CN110827995B - 一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的表征方法 - Google Patents

一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的表征方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的表征方法。本发明采用UPLC建立裸花紫珠道地药材全成分指纹谱，并采用UPLC与DAD/QTOF‑MS/MS联用技术对裸花紫珠道地药材全成分指纹谱在线快速成分定性分析与化合物鉴定，形成裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型。本发明的有益效果在于：裸花紫珠道地药材全成分指纹谱方法操作简单，峰容量大，且精密度、重现性和稳定性均良好，色谱峰分离度好、分析时间短、分析效率和灵敏度高；形成的裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型，解决了市场上裸花紫珠基源应用混乱、道地药材无法表征等问题。

Description

一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的 表征方法
技术领域
本发明涉及中药药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹谱的表征方法。
背景技术
道地药材是中医药的精髓,它在传统中医药中是优质药材的代名词。道地药材的形成与中药的优良种质和特定自然环境密不可分。为此,不少道地药材在药名前多冠以地名,以示其道地产区，如西宁大黄、宁夏枸杞、川贝母等。
现代生物学认为道地药材的生物学本质为表型变异＝遗传变异+环境饰变,可见,道地药材的表型可塑性与自然环境关系密切。作为中药适应特定自然环境的最佳表型,临床疗效好、药效成分含量高是道地药材最重要的优良品质。此外,中药的道地性还包括外观性状好、高产、易贮藏、抗虫、抗病性强等诸多优良性状的全部或部分(黄璐琦，郭兰萍.环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J].中国中药杂志，2007，32(4):277.)。道地药材质量形成的研究是中药资源研究的重点和难点(孟祥才，王喜军.活性氧促进道地药材质量形成的假说及其探讨 [J].中草药,2011,42(4):799-804.)。
次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。
现代药学研究表明,药用植物的有效成分通常都是植物次生代谢产物，其含量高低与药材品质息息相关。药材质量及有效性的基础是植物的次生代谢，取决于次生产物的积累。在植物不同的器官和组织或是不同的发育时期，次生代谢产物的产生和积累量都不同，通常在胁迫条件下才能大量积累。
次生代谢过程被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，它在处理植物与生态环境的关系中充当着重要的角色。在传统中医药中,人们早已认识到环境对药材有效性的影响，药材的“道地性”就体现了这点,至今仍然对指导药用植物资源的开发和利用有着重要的借鉴意义和参考价值。
次生代谢产物积累的内在规律等为认识药用植物次生代谢有效成分变化,以及药用植物种植时有效成分控制的理论基础。次生代谢产物为有效成分的药用植物人工种植中质量控制和保持有效性的重要基础理论,是制定药用植物种植GAP和SOP规范的科学基础。以植物次生代谢理论为基础阐明药材道地性的科学内涵,将是传统中医药继续发展和传承迫切需要研究解决的重要问题。
中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药组分群的特征图谱和图像，目前已成为国内外公认鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。指纹图谱可通过不同的特性共有峰来表示，其能基本上反映中药的化学成分以及含量分布情况。值得注意的趋势是色谱指纹图谱的应用。近年来，美国Waters公司在2004年率先推出了超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC),它采用1.7μm颗粒度的色谱柱填料。它是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱也由此进入了全新的时代，是复杂体系中药分离分析的重要手段。与传统的采用5.0μ m颗粒度的色谱柱填料的HPLC技术相比能获更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，高分离度可以从容面对复杂组份(如天然产物或中草药等)分离的挑战，高灵敏度检测更加痕量的目标化合物，快速的分离分析大量样品，实现高通量。
液-质联用技术(LC-MS)是将液相色谱的高分离效能与质谱的强大结构鉴定功能相结合，其在中药化学成分分析、中药质量控制、中药药代动力学及代谢组学等研究工作中得到了广泛地应用。液 -质联用技术所具备的高分离、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信息等一系列优点，决定了它将在越来越多地相关领域得到应用。
超高效液相色谱(UPLC)由于其具有分离速度快、灵敏度高、分辨率高等特点，是目前对生物体内复杂体系的高效手段之一。四极杆-飞行时间质谱(QTOF-MS)具有采集数据分辨率高和测定动态范围宽等优势，并且应用全扫描和目标二级质谱等模式可以得到待测物的大量一级二级质谱信息。因此 UPLC与QTOF-MS/MS联用技术是对植物提取物中多种物质的快速定性分析的有力工具。
