实施例1、制备增强免疫力的保健食品
该实施例中所用的原料灵芝孢子粉、党参、黄精和大麦粉均可从商业途径购买得到。
1、灵芝孢子粉的破壁浸取方法:
用水作溶剂与灵芝孢子粉混合,经10min超声波预处理后,在室温下采用压力为300Mpa、保压时间为15min进行高压处理,真空干燥后,得到破壁灵芝孢子粉。
2、制备党参提取物
党参提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)除尘洗净:将党参用清水冲洗干净;(2)切碎:将党参切成2—4cm的段;(3)提取:将切好的党参段,加入10倍量水回流2次,每次1小时,水提液过滤,合并水提液;(4)浓缩:水提液减压浓缩至相对密度约为1.1(60~65℃)的流浸膏;(5)干燥:将流浸膏喷雾干燥(进风温度为130℃,出风温度95℃,进风量4m3/min,蠕动泵进量速度20ml/min),得黄白色粉末,即党参提取物。
3、制备黄精提取物
黄精提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)提取:将黄精药材粗粉溶于8倍水中,加热煎煮0.5小时,提取1-3次,过滤,得到黄精的水提取液;(2)浓缩:水提液减压浓缩至相对密度约为1.1(60~65℃)的流浸膏;(3)干燥:将流浸膏喷雾干燥(进风温度为130℃,出风温度95℃,进风量4m3/min,蠕动泵进量速度20ml/min),得黄色粉末,即黄精提取物。
4、过筛:取上述制备得到的破壁灵芝孢子粉、党参提取物、黄精提取物以及大麦粉,用漩涡振荡筛(型号ZS-650)分别过60目筛,备用。
5、混合:将过筛后的破壁灵芝孢子粉、党参提取物、黄精提取物以及大麦粉分别按照下表中的比例倒入三维混合机进行混合,混合40分钟,得到混合粉,包装后即得到本发明的保健食品。
经长期实践,得到以下具有协同作用的配比(以重量百分比为单位):
根据以上配比制备得到不同的增强免疫力的保健食品,对这些食品进行安全毒理试验、动物喂养试验以及功能试验,其结果如下:
1安全性毒理学试验
1.1大鼠急性经口毒性试验(最大耐受量法):
选用180-220g SPF级Wistar大鼠20只,雌雄各半,禁食16h后进行试验,以15.0g/kg·BW的剂量,间隔6小时经口两次给予(称取样品75.00g加蒸馏水至200ml,充分混匀,浓度0.375g/ml),灌胃量为2.0ml/100g·BW,给受试物后连续观察14天。记录中毒表现及死亡情况。
表1 大鼠急性经口毒性试验结果
由表1可见,分别以15.0g/kg·BW的剂量灌胃两种性别的大鼠,观察14天,试验期间未见明显的中毒表现,动物无死亡,尸检中各主要脏器亦未见异常。
230天喂养试验
2.1试验方法:人拟用剂量为3.0g/60kg·BW·日,具体剂量设计为:1.25、2.50、5.00g/kg·BW(分别相当于人拟用剂量25倍、50倍、100倍)。将大鼠(SPF级Wistar大鼠,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号为SCXK-(京)2006-00090204183)随机分为三个样品组及对照组,每组20只,雌雄各半。分别称取样品25.00、50.00、100.00g,加蒸馏水稀释至200ml,充分混匀,连续灌胃30天,灌胃量为1.0ml/100g·BW,对照组给予等量蒸馏水。动物单笼喂养,自由饮食,每周记录大鼠进食量、体重,连续观察30天。试验结束时,取血测定各项指标,动物取血前一晚禁食,不停水。
2.2观察指标:
2.2.1一般情况观察:每天观察动物的外观、行为、毒性表现和死亡情况。每周称体重、进食量,计算每周食物利用率、总食物利用率、总进食量及总增重。
2.2.2血液学检查:测定血红蛋白含量(Hgb)、红细胞(RBC)及白细胞(WBC)计数,白细胞分类(淋巴、单核、中性粒、嗜酸、嗜碱),所用仪器为Sysmex XT-2000i五分类血球计数仪。所用试剂盒均购自日本希森美康株式会社。
2.2.3生化指标测定:测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE),所用仪器为TOSHIBA TBA-40FR全自动生化分析仪,试剂盒由北京中生北控生物技术有限公司,北京九强生物技术有限公司提供。
2.2.4大体观察及病理组织检查:颈椎脱臼处死动物,观察各主要脏器及胸、腹腔大体病理改变。取出全部动物的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸,称重并计算脏器系数。取出对照组和高剂量组动物的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸(或卵巢)、胃及十二指肠,用4%甲醛固定,石蜡包埋、切片、HE染色,在光镜下进行组织学检查。
2.2.5统计方法:各组数据均采用SPSS11.5FOR WINDOWS中方差分析进行统计分析,方差不起者采用数据转换,如转换后仍不齐则采用非参数统计。
2.3结果
2.3.1实验动物一般情况观察结果
由表1-4可见,以1.25、2.50、5.00g/kg·BW的受试物经口灌胃大鼠30天,动物未出现拒食现象。各组动物每周食物利用率、总食物利用率、体重和增重与对照组比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。
表1 受试物对大鼠体重影响(g,均值±标准差)
