CN108713738A - 一种西洋参黄精组合物、制备方法、制剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种西洋参黄精组合物、制备方法、制剂及应用，其中西洋参黄精组合物包括以下以重量份数表示的组分：黄精35‑300份；西洋参10‑100份；L‑阿拉伯糖300‑1000份；木糖醇120‑500份。采用以上方法制得的西洋参黄精组合物活性成分高、利于消化吸收，并且副作用小，服用安全。

Description

一种西洋参黄精组合物、制备方法、制剂及应用
技术领域
本发明涉及用于降血糖的保健品领域，具体涉及一种西洋参黄精组合物、制备方法、制剂及应用。
背景技术
糖尿病是由于人体内胰岛素缺乏或相对缺乏导致的一种慢性内分泌代谢性疾病。糖尿病的症状表现为糖代谢紊乱，以高血糖为主要特征，并伴有蛋白质和脂肪代谢异常。为了有效控制糖尿病，目前通常采用的口服降糖药物以非胰岛素类药物为主，多以非胰岛素类促胰岛素分泌剂类、双胍类、α-糖苷酶抑制剂类、胰岛素增敏剂类、磺脲类和格列奈类。但这类口服降糖药的副作用较大，会出现低血糖、出冷汗、全身无力等症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种西洋参黄精组合物，其活性成分高、利于消化吸收，并且副作用小。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种西洋参黄精组合物，包括以下以重量份数表示的组分：黄精35-300份；西洋参10-100份；L-阿拉伯糖300-1000份；木糖醇120-500份。
优选地，西洋参黄精组合物包括以下以重量份数表示的组分：黄精50-100份；西洋参20-60份；L-阿拉伯糖500-750份；木糖醇150-300份。
采用以上技术方案，L-阿拉伯糖能有选择地影响小肠二糖水解酶蔗糖酶的活性，减少碳水化合物的摄入，从而抑制血糖升高；西洋参性凉，归心、肺、肾经，具有补气养阴、清热生津的作用，可缓解适宜人群气虚阴亏、虚热烦渴、内热消渴、口燥咽干的症状；黄精性平，归脾、肺、肾经，在增强补气养阴作用的同时，也起到健脾润肺、益肾的作用，可缓和适宜人群脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干、肺虚燥咳、精血不足、腰膝酸软、内热消渴的症状。L-阿拉伯糖配以西洋参提取物和黄精提取物，可在减少因碳水化合物的过多摄入引起的血糖升高的同时，缓解因脾气虚弱而致的脏腑失调。本发明选用该三者配伍应用，使辅助降血糖的保健功能更加显著。
进一步地，黄精选择黄精粉和/或黄精提取物；西洋参选择西洋参粉和/或西洋参提取物。
采用以上技术方案，可进一步促进人体吸收，辅助提高降血糖的功效。
进一步地，西洋参黄精组合物按照如下方法制得：
西洋参、黄精和麦芽糊精过60-200目筛，搅拌混合10-30min制得第一混合物；L-阿拉伯糖和木糖醇搅拌混合形成第二混合物；
第一混合物和第二混合物搅拌均匀后制得西洋参黄精组合物。
采用以上技术方案，提高西洋参中总皂苷活性组分的溶出，黄精与西洋参配合，促进胰岛素分泌。按照以上制备方法得到的西洋参黄精组合物更利于人体吸收。
本发明的另一目的在于提供一种西洋参黄精制剂，包括上述藻类组合物，还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述制剂为粉剂、口服液或者颗粒剂中的一种。
本发明的还一目的在于上述的西洋参黄精组合物或者西洋参黄精制剂，可用于降血糖、提高免疫力和抗疲劳。
采用以上技术方案，西洋参可在一定程度上抑制小肠粘膜α-淀粉酶的活性，黄精和西洋参配合起到健脾润肺、益肾的作用，并且可缓和脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干、肺虚燥咳、内热消渴的症状。L-阿拉伯糖与西洋参、黄精配伍，可大幅减少因碳水化合物的过多摄入引起的血糖升高，并且可以缓解因脾气虚弱导致的脏腑失调、减轻糖尿病症状。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制得的西洋参黄精组合物中西洋参、黄精和L-阿拉伯糖配伍，减少因碳水化合物的过多摄入引起的血糖升高的同时，缓解因脾气虚弱而致的脏腑失调；
