CN108203473A - 一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型抗肿瘤化合物,以黑灵芝为原料,经过提取、精制分离、硫酸化得到产物S‑PSG,能够刺激巨噬细胞,明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF‑α的蛋白表达量,使机体的免疫功能加强,进而增强抵抗疾病的能力,对DPPH自由基的清除效果较好,可用于抗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型抗肿瘤化合物,尤其涉及一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物。
背景技术
近年来随着人们生活方式的改变和医疗技术的提高,肿瘤检出人数也呈增高趋势,肿瘤已成为对人类健康造成严重威胁的重要疾病之一,由于对患者机体具有较高的损害性和较高的病死率,抗肿瘤药物的应用和研究一直是人们所关注的焦点,新的治疗理论和新型药物不断被开发和应用。
科学家们合成了许多分子靶标明确的抗肿瘤分子药物,但是由于化学合成药物的开发周期长以及研发费用昂贵,且临床毒副作用大,制约了药物的进一步研发和应用。中草药和植物药等天然药用材料中存在着广泛的生物活性物质,研究者可从中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型抗肿瘤药物,对免疫巨噬细胞则有明显的激活作用,通过刺激机体的免疫功能来消灭肿瘤细胞,而不是通过细胞毒作用直接抗肿瘤。
本发明的技术方案如下:
一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,制备方法为:
(1)取干燥黑灵芝药材100g,加95%乙醇室温浸泡提取48h,过滤,重复一次,药渣于室温下置通风处晾干,然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:20的比例混合,回流提取两次,每次提取时间依次为2h,1h,合并提取液,离心分离,减压浓缩;所得样品加入适量的95%乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80%,然后进行沉淀,4℃下静置24h,离心过滤;沉淀物合并,依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物,冷冻干燥得样品;取得到的干燥样品,以Sevag法除蛋白,即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇=5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀,静置,除去下层蛋白质变性层;将样品浓缩,重复除蛋白操作10次;浓缩除蛋白样品后用95%乙醇洗涤,再浓缩,冻干得粗提物样品;将粗提物样品使用透析袋透析3天,将袋内样品浓缩至小体积,冷冻干燥,得黑灵芝精提物;
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg,加入蒸馏水配成浓度为3~5mg/mL的溶液,离心,上清液过凝胶柱层析,使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统,凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade,上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱,洗脱液为蒸馏水,流速为2mL/min,上样体积为5mL,分部收集体积为8mL/管,紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况;取第6-14管合并,浓缩,冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG,为黄色或棕色的絮状固体;
(3)①硫酸酯化试剂的制备:加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中,冰水浴冷却至0℃,磁力搅拌下缓慢地加入氯磺酸,室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏,1周内有效。
②S-PSG的制备:取PSG300mg,悬浮于30mL无水甲酰胺中,反应瓶置于冰浴中,逐滴加入4mL硫酸酯化试剂,然后混合物在45℃水浴中搅拌反应6h,反应结束后,冷却至室温,加15mL 2.5mo/L的氢氧化钠溶液中和,混合液置于透析袋中对水透析3d,将透析内液真空浓缩至最小体积,加入4倍体积乙醇沉淀,沉淀物用无水乙醇反复洗涤,挥发干乙醇,研磨,过筛后得白色粉末状产物,记为S-PSG。
所述步骤(3)①中硫酸酯化试剂的制备,氯磺酸和吡啶的比例可为氯磺酸﹕吡啶=1﹕3,1﹕1和3﹕1(v/v),得到的S-PSG分别极为S-PSG1、S-PSG2和S-PSG3。
本发明硫酸化产物S-PSG,能够刺激巨噬细胞,明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清中TNF-α的蛋白表达量,使机体的免疫功能加强,进而增强抵抗疾病的能力,对DPPH自由基的清除效果较好,可用于抗肿瘤。
附图说明
图1为S-PSG1的高效凝胶渗透色谱图。
图2为PSG、S-PSG3的红外光谱图。
图3为PSG、S-PSG1、S-PSG 3清除DPPH自由基的能力示意图。
具体实施方式
实施例1:一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,制备方法为:
(1)取干燥黑灵芝药材100g,加95%乙醇室温浸泡提取48h,过滤,重复一次,药渣于室温下置通风处晾干,然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:20的比例混合,回流提取两次,每次提取时间依次为2h,1h,合并提取液,离心分离,减压浓缩;所得样品加入适量的95%乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80%,然后进行沉淀,4℃下静置24h,离心过滤;沉淀物合并,依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物,冷冻干燥得样品;取得到的干燥样品,以Sevag法除蛋白,即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇=5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀,静置,除去下层蛋白质变性层;将样品浓缩,重复除蛋白操作10次;浓缩除蛋白样品后用95%乙醇洗涤,再浓缩,冻干得粗提物样品;将粗提物样品使用透析袋透析3天,将袋内样品浓缩至小体积,冷冻干燥,得黑灵芝精提物;
