CN116462778B - 一种银耳多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银耳多糖的提取方法,属于银耳深加工技术领域。它包括以下步骤:以干银耳为原料,使用粉碎机进行粉碎,过筛,取筛下部分;按投料质量比,加入去离子水,泡发后,放置于冰箱结冻;结冻后的样品放置水浴化冻,反复冻融;调节pH值,同时加入复合酶,搅拌提取;收集上清液与银耳渣;收集的银耳渣投入反应釜,加入纯化水,调节pH,加热保温,进行二次提取,保温提取,离心,收集上清液;收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调节pH至中性,浓缩;上清液进行第一次醇沉;上清液进行第二次醇沉;流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩;收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体,提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种银耳多糖的提取方法,属于银耳深加工技术领域。
背景技术
银耳多糖(Tremellam)是一种酸性杂多糖,从银耳(Tremella fuciformisBerk)子实体中得到的,其主链结构是由α-(1→3)糖苷键连接的甘露聚糖,支链由葡萄糖醛酸和木糖组成。存在于银耳深层发酵孢子体中的酸性杂多糖,主链结构与上述相似,仅在支链上有所区别。
银耳多糖的主要药用价值:
1、提高免疫调节能力
能激活小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力和特异性抗体的形成,能增加外周血中T淋巴细胞和B淋巴细胞的数量,能促进诱生干扰素的效价比,比常规组高出10-20倍(P﹤0.01),延缓胸腺的萎缩,可对抗由免疫抑制剂环磷酰胺所引起的,细胞免疫和体液免疫低下的作用。
2、辅助抑制肿瘤作用
能提高肿瘤细胞中的磷脂腺苷的含量,从而影响其核酸和蛋白质的代谢,改变肿瘤细胞的分裂特性,使之向正常方向转化。
3、延缓衰老作用
能明显降低小鼠心肌组织的脂褐质含量。果蝇中脂褐质含量可降低24%,平均寿命延长28%,能增加小鼠脑和肝组织中的SOD活力。
4、调节血糖
对由四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠,腹腔注射300mg/kg,72小时后血糖明显下降,对小鼠胰岛β细胞有保护作用。
5、调节血脂、预防血栓
能明显降低高血压大鼠的血清中胆固醇水平。同时经家兔实验,可明显延长特异性血栓和纤维蛋白血栓的形成时间,缩短血栓长度,下降血栓重量,降低血小板粘附率和血液粘度,降低血浆纤维蛋白元含量,增强纤维溶解酶的活力。
6、抗辐射
用Co60射线进行放疗者,骨髓中有核细胞数,比不授予银耳多糖的对照组多186%。
7、保护胃粘膜
对应急型胃溃疡,有明显抑制作用,口服可使溃疡面积缩小,促进醋酸型胃溃疡的愈合。
除以上几种功能外,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所的徐文清等还通过银耳多糖及其衍生物抑制牛免疫缺陷病毒的试验研究得出以下结论:银耳多糖和银耳多糖硫酸酮具有一定的抑制BIV引起的合胞体的作用,是优秀的免疫功能调节剂,且毒性极低,对于 AIDS 病人的联合药物治疗和艾滋病高危人群的预防有一定的作用。
申请号201811543288 .1的中国专利申请公开了一种银耳多糖的提取方法。该方法是将银耳干燥至含水量为4-8%,放入粉碎机中,氮气冷冻粉碎,再在微酸性条件下进行超声提取,提取液使用Sevage法脱除蛋白,最后醇沉得到银耳多糖。该发明方法使银耳多糖的提取率提高至35%,含量可达到96%。这一发明中,一,该方法虽然得到银耳多糖含量较高,但提取率还略微偏低;二,氮气冷冻粉碎及超声提取,设备与操作条件要求太高,难以大规模生产;三,用Sevage法脱除蛋白,会使用到三氯甲醇与正丁醇,为有毒性有机溶剂,除去方法繁琐,且产品有严格的限量要求,容易导致产品中溶剂超标。
申请号201610075259.1的中国专利申请公开了一种银耳多糖的提取方法。所述方法包括粉碎、酶解提取、碱提、第一次浓缩、去蛋白、第二次浓缩、干燥步骤,所述酶解步骤所用的酶为复合酶,所述复合酶为蛋白酶、纤维素酶、果胶酶按质量比为0.5:1:2~4的比例进行混合得到。这一发明中,一,直接粉碎后,未有泡发过程,细胞壁通透性未能改善;二,未有脱色过程,其终产品可能会带有黄褐色。
申请号202010397807.9的中国专利申请公开了一种银耳多糖的提取方法。包括以下步骤:对银耳子实体进行干燥,粉碎过筛,加水提取,减压精滤,得一次银耳渣和一次银耳提取液;对一次银耳渣分别进行 多次加水提取、减压精滤,得多次银耳渣和多次银耳提取液;将一次银耳提取液、……多次银耳提取液进行合并,并与膨润土混合均匀,煮沸,减压精滤,调节pH至8~9,减压精滤,再调节pH至6~7,再次减压精滤,脱色,浓缩,醇沉,真空干燥,得银耳多糖;本发明所得的银耳多糖的含量为 90.5%以上、白度为 87以上,收率为14.2 -15.6%、平均分子量为436-496kDa、分子量分布比较均一,提取方法简单,生产成本低,易于企业规模化生产。这一发明中,一,涉及使用活性炭,处理活性炭过程,易带入外源物,难以处理且增加生产成本。二,未有分级醇沉除杂,最终多糖含量不高。
发明内容
本发明的目的是克服现有的技术不足,提供一种提取率高,工艺生产简单,工业化生产易实现银耳多糖的制备方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
一种银耳多糖的提取方法,包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,使用粉碎机进行粉碎,过筛,取筛下部分;按投料质量比,加入去离子水,泡发后,放置于冰箱结冻;
(2)结冻后的样品放置水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程,反复冻融;
