CN112014517B - 一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法 - Google Patents
一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,属于中药材鉴定领域,该方法包括如下步骤:1)将采集的三七块根样品洗净、烘干、粉碎;2)检测三七粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C比率,单位为‰;按照判别模型Y春三七=‑548.75‑2.07δ2H+13.29δ18O‑25.03δ13C,Y冬三七=‑665.56‑2.07δ2H+14.89δ18O‑27.85δ13C,可得到Y春三七、Y冬三七的数值;若Y春三七>Y冬三七,则判定为春三七;若Y春三七<Y冬三七,则判定为冬三七。本发明从三七本身具有的稳定同位素指纹差异入手,利用C、H、O三个元素稳定同位素指纹特征建立春三七与冬三七的判别模型,检测指标少、精度高、方法简便、重复性好、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对春三七与冬三七的整体鉴别率能达到100%,均无错判。
Description
技术领域
本发明属于中药材鉴定领域,具体地说,涉及一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法。
背景技术
三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科多年生草本植物,生药称三七,味甘、微苦、性温。三七具有止血、活血化瘀、抗疲劳、抗衰老、耐缺氧、降血糖和提高机体免疫力等功效,对三七功用的认识也从"活血化瘀、消肿定痛"延伸到整个心脑血管系统、中枢神经系统、代谢系统等领域。由于三七特殊的生理生态需求,其分布范围十分狭小,仅限于云南的东南部、西南部、东部、中部、西部及其周边的贵州省和广西省的某些区域。云南文山曾经为三七的主要产区,由于连作障碍和对三七的需求增加,现三七的种植区域已向云南省的红河、玉溪、曲靖、昆明、大理、保山、普洱等州市扩展。现在云南文山州境内主要为三七种子和种苗产区。
三七块根分为“春三七”(简称“春七”)和“冬三七”(简称“冬七”)。春七指未留红籽(三七种子)的3-4年生三七块根,一般于农历八月十五后,即10月-11月采挖,并不是春天采挖的三七。春七每年花期摘取了三七花蕾,全株营养成分供于根部;冬七指留过红籽的三年生三七块根,一般于采籽后的次年1—2月采挖,并不是冬天采挖的三七。由于2年生三七籽少且千粒重小,种子质量差,一般不留红籽。因此,冬七均为3年生三七。由于三七花在成长为红籽的期间吸收了大量营养成分,故冬三七块根个头及密度较小。中医传统认为春七药效成分高于冬七、疗效好于冬七。但最新研究表明,冬七和春七皂苷组分及其比例基本一致,但冬七皂苷组分含量及氨基酸含量均高于春七。需要进一步研究两者其余药效成分及其药理的差异。因春七外观美观,无论是原料销售还是被加工成各类终端产品,春七都备受消费者青睐。因冬七外观逊色,主要被用于集中加工提取有效成分,在市场中也占有一席之地。冬七主要分布在文山州海拔1200-1600米的区域,占文山州三七种植面积的一半左右,在整个三七产量中约占10%的份额。因此,准确鉴别冬七与春七对中医三七药材鉴定、三七企业原料确证和贸易具有重要的意义。
传统的冬七和春七鉴别主要靠外观,一般认为,春七气势足、饱满、体重、坚实、不空泡、无裂痕,细纹紧密,横断面菊花心明显;冬七气势不足,瘦而皱缩,不饱满,密度小,质地泡松。由于外观受栽培和初加工工艺影响较大,仅靠外观很难准确鉴别冬七和春七,尤其在打粉后两者则无法区别。因此,需要建立科学的技术对其进行鉴别,以促进三七产业的健康发展,保障消费者的权益,提高消费者的消费信心。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种基于稳定同位素指纹的春三七与冬三七块根鉴别方法,仅用C、H、O三种稳定同位素指纹建立判别模型,检测指标少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七和冬七块根的整体判别率达到100%。
为了达到上述目的,本发明提出如下技术方案:
一种基于稳定同位素指纹的春三七与冬三七块根鉴别方法,包括如下步骤:
1)将采集的待测三七块根样品洗净、烘干、粉碎;
2)检测三七块根粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C比率,单位为‰,将δ2H、δ18O、δ13C数值带入到春三七与冬三七的判别模型(1)~(2)中,按照判别模型(1)~(2)即可得到Y春三七、Y冬三七;若Y春三七>Y冬三七,则判定为春三七;若Y春三七<Y冬三七,则判定为冬三七;
