量约为3.27mg/L，原儿茶酸的含量约为0.52mg/L，儿茶素和绿原酸的含量约为2.54mg/L，表儿茶素的含量约为0.02mg/L，咖啡酸的含量约为0.37mg/L，阿魏酸的含量约为4.53mg/L，根皮苷的含量约为10.86mg/L。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：本基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法是一种提取效率高、工艺条件准确且操作简便的响应面优化‘凤丹’牡丹叶片多酚的提取工艺，建立了‘凤丹’牡丹多酚的HPLC检测方法，明确了多酚的主要化学成分及含量，并评价了其抗氧化性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将采集‘凤丹’牡丹幼嫩叶为原料，真空干燥，粉碎成粉末状，得到处理粉末；
(2)将处理粉末在不同工艺条件下酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提后离心，得到上清液，混合两次上清液，定容至100ml，得到多酚提取液；
(3)选取酶浓度、酶解温度、酶解时间、pH为考察因素，做单因素变量试验，在单因素实验结果的基础上，以多酚提取液的多酚提取率(Y)为响应值，通过Design-Expert 7.0软件进行响应面设计，对各因素进行多项式拟合回归，得到回归方程：
Y＝34.45+0.11A+1.07B+4.01C+0.50D-0.66AB-0.032AC-4.55AD+0.95BC-0.62BD-0.78CD-3.82A2-6.14B2-7.01C2-4.48D2
式中A代表酶浓度，B代表酶解时间，C代表酶解温度，D代表pH值，Y代表多酚得率；
(4)对上述回归方程进行计算得到‘凤丹’牡丹多酚的最优提取工艺：条件纤维素酶浓度为149.34U/mL，pH值为5.05，酶解时间为105.83min，酶解温度为50.30℃，在此条件下提取多酚含量为35.097mg/g；
(5)用HPLC法分析测定叶片多酚提取液的多酚主要化学成分；
(6)通过对比峰面积可知提取液中没食子酸的含量约为3.27mg/L，原儿茶酸的含量约为0.52mg/L，儿茶素和绿原酸的含量约为2.54mg/L，表儿茶素的含量约为0.02mg/L，咖啡酸的含量约为0.37mg/L，阿魏酸的含量约为4.53mg/L，根皮苷的含量约为10.86mg/L。
2.根据权利要求1所述的基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，真空干燥的条件为：温度50℃，干燥时间24小时。
3.根据权利要求1所述的基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对沉淀物进行水提离心，料液比1:20，温度50℃，搅拌1h。
4.根据权利要求1所述的基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，选取10种多酚标准品：没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸、根皮苷、槲皮素、山奈酚。
5.根据权利要求4所述的基于响应面优化的‘凤丹’牡丹多酚提取与检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，色谱条件为：流动相中溶剂A为三氟乙酸，pH＝2.5，溶剂B为乙腈，梯度洗脱：10％-50％溶剂B，0-20min，50％-100％溶剂B，20-22min，100％溶剂B，22-30min，10％溶剂B，30-40min，流速为1mL/min，进样量为20μL，柱温30℃，检测器为紫外检测器，在波长280nm条件下检测。
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