裸花紫珠药材是马鞭草科紫珠属裸花紫珠的干燥叶和带叶的嫩枝，是一种常用的海南传统民族药材，因主要生长在海南黎族地区，也被称为黎药。裸花紫珠化学成分主要有苯丙素类、黄酮类、三萜类、二萜类、环烯醚萜类、酚酸类及其苷和甾醇等，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、祛风祛湿功效、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症。
裸花紫珠在中国广东、广西、海南以及东南亚的印度、越南、新加坡等地均有分布，其中以海南五指山和白沙产的为上品，具有明显地域特点的药材，但缺乏表征道地药材的方法。此外，现今市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物的现象也较为严重。本领域亟需一种裸花紫珠道地药材次生代谢产物的表征方法。
以现有的植物次生代谢理论为基础阐明药材道地性的科学内涵,将是传统中医药继续发展和传承迫切需要研究解决的重要问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物以及道地药材无法表征等，而提供一种裸花紫珠道地药材的次生代谢产物色谱与质谱指纹图的表征方法。
本发明提供了一种裸花紫珠道地药材次生代谢产物的表征方法，包括如下步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温15～50℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％～0.5％的磷酸水溶液，流速0.2～0.5mL/min；梯度洗脱；洗脱梯度如下所示：
Figure RE-GDA0002258224680000021
Figure RE-GDA0002258224680000031
供试品溶液的制备:将裸花紫珠道地药材粉碎，过30～80目筛，裸花紫珠道地药材粉末与体积质量比20～100倍量的40％～95％的甲醇水溶液混合，超声提取30～60min，提取后，冷却至15～25℃，用微孔滤膜过滤，即可。
检测：精密吸取供试品溶液1～10uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠道地药材全成分指纹谱。
指纹谱表征：采用UPLC与DAD/QTOF-MS/MS联用技术对裸花紫珠道地药材全成分指纹谱在线快速成分定性分析与化合物鉴定，对全成分指纹谱的成分进行明确归类，形成裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型。
优化的，本发明提供了一种裸花紫珠道地药材次生代谢产物的表征方法，包括如下步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温45℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流速0.3mL/min；梯度洗脱；洗脱梯度如下所示：
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
35min 22％ 45min 30％
50min 50％ 55min 65％
65min 100％ 75min 100％
供试品溶液的制备:将裸花紫珠道地药材粉碎，过30～80目筛，裸花紫珠道地药材粉末与体积质量比50倍量的80％的甲醇水溶液混合，超声提取45min，提取后，冷却至15～25℃，用0.22μm微孔滤膜过滤，即可。
检测：精密吸取供试品溶液2～5uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠道地药材全成分指纹谱。
指纹谱表征：采用UPLC与DAD/QTOF-MS/MS联用技术对裸花紫珠道地药材全成分指纹谱在线快速成分定性分析与化合物鉴定，对全成分指纹谱的成分进行明确归类，形成裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型。
本发明中，所述的裸花紫珠药材来源于海南白沙，经江西普正制药有限公司吴永忠研究员鉴定为马鞭草科裸花紫珠C.nudiflora Hook.et Am.的干燥叶。
本发明的有益效果在于：本发明采用UPLC构建了裸花紫珠道地药材全成分指纹谱，其测定方法操作简单，峰容量大，且精密度、重现性和稳定性均良好，并且该方法中裸花紫珠的色谱峰分离度好、分析时间短、分析效率和灵敏度高；以海南白沙裸花紫珠道地药材为对象快速表征次生代谢产物的积累，采用UPLC与QTOF-MS/MS联用技术，在线对次生代谢产物进行UHPL-MS/MS表征，次生代谢产物分属于苯丙烯酸类化合物17个，黄酮类化合物13个，环烯醚萜类化合物11个，二萜类化合物32 个，三萜类化合物21个，形成裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型，解决了市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物以及道地药材无法表征等问题，基于植物次生代谢理论阐明了裸花紫珠药材道地性的科学内涵；本发明以植物次生代谢与“道地性”理论为基础,表征了裸花紫珠道地药材次生代谢产物的积累,有助揭示“道地性”其本质和内在规律。
附图说明
图1为实施例1中不同梯度洗脱条件与不同紫外波长下裸花紫珠(产地白沙，采收时间2017年2 月)UPLC色谱图
图2为实施例2中不同梯度洗脱波长210nm下裸花紫珠(产地白沙，采收时间2016年10月)UPLC 色谱图
