CN104678019A - 一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于稳定同位素指纹鉴别三七块根产地的方法,属于道地中药材产地溯源领域,该方法步骤如下:(1)从广西百色、云南文山、云南新拓展区域任一地域采集三年春七块根样品;(2)将所采集的三年春七块根样品洗净、烘干、粉碎;(3)检测三七粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C、δ15N比率,单位为‰;按照判别模型(1)~(3)可得到Y广西百色片区、Y云南文山片区、Y云南新拓展片区的数值,三七样品来源于数值最大的地域。本发明从三七本身具有的稳定同位素指纹差异入手,利用C、H、O、N四个元素稳定同位素指纹特征建立产地判别模型,检测指标少、精度高,减少基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七产地来源的整体判别率能达到84%以上。
Description
技术领域
本发明属于道地中药材产地溯源领域,具体地说,涉及一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法。
背景技术
三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科多年生草本植物,生药称三七,味甘、微苦,性温。三七具有止血、活血化瘀、抗疲劳、抗衰老、耐缺氧、降血糖和提高机体免疫力等功效,对三七功用的认识也从"活血化瘀、消肿定痛"延伸到整个心脑血管系统、中枢神经系统、代谢系统等领域。三七起源于2500万年前的第三纪古热带中国西南山区,其分布主要局限在23°30′N附近的中高海拔地区,分布范围极其狭小。云南文山为三七的主要产区,其种植面积和产量均占全国70%以上。除云南文山主产区外,现云南文山的周边红河、玉溪、曲靖、昆明、大理、保山、普洱,以及广西百色的靖西、那坡等州(县)也有一定面积的种植,以文山三七品质最佳。三七以块根、卢头入药。卢头呈不规则皱缩块状或条状,表面有数个明显的茎痕及环纹,在三七地下部分中所占比例小,皂苷含量高,主要用于制药企业提取皂苷组分的原料。三七一般生长3年采收,分为春七和冬七,春七是采收当年不留籽的三七块根,冬七为采收当年留籽、次年1~2月采收的三七。冬七面积和产量很小,均分布在文山州1400m~1900m的区域。目前市场上的三七药材基本是春三七块根或其粉末。冬七体积小、重量轻、表面皱缩、密度小、断面有空隙;春七则相反,其体积大、密度大、表面光滑、断面致密、菊花心明显。通常认为春七皂苷含量高于冬七。卢头、春三七块根和冬三七块根仅凭外表和断面就可以准确分开。因此,春三七块根产地鉴别就成为三七产地溯源的关键。近年来,随着三七连作障碍的加 重和三七价格的上涨,三七种植区域已由云南文山扩展到云南的红河、玉溪、昆明、曲靖、铺、普洱、大理、保山等区域。2008年7月,文山三七获地理标志产品保护。
目前中药材溯源主要采用条形码技术,仅从产地、加工、储藏、运输等环节进行记录溯源,未能从中药材本身进行溯源。这种溯源体系是表象的,如果不法商贩受经济利益驱使,采用虚假标签、以次充好、假冒优质产品,在发生贸易纠纷时,无科学的证据。因此,迫切需要建立鉴别中药材原产地的简便、准确、可操作性强的方法,以提高政府对中药材贸易的监管能力,保护中药材生产企业的合法权益,同时帮助消费者辨别真假,避免销售欺诈。
在自然界中,生物体不断与外界环境进行物质交换,其体内同位素组成受气候、环境、生物代谢类型等因素的影响而发生自然分馏效应,从而使不同来源的物质中同位素自然丰度存在差异。这种差异拥有环境因子的信息,反映生物体所处的环境条件。生物体中稳定性同位素组成是物质的自然属性,可作为物质的一种“自然指纹”,区分不同来源的物质。换言之,生物体中同位素指纹是外部环境在生物体中打下的“烙印”,因此,同位素指纹是所有生物(包括食品产品)的一个自然标签,它与生物的生长环境密切相关,且不随化学添加剂的改变而改变。它能为食品(中药材)溯源提供一种科学的、独立的、不可改变的,以及随整个食品链流动的身份鉴定信息。利用同位素指纹信息,可以鉴别食品(中药材)成分掺假、污染物来源、追溯产品原产地等。国内外利用稳定同位素技术进行植源性食品和肉类产地溯源的研究较多,且部分成果已应用于相关产品鉴别的标准中。但在中药材产地溯源中,目前仍然采用二维码和网络数据库溯源系统。缺乏中药材产地稳定同位素指纹鉴别技术的研究和应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明提供了一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,仅用4种稳定同位素指纹建立判别模型,检测指标少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七块根产地来源的整体判别率能达到84%以上。
为了达到上述目的,本发明提出如下技术方案:
一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,包括如下步骤:
1)从三七产区的广西百色、云南文山、云南新拓展区域任一地域随机均匀采集三年春七块根样品,也包括为鉴别三七产地来源,采集在市场上销售的三七块根和粉末;
2)将采集的样品烘干、粉碎;
3)检测三七块根粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C、δ15N比率,单位为‰,按照判别模型(1)~(3)即可得到Y广西百色片区、Y云南文山片区、Y云南新拓展片区,则所述三年春七块根样品来源于Y广西百色片区、Y云南文山片区、Y新拓展片区中数值最大的地域;
Y广西百色片区=-557.00-0.96δ2H+7.60δ18O-31.46δ13C+4.70δ15N; (1)
Y云南文山片区=-529.57-1.14δ2H+7.88δ18O-29.90δ13C+3.51δ15N; (2)
Y云南新拓展片区=-501.06-1.25δ2H+8.65δ18O-27.90δ13C+2.94δ15N; (3)
作为优选,步骤1)中,在广西百色、云南文山和文山州外新拓展区域的东、南、西、北、中布点进行采样,每个采样点在该种植田块或区域东、南、西、北、中随机均匀采集15~20株三七组成一个样本。
作为优选,步骤2)中,用自来水+洗洁精洗去三七块根泥土、再自来水冲洗干净、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min,60℃~70℃烘干至恒重。
作为优选,步骤2)中所述的三七样品粉碎至粒度为100~200目。
作为优选,步骤3)中的检测仪器为同位素比率质谱仪(IRMS)。
本发明的有益效果:本发明从三七本身具有的稳定同位素指纹差异入手,仅利用C、H、O、N四个元素稳定同位素指纹特征建立产地判别模型,检测指标 少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七块根产地来源的整体判别率能达到84%以上。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例
1)样品采集
2011年10月~11月分别在广西靖西、云南文山州三七主产县、云南三七新拓展产区(红河、昆明、曲靖、宣威、玉溪、保山)随机选择三年生春三七种植户,从其种植地块或区域按东、南、西、北、中随机采集三七块根15~20个,作为一个样本;广西采集5个样本、文山采集17个样本、云南新拓展片区采集22个样本。
2)样品的烘干、粉碎
用自来水+洗洁精洗去三七块根泥土、再自来水冲洗干净、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min,60℃~70℃烘干至恒重,用万能不锈钢粉碎机将三七样品粉碎至粒度为100~200目。
3)稳定同位素比率测定
稳定氢同位素测定:称取1mg三七块根样品放入银杯中(8mm×5mm),放入96孔酶联免疫盘中,盖上盖子,在室温环境下平衡96h,然后将样品取出放入高温裂解炉的旋转自动进样盘中,样品在1275℃高温下分解为H2、N2和CO气体。然后经过100℃的纯化柱,利用孔径为5nm的分子筛除去N2和CO气体,得到纯 净的H2,然后进入DELTAPlus Thermo Finnigan连续流动的同位素比率质谱仪中进行测定。载气He气流量为100mL/min,样品在载气作用下的流量为50mL/min。
稳定氢同位素比率用δ2H‰表示,δ2H‰的相对标准为V-SMOW。计算公式为:δ2H‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=2H/1H。
稳定氧同位素测定:取大约1.0mg三七块根粉末样品放入锡箔杯中,密封,通过自动采样器送入高温元素分析仪(TC-EA)。样品在1430℃的高温下电离为CO气体,然后经过柱温为90℃的气相色谱柱,最后进入同位素比率质谱仪(IRMS)中进行测定。载气He气流量为70mL/min,标准气体为CO。
稳定氧同位素比率用δ18O‰表示,δ18O的标准物质为SMOW(标准平均海洋水)。计算公式为:δ18O‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=18O/16O。
稳定碳、氮同位素测定:称取600~800μg三七块根粉末,先经过Flash EA1112型元素分析仪转化为纯净的CO2和N2气体,再经过型号为Conflo Ⅲ型稀释仪,最后进入DELTAPlus Thermo Finnigan质谱仪进行检测。具体工作参数如下:
元素分析仪:进样器氦气吹扫流量为200ml.min-1,氧化炉温度为1020℃,载气氦气流量为90ml.min-1。
Conflo Ⅲ条件设定:氦气稀释压力为0.6bar,CO2参考压力为0.6bar,N2参考压力为1.0bar。