(3)将上一步骤中结冻的样品水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入纯化水,调节pH值,同时加入复合酶,搅拌提取,控制搅拌速度与温度;
(4)继续加入纯化水,调节pH值,快速升温,保温提取,离心,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜,加入纯化水,调节pH,加热保温,进行二次提取,保温提取,离心,收集上清液;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调节pH至中性,浓缩;
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,边加边搅拌,至乙醇到第一浓度,静置,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,边加边搅拌,至乙醇到第二浓度,静置,过滤去上清液,收集沉淀;所述第二浓度高于第一浓度;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用预冷配置好的一定浓度乙醇搅拌洗涤;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用一定倍量纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,上清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用一定倍量的纯化水清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,控制真空度,浓缩温度,浓缩至一定体积,加水除醇,浓缩至一定体积时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
本发明步骤(1)中加入20倍去离子水,用去离子水,可使细胞形成渗透压,更易进入细胞内,进行发泡后,反复冻融二次,破坏了细胞结构,有利于后面步骤多糖的浸出;步骤(3)中摸索了复合酶用量,相关比例,最佳酶解pH及最佳温度;步骤(4)与(5)中,直接调节pH及温度,达到提取目的,同时也达到灭酶效果,无需单独增加灭酶步骤,同时温度相对较低,间接的降低了高温对终产品易炭化,易褐变等因素,为后期脱色减小了压力;步骤(7)与(8),使用了不同浓度的分级醇沉,可除去部分杂质及蛋白,有效提高了多糖含量;步骤(9)中,使用了一定浓度的冷乙醇进行洗涤,可除去多糖中的盐分;步骤(11)中,利用冻干技术进行干燥,防止了高温对多糖活性的破坏,减小了终产品炭化及褐变的可能性。
作为优选,步骤(10)中,利用树脂型号为罗门哈斯公司的4500CL型阴离子树脂,进行脱色。
作为优选,银耳多糖的提取方法,包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,加入15-25倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-15- -25℃冰箱结冻,结冻后继续放置3-5h;
(2)结冻后的样品放置20-40℃水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品40-60℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入10-30倍纯化水,调节pH6-8,同时加入0.05-0.15%复合酶,搅拌提取0.5-1.5h,搅拌速度70-90rmp/min,温度40-60℃;
(4)继续加入30-50倍纯化水,用调节pH至11-13,快速升温至70-80℃,保温提取1-3h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入50-70倍纯化水,调节pH至11-13,保温70-80℃,进行二次提取,保温提取0.5-1.5h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/70-1/50,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为20-30%,边加边搅拌,搅拌20-40min后,3-5℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为80-90%,边加边搅拌,搅拌50-70min后,3-5℃静置1-3h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于3-5℃配置好的80-90%乙醇搅拌洗涤1-3次,每次10-20min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用60倍纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用1-3倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时,加水2-4次,每次加0.5-1.5倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
作为优选,银耳多糖的提取方法,包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,按投料质量比,加入20倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-20℃冰箱结冻,结冻后继续放置4h;
(2)结冻后的样品放置30℃水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品50℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入20倍纯化水,调节pH7.2,同时加入0.1%复合酶,搅拌提取1h,搅拌速度80rmp/min,温度50℃;