图3为实施例6中空白UPLC色谱图
图4为实施例6中裸花紫珠道地药材次生代谢产物UPLC指纹谱的表征
图5为实施例7中裸花紫珠道地药材UPLC指纹峰DAD紫外可见光谱图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的药材粉末由下列制备方法制得：将裸花紫珠药材用粉碎机粉碎，即可。
实施例1
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2017年2月)，粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇水溶液25mL，称重，超声30min，放冷，用50％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；EclipsePlusC18 RRHD色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.8μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱，改变梯度，对裸花紫珠指纹图谱条件进行优化，选出了结果较好的图谱，1-6不同梯度洗脱如下所示：
(1)梯度洗脱色谱系统1。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 17％
15min 17％ 25min 25％
35min 35％ 45min 70％
50min 95％ 55min 95％
(2)梯度洗脱色谱系统2。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 17％
15min 17％ 30min 30％
40min 70％ 45min 95％
50min 95％
(3)梯度洗脱色谱系统3。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 7％ 5min 14％
15min 14％ 30min 30％
35min 60％ 40min 95％
45min 95％
(4)梯度洗脱色谱系统4。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 14％
15min 14％ 35min 30％
45min 70％ 50min 95％
55min 95％
(5)梯度洗脱色谱系统5。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 14％
15min 14％ 35min 35％
40min 65％ 50min 95％
(6)梯度洗脱色谱系统6。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 14％
15min 14％ 35min 30％
40min 70％ 45min 95％
50min 95％
流速为0.3ml/min，检测波长332nm、254nm、210nm，柱温45℃，进样量2μL。不同梯度洗脱条件与不同紫外波长下裸花紫珠UPLC色谱图见图1。发现210nm时色谱峰信息最完全，由于裸花紫珠中大量二萜、三萜类化合物只在紫外波长210nm处有末端吸收，而苯丙烯酸类、黄酮类等化合物的最大吸收峰在254nm和332nm处，210nm处也有末端吸收，因此选择210nm作为指纹图谱的检测波长。以分离度、拖尾因子和峰容量进行评价，最优梯度洗脱条件选择梯度洗脱色谱系统6。
实施例2
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)，粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇水溶液25mL，称重，超声30min，放冷，用50％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；phenomenex kintex XB-C18 100A色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱，改变梯度，对裸花紫珠指纹图谱条件进行优化。1-7不同梯度洗脱如下所示：
(1)梯度洗脱色谱系统1。
Figure RE-GDA0002258224680000051
Figure RE-GDA0002258224680000061
(2)梯度洗脱色谱系统2。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 14％
15min 14％ 20min 18％
30min 22％ 40min 30％
45min 50％ 60min 80％
65min 90％ 70min 100％
85min 100％
(3)梯度洗脱色谱系统3。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 10％ 2min 15％
15min 17％ 25min 23％
35min 30％ 45min 60％
55min 100％ 70min 100％
(4)梯度洗脱色谱系统4。
时间 有机相浓度 时间 有机相浓度
0min 10％ 2min 15％
15min 17％ 25min 25％
40min 65％ 50min 100％
65min 100％
(5)梯度洗脱色谱系统5。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 10％ 2min 15％
15min 17％ 20min 21％
30min 52％ 45min 100％
60min 100％
