CN101948549B - 一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，取绞股蓝多糖，按照87.5ml/g的量加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），超声波处理20分钟，在加入体积比为1：8的氯磺酸和吡啶，在90℃条件下反应2小时，分离提纯得到硫酸化绞股蓝多糖。本发明采用氯磺酸与吡啶对绞股蓝多糖进行硫酸化修饰，并对方法中氯磺酸与吡啶的配比、反应时间、反应温度进行了优化，易于操作，而且在修饰前采用DMF对绞股蓝多糖进行分散处理，提高了绞股蓝多糖硫酸化的酯化收率。修饰后的绞股蓝多糖具有很高的生物活性，能够显著提高动物机体的免疫能力，也能够显著对抗地塞米松对动物机体引起的免疫抑制，效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法。
背景技术
多糖是醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，其结构多样且分布广泛，是自然界含量最丰富的物质之一，也是与人类生活紧密相关的一类生物高分子。多糖是一类非特异性免疫增强化合物，能提高机体的免疫功能，增强抗病能力，具有抗衰老、防癌、抗癌以及防治肝炎等作用，受到人们的普遍关注。
绞股蓝又名七叶胆、甘茶蔓、七叶参等，是葫芦科绞股蓝属植物，始载于《救荒本草》，性寒、味甘，归肺、脾、肾经，具有清热解毒、补气生津、祛痰止咳、安神固精等功效。绞股蓝含有丰富的皂苷、糖类、黄酮类、多种维生素、氨基酸、矿物质及甜叶素等。多糖是绞股蓝主要的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节功能、降低血糖血脂等方面的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，以提高绞股蓝多糖的生物活性。
为了实现以上目的，本发明绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，取绞股蓝多糖，按照87.5ml/g的量加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），超声波处理20分钟，在加入体积比为1：8的氯磺酸和吡啶，在90℃条件下反应2小时，经分离纯化、透析干燥得到硫酸化绞股蓝多糖。
所述分离纯化步骤为：将反应后的硫酸化多糖溶液置入冷水中，用氢氧化钠溶液中和至pH为7.5，加入乙醇并静置24小时，离心收集沉淀。
所述乙醇加入量为加入前总溶液体积的3倍。
本发明采用氯磺酸与吡啶对绞股蓝多糖进行硫酸化修饰，并对方法中氯磺酸与吡啶的配比、反应时间、反应温度进行了优化，易于操作，而且在反应前采用DMF对绞股蓝多糖进行分散处理，提高了绞股蓝多糖硫酸化的酯化收率。修饰后的绞股蓝多糖具有很高的生物活性，能够显著提高动物机体的免疫能力，也能够显著的对抗地塞米松对动物机体引起的免疫抑制，效果显著。
具体实施方式
实施例
本发明的硫酸化绞股蓝多糖的具体制备方法如下：
1、绞股蓝多糖的提取：取绞股蓝1kg烘干，粉碎，加乙醇回流提取两次，每次1h，药渣加入10倍量水，武火煮沸后文火煮2h，滤出药渣，再加水煎煮2次，合并滤液，减压浓缩，离心去除沉淀，上清缓慢加，hhhh加加乙醇至80%，搅匀后静置过夜，离心取沉淀，用乙醇、丙酮洗涤，干燥即得粗绞股蓝多糖58.4g。
2、粗绞股蓝多糖的纯化：
⑴ 去除果胶及色素 将绞股蓝多糖用蒸镏水配成10%的溶液，缓慢加入无水氯化钙至2%，室温搅拌2h，然后离心去除果胶酸钙沉淀。上清液加H2O2使其终浓度为5%，NaOH溶液调节pH至8.5-9.0，室温搅拌5h，离心，弃去沉淀，上清加入3倍乙醇，4℃过液，离心后沉淀用乙醇、丙酮依次洗涤，干燥得精制绞股蓝多糖。
⑵柱层析 湿法装Sepharose Fast Flow柱，用0.9%NaCl冲洗，过夜。取精制绞股蓝多糖0.5g溶于100ml蒸镏水，微孔滤膜过滤后上样，分别用蒸镏水、0.15mol/L的NaCl水溶液洗脱，收集多糖部分，真空浓缩，再过Sephadex G-200色谱柱，0.15mol/LNaCl洗脱，收集多糖部分，真空浓缩，再经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥，即得纯化的绞股蓝多糖。（在洗脱过程中流速控制在1ml/min，每10ml收集1管，每隔4管用苯酚-硫酸法测定多糖含量，绘制洗脱曲线，合并含糖管的洗脱液，再浓缩处理。）