(4)继续加入40倍纯化水,用调节pH至12,快速升温至75℃,保温提取2h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入60倍纯化水,调节pH至12,保温75℃,进行二次提取,保温提取1h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/60,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为25%,边加边搅拌,搅拌30min后,4℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为85%,边加边搅拌,搅拌60min后,4℃静置2h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于4℃配置好的85%乙醇搅拌洗涤2次,每次15min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用60倍纯化水(质量与体积比)搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用2倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/30时,加水3次,每次加1倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/30时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
更优选地,所述复合酶为纤维素酶:果胶酶的体积比=3:1混合而成。
作为优选,所述步骤(7)和步骤(8)采用连续分级醇沉装置,包括反应釜和搅拌机构,所述搅拌机构设置在反应釜的内部,所述搅拌机构包括呈镂空框架结构的,所述搅拌机构的外侧设置有弹性机构;
所述弹性机构包括固定连接在搅拌机构外侧的n形固定块,所述n形固定块的外侧滑动连接有第一滑块和第二滑块,所述第一滑块的一侧固定连接有第一弹簧,且所述第一弹簧与第二滑块之间固定连接,所述第一滑块和第二滑块的一侧均固定连接有第一固定杆,所述第一固定杆的外侧转动连接有支杆,所述搅拌机构的外侧设置有连接块,所述连接块的一侧固定连接有第二固定杆,且所述支杆转动连接在第二固定杆的外侧,所述连接块的一侧固定连接有第一挡板;
所述反应釜上设置有乙醇进料口以及加料口,所述反应釜的下方设置有药渣去除口,所述反应釜的上端设置有驱动机构。
作为本发明的一种优选方案,所述第一滑块的一侧开设有第一空心槽,所述第二滑块的一侧开设有第二空心槽,所述n形固定块的一侧固定连接有限位杆,所述第一滑块和第二滑块均滑动连接在限位杆的外侧,且所述第一弹簧套设在限位杆的外侧。
作为本发明的一种优选方案,所述连接杆的一侧设置有第一限位环和第二限位环,所述第一限位环与第一固定杆之间固定连接,所述第二限位环与第二固定杆之间固定连接。
作为本发明的一种优选方案,所述n形固定块的一侧设置有伸缩杆,所述伸缩杆的一端与搅拌机构之间固定连接,所述伸缩杆的另一端与第一挡板之间固定连接。
作为本发明的一种优选方案,所述搅拌机构的外侧固定连接有第二弹簧,所述第二弹簧与第一挡板之间固定连接,且所述支杆套设在伸缩杆的外侧。
作为本发明的一种优选方案,所述第一挡板的一侧设置有第二挡板,且所述第二挡板与搅拌机构之间固定连接,所述第二挡板上均匀开设有通孔。
作为本发明的一种优选方案,所述驱动机构包括驱动电机,所述驱动电机的下端输出端上通过联轴器连接有框架。
作为本发明的一种优选方案,所述反应釜上设置有盖件,所述反应釜的上开设有第一贯穿孔,所述盖件盖在第一贯穿孔上,所述盖件的中部开设有第二贯穿孔,所述反应釜与盖件之间贯穿安装有反应釜控压组件;
所述反应釜控压组件包括密封滑动设置于第一贯穿孔内部的锥形塞a,所述第二贯穿孔上密封滑动设置有锥形塞b,所述锥形塞b与第二贯穿孔之间密封滑动设置,所述锥形塞a与锥形塞b之间设置有连接杆,所述盖件位于连接杆的外部固定设置有固定套,所述连接杆的中部固定设置有记忆合金片,且所述记忆合金片与固定套之间呈密封固定连接;
所述锥形塞a与锥形塞b均呈锥型设置,且所述锥形塞a设置于反应釜的内部,所述锥形塞b设置于盖件的外部。
作为本发明的一种优选方案,所述第一挡板的形状呈弧形设置,且第一挡板的外表面上设置有刮片。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
1、本发明步骤(1)中加入20倍去离子水,用去离子水,可使细胞形成渗透压,更易进入细胞内,进行发泡后,反复冻融二次,破坏了细胞结构,有利于后面步骤多糖的浸出;步骤(3)中摸索了复合酶用量,相关比例,最佳酶解pH及最佳温度;步骤(4)与(5)中,直接调节pH及温度,达到提取目的,同时也达到灭酶效果,无需单独增加灭酶步骤,同时温度相对较低,间接的降低了高温对终产品易炭化,易褐变等因素,为后期脱色减小了压力;步骤(7)与(8),使用了不同浓度的分级醇沉,可除去部分杂质及蛋白,有效提高了多糖含量;步骤(9)中,使用了一定浓度的冷乙醇进行洗涤,可除去多糖中的盐分;步骤(11)中,利用冻干技术进行干燥,防止了高温对多糖活性的破坏,减小了终产品炭化及褐变的可能性;
2、本发明连续分级醇沉装置中第一挡板会通过连接块带动第二固定杆一起进行移动,而第二固定杆则会带动连接杆进行旋转,同时连接杆会挤压第一固定杆进行移动,因连接杆和第一固定杆均设置有两个,使得两个连接杆在移动时能通过第一固定杆对第一滑块和第二滑块进行挤压移动,让第一滑块和第二滑块能够进行反方向移动,此时第一滑块和第二滑块便会挤压第一弹簧使得第一弹簧进行收缩,之后第一弹簧会把第一滑块和第二滑块弹回复位,同时第一滑块会通过第一固定杆带动连接杆进行反向旋转,与此同时连接杆会通过第二固定杆和连接块来带动第一挡板进行移动复位,第一挡板的一侧连接有刮片,可以更好的将反应釜的内表面刮干净,并且提高搅拌的效果;限位杆可对第一弹簧起到限位作用,使得第一滑块和第二滑块在对第一弹簧进行挤压收缩时,第一弹簧不易发生形变和弯曲,而是能够顺利的进行移动收缩;从而更有利于提高分级醇沉效果,从而有效提高多糖含量,减小了终产品炭化及褐变的可能性,从而提高了银耳多糖的提取率。