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg,加入蒸馏水配成浓度为3~5mg/mL的溶液,离心,上清液过凝胶柱层析,使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统,凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade,上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱,洗脱液为蒸馏水,流速为2mL/min,上样体积为5mL,分部收集体积为8mL/管,紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况;取第6-14管合并,浓缩,冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG,为黄色或棕色的絮状固体;
(3)①硫酸酯化试剂的制备:加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中,冰水浴冷却至0℃,磁力搅拌下缓慢地加入氯磺酸,室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏,1周内有效。
②S-PSG的制备:取PSG300mg,悬浮于30mL无水甲酰胺中,反应瓶置于冰浴中,逐滴加入4mL硫酸酯化试剂,然后混合物在45℃水浴中搅拌反应6h,反应结束后,冷却至室温,加15mL 2.5mo/L的氢氧化钠溶液中和,混合液置于透析袋中对水透析3d,将透析内液真空浓缩至最小体积,加入4倍体积乙醇沉淀,沉淀物用无水乙醇反复洗涤,挥发干乙醇,研磨,过筛后得白色粉末状产物,记为S-PSG。
所述步骤(3)①中硫酸酯化试剂的制备,氯磺酸和吡啶的比例可为氯磺酸﹕吡啶=1﹕3(v/v),得到的S-PSG分别极为S-PSG1。
实施例2:一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,制备方法为:
(1)取干燥黑灵芝药材100g,加95%乙醇室温浸泡提取48h,过滤,重复一次,药渣于室温下置通风处晾干,然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:20的比例混合,回流提取两次,每次提取时间依次为2h,1h,合并提取液,离心分离,减压浓缩;所得样品加入适量的95%乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80%,然后进行沉淀,4℃下静置24h,离心过滤;沉淀物合并,依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物,冷冻干燥得样品;取得到的干燥样品,以Sevag法除蛋白,即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇=5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀,静置,除去下层蛋白质变性层;将样品浓缩,重复除蛋白操作10次;浓缩除蛋白样品后用95%乙醇洗涤,再浓缩,冻干得粗提物样品;将粗提物样品使用透析袋透析3天,将袋内样品浓缩至小体积,冷冻干燥,得黑灵芝精提物;
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg,加入蒸馏水配成浓度为3~5mg/mL的溶液,离心,上清液过凝胶柱层析,使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统,凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade,上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱,洗脱液为蒸馏水,流速为2mL/min,上样体积为5mL,分部收集体积为8mL/管,紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况;取第6-14管合并,浓缩,冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG,为黄色或棕色的絮状固体;
(3)①硫酸酯化试剂的制备:加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中,冰水浴冷却至0℃,磁力搅拌下缓慢地加入氯磺酸,室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏,1周内有效。
②S-PSG的制备:取PSG300mg,悬浮于30mL无水甲酰胺中,反应瓶置于冰浴中,逐滴加入4mL硫酸酯化试剂,然后混合物在45℃水浴中搅拌反应6h,反应结束后,冷却至室温,加15mL 2.5mo/L的氢氧化钠溶液中和,混合液置于透析袋中对水透析3d,将透析内液真空浓缩至最小体积,加入4倍体积乙醇沉淀,沉淀物用无水乙醇反复洗涤,挥发干乙醇,研磨,过筛后得白色粉末状产物,记为S-PSG。
所述步骤(3)①中硫酸酯化试剂的制备,氯磺酸和吡啶的比例可为氯磺酸﹕吡啶=1﹕1(v/v),得到的S-PSG分别极为S-PSG2。
实施例3:一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,制备方法为:
(1)取干燥黑灵芝药材100g,加95%乙醇室温浸泡提取48h,过滤,重复一次,药渣于室温下置通风处晾干,然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:20的比例混合,回流提取两次,每次提取时间依次为2h,1h,合并提取液,离心分离,减压浓缩;所得样品加入适量的95%乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80%,然后进行沉淀,4℃下静置24h,离心过滤;沉淀物合并,依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物,冷冻干燥得样品;取得到的干燥样品,以Sevag法除蛋白,即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇=5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀,静置,除去下层蛋白质变性层;将样品浓缩,重复除蛋白操作10次;浓缩除蛋白样品后用95%乙醇洗涤,再浓缩,冻干得粗提物样品;将粗提物样品使用透析袋透析3天,将袋内样品浓缩至小体积,冷冻干燥,得黑灵芝精提物;