Y春三七=-548.75-2.07δ2H+13.29δ18O-25.03δ13C (1)
Y冬三七=-665.56-2.07δ2H+14.89δ18O-27.85δ13C (2)
作为优选,步骤1)中,所述的待测三七块根样品为种植区采集或市场上销售的三七块根或粉末。
作为优选,步骤1)中,用细毛刷在滴加少许洗洁精的洁净自来水中刷洗除去三七块根上的泥土、再用洁净自来水冲洗、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min,60℃~70℃烘干至恒重。
作为优选,步骤1)中所述的三七样品粉碎至粒度为100~200目。
作为优选,步骤2)中的检测仪器为同位素比率质谱仪(IRMS)。
本发明的有益效果:
本发明从春三七与冬三七块根本身具有的稳定同位素指纹差异入手,仅利用C、H、O三个元素稳定同位素指纹特征建立判别模型,检测指标少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七与三年冬七块根的整体判别率能达到100%。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
冬七与春七,由于栽培的目的不同,其目标产品与体内生理生化过程截然不同。冬七以生产种子为目的,主要进行生殖生长,其次是营养生长。其光合产物主要是向上进入果实中,形成胚和胚乳。其次是向下进入芦头和根系中,形成药效成分;而春七则主要进行营养生长,其光合产物全部向下进入芦头和根系中,形成药效成分。因此,两者体内同位素分馏特征具有显著的差异,两者δ2H‰、δ18O‰、δ13C‰具有极显著差异,两者δ15N‰无差异,这也是能够利用稳定同位素指纹对两者进行区别的理论依据(见表1)。
表1冬七与春七主根稳定同位素指纹特征
注:LSD法差异显著性分析,在0.05,0.01水平上差异显著性比较,分别以小写和大写字母标注。
实施例1
1)样品采集
2011-2012年10月~11月分别在广西靖西、广东南雄、云南文山州三七主产县、云南三七新拓展产区(红河、昆明、曲靖、玉溪、保山)随机选择3年生春三七种植户,从其种植地块或区域按东、南、西、北、中随机采集春三七块根15~20个,作为一个样本,共计44个样本-广东1个、广西4个、文山17个、云南新拓展片区22个;在文山州冬三七产区各主产县随机选择3年生冬三七种植户,从其种植地块或区域按东、南、西、北、中随机采集冬三七块根15~20个作为一个样本,共采集12个样本。
2)样品的烘干、粉碎
3)用细毛刷在滴加少许洗洁精的洁净自来水中刷洗除去三七块根表面的泥土、再用洁净自来水冲洗、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min,60℃~70℃烘干至恒重,用万能不锈钢粉碎机将三七样品粉碎至粒度为100~200目。
4)稳定同位素比率测定
稳定氢同位素测定:称取1mg三七块根粉末样品放入银杯中(8mm×5mm),放入96孔酶联免疫盘中,盖上盖子,在室温环境下平衡96h,然后将样品取出放入高温裂解炉的旋转自动进样盘中,样品在1275℃高温下分解为H2、N2和CO气体。然后经过100℃的纯化柱,利用孔径为5nm的分子筛除去N2和CO气体,得到纯净的H2,然后进入DELTAPlus Thermo Finnigan连续流动的同位素比率质谱仪中进行测定。载气He气流量为100mL/min,样品在载气作用下的流量为50mL/min。
稳定氢同位素比率用δ2H‰表示,δ2H‰的相对标准为V-SMOW。计算公式为:δ2H‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=2H/1H。
稳定氧同位素测定:取大约1.0mg三七块根粉末样品放入锡箔杯中,密封,通过自动采样器送入高温元素分析仪(TC-EA)。样品在1430℃的高温下电离为CO气体,然后经过柱温为90℃的气相色谱柱,最后进入同位素比率质谱仪(IRMS)中进行测定。载气He气流量为70mL/min,标准气体为CO。
稳定氧同位素比率用δ18O‰表示,δ18O的标准物质为SMOW(标准平均海洋水)。计算公式为:δ18O‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=18O/16O。
稳定碳同位素测定:称取600~800μg三七块根粉末,先经过Flash EA1112型元素分析仪转化为纯净的CO2和N2气体,再经过型号为ConfloⅢ型稀释仪,最后进入DELTAPlusThermo Finnigan质谱仪进行检测。具体工作参数如下:
元素分析仪:进样器氦气吹扫流量为200ml.min-1,氧化炉温度为1020℃,载气氦气流量为90ml.min-1。
ConfloⅢ条件设定:氦气稀释压力为0.6bar,CO2参考压力为0.6bar。