附图说明
图1为本发明步骤(7)和步骤(8)采用的连续分级醇沉装置的剖视结构示意图;
图2为本发明连续分级醇沉装置的局部结构示意图;
图3为本发明连续分级醇沉装置的弹性机构第一剖视结构示意图;
图4为本发明图3中A处的放大结构示意图;
图5为本发明的弹性机构第二剖视结构示意图;
图6为本发明图5中B处的放大结构示意图;
图7为本发明的弹性机构第三剖视结构示意图;
图8为本发明连续分级醇沉装置的立体结构示意图;
图9为本发明连续分级醇沉装置的反应釜控压组件结构示意图。
图10是本发明银耳多糖的提取方法的工艺流程图;
图中,1、搅拌机构;101、框架;21、n形固定块;22、第一滑块;23、第二滑块;24、第一固定杆;25、第二固定杆;26、支杆;27、连接块;28、第一挡板;29、第一弹簧;31、第一限位环;32、第二限位环;41、第一空心槽;42、限位杆;43、第二空心槽;5、伸缩杆;6、第二弹簧;7、第二挡板;10、反应釜;11、乙醇进料口;12、加料口;13、药渣去除口;14、驱动机构;1401、驱动电机;15、盖件;16、第一贯穿孔;17、第二贯穿孔;18、反应釜控压组件;1801、锥形塞a;1802、锥形塞b;1803、连接杆;1804、固定套;1805、记忆合金片;19、刮片。
具体实施方式
实施例1
(1)步骤(1):以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,按投料质量与体积比(w:v),加入20倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-20℃冰箱结冻,结冻后继续放置4h;
(2)步骤(2):结冻后的样品放置30℃水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程;
(3)步骤(3):将第二次结冻的样品50℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入20倍纯化水,调节PH7.2,同时加入0.1%复合酶(纤维素酶:果胶酶=3:1,加入量按物料总体积),搅拌提取1h,搅拌速度80rmp/min,温度50℃;
(4)步骤(4):继续加入40倍纯化水(投料质量与体积比),用调节pH至12,快速升温至75℃,保温提取2h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)步骤(5):收集的银耳渣投入反应釜内,加入60倍纯化水,调节PH至12,保温75℃,进行二次提取,保温提取1h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)步骤(6):收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/60,
(7)步骤(7):缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为25%,边加边搅拌,搅拌30min后,4℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)步骤(8):上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为85%,边加边搅拌,搅拌60min后,4℃静置2h,过滤去上清液,收集沉淀;
其中,步骤(7)和步骤(8)采用一种连续分级醇沉装置,请参阅图1-9,一种连续分级醇沉装置,包括反应釜10和搅拌机构1,搅拌机构1设置在反应釜10的内部,搅拌机构1包括呈镂空结构的框架101,搅拌机构1可用于实现对混合液的搅拌反应,对于本领域技术人员而言搅拌机构1为现有技术,在此不进行过多赘述,搅拌机构1的外侧设置有弹性机构,弹性机构具有一定的弹性作用,在进行搅拌的过程中,弹性机构可以将反应釜10内壁上材料刮掉,防止残留,并且可以进行充分的搅拌,反应釜10上设置有乙醇进料口11以及加料口12,反应釜10的下方设置有药渣去除口13,反应釜10的上端设置有驱动机构14。
弹性机构包括固定连接在搅拌机构1外侧的n形固定块21,n形固定块21的外侧滑动连接有第一滑块22和第二滑块23,第一滑块22的一侧固定连接有第一弹簧29,且第一弹簧29与第二滑块23之间固定连接,n形固定块21可用于放置第一滑块22和第二滑块23,使得第一滑块22和第二滑块23能够顺利的进行滑动,第一滑块22和第二滑块23可进行反方向移动,并对第一弹簧29进行挤压收缩,而第一弹簧29则可通过自身弹力把第一滑块22和第二滑块23弹回复位,以达到缓冲第一滑块22和第二滑块23的作用,第一滑块22和第二滑块23的一侧均固定连接有第一固定杆24,第一固定杆24的外侧转动连接有支杆26,第一固定杆24可用于连接支杆26,使得支杆26在移动时能通过第一固定杆24对第一滑块22进行挤压移动。
此外,搅拌机构1的外侧设置有连接块27,连接块27的一侧固定连接有第二固定杆25,且支杆26转动连接在第二固定杆25的外侧,连接块27可用于连接第一挡板28和第二固定杆25,使得第一挡板28在移动时能通过连接块27带动第二固定杆25进行移动,第二固定杆25可对支杆26进行挤压,同时因支杆26的另一侧与第一固定杆24转动连接,使得第一固定杆24能对支杆26进行限位,这使得第二固定杆25在移动挤压支杆26的时候,支杆26能顺利的进行旋转,而支杆26则可在旋转时通过第一固定杆24带动第一滑块22进行移动。
另外,连接块27的一侧固定连接有第一挡板28,第一挡板28的形状呈弧形设置,且第一挡板28的外表面上设置有刮片19,第一挡板28可用于连接连接块27,使得第一挡板28在移动时能带动连接块27一起进行移动,且第一挡板28的面积较大,可以更好的将反应釜10的内表面刮干净,第一固定杆24、第二固定杆25、支杆26和连接块27均设置有两个,使得第一挡板28在移动时能顺利的带动两个支杆26进行反方向旋转,这使得第一滑块22和第二滑块23能够进行反方向移动。