表2 受试物对大鼠每周进食量的影响(g,均值±标准差)
表3 受试物对大鼠每周食物利用率的影响(%,均值±标准差)
表4 受试物对大鼠总食物利用率的影响(均值±标准差)
2.3.2受试物对大鼠血液学指标的影响
由表5和表6可见,实验末期血液学的各项指标均在本检测单位正常值范围内,仅雌性动物中剂量组单核细胞百分比高于对照组,且有统计学意义(P<0.05),但无生物学意义;其余各剂量组的各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
表5 受试物对大鼠血液学指标的影响(均值±标准差)
表6 受试物对大鼠白细胞分类的影响(%,均值±标准差)
*:与对照组比较,P<0.05
2.3.3受试物对大鼠生化指标的影响
由表7可见,实验末期实验动物各项生化指标均在本检测单位正常值范围内,各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
表7 受试物对大鼠生化指标的影响(均值±标准差)
续表7 受试物对大鼠生化指标的影响(均值±标准差)
2.3.4受试物对大鼠脏器的影响
大体解剖观察未发现异常。各组动物脏器重量及脏体比值与对照组比较,差异无统计学意义(表8和表9)(P>0.05)。
表8 受试物对大鼠脏器重量的影响(g,均值±标准差)
表9 受试物对大鼠脏体比的影响(%,均值±标准差)
2.3.5病理组织学检查:
各主要脏器取高剂量组20只,对照组20只,均为雌雄各半。
2.3.5.1肝脏:被膜完整,无明显纤维组织增生。肝小叶结构清晰可见,间质未见结缔组织增生。肝中央静脉、肝小动、静脉未见异常。部分动物汇管区可见少量小圆形炎细胞浸润,对照组2/20(雄1只、雌1只),高剂量组2/20(雄1只、雌1只)。两组比较无明显差别。
2.3.5.2脾脏:两组动物脾脏包膜完整,红、白髓结构清晰,红髓脾窦红细胞充盈,白髓生发中心活跃及脾小结中央动脉管壁未见增厚或变性。两组比较无明显差别。
2.3.5.3肾脏:两组动物肾脏包膜完整,皮髓质结构清楚,肾小球体积未见缩小或扩大,数目未见减少。肾小管上皮细胞未见变性、坏死或脱落,管腔中未见管型及结石,肾间质未见纤维组织增生。个别动物肾间质可见少量小圆形炎细胞浸润,对照组2/20(雄1只、雌1只),高剂量组2/20(雄1只、雌1只)。两组比较无明显差别。
2.3.5.4胃:前胃角化良好,胃粘膜完整,未见出血、糜烂、溃疡及脱落,腺体未见增生、化生或萎缩,固有层、肌层及浆膜层未见异常。前后胃交界处无明显异常。
2.3.5.5十二指肠:黏膜完整,未见出血、糜烂、溃疡及脱落,固有膜肠腺丰富、未见增生、化生或萎缩,固有层、肌层及浆膜层未见异常。两组比较无明显差别。
2.3.5.6睾丸:睾丸被膜完整,曲精细管可见各级生精细胞存在且分布正常,腔中可见发育良好的精子细胞及精子,间质未见显著改变。两组比较无明显差别。
2.3.5.7卵巢:卵巢可见不同生长发育阶段的卵泡细胞及黄体、白体,均未见异常。两组比较无明显差别。
通过镜下观察高剂量组与对照组比较,未发现与样品相关的病理组织学改变(表10),故未对中、低剂量组进行组织病理学检查。
表10 受试物对大鼠主要脏器病理组织的影响
小结:以1.25、2.50、5.00g/kg·BW(分别相当于人拟用剂量25倍、50倍、100倍)的受试物经口灌胃大鼠30天,在试验期间,各组动物体重、增重、食物利用率及脏体比值与对照组比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05);血液学指标、生化指标均在本检测单位正常值范围内;大体解剖未见异常,未发现与受试样品相关的病理组织学改变。本受试物经大鼠30天喂养试验未见明显的毒性作用。
3增强免疫力动物实验
3.1实验方法
实验动物:18-22g雌性SPF级昆明种小鼠160只,由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供,合格证号:SCXK(军)2009-003 0000616。
实验动物饲养环境:SPF级实验动物室,合格证号:SYXK(津)2008-0004。温度:20-25℃,湿度:40-70%RH。饲料由天津市华荣实验动物科技有限公司提供,饲料生产许可证号:SYXK(津)2006-0001。
剂量选择:本试验设计了低、中、高三个剂量组,分别为0.25g/kg·BW、0.50g/kg·BW、1.00g/kg·BW,即相当于人拟用剂量的5倍、10倍、20倍。低、中、高剂量组分别取样品2.5g、5.0g、10.0g加蒸馏水至200ml。充分混匀,按0.2ml/10g·BW灌胃,对照组给予等量蒸馏水,每日一次,连续30天,末次给受试物后24小时测定各项指标。将实验动物分成4个大组,然后每组40只动物又分成4个小组,分别为对照和低、中、高三个剂量组,每组10只。其中1组进行HC50测定,抗体生成细胞检测、迟发型变态反应(足趾增厚法);2组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、脏/体比值测定;3组进行碳廓清试验;4组进行小鼠淋巴细胞转化试验、NK细胞活性测定试验。
3.1.1脏器/体重比值测定:给受试物30天后,称取脾脏、胸腺,计算脏/体比。
3.1.2迟发型变态反应(足趾增厚法):给受试物第25天时腹腔注射2%SRBC,再连续给受试物至第30天时测量左后足趾部厚度,同时在测量部位注射20%SRBC20μl,24小时后再次测量。
