CN108033991A - 一种利用双水相分配技术提取甘草酸的方法 - Google Patents

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吴疆
王少侠
田申红
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Abstract

本发明公开了一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括：1)将甘草和蒸馏水放入加热回流装置中，加热至沸腾，回流0.5‑2小时，将回流后液体过滤后离心分离出上清液，并将上清液浓缩至原滤液体积的三分之一，得到甘草浓缩液；2)向离心装置中加入由K2HPO4、EO60PO40和蒸馏水组成的双水相萃取液，并加入甘草浓缩液，混匀，在3000‑6000r/min的速度下离心分离上下相；将上相在45‑60℃的恒温水浴中加热0.5‑2h，并分离出下相，得到甘草酸，其中，双水相萃取液由18‑26wt％的K2HPO4、20‑40wt％的EO60PO40和余量的蒸馏水组成，甘草浓缩液与双水相萃取液的质量比为(3‑5)：(5‑7)。该方法条件温和，能尽可能地保护甘草酸的生物学活性，产品的得率和提取率高且操作简单，适合大规模生产。

Description

一种利用双水相分配技术提取甘草酸的方法
技术领域
本发明涉及甘草酸提取领域，特别是涉及一种利用双水相分配技术提取甘草酸的方法。
背景技术
科学家已经确认甘草酸具有消炎、解毒、镇咳、抗菌、抗溃疡、抗肿瘤作用，能够改善高血脂、改善肝功能，抗病毒的作用、癌症促进因子抑制的作用、预防龋齿作用等药理作用。甘草酸的另外一个重要特征是具有蔗糖170倍的甜味，可以与多种生物碱、抗生素以及氨基酸生成复盐或复方制剂。具备协同、增溶、增加药物的稳定性、提高生物利用度以及减小毒副作用的功效。
目前，甘草酸的提取主要是利用甘草酸遇酸沉淀的特性进行提取，主要提取方法有浸渍法、煎煮法、乙醇回流法等，这些方法共同的缺点是提取过程条件激烈，温度较高，使用乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂进行提取，较高的温度和有机溶剂的使用易使甘草酸损失生物活性。另外有机溶剂的残留与回收都会造成严重的环境问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能使甘草酸保持生物活性且环保的提取纯化甘草酸的方法。
为此，本发明的技术方案如下：
一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括以下步骤：
1)材料预处理：将甘草和蒸馏水放入加热回流装置中，加热至沸腾后，回流0.5-2小时，将回流后的液体过滤，所得滤液在3000-6000r/min的速度下离心10-15min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至其体积的三分之一，得到甘草浓缩液，
其中，所述甘草与蒸馏水的质量比为1：(2-4)；
2)双水相萃取：向离心装置中加入由K2HPO4、EO60PO40和蒸馏水组成的双水相萃取液，并加入所述甘草浓缩液，混匀，在3000-6000r/min的速度下离心10-15min，分离上下相；将含有甘草酸的上相在45-60℃的恒温水浴中加热0.5-2h，并分离出下相，得到甘草酸，
其中，所述双水相萃取液由18-26wt％的K2HPO4、20-40wt％的EO60PO40和余量的蒸馏水组成，所述甘草浓缩液与双水相萃取液的质量比为(3-5)：(5-7)。
优选的是，步骤1)中，所述甘草与蒸馏水的质量比为1：2。
优选的是，步骤2)中，所述的双水相萃取液由30wt％的EO60PO40、24wt％的K2HPO4和余量的蒸馏水组成。
优选的是，步骤2)中，恒温水浴的温度为53℃，恒温水浴时间为1.5h。
本发明具有以下有益效果：
本发明的方法采用两水相进行甘草酸的提取，甘草酸始终处于水溶液中，可以尽可能地保护其生物学活性。该方法条件温和，不仅提高了产品的得率和提取率，而且操作简单，适合大规模生产。另外，本发明提供了一种新型双水相体系，其中的成相物质能够通过温度变化重新分相进行回收(分相后直接取出下相即可)和再利用。
附图说明
图1是本发明的实施例2中不同质量分数的K2HPO4所萃取的甘草酸溶液的吸光度值；
图2是本发明的实施例3中不同的水浴时间下萃取液的吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细说明。
实施例1
一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括以下步骤：
(1)材料预处理：称取市售的甘草50g，加入100mL的蒸馏水，用加热套加热回流，加热至溶液沸腾时开始计时，回流1.5h。将回流后的液体过滤，将滤液放入离心管中，在3000r/min的速度下离心10min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至上清液体积的三分之一，得到甘草浓缩液。
(2)双水相萃取：取一支50mL的离心管，向离心管内加入质量分数为24％的K2HPO4，质量分数为30％的EO60PO40和蒸馏水，使总质量为10g，再加入4g的甘草浓缩液混匀，在3000r/min的速度下离心10min，分离上下相，将含有甘草酸的上相(EO60PO40)放入小试管内，将小试管放入53℃恒温水浴锅，水浴时间为1.5h。分离出下相，得到甘草酸。
甘草酸大部分被分配在下相中。经大量实验验证，上述实验条件为最佳条件，即：EO60PO40的质量分数为30％，K2HPO4的质量分数为24％，水浴温度53℃，水浴时间1.5h。
在上述最佳条件下制得的甘草酸提取液的吸光度值达到最高，即：0.697。
标准曲线的绘制：
(1)将实施例1制得的甘草酸样品用50％的乙醇稀释至50mL容量瓶的刻度线处，摇匀。在253nm的波长下测定其吸光度值。