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg,加入蒸馏水配成浓度为3~5mg/mL的溶液,离心,上清液过凝胶柱层析,使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统,凝胶柱Hiload 26/60 Superdex-200 prep grade,上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱,洗脱液为蒸馏水,流速为2mL/min,上样体积为5mL,分部收集体积为8mL/管,紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况;取第6-14管合并,浓缩,冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG,为黄色或棕色的絮状固体;
(3)①硫酸酯化试剂的制备:加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中,冰水浴冷却至0℃,磁力搅拌下缓慢地加入氯磺酸,室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏,1周内有效。
②S-PSG的制备:取PSG300mg,悬浮于30mL无水甲酰胺中,反应瓶置于冰浴中,逐滴加入4mL硫酸酯化试剂,然后混合物在45℃水浴中搅拌反应6h,反应结束后,冷却至室温,加15mL 2.5mo/L的氢氧化钠溶液中和,混合液置于透析袋中对水透析3d,将透析内液真空浓缩至最小体积,加入4倍体积乙醇沉淀,沉淀物用无水乙醇反复洗涤,挥发干乙醇,研磨,过筛后得白色粉末状产物,记为S-PSG。
所述步骤(3)①中硫酸酯化试剂的制备,氯磺酸和吡啶的比例可为氯磺酸﹕吡啶=3﹕1(v/v),得到的S-PSG分别极为S-PSG3。
一、产物的理化性质
对实施例1制得的S-PSG进行红外光谱分析和硫酸酯基含量的测定,同时测定纯度、平均分子量、糖醛酸含量。
(1)纯度鉴定
用高效渗透凝胶色谱法进行纯度的检测,取测试样品3mg溶于1mL蒸馏水,1000rpm离心10min,用微孔过滤膜过滤后自动上样20μL,记录洗脱曲线用于判定该组分的纯度。
实验所用的HPLC的具体测试条件如下:
色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid;流动相为0.1MNaCl;流速0.6mL/min;柱温35℃。
(2)分子量测定
液相色谱柱为UltrahydrogelTM500 300mm×7.8mmid,流动相为0.1MNaCl,流速为0.6mL/min,柱温为35℃。
配制各标准品Glc,T10,T40,T70,T500,T2000 2%溶液,各溶液在HPLC进样后得到相应的液相图谱。设定T2000的洗脱体积为柱的空体积V0,Glc的洗脱体积作为柱的总体积Vt,以公式Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)计算,以LogMw-Kav作图得标准曲线。根据样品的Ve,从标准曲线上即得样品的分子量。由于洗脱液的流速恒定,所以可以绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线,根据其回归方程即可求得各产物的分子量。
(3)糖醛酸含量测定
a、采用改良的硫酸咔唑法,以半乳糖醛酸为标准测定糖醛酸的含量。
b、高效液相色谱法
色谱条件
色谱柱:Sugar-Pak Ⅰ(300mm×6.5mm),流动相:0.0001mol/L EDTA水溶液,流速:0.6mL/min,示差检测器,柱温:90℃,示差检测池温度:40℃,进样量:20μL。
标准曲线的绘制
精密称取半乳糖醛酸对照品适量,加超纯水溶解,摇匀,制得0.16432,0.32864,0.49296,0.65728,0.8216,0.98592,1.15024,1.31456,1.47888mg/mL的系列标准溶液。按上述色谱条件分别进样20μL,测定半乳糖醛酸峰面积,以半乳糖醛酸峰面积为横坐标,对照品浓度(mg/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。求得回归方程。
样品糖醛酸含量的测定
分别称取一定量的样品,加超纯水溶解并定容至10mL,配制得到样品溶液。按标准曲线制作时的色谱条件测定,由回归方程计算样品中糖醛酸的含量。
(4)红外光谱(IR)分析
取1-2mg样品,用KBr压片进行常规IR分析,红外光谱仪测定参数如下:背景扫描次数:128次;分辨率:4.0cm-1;检测器:DTGS。
(5)硫酸酯基含量的测定方法(采用氯化钡明胶浊度法)
溶液配制:
0.5%明胶溶液:1.25g明胶60-70℃溶解于10mL水中,定容至250mL,4℃保存,静置过夜;
氯化钡-明胶溶液:0.5g BaCI2溶于100mL0.5%明胶溶液中,4℃保存,静置过夜;
K2S04溶液:称105℃干燥恒重的K2S04108.75mg,以水定容至100mL,即硫酸基标准(硫酸根质量浓度)600μg/mL;
稀盐酸配制:1mL浓盐酸加水稀释至30mL。
标准曲线的绘制:分别取上述标准硫酸盐溶液0,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL加水补至1.0mL,依次加入稀盐酸1mL,氯化钡-明胶溶液0.5mL,混匀,25℃准确放置20min,以水为参比在360nm处测定其吸光度值。以硫酸基的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,同时,作空白试验。
样品的测定:准确称取5mg样品溶于4mL的lmol/L HCl中,封管,于105℃的烘箱中反应12h,使硫酸根游离。水解物40℃旋转蒸干,溶于1mL水中制成供试品溶液。准确移取供试品溶液0.1mL,按标准曲线的测定方法测定其吸光值,按标准曲线计算样品中硫酸基的含量,并按公式转换成硫酸基取代度,公式:Ds=(l.62×S%)/(32-1.02×S%).