具体的,第一滑块22的一侧开设有第一空心槽41,第二滑块23的一侧开设有第二空心槽43,第一滑块22可通过第一空心槽41在限位杆42的外侧进行滑动,而第二滑块23则可通过第二空心槽43在限位杆42的外侧进行滑动,使得限位杆42不易阻碍第一滑块22和第二滑块23的移动,n形固定块21的一侧固定连接有限位杆42,第一滑块22和第二滑块23均滑动连接在限位杆42的外侧,且第一弹簧29套设在限位杆42的外侧,限位杆42可对第一弹簧29起到限位作用,使得第一滑块22和第二滑块23在对第一弹簧29进行挤压收缩时,第一弹簧29不易发生形变和弯曲,而是因受到限位杆42的限位,能够顺利的进行移动收缩。
具体的,支杆26的一侧设置有第一限位环31和第二限位环32,第一限位环31与第一固定杆24之间固定连接,第一限位环31可对支杆26位于第一固定杆24的一侧起到限位作用,使得支杆26不易脱离于第一固定杆24,第二限位环32与第二固定杆25之间固定连接,第二限位环32的作用与第一限位环31相似,可对支杆26位于第二固定杆25的一侧起到限位作用,使得支杆26在旋转时能够更加稳定,不易脱离于第二固定杆25。
具体的,n形固定块21的一侧设置有伸缩杆5,伸缩杆5的一端与搅拌机构1之间固定连接,伸缩杆5的另一端与第一挡板28之间固定连接,伸缩杆5可对第一挡板28起到限位作用,使得第一挡板28在搅拌机构1的外侧不易发生偏移,而是能够顺利的进行移动,同时伸缩杆5由第一伸缩杆和第二伸缩杆组成,第一伸缩杆活动插接在第二伸缩杆的内部。
具体的,搅拌机构1的外侧固定连接有第二弹簧6,第二弹簧6与第一挡板28之间固定连接,且支杆26套设在伸缩杆5的外侧,第二弹簧6可辅助弹性机构对第一挡板28起到缓冲的作用,使得第一挡板28的缓冲效果更好,在进行搅拌刮面的时候,效果更好。
具体的,第一挡板28的一侧设置有第二挡板7,且第二挡板7与搅拌机构1之间固定连接,第二挡板7上均匀开设有通孔,可以增大搅拌面积,提高搅拌效果,使混合的更好。
具体的,驱动机构14包括驱动电机1401,驱动电机1401的下端输出端上通过联轴器连接有框架101。
使用时,驱动电机1401可以带动框架101的转动,框架101可以带动弹性机构的转动。
反应釜10上设置有盖件15,反应釜10的上开设有第一贯穿孔16,盖件15盖在第一贯穿孔16上,盖件15的中部开设有第二贯穿孔17,反应釜10与盖件15之间贯穿安装有反应釜控压组件18;
反应釜控压组件18包括密封滑动设置于第一贯穿孔16内部的锥形塞a1801,第二贯穿孔17上密封滑动设置有锥形塞b1802,锥形塞b1802与第二贯穿孔17之间密封滑动设置,锥形塞a1801与锥形塞b1802之间设置有连接杆1803,盖件15位于连接杆1803的外部固定设置有固定套1804,连接杆1803的中部固定设置有记忆合金片1805,记忆合金片1805为钛镍记忆合金片,记忆合金片1805的性质为双程记忆合金,且记忆合金片1805与固定套1804之间呈密封固定连接;
锥形塞a1801与锥形塞b1802均呈锥型设置,且锥形塞a1801设置于反应釜10的内部,锥形塞b1802设置于盖件15的外部。
设置的锥形塞a1801用于对第一贯穿孔16进行密封,通过设置的锥形塞b1802用于对第二贯穿孔17进行密封,通过设置的连接杆1803将锥形塞a1801与锥形塞b1802之间进行固定连接,使锥形塞a1801与锥形塞b1802进行同步移动,设置的连接杆1803对记忆合金片1805进行固定支撑,记忆合金片1805常态下位弯曲状态,其中记忆合金片1805在受热后会恢复到平直状态,发生形变。
通过设置的盖件15对固定套1804进行固定支撑,并通过设置的固定套1804对记忆合金片1805进行限位固定,其中当反应釜10和盖件15内部存储介质由于温度升高,产生大量气体,压力升高,高于外界大气压时,记忆合金片1805受热会发生变形,会带动连接杆1803进行移动,并通过连接杆1803带动锥形塞a1801与锥形塞b1802向上进行滑动,使第一贯穿孔16和第二贯穿孔17打开,并通过第一贯穿孔16与第二贯穿孔17进行自动泄压处理。
本发明的工作原理及使用流程:在使用本装置时,第一挡板28会通过连接块27带动第二固定杆25一起进行移动,而第二固定杆25则会带动支杆26进行旋转,同时支杆26会挤压第一固定杆24进行移动,因支杆26和第一固定杆24均设置有两个,使得两个支杆26在移动时能通过第一固定杆24对第一滑块22和第二滑块23进行挤压移动,让第一滑块22和第二滑块23能够进行反方向移动,此时第一滑块22和第二滑块23便会挤压第一弹簧29使得第一弹簧29进行收缩,之后第一弹簧29会把第一滑块22和第二滑块23弹回复位,同时第一滑块22会通过第一固定杆24带动支杆26进行反向旋转,与此同时支杆26会通过第二固定杆25和连接块27来带动第一挡板28进行移动复位,第一挡板28的一侧连接有刮片19,可以更好的将反应釜10的内表面刮干净,并且提高搅拌的效果。
设置的锥形塞a1801用于对第一贯穿孔16进行密封,通过设置的锥形塞b1802用于对第二贯穿孔17进行密封,通过设置的连接杆1803将锥形塞a1801与锥形塞b1802之间进行固定连接,使锥形塞a1801与锥形塞b1802进行同步移动,设置的连接杆1803对记忆合金片1805进行固定支撑,记忆合金片1805常态下位弯曲状态,其中记忆合金片1805在受热后会恢复到平直状态,发生形变。
通过设置的盖件15对固定套1804进行固定支撑,并通过设置的固定套1804对记忆合金片1805进行限位固定,其中当反应釜10和盖件15内部存储介质由于温度升高,产生大量气体,压力升高,高于外界大气压时,记忆合金片1805受热会发生变形,会带动连接杆1803进行移动,并通过连接杆1803带动锥形塞a1801与锥形塞b1802向上进行滑动,使第一贯穿孔16和第二贯穿孔17打开,并通过第一贯穿孔16与第二贯穿孔17进行自动泄压处理。
然后,接着进行步骤(9),