2、本发明制得的西洋参黄精组合物制剂更适宜人体吸收，通过控制工艺参数，提高制得西洋参黄精组合物制剂的稳定性；
3、本发明制得的西洋参黄精组合物具有降血糖、提高免疫力和抗疲劳的功效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：西洋参黄精组合物：
西洋参黄精组合物的原料组成如表1所示，其中原料中所用的L-阿拉伯糖、西洋参、黄精、木糖醇和麦芽糊精均可从商业途径购置。
表1多组西洋参黄精组合物的原料
实施例二：西洋参黄精组合物制剂：
1、将实施例一中第1组的西洋参黄精组合物作为粉剂，具体制备方法如下：黄精提取物、西洋参提取物、L-阿拉伯糖、木糖醇按照第1组中的比例混合，再添加40g麦芽糊精在100r/min的速度下均匀混合30min制得粉剂，5g/袋。
2、将实施例一中第2组的西洋参黄精组合物作为内容物，另外添加辅料制备颗粒，具体制备方法如下：黄精提取物、西洋参提取物、L-阿拉伯糖、木糖醇按照第2组中的比例混合，再添加50g麦芽糊精在120r/min的搅拌速度下均匀混合30min制得混合物，用50％乙醇喷洒在混合物表面，并且采用摇摆机制得颗粒，5g/袋。
3、将实施例一中第3组的西洋参黄精组合物作为口服液，具体制备方法如下：将西洋参提取物，黄精提取物、L-阿拉伯糖、木糖醇按照第3组的比例搅拌混合，再添加10g甜菊糖苷，5g柠檬酸和7.5L蒸馏水经三维运动混合机混合均匀，在室温下用瓶装机灌装，50ml/瓶。
实施例三：对实施例一中六组制备得到的西洋参黄精组合物做三个月加速实验进行理化性能的测试。
1、活性物质测试：
将以上各组制得的西洋参黄精组合物放置在37-40℃，相对湿度为75％的条件下，每隔一个月测试西洋参黄精组合物中粗多糖和总皂苷的含量，具体测试结果如表2所示。其中总皂苷的测定按照《保健食品检测与评价技术规范》(2003年版)中“保健食品中的总皂苷的测定”方法进行。粗多糖按照《保健食品功效成分检测方法》(王光亚、白鸿主编)中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法”的方法测定。
表2各实施例制得的西洋参黄精组合物的活性物质含量
经过三个月加速试验后，以上各实施例制得的西洋参黄精组合物制剂中粗多糖和总皂苷的含量损失较小，长期保存不会导致西洋参黄精组合物制剂中的营养成分丧失。
2、重金属和农药残留测试：
西洋参黄精组合物制剂放置在37-40℃、相对湿度为75％的环境下进行三个月加速实验。每隔一个月测试西洋参黄精组合物制剂中的重金属和农药残留量，具体如表3所示。检测依据：铅GB5009.12-2010第一法；砷GB/T5009.11-2003第一法；汞GB/T 5009.17-2003第一法；灰分GB5009.4-2010；六六六GB/T5009.19-2008第一法；滴滴涕GB/T5009.19-2008第一法；水分GB5009.3-2010第一法。
表3西洋参黄精组合物中的重金属和农药残留量测试结果
由以上结果可知，以上各组制得的西洋参黄精组合物中重金属和农药残留均符合标准。
3、卫生指标测试：
西洋参黄精组合物放置在38℃、相对湿度为75％的条件下进行三个月加速实验，每隔一个月测试黄精组合物制剂总菌类残留量，具体如表4所示。
表4西洋参黄精组合物的卫生指标测试结果
实施例四：对实施例二中第1组制得的西洋参黄精组合物制剂进行降糖功能测试。
一、动物试验：
1、实验所用动物：SPF级昆明种雌性小鼠215只，体重24-28g(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，饲养于SPF级试验动物房，温度20-25℃，相对湿度为40-70％。
2、剂量选择：设置3个剂量组和一个对照组。3个剂量组分别为人拟用剂量的5倍、10倍、20倍，即0.583g/kg·BM、1.167g/kg·BM和2.333g/kg·BM。分别称取样品5.83g、11.67g、23.33g，各加蒸馏水至200mL，作为低、中、高3个剂量组的受试物，对照组给予等量蒸馏水，灌胃量均为0.2mL/10g·BW。同时设两个正常动物组，分别给予高剂量受试物和蒸馏水。