3.1.3ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法):给受试物33天,无菌取脾,制成单细胞悬液,Hank’s液洗3遍,调整细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,一孔加75μlConA液(100μg/ml),另一孔为对照,置5%CO2,37℃孵箱中培养72h。培养结束前4h,每孔吸去上清液0.7ml,加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打均匀,使紫色结晶完全溶解,以570nm波长测定光密度值。
3.1.4半数溶血值(HC50)的测定:给受试物第25天腹腔注射2%SRBC,再连续给受试物至第30天时,内眦取血,离心集血清,试管内加入300倍稀释的血清1ml、10%SRBC0.5ml、补体1ml,37℃水浴20分钟,冰浴终止反应,离心,取上清1ml,加都氏试剂3ml,10分钟后540nm比色。
3.1.5抗体生成细胞检测:给受试物30天,于第25天腹腔注射2%SRBC,免疫5天后,脱臼处死,取脾,制成细胞悬液,200目筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次1000r/min离心10min,将细胞悬浮于5mlRPMI1640培养液中,并调整细胞浓度为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解,45℃水浴保温,与等量2倍浓度Hanks液混合,分装小试管,每管0.5ml,加入50μl10%SRBC,20μl脾细胞悬液,混匀,倒片,二氧化碳培养箱中培养1小时,加入用SA缓冲液稀释的补体(1:10),继续培养1小时,计数溶血空斑数。
3.1.6小鼠碳廓清实验:给受试物30天后,尾静脉注射3.5倍稀释的印度墨汁(每10克体重0.1ml),分别于第2、10分钟内眦取血20μl,加入到2.98ml0.1%碳酸钠溶液中,600nm比色。另取肝、脾称重,计算吞噬指数。
3.1.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法):给受试物30天后,每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml,间隔30min,颈椎脱臼处死动物,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1min,吸出腹腔洗液1ml,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盘内,于37℃孵箱温育30min,孵毕,生理盐水漂洗,晾干,以1:1丙酮甲醇溶液固定,4%Giemsa染色10min。计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的巨噬细胞数。
3.1.8NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法):试验前24h将YAC-1细胞(靶细胞)进行传代培养,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。无菌取脾,制成单细胞悬液,Hank’s液洗3遍,调整细胞浓度为2×107个/ml。取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1),加入U型96孔培养板,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μl,均设三个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养4h,每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板中,同时加入LDH基液100μl,反应3min,每孔加1mol/L的HCl30μl,在酶标仪492nm测定光密度值。
3.2结果统计:实验数据用SPSS11.5for Windows进行统计检测,对照组与实验组采用方差分析,如方差不齐者采用数据转换,转换后仍不齐则采用非参数统计。
3.3结果
3.3.1受试物对小鼠体重的影响
由表1-4可见,经口给予不同剂量的受试物30天后,各组动物生长活动良好,各剂量组动物增重与对照组比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。
表1 受试物对免疫1组小鼠体重的影响(g,均值±标准差)
表2 受试物对免疫2组小鼠体重的影响(g,均值±标准差)
表3 受试物对免疫3组小鼠体重的影响(g,均值±标准差)
表4 受试物对免疫4组小鼠体重的影响(g,均值±标准差)
3.3.2受试物对小鼠脏器/体重比值的影响
由表5可见,各剂量组小鼠脾脏、胸腺/体重比值与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
表5 受试物对小鼠脏器/体重比值的影响(均值±标准差)
3.3.3受试物对小鼠细胞免疫功能的影响
3.3.3.1受试物对小鼠迟发型变态反应的影响(足趾增厚法)
