CN103645238A - 一种基于稳定同位素比值鉴别冬虫夏草产地的方法 - Google Patents

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程池
扎西才吉
李辉
姚粟
刘洋
白飞荣
钟其顶
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YUSHU TIBETAN AUTONOMOUS PREFECTURE SANJIANGYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
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Abstract

本发明公开了一种基于稳定同位素比值鉴别冬虫夏草产地的方法，属冬虫夏草真实性鉴别技术领域。主要步骤如下：（1）采用稳定同位素质谱技术测定真实产地冬虫夏草样品的δ15N值，构建真实产地冬虫夏草样品δ15N数据库；（2）测定待测冬虫夏草样品的δ15N值；（3）将待测样品的δ15N值与数据库中真实产地冬虫夏草样品δ15N值进行显著性差异分析，若无显著差异这表明待测样品与真实样品来自于同一产地，反之则表明来自不同的产地。本发明利用稳定同位素质谱技术建立了一种能够准确鉴别冬虫夏草产地的方法，解决我国冬虫夏草产地的市场监管存在的技术难题，利于规范市场行为，保护消费者和企业的合法权益，促进冬虫夏草产业的健康有序发展。

Description

一种基于稳定同位素比值鉴别冬虫夏草产地的方法
技术领域
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及一种冬虫夏草的产地鉴别方法。
背景技术
冬虫夏草是我国青藏高原地区的珍稀物种资源，具有提高人体免疫力、抗肿瘤等保健功能和特殊药效，其有效作用在民间已得到广泛的认可。
冬虫夏草的产地属性是衡量其价值的重要指标，不同产地的冬虫夏草在营养成分和功能上具有明显差别，价值上也存在差异。然而我国尚缺乏冬虫夏草产地有效鉴别的技术手段和方法，仅仅依靠企业自律和现有的标准管理体系无法有效规范市场，极少部分企业受到利益驱动，利用假冒伪劣冬虫夏草冒充优质产地冬虫夏草，获取高额利润，对冬虫夏草市场造成较大冲击，不利于我国冬虫夏草产业的良性发展和有序竞争，同时损害了消费者的利益和知情权。因此开发一种能够有效鉴别冬虫夏草产地的技术方法对于规范市场行为，促进我国冬虫夏草产业健康发展，维护合法企业和消费者利益具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于冬虫夏草原冬虫夏草产地鉴别的可靠方法。
为达到上述目的，本发明的发明人经过多年研究发现，不同地区的冬虫夏草在形成过程中，不断与外界环境进行物质交换，从冬虫夏草侵染幼虫到菌丝长满幼虫虫体的整个过程中，虫草处于土壤下，其体内物质组成受当地土壤影响较大，待虫草长出子座后与空气直接接触，受到当地空气、雨水等其他环境因素的影响，冬虫夏草体内同位素（如N）受土壤、空气、气候条件等因素影响而发生自然分馏效应，导致不同产地冬虫夏草体内同位素自然丰度的差异；成熟冬虫夏草的同位素丰度在一定程度上能够反映所处环境的同位素特征。因此利用稳定同位素比值质谱检测冬虫夏草中氮稳定同位素的比值差异可鉴别不同产地的冬虫夏草。
本发明采用稳定同位素比值质谱仪对来自真实产地的冬虫夏草中氮同位素比值进行了测定，通过对待测冬虫夏草样品进行氮稳定同位素比值测定，然后将待测样品氮稳定同位素比值与参考的真实产地冬虫夏草氮稳定同位素比值进行显著性差异分析，若无显著差异则表明待测样品与真实样品来自于同一产地，反之则表明来自不同的产地。
优选的，在实施本发明过程中，可构建真实产地冬虫夏草δ15N值数据库，从而在使用本发明的方法鉴别冬虫夏草产地时，不需要每次都测定真实产地冬虫夏草δ15N值，而是使用已经建立的真实产地冬虫夏草δ15N值数据库。
当然，本领域技术人员可以选择在同一检测周期内，既测定真实产地冬虫夏草δ15N，有测定待测样品中的δ15N。
优选的，本发明的真实产地冬虫夏草样品是从冬虫夏草主产区实地采集获得的真实样品。
本发明的真实产地冬虫夏草δ15N值数据库可通过如下方法构建：采集样品，其中任一产地至少采集10个以上不同草甸的样品，然后测定样品的δ15N值，建立真实产地冬虫夏草δ15N值数据库，其中采用统计学方法分析原产地样品的δ15N值与产地的相关性。
本发明中样品的δ15N值测定方法为：取冬虫夏草样品1根（0.2-0.4g），采用组织粉碎仪将样品粉碎为粉末状，组织粉碎仪粉碎条件为1600 rpm，5 min，先经过元素分析仪转化为纯净的N2气体，再经过型号为稀释仪，最后进入质谱仪进行检测。元素分析仪工作参数为：进样器氦气吹扫流量为 200ml·min-1，氧化炉温度为980℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为 90 ml·min-1。稀释仪条件设定：氦气稀释压力为 0.6 bar，N2参考气压力为 0.6 bar。
    本发明经过充分的前期试验摸索和优化，发明的方法稳定可靠，且无需复杂的前处理过程，操作简单，成本低，解决了冬虫夏草产地鉴别的技术问题，有利于促进冬虫夏草产业的健康发展，具有良好的应用前景。
 