(6)梯度洗脱色谱系统6。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
30min 22％ 35min 30％
40min 50％ 45min 65％
55min 100％ 70min 100％
(7)梯度洗脱色谱系统7。
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
35min 22％ 45min 30％
50min 50％ 55min 65％
65min 100％ 75min 100％
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。裸花紫珠UPLC色谱图见图2。以分离度、拖尾因子和峰容量进行评价，最优梯度洗脱条件选择梯度洗脱色谱系统7。
实施例3
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)，粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
35min 22％ 45min 30％
50min 50％ 55min 65％
65min 100％ 75min 100％
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。连续进样6次，结果见表1～2。
表1相对保留时间精密度考察
Figure RE-GDA0002258224680000071
Figure RE-GDA0002258224680000081
Figure RE-GDA0002258224680000091
表2相对峰面积精密度考察(RSD％从小到大排列)
Figure RE-GDA0002258224680000092
Figure RE-GDA0002258224680000101
Figure RE-GDA0002258224680000111
实施例4
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约 0.5g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
Figure RE-GDA0002258224680000112
Figure RE-GDA0002258224680000121
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。依次进样，结果见表3～4。
表3相对保留时间重复性考察
Figure RE-GDA0002258224680000122
Figure RE-GDA0002258224680000131
Figure RE-GDA0002258224680000141
表4相对峰面积重复性考察(RSD％从小到大排列)
Figure RE-GDA0002258224680000142
Figure RE-GDA0002258224680000151
Figure RE-GDA0002258224680000161
实施例5
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，1份，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
35min 22％ 45min 30％
50min 50％ 55min 65％
65min 100％ 75min 100％
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。分别在0、2、4、6、12和24h进样，结果见表5～6。
表5相对保留时间稳定性考察
Figure RE-GDA0002258224680000171
Figure RE-GDA0002258224680000181
Figure RE-GDA0002258224680000191
表6相对峰面积稳定性考察(RSD％从小到大排列)
Figure RE-GDA0002258224680000192
Figure RE-GDA0002258224680000201
Figure RE-GDA0002258224680000211
实施例6
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约 0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
Figure RE-GDA0002258224680000212
Figure RE-GDA0002258224680000221
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL，并进80％甲醇水溶液的空白样品溶液2μL。空白UPLC色谱图见图3；裸花紫珠的次生代谢产物UPLC全成分指纹谱的表征见图4。
实施例7
取裸花紫珠样品(产地白沙，采收时间2016年10月15日)粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约 0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱Agilent 1290超高效液相色谱-6530四极杆-飞行时间质谱仪，配有二元高压梯度泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器和电喷雾离子源；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间 流动相(v/v％)B 时间 流动相(v/v％)B
