CN106928309A - 一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱(3β,22α,25R)‑螺旋甾碱烷‑5‑烯基‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→2)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→4)‑β‑D‑吡喃半乳糖苷及其制备方法与用途，该螺旋甾碱烷型糖苷生物碱对人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞H460和人肺鳞癌细胞SK‑MES‑1均具有抑制作用，且对A549细胞的半抑制浓度为61.53μg/ml，对H460细胞的半抑制浓度为159.11μg/ml，对SK‑MES‑1细胞的半抑制浓度为81.64μg/ml，可见本发明制备得到的(3β,22α,25R)‑螺旋甾碱烷‑5‑烯基‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→2)‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→4)‑β‑D‑吡喃半乳糖苷及其制剂可用于治疗非小细胞肺癌。
Description
技术领域
本发明属于糖苷生物碱制备方法及药物用途技术领域，具体涉及一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱及其制备方法与用途。
背景技术
糖苷生物碱主要分布在茄科及百合科的植物体内，由疏水性的苷元和亲水性的寡糖链构成，其苷元包括螺旋甾碱烷、茄次碱烷和其他甾体衍生物三种，寡糖链由3～4个单糖组成，是一种甾体皂苷。植物合成糖苷生物碱主要是为了防御微生物、动物及昆虫的侵袭，因此，糖苷生物碱具有一定的毒性，但与此同时，它还具有降低胆固醇和高血压、消炎、活血镇痛、抗过敏、增强机体免疫力、抗病原微生物等多种生理活性，具有潜在的药用价值。茄科和百合科的植物在自然界中广泛存在，如白英、马铃薯和番茄等植物，具有很强的经济价值，中药白英始载于《神农百草经》，其味甘，性寒，具有清热、解毒、祛风、化瘀等功效，研究表明白英的主要化学成分为糖苷生物碱，因此，研究从中药白英中提取新型的糖苷生物碱具有重要意义。
鉴于糖苷生物碱的上述药物功效，医药界对其非常重视，中国专利文献CN101450144 A公开了一种白英总皂苷提取物及其制备方法和用途，该提取物为蜀羊泉苷B、蜀羊泉苷C、δ-苦茄碱和薯蓣皂苷(结构式如下)中的一种或多种，上述白英总皂苷提取物可用于治疗胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃癌和银屑病等疾病，且具有很好的治疗效果。众所周知，白英总皂苷提取物是一种混合物，其包括了多种结构的化合物，但并不能确定每种化合物均具有相同或相应的功效，即并不能完全确认上述文献中公开的白英总皂苷提取物中包括的化合物对治疗胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃癌和银屑病等疾病均能起到良好的协同作用，这也是中药提取物具有不可预见的副作用的原因，因此，对药用植物提取物进行进一步的精制和研究，将多种复杂的化合物进行分离和提取，并对其功效进行确认具有重要的意义，为此，如何对药用植物提取物进行有效的分离并得到具有潜在药用价值的化合物是所有医药工作者所必须面对的课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中药用植物提取物成分复杂，其所有成分的功效及相互影响不能完全确认的缺陷，从而提供一种单一组分的化合物螺旋甾碱烷型糖苷生物碱，进而提供其制备方法与其在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。
为此，本发明实现上述目的的技术方案为：
本发明提供一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱，具有式(I)所示结构，
本发明还提供一种上述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制备方法，包括如下步骤：
(1)取白英药材加入醇溶液中进行醇提，将获得的醇提取液进行精制，即得白英总碱样品，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的白英总碱样品加入醇溶液中加热溶解，以薄层层析硅胶拌样，然后上样于硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为(2～3):1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为93％～97％，，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流动相流速为25～35mL/min；控制柱温为20～30℃；控制进样体积为0.5～1.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
在所述步骤(1)中，制备白英总碱样品的具体方法为：将白英干燥全草用体积浓度为70％的乙醇水溶液回流提取，过滤，将滤液浓缩至50℃相对密度为1.05的浸膏，加入蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2～4倍柱体积的蒸馏水和2～4倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为6‰的盐酸乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用6～10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得白英总碱。
在所述步骤(2)中，称取白英总碱样品30～40重量份，加入300-1000体积份的体积浓度为93～97％的乙醇水溶液中在温度为80～100℃下溶解，然后加入10～20重量份的薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入780～820重量份的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
在所述步骤(2)中，以体积比为2.5:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为95％。
在所述步骤(2)中，所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的制备方法为：
称取碱式硝酸铋0.8～0.9重量份，依次加入9～11体积份的冰醋酸、39～41体积份的水和19～21体积份的碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；
向所述碘化铋钾试液中加入质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液；
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
在所述步骤(3)中，流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％。
本发明还提供包括上述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂，或者包括上述制备方法制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂，以所述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱为有效成分，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的制剂。
所述制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、锭剂或合剂。
本发明还提供上述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱、上述制备方法制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱、上述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下优点：
1、本发明所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱，其为一种单一组分即化学命名为(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，其对人肺腺癌细胞A549，人大细胞肺癌细胞H460和人肺鳞癌细胞SK-MES-1均具有抑制作用，且本发明制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱对A549细胞的半抑制浓度为61.53μg/ml，对H460细胞的半抑制浓度为159.11μg/ml，对SK-MES-1细胞的半抑制浓度为81.64μg/ml，可见本发明所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱组分单一，功能确切，且可用于治疗非小细胞肺癌。