3、试验所用试剂：四氧嘧啶(购自Sigma)、葡萄糖(天津市化学试剂一厂)。
4、试验方法：
4.1正常动物降糖实验：选择健康雌性小鼠，按禁食5小时的血糖水平，随机分为1个对照组和1个高剂量组。对照组给予蒸馏水，高剂量组按2.333g/kg·BM给予受试物，灌胃量均为0.2mL/10g·BW，连续灌胃30天后，禁食5小时测空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
4.2胰岛损伤高血糖模型：将适应后的健康雌性小鼠，随机取15只禁食5小时，测空腹血糖，作为该批次小鼠的基础血糖值。随后将小鼠禁食24小时后，腹腔注射一次给予四氧嘧啶130mg/kg·BM(给予量0.1mL/10g·BW)，6天后禁食5小时，取尾血测血糖值。血糖值在10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。
4.3高血糖模型动物降糖试验：选高血糖模型动物按照禁食5小时的血糖水平，随机分为1个模型对照组和低、中、高三个剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)。0.583g/kg·BM(低剂量)、1.167g/kg·BM(中剂量)和2.333g/kg·BM(高剂量)不同浓度受试样品，模型对照组给予等量蒸馏水，连续灌胃30天后，禁食5小时测空腹血糖值，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。
血糖下降了％＝(给予受试物前血糖值-给予受试物后血糖值)/给予受试物前血糖值×100％
4.4高血糖模型动物糖耐量实验：连续给予不同剂量受试物30天后，各组动物禁食5小时，测定给2g/kg·BM葡萄糖(即0小时)血糖值，各剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予等量蒸馏水，20分钟后各组经口给予葡萄糖2g/kg·BM，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖后各时间点(0、0.5、2小时)血糖值及血糖曲线下面积的变化。
血糖曲线下面积＝(0小时血糖+0.5小时血糖)×0.5/2+(2小时血糖+0.5小时血糖)×1.5/2
5、数据处理及结果判定：
5.1正常动物降糖试验
血糖指标：空腹血糖受试样品剂量组与对照组比较无统计学意义，判定对正常动物血糖无影响。
5.2高血糖模型降糖试验
空腹血糖指标：模型成立的前提下，受试样品剂量组与模型对照组比较，空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有统计学意义，判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。
糖耐量指标：模型成立的前提下，受试样品剂量组与模型对照组比较，在给葡萄糖或医用淀粉后0.5、2小时任一时间点血糖下降(或血糖下降百分率升高)有统计学意义，或0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低有统计学意义，判定该受试样品糖耐量指标结果阳性。
5.3结果判定
空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。
6实验结果
6.1受试物对试验动物体重的影响
表5西洋参黄精组合物对正常小鼠体重的影响(g，均值±标准差)
表6西洋参黄精组合物对高血糖模型动物降糖试验小鼠体重的影响(g，均值±标准差)
表7西洋参黄精组合物对高血糖模型动物糖耐量试验小鼠体重的影响(g，均值±标准差)
由以上数据可知，各剂量组动物增重与相应对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
6.2受试物对正常小鼠空腹血糖的影响
表8西洋参黄精组合物对正常小鼠空腹血糖的影响(mmol/L，均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 试验前 试验后 下降值
正常对照组 10 6.46±0.8 6.61±0.79 -0.15±0.23