(2)标准曲线制作：精密称取甘草酸铵盐对照品0.0525g，用50％的乙醇溶解并转移至50mL的容量瓶中，然后用50％的乙醇对烧杯进行润洗，润洗3次，将润洗液转移全量转移至50mL容量瓶中，加入50％的乙醇稀释至刻度线，摇匀，所得溶液简称A液。用移液管吸取A液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL分别置于50mL的容量瓶，用50％的乙醇稀释至刻度线，摇匀。配成的一系列梯度溶液，用紫外-可见分光光度计在253nm的波长下测定其吸光度值，以50％的乙醇作为参比溶液。实验结果见表1，回归方程为：y＝7.832x-0.045
表1 绘制标准曲线的实验数据
实施例2
一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括以下步骤：
(1)材料预处理：称取市售的甘草50g，加入100mL的蒸馏水，用加热套加热回流，加热至溶液沸腾时开始计时，回流1.5h。将回流后的液体过滤后放入离心管中，用托盘天平配平，在3000r/min的速度下离心10min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至其体积的三分之一。
(2)双水相萃取操作：取5支50mL的离心管，编号为1-5，每支离心管内加入质量分数为30％的EO60PO40，于每支试管内加入不同质量分数的K2HPO4和蒸馏水，使总质量为10g，具体配置方法如表2所示。再加入4g的甘草浓缩液混匀，在3000r/min的条件下离心10min，分离上下相，将含有甘草酸的上相(EO60PO40)放入小试管内，编号与离心管相对应，将小试管分别放入53℃恒温水浴锅，水浴时间为1h。分离上下相，将富含甘草酸的下相收集，对其进行20倍稀释，在253nm处测其吸光度值并记录数据。
表2 不同质量分数的K2HPO4配置的双水相体系
在EO60PO40的质量分数为30％的时候，考察K2HPO4的质量分数的变化，对甘草酸萃取率的影响，结果见表3。
表3 不同K2HPO4的质量分数所得到溶液的吸光度
将表3的数据进行整理分析，制成折线图，得到图1，不同质量分数的K2HPO4萃取甘草中甘草酸溶液的吸光度值的变化趋势。
通过表3和图1可以看出，在K2HPO4的质量分数为18％-22％时，随着K2HPO4的质量分数逐渐增加，测得溶液的吸光度值在逐渐的增加，增加趋势较明显，即溶液中甘草酸的含量在逐渐的增多；当K2HPO4的质量分数由22％向24％增加时，溶液的吸光度同样也在增加，但是增加趋势有所减弱；当K2HPO4的质量分数增加到24％时，继续增加K2HPO4的质量分数，溶液的吸光度不但没有增加，反而减小。说明在该体系中，当EO60PO40的质量分数为30％时，K2HPO4的最佳质量分数为24％。
实施例3
一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括以下步骤：
(1)材料预处理：称取市售的甘草50g，加入100mL的蒸馏水，用加热套加热回流，加热至溶液沸腾时开始计时，回流1.5h。将回流后的液体过滤，放入离心管中，用托盘天平配平，在3000r/min的速度下离心10min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至其体积的三分之一。
(2)双水相萃取操作：取4支50mL的离心管，编号1-4。配置总质量为10g的双水相体系，每支离心管内加入EO60PO40的质量分数为30％，K2HPO4的质量分数为24％和蒸馏水。再加入4g的甘草浓缩液混匀，在3000r/min的转速下离心10min，分离上下相，将含有甘草酸的上相(EO60PO40)放入小试管内，编号与离心管相对应，将小试管用试管夹夹好，放入温度为53℃恒温水浴锅内，水浴时间依次为0.5h、1h、1.5h和2h，水浴后观察试管内溶液是否分相，分离上下相，对其进行20倍稀释，用紫外分光光度计在253nm处进行测量，并对测量值进行记录。
表4 1-4号的小试管的水浴时间(单位：h)
在EO60PO40的质量分数在30％、K2HPO4的质量分数在24％，浊点温度为53℃的时候，观察分相时间的变化，对甘草中甘草酸萃取率的影响，结果见表5。
表5 不同萃取时间对萃取结果的影响
对表5的数据进行整理分析，分析在二次分相时，不同的水浴时间对萃取液中甘草酸含量的影响，制成折线图表，得到图2，溶液的吸光度值的变化趋势如图2所示。
从表5和图2可以看出，当萃取时间为1.5h时，甘草酸溶液的吸光度值最大，即萃取率较高。当萃取时间为0.5h或小于0.5h时，在该双水相体系中，溶液的二次分相是无法完成的；当萃取时间在0.5-1h时，溶液的二次分相是逐渐慢慢开始的，当萃取时间为1h时，该体系所得到溶液的吸光度值为0.384；当萃取时间在1-1.5h时，溶液的吸光度值极具的增加；当萃取时间大于1.5h时，溶液的吸光度值开始减小，但是溶液的吸光度值变化幅度没有1-1.5h区间的变化幅度大。即该双水相的最佳萃取时间为1.5h。
实施例4
一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，包括以下步骤：
(1)材料预处理：称取市售的甘草50g，加入100mL的蒸馏水，用加热套加热回流，加热至溶液沸腾时开始计时，回流1.5h。将回流后的液体过滤，放入离心管中，用托盘天平配平，在3000r/min的速度下离心10min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至原滤液体积的三分之一。
(2)取5支50mL的离心管，编号1-5，配置总质量为10g的体系。每支离心管内加入EO60PO40的质量分数为30％，K2HPO4的质量分数为24％和蒸馏水共10g。混匀后加入4g的甘草浓缩液混匀，在3000r/min的转速下离心10min，分离上下相，将含有甘草酸的上相(EO60PO40)放入小试管内，编号与离心管相对应，将小试管分别放入不同温度的恒温水浴锅，水浴时间为1.5h，具体水浴温度如下表6所示。分离上下相，将富含甘草酸的下相收集，对其进行20倍稀释，在253nm处测其吸光度值并记录数据。
表6 1-5号的小试管的水浴温度(单位：℃)
在EO60PO40的质量分数为30％，K2HPO4的质量分数为24％的时候，考察温度的变化，对甘草中甘草酸萃取率的影响，结果见表7。
表7 不同温度对萃取结果的影响
由表7中的结果可以看出，当萃取温度为53℃时，所测得的吸光度值最大，表明53℃为萃取的最佳温度。