2、本发明所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制备方法，由于糖苷生物碱含有极性较大的糖链结构和极性较小的甾体单元，使得糖苷生物碱不溶于水、丙酮和乙酸乙酯等大多数有机溶剂，只能溶于甲醇、乙醇等少数有机溶剂，糖苷生物碱结构中含有氮原子，表现出一定的弱碱性，因此可在酸性溶液中成盐溶解，在碱性条件下沉淀析出，因此本发明采用盐酸乙醇-氨水沉淀法精制白英总碱，然后应用柱层析，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；将两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解后通过制备色谱纯化，通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到本发明所述的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，所述制备方法操作简单，科学合理。
3、本发明所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制备方法，在柱层析分离过程中以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，该显色剂的制备方法为：向碱式硝酸铋中依次加入冰醋酸、水和碘化钾溶液，再向混合均匀后的试液中加入0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即制得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液，该制备方法制备得到的显色剂使得以薄层色谱进行检测时，极性组分相对背景色而言显色清楚，容易判断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的结构式；
图2是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的1HNMR谱图；
图3是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的13C NMR谱图；
图4是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的H-H cosy谱图；
图5是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的HMQC谱图；
图6是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的HMBC谱图；
图7是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的Tocsy谱图；
图8是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的Noesy谱图；
图9是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对A549、H460和SK-MES-1细胞的抑制效果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明以下实施例和实验例中，
1、试剂与耗材：
细胞培养瓶(美国FALCON 353014)；
Penicillin/streptomycin solution(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGY002)；
0.25％Tripsin-EDTA(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGY001)；
MTT(美国Amresco 0793)；
DMSO(美国SIGMA D2650)；
PBS(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGB500)；
RPMI-1640(美国GIBCO 31800-105)；
DMEM(美国GIBCO 12800-082)；
FBS(美国ExCell Biology FBS500)；
96wellcell culture plate(美国Corning Incorporated 3599)；
2、仪器与设备
超净工作台(中国苏州净化SW-CJ-1FD)；
CO2培养箱(日本SANYO XD-101)；
生物倒置显微镜(日本OLYMPUS IX51)；
台式低速离心机(中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2)；
2.5uL、10uL、200uL、1000uL移液器(德国eppendorf)；
立式压力锅(中国上海博讯，YXQ-LS-50)；
电热鼓风干燥箱(中国上海圣欣，101AS-3)；
酶标仪(美国BioTek ELx800)；
振荡器(中国上海沪西分析仪器厂WH-2)；
Waters 2767/QDa制备液相质谱联用色谱仪：Masslynx4.1色谱工作站，Waters2767样品管理器，Waters2489紫外可见光检测器，Waters2545二元高压色谱泵，QDa质谱检测器，色谱柱为Waters SunFire Prep C18OBD(10μm，19×250mm)Column。
实施例1
本实施例提供的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法包括以下步骤：
(1)取10Kg白英干燥全草，加入80L体积浓度为70％的乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2h，过滤，合并滤液；将上述滤液浓缩至在50℃相对密度为1.05的浸膏，加入10倍浸膏质量的蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用3倍柱体积的蒸馏水和3倍柱体积的体积浓度为95％的乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用4倍柱体积的含有体积分数为6‰盐酸的乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用8倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用4倍柱体积的体积浓度为95％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得35g白英总碱，得率为3.5‰；
(2)取35g白英总碱样品加入650mL体积浓度为95％乙醇水溶液中在温度为90℃下溶解，然后加入15g薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入800g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；以体积比为2.5∶1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为95％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.85g，依次加入10mL冰醋酸、40mL水和20mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％～70％；控制流动相流速为30mL/min；控制柱温为25℃；控制进样体积为1mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的1HNMR谱图、13C NMR谱图、H-H cosy谱图、HMQC谱图、HMBC谱图、Tocsy谱图和Noesy谱图分别见图2-8。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，其结构式如图1所示，其中碳原子编号1-27已经在图1所示的结构式中标出。表1为图2-8的解析结果。
表1图2-8的解析结果
其中，表1中的氢谱和碳谱数据为在1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)，溶剂为氘代甲醇的条件下得到。
实施例2
本实施例提供的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法包括以下步骤：