附图说明
附图1 不同产地冬虫夏草样品δ15N统计，其中QH代表青海，SC代表四川，YN代表云南，NBR代表尼泊尔
具体实施案例
下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。
实施例一： 真实产地冬虫夏草样品的δ15N测定
1.1 真实产地样品的采集
实地采集来自我国青海省、四川省、云南省以及尼泊尔的12个不同产区冬虫夏草样品，每个产区采集10个不同草甸上生长的样品，详见下表1。
表1 真实产地样品的采集列表
序号 样品编号 样品名称 样品来源
1 YSHX 冬虫夏草 青海玉树州哈秀
2 YSGQ 冬虫夏草 青海玉树州郭钦
3 YSYS 冬虫夏草 青海玉树州玉树县
4 YSZD 冬虫夏草 青海玉树治多县
5 QHGL 冬虫夏草 青海果洛州
6 QHHN 冬虫夏草 青海海南州
7 SCAB 冬虫夏草 四川阿坝州
8 SCKD 冬虫夏草 四川康定
9 SCYL 冬虫夏草 四川雅拉雪山
10 YNBM 冬虫夏草 云南白马雪山
11 YNLJ 冬虫夏草 云南老君山
12 NBR 冬虫夏草 尼泊尔
1.2 真实产地样品的氮同位素测定
1）取不同冬虫夏草样品各一支，利用组织粉碎仪（北京艾科塞恩斯公司）1600 rpm，5 min，粉碎成细微粉末。
2）分别取样品粉末0.2g，经Flash EA1112 型元素分析仪转化为纯净的 N2气体。元素分析仪工作参数为：进样器氦气吹扫流量为 200ml·min-1，氧化炉温度为980℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为 90 ml·min-1。
3）生成的N2气体经Conflo Ⅲ型稀释仪进行稀释，条件设定：氦气稀释压力为 0.6 bar，N2参考气压力为 0.6 bar。
4）采用DELTAPlus Thermo Finnigan 质谱仪进行氮同位素检测。
1.3 数据处理和分析
氮同位素测定结果以δ‰表示：δ‰=(R样品/R标准-1)×1,000，R代表样品和标准物质中重同位素与轻同位素的丰度比， δ 15N的相对标准物质为空气。
采用origin 8.0软件对样品原产地与δ 15N数据进行相关性分析，结果见附图1。
不同产地冬虫夏草样品δ 15N值范围见下表2：
产地 青海 四川 云南 尼泊尔
δ15N范围 0.880‰~2.195‰ 0.055‰~0.280‰ -0.965‰~0.190% -3.155‰~-2.650‰
由表2可知，青海产冬虫夏草δ15N值波动范围为0.850‰~2.195‰，四川产冬虫夏草δ 15N值波动范围为0.055‰~0.280‰，青海产冬虫夏草δ 15N值波动范围为-0.965‰~0.190%，青海产冬虫夏草δ 15N值波动范围为-3.155‰~-2.650‰，三个产地的冬虫夏草δ15N值波动范围明显不同。
实施例二：冬虫夏草产地鉴别实例
2.1样品的来源
从市场购买分别标注产地为青海，四川和云南的冬虫夏草样品3种。
2.2 样品的氮同位素测定
1）取不同冬虫夏草样品各一支，利用组织粉碎仪（北京艾科塞恩斯公司）1600 rpm，5 min，粉碎成细微粉末。
2）分别取样品粉末0.2g，经Flash EA1112 型元素分析仪转化为纯净的 N2气体。元素分析仪工作参数为：进样器氦气吹扫流量为 200ml·min-1，氧化炉温度为980℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为 90 ml·min-1。
3）生成的N2气体经Conflo Ⅲ型稀释仪进行稀释，条件设定：氦气稀释压力为 0.6 bar，N2参考气压力为 0.6 bar。
4）采用DELTAPlus Thermo Finnigan 质谱仪进行氮同位素检测。
2.3 数据处理和分析
氮同位素测定结果以δ‰表示：δ‰=(R样品/R标准-1)×1,000，R代表样品和标准物质中重同位素与轻同位素的丰度比， δ 15N的相对标准物质为空气。
检测样品的δ 15N值测定结果见下表3：
待测样品 标注产地 δ 15N（‰） 判定产地
样品1 青海 1.130 青海
样品2 四川 0.221 四川
样品3 云南 -0.782 云南
由表3可以看出，样品1的δ15N值为1.130‰，处于0.880‰~2.195‰之间，判定其原产地为青海，与所标注的产地一致；样品2的δ15N值为0.221‰，处于0.055‰~0.280‰之间，判定其原产地为四川，与所标注的产地一致；样品3的δ 15N值为-0.782，处于-0.965‰~0.190%之间，判定其原产地为云南，与所标注的产地一致。

Claims (6)

1.一种基于氮稳定同位素比值鉴别冬虫夏草产地的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
测定待测冬虫夏草样品的δ15N值；
将待测样品的δ15N值在真实产地冬虫夏草样品δ15N值数据库中进行显著性差异分析，若无显著差异则表明待测样品与真实样品来自于同一产地，反之则表明来自不同的产地。
2.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，采用稳定同位素质谱技术测定冬虫夏草样品的δ15N值。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测定样品δ15N值前，利用组织粉碎仪将冬虫夏草样品粉碎成细微粉末。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，组织粉碎仪的粉碎条件为1600 rpm，5 min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，粉碎后的冬虫夏草样品采用Flash EA1112 型元素分析仪转化为纯净N2气体后经稀释仪进入同位素质谱仪进行测定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在将样品转化为纯净N2气体过程中，元素分析仪工作参数为：进样器氦气吹扫流量为 200ml·min-1，氧化炉温度为1020℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为 90 ml·min-1。
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