3、绞股蓝多糖的硫酸化修饰
绞股蓝多糖采用氯磺酸和吡啶进行硫酸化修饰（酯化处理），以修饰的反应温度、氯磺酸与吡啶的体积比、反应时间为考察因素，以产物量和硫酸基取代度为指标，按L9(34)正交试验配制9种酯化试剂（表1）。反应结束后反应产物用硫酸钡比浊法测定硫酸基取代度。
表1 正交试验设计因素水平表
| 因素 | 反应温度（℃） | 试剂配比 | 反应时间（h） |
| 1 | 80 | 1：6 | 1 |
| 2 | 90 | 1：8 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1：10 | 2 |
将带有冷凝管和搅拌装置的三颈烧瓶置于盐水-冰浴中，加入无水吡啶25ml，搅拌，使之充分冷却，按上表中试剂配比取相应比例的氯磺酸逐滴加入，于40min内加完，制备9种酯化试剂。
精确称取待修饰多糖400mg，分别加入到装有9种酯化试剂的烧瓶中，移入设定温度的水浴中搅拌反应一定时间，反应结束后冷却至室温，将反应液倾入预冷的100ml冰水中，用饱和的NaOH溶液中和至pH7.5，加入3倍体积的乙醇，静置24h，析出沉淀，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水，先用自来水透析2d，再蒸镏水透析1d，透析液过滤，滤液经冷冻干燥，共得到9种硫酸化绞股蓝多糖，结果见表2。
表2 硫酸化修饰正交试验结果
结果：从上表可知，在90℃、试剂配比为1：8、反应时间为2h条件下产物硫酸基取代度最高，为2.02。在90℃、试剂配比为1：10、反应时间为1.5h条件下产物量最高，为471mg。从产物量分析的R值可见，各因素对产物量的影响为B>A>C，氯磺酸与吡啶的配比的影晌最大; 从取代度分析的r值可见，各因素对取代度的影响为C>B>A，反应时间对取代度的影晌最大。通过进一步分析，综合考虑3个因素对产物量和取代度的影晌，确定最佳修饰条件为氯磺酸与吡啶体积比为1：8、反应时间为2h、反应温度为90℃。
4、绞股蓝多糖DMF分散优化
用优化的修饰条件对所得绞股蓝多糖进行硫酸化修饰：将三颈烧瓶移至90℃水浴中，直接将称量的400mg待修饰多糖，加入装有酯化试剂的烧瓶中，搅拌2h后将烧瓶移出，冷至室温，将硫酸化修饰后的溶液倒入预冷的100ml冰水中，用饱和的NaOH溶液中和至pH7.5，加入3倍体积的乙醇，静置24h，析出沉淀，离心，收集沉淀，将沉淀溶于水，先用自来水透析2d，再蒸镏水透析1d，透析液过滤，滤液经冷冻干燥，得到硫酸化绞股蓝多糖（sGPS-1），称重0.371g，酯化收率为92.75%。
采用DMF分散优化：将三颈烧瓶移至90℃水浴中，准确称量400mg绞股蓝多糖，将其混悬于35ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）后，超声波处理20min后，加入到酯化试剂中，具体操作同上，冷冻干燥后收得硫酸化绞股蓝多糖（sGPS-2），称重0.509g，酯化收率为127.3%。
结果表明，先采用DMF对绞股蓝多糖进行分散再进行酯化处理，得到的硫酸化绞股蓝多糖的酯化收率较高。
4. 硫酸化绞股蓝多糖的生物活性比较
4.1 硫酸化绞股蓝多糖对正常小鼠免疫机能的影晌
4.1.1 试验方法 选用8周龄，体重为18-20g的健康雄性昆明种小鼠50只，试验前适应性饲养7天，将50只小鼠随机分为5组，每组10只，分笼饲喂。设空白对照组和待测试药组，GPS（未修饰绞股蓝多糖）[设为高H（200mg／kg）、低L（100mg／kg）两个剂量组]、sGPS（硫酸化修饰的绞股蓝多糖） [设为高H（50mg／kg）、低L（25mg／kg）两个剂量组]。每只小鼠根据体重腹腔注射药物，阴性对照组给予同量的生理盐水，每日给药一次，连续给药7d。末次给药后24h，将所有供试小鼠称重后，断颈椎处死，剖离脾脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重，计算脾指数，按以下公式计算：
免疫器官指数=免疫器官重量（mg）/体重（g）。
4.1.2 试验结果 采用SPSS12.0软件分析数据的差异显著性，数据用平均数±标准偏差（Mean±SD）表示。