(1)精制白英总碱：取10Kg白英干燥全草，加入60L体积浓度为70％乙醇水溶液，回流提取4次，每次提取2h，过滤，合并滤液；将上述滤液浓缩至在50℃相对密度为1.05的浸膏，加入8倍浸膏质量的蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2倍柱体积的蒸馏水和4倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用3倍柱体积的含有体积浓度为6‰盐酸的乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用6倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得35g白英总碱，得率为3.5‰；
(2)取30g白英总碱样品加入1000mL体积浓度为93％乙醇水溶液中在温度为100℃下溶解，然后加入10g薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入820g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；以体积比为3∶1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为93％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.8g，依次加入11mL冰醋酸、39mL水和21mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％：76％→31％～69％；控制流动相流速为25mL/min；控制柱温为30℃；控制进样体积为0.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂。
实施例3
本实施例提供的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法包括以下步骤：
(1)精制白英总碱：取10Kg白英干燥全草，加入100L体积浓度为70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液；将上述滤液浓缩至在50℃相对密度为1.05的浸膏，加入12倍浸膏质量的蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用4倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用5倍柱体积的含有体积分数为6‰盐酸的乙醇水溶液洗脱，盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用3倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得35g白英总碱，得率为3.5‰；
(2)取40g白英总碱样品加入300mL体积浓度为97％乙醇水溶液中在温度为80℃下溶解，然后加入20g薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入780g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；以体积比为2:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为97％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.9g，依次加入9mL冰醋酸、41mL水和19mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为26％：74％→29％～71％；控制流动相流速为35mL/min；控制柱温为20℃；控制进样体积为1.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷加入常规辅料，按照常规工艺制成胶囊剂。
实施例4
本实施例提供的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法包括以下步骤：
(1)精制白英总碱：取10Kg白英干燥全草，加入100L体积浓度为70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液；将上述滤液浓缩至在50℃相对密度为1.05的浸膏，加入12倍浸膏质量的蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用3倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用4倍柱体积的含有体积分数为6‰盐酸的乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用4倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得35g白英总碱，得率为3.5‰；
(2)取38g白英总碱样品加入300mL体积浓度为94％乙醇水溶液中在温度为80℃下溶解，然后加入16g薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入780g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；以体积比为2.6:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为94％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.88g，依次加入10.5mL冰醋酸、40.5mL水和19mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为26％：74％→29％～71％；控制流动相流速为35mL/min；控制柱温为20℃；控制进样体积为1.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷加入常规辅料，按照常规工艺制成糖浆剂。
实施例5
本实施例提供的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的制备方法包括以下步骤：
(1)精制白英总碱：取10Kg白英干燥全草，加入100L体积浓度为70％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2h，过滤，合并滤液；将上述滤液浓缩至在50℃相对密度为1.05的浸膏，加入12倍浸膏质量的蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2倍柱体积的蒸馏水和3倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用4倍柱体积的含有体积分数为6‰盐酸的乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用8倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得35g白英总碱，得率为3.5‰；
(2)取32g白英总碱样品加入1000mL体积浓度为96％乙醇水溶液中在温度为80℃下溶解，然后加入20g薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入810g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；以体积比为2.8:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为96％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.81g，依次加入9.6mL冰醋酸、40mL水和19.5mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为26％：74％→29％～71％；控制流动相流速为35mL/min；控制柱温为20℃；控制进样体积为1.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷加入常规辅料，按照常规工艺制成酊剂。
实验例1本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对非小细胞肺癌细胞的抑制效果
1、实验目的
研究本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对非小细胞肺癌细胞的抑制效果。
2、实验方法
2.1细胞信息
三种非小细胞肺癌细胞株：人肺腺癌细胞A549，人大细胞肺癌细胞H460，人肺鳞癌细胞SK-MES-1，细胞均由江苏凯基生物技术股份有限公司提供；A549/H460完全培养基为90％RPMI640+10％FBS；SK-MES-1完全培养基为90％DMEM+10％FBS；于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