Claims (4)

1.一种利用双水相分配技术提取纯化甘草酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)材料预处理：将甘草和蒸馏水放入加热回流装置中，加热至沸腾后，回流0.5-2小时，将回流后的液体过滤，所得滤液在3000-6000r/min的速度下离心10-15min，分离出上清液，并将所述上清液浓缩至所述其体积的三分之一，得到甘草浓缩液，
其中，所述甘草与蒸馏水的质量比为1：(2-4)；
2)双水相萃取：向离心装置中加入由K2HPO4、EO60PO40和蒸馏水组成的双水相萃取液，并加入所述甘草浓缩液，混匀，在3000-6000r/min的速度下离心10-15min，分离上下相；将含有甘草酸的上相在45-60℃的恒温水浴中加热0.5-2h，并分离出下相，得到甘草酸，
其中，所述双水相萃取液由18-26wt％的K2HPO4、20-40wt％的EO60PO40和余量的蒸馏水组成，所述甘草浓缩液与双水相萃取液的质量比为(3-5)：(5-7)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述甘草与蒸馏水的质量比为1：2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述的双水相萃取液由30wt％的EO60PO40、24wt％的K2HPO4和余量的蒸馏水组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中，恒温水浴的温度为53℃，恒温水浴时间为1.5h。
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