(9)步骤(9):将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于4℃配置好的85%乙醇搅拌洗涤2次,每次15min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)步骤(10):沉淀用60倍纯化水(质量与体积比)搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用2倍CV清洗,收集清洗液。
(11)步骤(11):流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/30时,加水3次,每次加1倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/30时即为浓缩终点;
(12)步骤(12):收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
经检测,本发明所得产品多糖含量可达到93.7%,多糖提取率46.2%;终产品颜色为纯白色。
实施例2
同实施例1,不同的是一种银耳多糖的提取方法,包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,加入15-25倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-15- -25℃冰箱结冻,结冻后继续放置3-5h;
(2)结冻后的样品放置20-40℃水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品40-60℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入10-30倍纯化水,调节pH6-8,同时加入0.05-0.15%复合酶,搅拌提取0.5-1.5h,搅拌速度70-90rmp/min,温度40-60℃;
(4)继续加入30-50倍纯化水,用调节pH至11-13,快速升温至70-80℃,保温提取1-3h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入50-70倍纯化水,调节pH至11-13,保温70-80℃,进行二次提取,保温提取0.5-1.5h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/70-1/50,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为20-30%,边加边搅拌,搅拌20-40min后,3-5℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为80-90%,边加边搅拌,搅拌50-70min后,3-5℃静置1-3h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于3-5℃配置好的80-90%乙醇搅拌洗涤1-3次,每次10-20min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用60倍纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用1-3倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时,加水2-4次,每次加0.5-1.5倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
经检测,本发明所得产品多糖含量可达到93.5%,多糖提取率45.2%;终产品颜色为纯白色。
实施例3
同实施例1,不同的是一种银耳多糖的提取方法,包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,加入15-25倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-15- -25℃冰箱结冻,结冻后继续放置3-5h;
(2)结冻后的样品放置20-40℃水浴化冻,完全化冻后,重复(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品40-60℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入10-30倍纯化水,调节pH6-8,同时加入0.05-0.15%复合酶,搅拌提取0.5-1.5h,搅拌速度70-90rmp/min,温度40-60℃;
(4)继续加入30-50倍纯化水,用调节pH至11-13,快速升温至70-80℃,保温提取1-3h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入50-70倍纯化水,调节pH至11-13,保温70-80℃,进行二次提取,保温提取0.5-1.5h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/70-1/50,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为20-30%,边加边搅拌,搅拌20-40min后,3-5℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为80-90%,边加边搅拌,搅拌50-70min后,3-5℃静置1-3h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于3-5℃配置好的80-90%乙醇搅拌洗涤1-3次,每次10-20min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用60倍纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用1-3倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时,加水2-4次,每次加0.5-1.5倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