2.2细胞培养
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％～90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶(0.25％)，消化1～2min；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化；
(4)用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000rpm离心5min；
(5)倒掉上清液，加1～2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养。
2.3MTT法检测细胞增殖：
(1)分别取对数生长期A549、H460、SK-MES-1细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液；
(2)将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
(3)用完全培养基稀释本发明实施例1制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱至表2中所需药物浓度，每孔加入100μL相应的上述含药培养基，同时设立空白对照组(加入同体积空白培养液)；
(4)将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h；
(5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值；
A每孔加入20μLMTT(5mg/ml)，在培养箱继续培养4h；
B弃去培养基，每孔加入150μLDMSO溶解，摇床10min轻轻混匀；
Cλ＝490nm，酶标仪读出每孔的吸光度OD值，计算抑制率；
(6)计数各组别抑制率及药物半抑制浓度(IC50)
抑制率(％)＝(A空白对照组-A药物组)/A空白对照组×100％，
式中，A为吸光度。
应用SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0通过机率单位加权回归法(Bliss法)计算IC50。
3、实验结果
本发明制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱对人肺腺癌细胞A549，人大细胞肺癌细胞H460和人肺鳞癌细胞SK-MES-1的抑制效果如表2和图9所示。
表2本发明制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱对A549、H460、SK-MES-1细胞的抑制率(n＝6)
由表2和图9可知，随着(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷浓度的增加，其对细胞的抑制作用逐渐增强，(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对A549细胞的半抑制浓度为61.53μg/ml，对H460细胞的半抑制浓度为159.11μg/ml，对SK-MES-1细胞的半抑制浓度为81.64μg/ml。
4、实验结论
本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞H460和人肺鳞癌细胞SK-MES-1具有较好的抑制效果，且对人肺腺癌细胞A549的抑制效果比其他两种癌细胞效果好，由此表明，本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷可用于治疗非小细胞肺癌。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种螺旋甾碱烷型糖苷生物碱，其特征在于，具有式(I)所示结构，
2.一种权利要求1所述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取白英药材加入醇溶液中进行醇提，将获得的醇提取液进行精制，即得白英总碱样品，备用；
(2)将步骤(1)制备得到的白英总碱样品加入醇溶液中加热溶解，以薄层层析硅胶拌样，然后上样于硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为(2～3):1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为93％～97％，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
(3)将步骤(2)得到的两种组分中极性小的组分用二甲基酰胺溶解，0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，1％TFA水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流动相流速为25～35mL/min；控制柱温为20～30℃；控制进样体积为0.5～1.5mL；通过质谱检测器检测成分，收集相对分子质量为899的成分，得到如式(I)所示结构的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，制备白英总碱样品的具体方法为：将白英干燥全草用体积浓度为70％的乙醇水溶液回流提取，过滤，将滤液浓缩至50℃相对密度为1.05的浸膏，加入蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2～4倍柱体积的蒸馏水和2～4倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为6‰的盐酸乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为95％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用6～10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得白英总碱。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，称取白英总碱样品30～40重量份，加入300-1000体积份的体积浓度为93～97％的乙醇水溶液中在温度为80～100℃下溶解，然后加入10～20重量份的薄层层析硅胶混合均匀，上样于加入780～820重量份的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，以体积比为2.5:1的乙酸乙酯和乙醇水溶液形成的洗脱剂进行洗脱，所述乙醇水溶液的体积浓度为95％。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的制备方法为：
称取碱式硝酸铋0.8～0.9重量份，依次加入9～11体积份的冰醋酸、39～41体积份的水和19～21体积份的碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；
向所述碘化铋钾试液中加入0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液；
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％。
8.包括权利要求1所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂，或者包括权利要求2-7任一项所述的制备方法制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂，其特征在于，以所述螺旋甾碱烷型糖苷生物碱为有效成分，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的制剂。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、锭剂或合剂。
10.权利要求1所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱、权利要求2-7任一项所述的制备方法制备得到的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱、或权利要求8或9所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。
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Granted publication date: 20190226 Termination date: 20220217 |
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