质谱条件:用USGS24(δ13CPDB=-16‰)标定CO2钢瓶,用标定的钢瓶气作为标准。稳定碳同位素比率用δ13C‰表示,δ13C的相对标准为V-PDB。计算公式为:δ13C‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=13C/12C。
所采集的春三七与冬三七块根3项稳定同位素比率(‰)如表2所示:
表2春三七与冬三七块根样品稳定同位素比率测定值
使用DPSv8.01软件对上述春三七与冬三七块根粉末样品3个稳定同位素比率进行逐步回归分析,分别建立春三七与冬三七的多类逐步判别函数(判别模型),具体如下:
Y春三七=-548.75-2.07δ2H+13.29δ18O-25.03δ13C (1)
Y冬三七=-665.56-2.07δ2H+14.89δ18O-27.85δ13C (2)
利用判别函数对冬三七和春三七块根样品进行判别归类。结果显示,回代检验中,44个春三七以及12个冬三七块根样品均无错判,整体正确判别率为100%。
稳定同位素组合对三年生春七与冬七块根判别分析结果如表3所示:
表3稳定同位素组合对三年生春七与冬七块根判别分析结果
来自\判为 | 春三七 | 冬三七 | 小计 | 正确率 |
春三七 | 44 | 0 | 44 | 100 |
冬三七 | 0 | 12 | 12 | 100 |
上述实例证明,冬七与春七块根样品其C、H、O同位素指纹特征具有显著差异,利用同位素比率质谱仪(IRMS)测定的稳定同位素比率,结合化学计量分析得出的春七与冬七块根判别模型,并利用该判别模型来进行冬七与春七辨别,可以准确、公正地鉴别出三七块根的归属。
本发明从三七本身具有的稳定同位素指纹差异入手,仅利用C、H、O三个元素稳定同位素指纹特征建立春七与冬七判别模型,检测指标少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年生春七与冬七块根的整体判别率能达到100%。
实施例2
1)样品采集:2011-2013年采集中药材市场上、药店、三七企业的饮片、三七礼品及三七粉产品。
2)稳定同位素比率测定:同实施例1.3)
3)三七企业原料及产品稳定同位素指纹特征及判别结果
表4.三七企业产品稳定同位素指纹特征及判别结果
4)利用实例1.建立的春七与冬七判别模型对各三七企业的产品进行抽样鉴别。结果表明:所市场上采集的30个样品中,春七为22个,冬七为8个,切片(饮片)均为冬七所制。苗乡三七实业公司的三七压粉片、有机粉、胶囊、精华素,云南白药集团的生三七粉,特安呐公司的三七主根(礼品)、超细粉,七丹公司的熟粉及超细粉均为春三七块根所制;特安呐公司的活性三七切片,七丹公司的三七切片为冬三七块根所制;特安呐公司的3个三七主根(活性)样品中,有2个为春三七块根所制,1个为冬三七块根所制。
最终,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)将采集的待测三七块根样品洗净、烘干、粉碎;
2)检测三七块根粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C比率,单位为‰,将δ2H、δ18O、δ13C数值带入到春三七与冬三七的判别模型(1)~(2)中,按照判别模型(1)~(2)即可得到Y春三七、Y冬三七;若Y春三七>Y冬三七,则判定为春三七;若Y春三七<Y冬三七,则判定为冬三七;
Y春三七=-548.75-2.07δ2H+13.29δ18O-25.03δ13C (1)
Y冬三七=-665.56-2.07δ2H+14.89δ18O-27.85δ13C (2)。
2.根据权利要求1所述的一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,其特征在于:步骤1)中,所述的待测三七块根样品为种植地块采集或市场上销售的三七块根。
3.根据权利要求1所述的一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,其特征在于:步骤1)中,用细毛刷在滴加少许洗洁精的洁净自来水中刷洗除去三七块根泥土、再用洁净自来水冲洗、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min, 60℃~70℃烘干至恒重。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,其特征在于:步骤1)中所述的三七块根样品粉碎至粒度为100~200目。
5.根据权利要求1所述的一种基于稳定同位素指纹鉴别春三七与冬三七块根的方法,其特征在于:步骤2)中的检测仪器为同位素比率质谱仪(IRMS)。
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