经检测,本发明所得产品多糖含量可达到93.4%,多糖提取率44.2%;终产品颜色为纯白色。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释,其并不是对本发明的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种银耳多糖的提取方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,使用粉碎机进行粉碎,过筛,取筛下部分;按投料质量比,加入去离子水,泡发后,放置于冰箱结冻;
(2)结冻后的样品放置水浴化冻,完全化冻后,重复步骤(1)的结冻过程,反复冻融;
(3)将上一步骤中结冻的样品水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入纯化水,调节pH值,同时加入复合酶,搅拌提取,控制搅拌速度与温度;
(4)继续加入纯化水,调节pH值至11-13,快速升温,保温提取,离心,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜,加入纯化水,调节pH至11-13,加热保温,进行二次提取,保温提取,离心,收集上清液;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调节pH至中性,浓缩;
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,边加边搅拌,至乙醇到第一浓度,静置,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,边加边搅拌,至乙醇到第二浓度,静置,过滤去上清液,收集沉淀;所述第二浓度高于第一浓度;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用预冷配置好的一定浓度乙醇搅拌洗涤;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用一定倍量纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,上清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用一定倍量的纯化水清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,控制真空度,浓缩温度,浓缩至一定体积,加水除醇,浓缩至一定体积时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
2.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,加入15-25倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-15- -25℃冰箱结冻,结冻后继续放置3-5h;
(2)结冻后的样品放置20-40℃水浴化冻,完全化冻后,重复步骤(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品40-60℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入10-30倍纯化水,调节pH6-8,同时加入0.05-0.15%复合酶,搅拌提取0.5-1.5h,搅拌速度70-90rmp/min,温度40-60℃;
(4)继续加入30-50倍纯化水,用调节pH至11-13,快速升温至70-80℃,保温提取1-3h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入50-70倍纯化水,调节pH至11-13,保温70-80℃,进行二次提取,保温提取0.5-1.5h,3500-4500rpm/min离心,时间8-12min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/70-1/50,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为20-30%,边加边搅拌,搅拌20-40min后,3-5℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为80-90%,边加边搅拌,搅拌50-70min后,3-5℃静置1-3h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于3-5℃配置好的80-90%乙醇搅拌洗涤1-3次,每次10-20min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用60倍纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用1-3倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时,加水2-4次,每次加0.5-1.5倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/40-1/20时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
3.根据权利要求2所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以干银耳为原料,投入粉碎机终进行粉碎,按投料质量比,加入20倍量的去离子水,浸泡6-8h,泡发后,放置于-20℃冰箱结冻,结冻后继续放置4h;
(2)结冻后的样品放置30℃水浴化冻,完全化冻后,重复步骤(1)的结冻过程;