由表6可见,中、高剂量组小鼠攻击前后足趾厚度差值高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组小鼠攻击前后足趾厚度差值与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
表6 受试物对小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法)的影响(均值±标准差)
*对照组比较,差异有统计学意计(P<0.05)
3.3.3.2受试物对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)的影响
由表7可见,中、高剂量组小鼠脾淋巴细胞转化高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
表7 受试物对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)的影响(均值±标准差)
*与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)
3.3.4受试物对体液免疫的影响
3.3.4.1受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
由表8可见,中、高剂量组的小鼠半数溶血值(HC50)高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组小鼠半数溶血值(HC50)与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
表8 受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响(均值±标准差)
*与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)
3.3.4.2受试物对小鼠抗体生成细胞试验的影响
由表9可见,高剂量组的小鼠抗体生成细胞数高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),中、低剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
3.3.5受试物对单核-巨噬细胞功能的影响
表9 受试物对小鼠抗体生成细胞的影响(均值±标准差)
*与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)
3.3.5.1受试物对小鼠碳廓清试验的影响
由表10可见,中、高剂量组的小鼠吞噬指数高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组的吞噬指数与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
表10 受试物对小鼠碳廓清试验的影响(均值±标准差)
*与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)
3.3.5.2受试物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验的影响
由表11可见,三个剂量组小鼠的吞噬百分率及吞噬指数与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。
表11 受试物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验的影响(均值±标准差)
3.3.6受试物对小鼠NK细胞活性的影响
由表12可见,高剂量组的NK细胞活性高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),中、低剂量组的NK细胞活性与对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。
表12受试物对小鼠NK细胞活性的影响(乳酸脱氢酶测定法)(均值±标准差)
*与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)
小结:经口给予不同剂量的受试物30天后,各组动物生长活动正常。迟发型变态反应试验显示,中、高剂量组的足趾厚度差值高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05);小鼠半数溶血值(HC50)影响试验显示,中、高剂量组的半数溶血值(HC50)高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05);抗体生成试验显示,高剂量组的小鼠抗体生成细胞数高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05);小鼠碳廓请试验显示,中、高剂量组小鼠吞噬指数高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05);小鼠脾淋巴细胞转化试验显示,中、高剂量组小鼠脾淋巴细胞转化高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05);NK细胞活性检测显示,高剂量组NK细胞活性高于对照组,且差异有统计学意义(P﹤0.05)。其它各项试验未见免疫抑制现象。结果表明,受试物具有增强动物免疫力功能作用。