表3硫酸化绞股蓝多糖对正常小鼠免疫机能的影晌
| 组别 | 脾指数（mg/g） |
| 空白组 | 6.991±0.463a |
| GH（200mg／kg） | 10.284± 0.526b |
| GL（100mg／kg） | 8.854±0.512ab |
| sGH（50mg／kg） | 8.712±0.919ab |
| sGL（25mg／kg） | 9.413±0.785b |
注：脾指数中字母相同者表示差异不显著（P>0.05），字母不相同者表示差异显著（P<0.05）。
结果：从上表可知，GH、sGL脾指数明显升高，与空白组相比差异显著（P<0.05）。正常小鼠注射用低剂量sGPS能够显著提高其脾脏指数。表明硫酸化绞股蓝多糖能显著增强小鼠的免疫机能，与修饰前绞股蓝多糖相比，效果显著。
4.2 硫酸化绞股蓝多糖对免疫抑制小鼠免疫机能的影响
4.2.1试验方法 选用8周龄，体重为18-20g的健康雄性昆明种小鼠40只，试验前适应性饲养7天，随机均分为4组，每组10只，分笼饲喂。组别为Ⅰ：空白对照组，小鼠腹腔注射生理盐水0.5ml，连续腹腔注射7天；Ⅱ：地塞米松组，地塞米松剂量为25mg/kg体重，连续3天腹腔注射；Ⅲ：GPS+地塞米松组，GPS剂量为200mg/kg体重，连续腹腔注射7天，地塞米松剂量为25mg/kg体重，连续3天腹腔注射；Ⅳ：sGPS+地塞米松组，sGPS剂量为200mg/kg体重，连续腹腔注射7天，地塞米松剂量为25mg/kg体重，连续3天腹腔注射。末次给药后24h，将所有供试小鼠称重后，断颈椎处死，剖离脾脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重，计算脾指数，按以下公式计算：
免疫器官指数=免疫器官重量（mg）/体重（g）。
4.2.2 试验结果 采用SPSS12.0软件分析数据的差异显著性，数据用平均数±标准偏差（Mean±SD）表示。
表4硫酸化绞股蓝多糖对免疫抑制小鼠免疫机能的影响
| 组别 | 脾指数（mg/g） |
| 空白组 | 7.082±0.26a |
| 地米组 | 4.400± 0.17b |
| GPS+地米组 | 7.598±0.66a |
| sGPS +地米组 | 8.521±0.64c |
注：脾指数中字母相同者表示差异不显著（P>0.05），字母不相同者表示差异显著（P<0.05）。
结果：从上表可知，小鼠腹腔注射地塞米松后，脾指数与胸腺指数明显降低，与空白组相比差异显著（P<0.05），表明用地塞米松制造免疫抑制模型成功， sGPS +地米组能升高免疫抑制小鼠的脾指数，与空白组相比有显著差异（P<0.05），与GPS+地米组相比，亦有显著差异（P<0.05）。
地塞米松为长效糖皮质激素，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克等药理作用，广泛用于临床。大剂量使用会造成机体免疫力低下，因此常被用作复制免疫功能低下的动物模型。脾指数是反映机体免疫功能的基本常规指标，已被广泛用于评价机体的整体免疫状态。本试验中地塞米松抑制小鼠的免疫机能，显著降低受试小鼠的脾指数，注射用硫酸化绞股蓝多糖能明显提高免疫抑制小鼠的脾指数，与修饰前绞股蓝多糖的作用相比差异显著，表明硫酸化绞股蓝多糖能更有效地对抗地塞米松引起的免疫抑制作用。
Claims (3)
1.一种绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，其特征在于：取绞股蓝多糖，按照87.5ml/g的量加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF），超声波处理20分钟，加入体积比为1：8的氯磺酸和吡啶，在90℃条件下反应2小时，经分离纯化、透析干燥得到硫酸化绞股蓝多糖。
2.根据权利要求1所述的绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，其特征在于：所述分离纯化步骤为：将反应后的硫酸化多糖溶液置入冷水中，用氢氧化钠溶液中和至pH为7.5，加入乙醇并静置24小时，离心收集沉淀。
3.根据权利要求2所述的绞股蓝多糖的硫酸化修饰方法，其特征在于：所述乙醇加入量为加入前总溶液体积的3倍。
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