(3)将第二次结冻的样品50℃水浴化冻,完全化冻后,放入反应釜内,继续加入20倍纯化水,调节pH7.2,同时加入0.1%复合酶,搅拌提取1h,搅拌速度80rmp/min,温度50℃;
(4)继续加入40倍纯化水,用调节pH至12,快速升温至75℃,保温提取2h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(5)收集的银耳渣投入反应釜内,加入60倍纯化水,调节pH至12,保温75℃,进行二次提取,保温提取1h,4000rpm/min离心,时间10min,分别收集上清液与银耳渣;
(6)收集一次、二次离心上清液合并,用盐酸调pH6-7,减压浓缩,温度≤60℃,真空度控制在-0.06~-0.09MPa,浓缩至合并上清液体积的1/60,
(7)上清液进行第一次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为25%,边加边搅拌,搅拌30min后,4℃静置2h,过滤去沉淀,收集上清液;
(8)上清液进行第二次醇沉,缓慢加入无水乙醇,至乙醇终浓度为85%,边加边搅拌,搅拌60min后,4℃静置2h,过滤去上清液,收集沉淀;
(9)将收集的沉淀置于烧杯中,用冷藏于4℃配置好的85%乙醇搅拌洗涤2次,每次15min;洗涤完毕后,过滤去上清液,收集沉淀;
(10)沉淀用质量与体积比为60倍的纯化水搅拌溶解,完全溶解后,过滤,清液过阴离子树脂,进行脱色,收集流出液,料液上柱完毕后,用2倍CV清洗,收集清洗液;
(11)流出液与清洗液合并进入旋转蒸发仪中进行减压浓缩,真空度控制-0.06~-0.09MPa,浓缩温度≤60℃,浓缩至原流出液体积的1/30时,加水3次,每次加1倍水除醇,浓缩至原流出液体积的1/30时即为浓缩终点;
(12)收集浓缩浸膏,冻干干燥,粉碎,收集干粉,得到白色粉末状固体。
4.根据权利要求3所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述复合酶为纤维素酶:果胶酶的体积比=3:1混合而成。
5.根据权利要求4所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述步骤(7)和步骤(8)采用连续分级醇沉装置,所述连续分级醇沉装置包括反应釜(10)和搅拌机构(1),所述搅拌机构(1)设置在反应釜(10)的内部,其特征在于:所述搅拌机构(1)包括呈镂空结构的框架(101),所述搅拌机构(1)的外侧设置有弹性机构;
所述弹性机构包括固定连接在搅拌机构(1)外侧的n形固定块(21),所述n形固定块(21)的外侧滑动连接有第一滑块(22)和第二滑块(23),所述第一滑块(22)的一侧固定连接有第一弹簧(29),且所述第一弹簧(29)与第二滑块(23)之间固定连接,所述第一滑块(22)和第二滑块(23)的一侧均固定连接有第一固定杆(24),所述第一固定杆(24)的外侧转动连接有支杆(26),所述搅拌机构(1)的外侧设置有连接块(27),所述连接块(27)的一侧固定连接有第二固定杆(25),且所述支杆(26)转动连接在第二固定杆(25)的外侧,所述连接块(27)的一侧固定连接有第一挡板(28);
所述反应釜(10)上设置有乙醇进料口(11)以及加料口(12),所述反应釜(10)的下方设置有药渣去除口(13),所述反应釜(10)的上端设置有驱动机构(14)。
6.根据权利要求5所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述第一滑块(22)的一侧开设有第一空心槽(41),所述第二滑块(23)的一侧开设有第二空心槽(43),所述n形固定块(21)的一侧固定连接有限位杆(42),所述第一滑块(22)和第二滑块(23)均滑动连接在限位杆(42)的外侧,且所述第一弹簧(29)套设在限位杆(42)的外侧。
7.根据权利要求6所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述支杆(26)的一侧设置有第一限位环(31)和第二限位环(32),所述第一限位环(31)与第一固定杆(24)之间固定连接,所述第二限位环(32)与第二固定杆(25)之间固定连接。
8.根据权利要求7所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述n形固定块(21)的一侧设置有伸缩杆(5),所述伸缩杆(5)的一端与搅拌机构(1)之间固定连接,所述伸缩杆(5)的另一端与第一挡板(28)之间固定连接。
9.根据权利要求8所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述搅拌机构(1)的外侧固定连接有第二弹簧(6),所述第二弹簧(6)与第一挡板(28)之间固定连接,且所述支杆(26)套设在伸缩杆(5)的外侧。
10.根据权利要求9所述的一种银耳多糖的提取方法,其特征在于:所述反应釜(10)上设置有盖件(15),所述反应釜(10)的上开设有第一贯穿孔(16),所述盖件(15)盖在第一贯穿孔(16)上,所述盖件(15)的中部开设有第二贯穿孔(17),所述反应釜(10)与盖件(15)之间贯穿安装有反应釜控压组件(18);
所述反应釜控压组件(18)包括密封滑动设置于第一贯穿孔(16)内部的锥形塞a(1801),所述第二贯穿孔(17)上密封滑动设置有锥形塞b(1802),所述锥形塞b(1802)与第二贯穿孔(17)之间密封滑动设置,所述锥形塞a(1801)与锥形塞b(1802)之间设置有连接杆(1803),所述盖件(15)位于连接杆(1803)的外部固定设置有固定套(1804),所述连接杆(1803)的中部固定设置有记忆合金片(1805),且所述记忆合金片(1805)与固定套(1804)之间呈密封固定连接;
所述锥形塞a(1801)与锥形塞b(1802)均呈锥型设置,且所述锥形塞a(1801)设置于反应釜(10)的内部,所述锥形塞b(1802)设置于盖件(15)的外部。
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