0min 8％ 5min 13％
15min 13％ 20min 16％
35min 22％ 45min 30％
50min 50％ 55min 65％
65min 100％ 75min 100％
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。
采用二极管阵列检测器(DAD)在线检测，得到紫外可见光谱信息见图5。
采用电喷雾离子源，四极杆-飞行时间质谱检测器，质谱条件：质谱检测分别在正、负离子模式下进行，毛细管电压分别为3500V(正模式)和3000V(负模式)，干燥气温度350℃，干燥气流量 10L/min，雾化气压力30psig，毛细管出口电压150V，扫描质量范围50-1500m/z，扫描速率1张谱图 /秒。质量校正液离子分别选为121.0509m/z和922.0098m/z(正模式)和112.9856m/z和1033.9881m/z (负模式)。目标二级离子模式(Targeted MS/MS)的碰撞电压值为30eV。
所得质谱信息通过一级质谱得到的精确质量数和二级质谱的特征碎片，在一级质谱中，这些化合物在正负模式下生成加合离子，依据加合离子信息，可以准确推断出化合物的精确分子量和分子式。通过二级质谱将各化合物的分子离子峰进一步碎裂，得到其碎裂信息，在线查阅文献以及将所得二级质谱的碎片信息与质谱数据库网站(http://www.chemspider.com/)对比，进行进一步鉴定化合物的结构。结果见表13。
表13裸花紫珠的次生代谢产物UPLC全成分指纹谱指纹峰鉴定结果
Figure RE-GDA0002258224680000222
Figure RE-GDA0002258224680000231
Figure RE-GDA0002258224680000241
Figure RE-GDA0002258224680000251
Figure RE-GDA0002258224680000261
注*：表示苯丙烯酸环烯醚萜类或苯丙烯酸黄酮类化合物
109指纹峰由苯丙烯酸类17个，黄酮类13个(其中包括苯丙烯酸黄酮类1个)，环烯醚萜类11 个(其中包括苯丙烯酸环烯醚萜类7个)，二萜类32个，三萜类21个等化合物组成，是裸花紫珠道地药材特定自然环境的化学物质最佳表型。在线UHPLC-DAD/Q-TOF-MS/MS鉴定了62个化合物。

Claims (2)

1.一种裸花紫珠道地药材次生代谢产物的表征方法，其特征在于包括如下步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温15～50℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％～0.5％的磷酸水溶液，梯度洗脱条件(v/v％)：0min～5min，8％B～13％B，5min～15min，13％B～13％B，15min～20min，13％B～16％B，20min～35min，16％B～22％B，35min～45min，22％B～30％B，45min～50min，30％B～50％B，50min～55min，50％B～65％B，55min～65min，65％B～100％B，65min～75min，100％B～100％B；流速0.2～0.5mL/min；
供试品溶液的制备:将裸花紫珠道地药材粉碎，过30～80目筛，裸花紫珠道地药材粉末与体积质量比20～100倍量的40％～95％的甲醇水溶液混合，超声提取30～60min，提取后，冷却至15～25℃，用微孔滤膜过滤，即可；
检测：精密吸取供试品溶液1～10uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠道地药材全成分指纹谱；
指纹谱表征：采用UPLC与DAD/QTOF-MS/MS联用技术对裸花紫珠道地药材全成分指纹谱在线成分定性分析与化合物鉴定，对全成分指纹谱的成分进行归类，形成裸花紫珠道地药材的化学物质指纹谱的表征。
2.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠道地药材次生代谢产物的表征方法，其特征在于包括如下步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温45℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱条件(v/v％)：0min～5min，8％B～13％B，5min～15min，13％B～13％B，15min～20min，13％B～16％B，20min～35min，16％B～22％B，35min～45min，22％B～30％B，45min～50min，30％B～50％B，50min～55min，50％B～65％B，55min～65min，65％B～100％B，65min～75min，100％B～100％B；
流速0.3mL/min；
供试品溶液的制备:将裸花紫珠道地药材粉碎，过30～80目筛，裸花紫珠道地药材粉末与体积质量比50倍量的80％的甲醇水溶液混合，超声提取45min，提取后，冷却至15～25℃，用0.22μm微孔滤膜过滤，即可；
检测：精密吸取供试品溶液2～5uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠道地药材全成分指纹谱；
指纹谱表征：采用UPLC与DAD/QTOF-MS/MS联用技术对裸花紫珠道地药材全成分指纹谱在线成分定性分析与化合物鉴定，对全成分指纹谱的成分进行归类，形成裸花紫珠道地药材的化学物质指纹谱的表征。
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