表1各产物的平均分子量和基团取代度
对PSG也进行完全酸水解,硫酸根未测出,表明PSG本身不含硫酸根。由表1可知不断增加磺化试剂中氯磺酸的比例可有效提高PSG的硫酸化程度,而制备出不同改性程度的硫酸化PSG。对于高取代的磺酸化反应而言,随取代度的增加分子量下降最明显,说明降解副反应较严重,这一现象与文献报道相一致。
从硫酸酯化PSG的红外光谱(见图2)可知,在2921cm-1,1410cm-1,1040cm-1,附近仍有PSG母体特征的吸收峰,硫酸酯化后,PSG位于3379cm-1处的羟基吸收峰移向高波数3428cm-1,并且峰形变窄,说明PSG中的-OH部分已被硫酸酯化;硫酸酯化后的PSG都在1258cm-1、810cm-1、617cm-1和575cm-1处都出现了硫酸酯键强的特征吸收峰,其中1258cm-1是由不对称S=0伸缩振动引起,810cm-1的吸收峰是由对称的C-0-S振动引起的。此外,2921.30cm-1的吸收峰是亚甲基(-CH2-)的C-H伸缩振动峰,此为糖单元C6的特征吸收峰,比较酯化前后,可见其吸收峰减弱。因为C6位上的轻基空间位阻较小,因此比较活泼,所以一般硫酸酯化容易在C6发生取代。
二、功能活性研究
1.体外免疫活性实验
(1)巨噬细胞的分离与纯化
取2只小鼠颈椎脱臼处死,先放入碘伏中3~5min,再放入体积分数75%酒精中浸泡5min脱色,腹腔注入10mL PBS缓冲液,用棉球轻揉腹部1~2min后吸取腹腔液于离心管中,以1000r/min离心5min,弃上清液收集巨噬细胞,胎盼兰染色证实细胞存活率在95%以上,用RPMI-1640培养液调整细胞密度至1.5×105个/mL。将巨噬细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,置二氧化碳培养箱(5%CO2、37℃)培养3h后,轻轻吸弃培养液,用PBS洗去未贴壁细胞,即得到纯化的腹腔巨噬细胞。
(2)试验分组及处理
将纯化的巨噬细胞用RPMI-1640培养液调整细胞密度为5×105/mL,并分为空白对照组(PBS)、阳性对照组(LPS)和不同剂量的给药组接种于96孔培养板中,每组设3个重复孔。每孔培养液总体积100μL,给药组添加GP的终浓度分别为0、10、100、200、400μg/mL,阳性对照组RPMI-1640培养液含LPS终浓度为2μg/mL。将各试验组均置于二氧化碳培养箱(5%CO2、37℃)中孵育至所需的时间,根据测定方法的不同进行不同处理,测定各个指标。
(3)巨噬细胞吞噬能力的检测
参考王晓京的方法进行。调节巨噬细胞的浓度5×105/mL,以每孔100μ1接种于96孔板,置5%CO2,37℃培养箱培养3h后洗去未贴壁细胞。每孔加入100μL含10%小牛血清的RPMI-1640,按所需剂量加入药物进行培养。培养48h后,每孔加入0.1%中性红生理盐水溶液100μ1,继续培养4h,倾去上清液,用PBS洗3遍,每孔加入细胞溶解液(冰醋酸:乙醇=1:1)100μL,4℃下放置2-3h,待细胞溶解后在酶标仪上测定540nm处吸光度。
(4)TNF-α的蛋白表达检测
TNF-α的诱生:制备的巨噬细胞,加入100μg/mL的样品,在5%CO2,37℃下孵育48h后,收集巨噬细胞上清,-70℃保存,供测定TNF-α活性时使用。
细胞上清TNF-α的Western blot法:以牛血清白蛋白为标准蛋白,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,样品分装-70℃保存。根据各样品蛋白浓度计算上样体积,将细胞上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。再通过电泳将凝胶上的样本转印到PDVF膜上。加入一抗Goat anti-TNF-α进行4℃孵育10~14h,然后加入HRP标记的二抗Rabbit anti-goatIg-G温育,最后采用ECL法进行显色定影,以β-actin作内参。
(5)统计学处理
所有数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS11.0统计软件对数据进行处理,检验水准ɑ=0.05。
2.体外抗氧化活性实验