质谱条件:用USGS24(δ13CPDB=-16‰)标定CO2钢瓶,用IAEA N1(δ15Nair=0.4‰)标定N2钢瓶,用标定的钢瓶气作为标准。稳定碳同位素比率用δ13C‰、δ15N‰表示,δ13C的相对标准为V-PDB,稳定氮同位素的相对标准为空气。计算公式为:δ13C‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=13C/12C;δ15N‰=(R样品/R标准-1)×1000,其中R=15N/14N。
所取的三个地域的春三七块根4项稳定同位素比率(‰)如表1所示:
表1三个地域三七块根样品稳定同位素比率测定值
使用DPSv8.01软件对上述春三七块根样品4个稳定同位素比率进行逐步回归分析,分别建立3个片区的Fisher’s判别分类函数(判别模型),具体如下:
Y广西百色片区=-557.00-0.96δ2H+7.60δ18O-31.46δ13C+4.70δ15N
Y云南文山片区=-529.57-1.14δ2H+7.88δ18O-29.90δ13C+3.51δ15N
Y云南新拓展片区=-501.06-1.25δ2H+8.65δ18O-27.90δ13C+2.94δ15N
利用判别函数对三七块根样品产地进行判别归类。结果显示,回代检验中,44个样品有7个被错判,整体正确判别率为84.09%。值得说明的是广西靖西和云南文山州紧邻,广西靖西有一个样品被错判入文山片区,云南文山州与三七新拓展片区的红河州紧邻,气候条件十分相似,所以各有2个样品分别落入广西靖西和新拓展片区,新拓展片区有2个落入文山片区,但相距较远的新拓展片区和广西靖西片区无误判,也间接说明行政区划和气候条件并非完全一致,是导致误判的主要原因。
三年春七块根稳定同位素组合产地判别分析结果如表2所示:
表2三年春七块根稳定同位素组合产地判别分析结果
来自\判为 | 广西百色 | 云南文山 | 云南新拓展 | 小计 | 正确率 |
广西百色 | 4 | 1 | 0 | 5 | 0.8000 |
[0046]
云南文山 | 2 | 13 | 2 | 17 | 0.7647 |
云南新拓展 | 0 | 2 | 20 | 22 | 0.9091 |
上述实例证明,不同产地来源的三七块根样品其C、H、O、N同位素指纹特征呈现地域性差异,利用同位素比率质谱仪(IRMS)测定的稳定同位素比率,利用化学计量分析来判断不同产地来源三七块根样品的稳定同位素指纹差异,得出三七块根产地稳定同位素指纹特征的判别模型,并利用判别模型来进行原产地域判别,可以准确、公正地鉴别出三七块根样品产地信息。
本发明从三七本身具有的稳定同位素指纹差异入手,仅利用C、H、O、N四个元素稳定同位素指纹特征建立产地判别模型,检测指标少、检测精度高、重现性好、方法简便、可操作性强,减少了基于标签和主观判断的不确定性,对三年春七块根产地来源的整体判别率能达到84%以上。
最终,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,包括如下步骤:
1)从三七产区的广西百色、云南文山、云南新拓展区域任一地域随机均匀采集三年生春七块根样品,也包括为鉴别三七产地来源,采集在市场上销售的三七块根和粉末;
2)将采集的样品烘干、粉碎;
3)检测三七块根粉末稳定同位素δ2H、δ18O、δ13C、δ15N比率,单位为‰,按照判别模型(1)~(3)即可得到Y广西百色片区、Y云南文山片区、Y云南新拓展片区,则所述三年春七块根样品来源于Y广西百色片区、Y云南文山片区、Y新拓展片区中数值最大的地域;
Y广西百色片区=-557.00-0.96δ2H+7.60δ18O-31.46δ13C+4.70δ15N; (1)
Y云南文山片区=-529.57-1.14δ2H+7.88δ18O-29.90δ13C+3.51δ15N; (2)
Y云南新拓展片区=-501.06-1.25δ2H+8.65δ18O-27.90δ13C+2.94δ15N; (3) 。
2.根据权利要求1所述的一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,其特征在于:步骤1)中,在广西百色、云南文山和文山州外新拓展区域的东、南、西、北、中布点进行采样,每个采样点在该种植田块或区域东、南、西、北、中随机均匀采集样品15~20株组成一个样本。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,其特征在于:步骤2)中,用自来水+洗洁精洗去三七块根泥土、再自来水冲洗干净、最后用蒸馏水反复冲洗,105℃杀青30min,60℃~70℃烘干至恒重。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,其特征在于:步骤2)中所述的三七样品粉碎至粒度为100~200目。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的一种基于稳定同位素指纹的三七块根产地鉴别方法,其特征在于:步骤3)中的检测仪器为同位素比率质谱仪(IRMS)。
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