(1)对DPPH自由基的清除作用
由于本发明产物不溶于高浓度的乙醇溶液,所以要测定本发明产物对DPPH自由基的清除作用,还需要对其方法进行一定的改良,改良后的方法如下:
DPPH以95%乙醇配成0.2mmol/L溶液。取1mL不同浓度的样品溶液,2mL新鲜配制的DPPH乙醇溶液和2mL 95%乙醇于同一具塞试管中,充分混匀,于暗处反应30min后,取出于525nm处测定吸光度。空白组用2mL 95%乙醇代替DPPH溶液,对照组为2mL DPPH溶液与3mL95%乙醇混合。每组样品一式三份,取平均值。
反应体系吸光度越低,说明清除DPPH自由基能力越强,DPPH自由基清除率计算公式为:
清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%
其中,Ai为样品组吸光度值,Aj为空白组吸光度值,Ac为对照组吸光度值。
3.结果与讨论
(1)各受试物对巨噬细胞吞噬能力的影响
非特异性免疫应答是机体生来就有的免疫特性,例如机体皮肤表面的自然屏障,对病毒复制的干扰,吞噬细胞对异物的吞噬等生理的、化学的及细胞的防御。巨噬细胞参与非特异性免疫,其吞噬功能是免疫系统维持自身内环境稳定的重要手段,也是机体产生免疫应答的基础,大多数抗原经巨噬细胞处理后,免疫原性大大增加。因此吞噬是非特异性免疫的关键环节。测定小鼠巨噬细胞的吞噬能力,一般是观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况,通过计数来计算吞噬百分率。本发明是采用细胞培养液中添加不同终浓度的受试物,测定巨噬细胞吞噬中性红的能力,根据测定OD值的大小来判定各样品对巨噬细胞吞噬能力的影响。
表2PSG及S-PSG(1,2,3)对巨噬细胞吞噬中性红的影响(x±s,n=3)
注:▲与空白对照组相比p<0.05,▲▲与空白组相比p<0.01;
从表2可以看出,与空白对照组相比,PSG及其硫酸酯化衍生物均能增加巨噬细胞的吞噬能力,具有一定的量效关系,说明其具有免疫增强作用。同时对不同取代度的硫酸酯化PSG的免疫活性来说,也存在一个硫酸基团的量效关系。与未取代之前相比,在硫酸基取代度较低时,硫酸化PSG对巨噬细胞的刺激作用有所降低,随着硫酸基取代度DS的增大,其免疫活性逐渐增大;当样品浓度较高(>100μg/mL)时,S-PSG 2与S-PSG 3的吞噬率差别不大,说明不是基团取代度DS越高,活性越强,DS过大或过小都无法使PSG活性达到理想状态。因而硫酸基团的有、无及其含量的多少对PSG免疫调节活性都有紧密相关性。
结合红外光谱结果,硫酸酯化过程中伴随着降解副反应,分子量降低后主要得到的是6位硫酸酯化PSG,说明分子量和6位硫酸酯基官能团同样对PSG的免疫活性起着十分重要的作用。
我们推测:硫酸化后,使一定比例的硫酸基团接入PSG分子链中,使PSG的水溶性得到改善,同时分子链中引入了聚阴离子基团,使之能更好地调动机体的免疫系统,从而在刺激巨噬细胞吞噬能力上更好的发挥作用。除了硫酸根聚阴离子特性外,引入硫酸基后所引起的PSG立体结构的变化也是硫酸化PSG产生生物学活性的重要原因。
(2)各受试物对细胞上清TNF-α的蛋白表达的影响
TNF-α主要是由激活的巨噬细胞产生的一种内源性细胞因子,是一种具有广泛重要生物学作用的蛋白质。它能作用于淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞,使机体的免疫功能加强,进而增强抵抗疾病的能力。我们利用Western blot法检测了各受试物对小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α蛋白表达情况的影响。
表3各受试物对巨噬细胞上清TNF-α蛋白表达的影响(x±s,n=3)
表3的结果表明,经过硫酸酯化,PSG促进巨噬细胞上清中TNF-α的蛋白表达量的作用明显增强,并且对不同取代度的硫酸酯化PSG来说,也存在一个硫酸基团的量效关系,随着硫酸基取代度DS的增大,其免疫活性逐渐增大,当达到中取代度时,TNF-α的蛋白表达量达到最大值0.0149,是未取代前的3倍多,其后随着取代度的进一步提高,其TNF-α的蛋白表达量反而有所下降,这说明也不是DS越高,活性越强,因为DS过大或过小都无法使PSG活性达到理想状态。因而硫酸基团的有、无及其含量的多少对PSG免疫调节活性都有紧密相关性。此结论与硫酸酯化PSG对巨噬细胞吞噬能力的影响的结论相一致。
(3)各受试物对DPPH自由基的清除作用
由图3可知,PSG经硫酸酯化处理后,其清除DPPH自由基的能力均明显提高,特别在高浓度时,无论是低取代度还是高取代度的衍生物的清除能力都能与BHT相当。原因可能是硫酸酯化后一方面使其负电荷密度增加,PSG络合金属离子(Fe2+、Cu2+等)的强度增强,使其清除DPPH自由基活性增强;另一方面发生硫酸酯基取代使得糖环上碳原子的正电荷增强,具有更强的电子给予能力,更容易与DPPH自由基反应,从而PSG表现出更强的清除DPPH自由基的活性。
Claims (2)
1.一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,其特征在于:制备方法为:
(1)取干燥黑灵芝药材100g,加95%乙醇室温浸泡提取48h,过滤,重复一次,药渣于室温下置通风处晾干,然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:20的比例混合,回流提取两次,每次提取时间依次为2h,1h,合并提取液,离心分离,减压浓缩;所得样品加入适量的95%乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80%,然后进行沉淀,4℃下静置24h,离心过滤;沉淀物合并,依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物,冷冻干燥得样品;取得到的干燥样品,以Sevag法除蛋白,即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇=5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀,静置,除去下层蛋白质变性层;将样品浓缩,重复除蛋白操作10次;浓缩除蛋白样品后用95%乙醇洗涤,再浓缩,冻干得粗提物样品;将粗提物样品使用透析袋透析3天,将袋内样品浓缩至小体积,冷冻干燥,得黑灵芝精提物;
(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg,加入蒸馏水配成浓度为3~5mg/mL的溶液,离心,上清液过凝胶柱层析,使用的层析系统是Purifier 100生物大分子纯化系统,凝胶柱Hiload 26/60Superdex-200prep grade,上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱,洗脱液为蒸馏水,流速为2mL/min,上样体积为5mL,分部收集体积为8mL/管,紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况;取第6-14管合并,浓缩,冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG,为黄色或棕色的絮状固体;
(3)①硫酸酯化试剂的制备:加无水吡啶于500mL圆底烧瓶中,冰水浴冷却至0℃,磁力搅拌下缓慢地加入氯磺酸,室温下持续搅拌30min,密封后冰箱中冷藏,1周内有效。
②S-PSG的制备:取PSG300mg,悬浮于30mL无水甲酰胺中,反应瓶置于冰浴中,逐滴加入4mL硫酸酯化试剂,然后混合物在45℃水浴中搅拌反应6h,反应结束后,冷却至室温,加15mL2.5mo/L的氢氧化钠溶液中和,混合液置于透析袋中对水透析3d,将透析内液真空浓缩至最小体积,加入4倍体积乙醇沉淀,沉淀物用无水乙醇反复洗涤,挥发干乙醇,研磨,过筛后得白色粉末状产物,记为S-PSG。
2.如权利要求1所述的一种通过硫酸化得到的新型抗肿瘤化合物,其特征在于:所述步骤(3)①中硫酸酯化试剂的制备,氯磺酸和吡啶的比例可为氯磺酸﹕吡啶=1﹕3,1﹕1和3﹕1(v/v),得到的S-PSG分别极为S-PSG1、S-PSG2和S-PSG3。
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