2.333 10 6.38±0.82 6.67±0.99 -0.29±0.45
由以上数据可知，经口给予2.333g/kg·BW的西洋参黄精组合物30天后，正常动物高剂量组空腹血糖值与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
6.3受试物对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响
表9西洋参黄精组合物对高血糖模型小鼠空腹血糖下降百分率的影响(均值±标准差)
*与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)
6.4受试物对高血糖模型小鼠糖耐量的影响
表10西洋参黄精组合物对高血糖模型小鼠糖耐量的影响(均值±标准差)
*与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)
以上不同剂量的西洋参黄精组合物灌胃高血糖模型小鼠30天后，高剂量组各时间点血糖曲线下面积低于模型对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。
二、人体试食试验
1、受试对象：在天津市第三中心医院收集空腹血糖和餐后2h血糖异常的非住院Ⅱ型糖尿病患者，通过健康体检和知情同意后，筛选108例志愿者。
2、选择饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药物品种及剂量仅服用维持量的成年Ⅱ型糖尿病病人；空腹血糖(FBG)≥7mmol/L或餐后2h血糖(P2hBG)≥11.1mmol/L；也可选择空腹血糖5.6-7mmol/L或餐后2h血糖7.8-11.1mmol/L的糖调节受损(IGR)人群。
3、排除标准：Ⅰ型糖尿病患者；年龄在18岁以下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，对受试样品过敏者；有心、肝、肾等主要脏器并发症，或合并有其他严重疾病，精神病患者；不能配合饮食控制而影响观察结果者；近3个月内有糖尿病酮症、酸中毒以及感染者；服用糖皮质激素或其他影响血糖药物者；短时间内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者；不符合纳入标准，未按规定服用受试样品的受试者，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
4、试验按照随机的原则，采用自身对照组及组间对照试验设计。按受试者的糖化血红蛋白及血糖水平将已选择的108例受试者随机分为试食组和对照组，对照组54例，试食组54例，分组时尽可能考虑影响结果的主要因素如病程及服药种类，进行均衡性检验，以保障组间的可比性。
试食组每人口服西洋参黄精组合物每次1袋，每日2次，0.5g/袋，连续服用60天，对照组为空白组，试食期间坚持饮食控制，治疗糖尿病的药物种类和剂量不变。
所有试验对象在天津市第三中心医院进行试食前后二次全面体检，以检验该样品对健康影响，通过健康体检和知情同意后筛选108名志愿者(试食期间8例中途退出，统计100例)。
5、安全性指标：
一般状况：精神、睡眠、饮食、大小便、心率、血压等。
血常规、尿常规、便常规检查：红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白、尿常规(包括尿酮体)、便常规检查。
生化指标：总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)。
其他检查：腹部B超、心电图、X线胸部透视(试验前检查一次)。
6、功效性指标：
症状观察：详细询问病史，了解患者饮食情况，用药情况，活动量，观察口渴多饮、多食易饥、倦怠乏力、多尿等主要临床症状，按症状轻重积分，于试验前后统计积分值，并就其主要症状改善(改善1分为有效)，观察临床症状改善率。
空腹血糖(FBG)：测试受试者试食前后空腹血糖值及计算空腹血糖下降的百分率、空腹血糖有效率。
空腹血糖下降百分率＝(试食前空腹血糖值-试食后空腹血糖值)/试食前空腹血糖值×100％
空腹血糖下降有效率＝空腹血糖有效例数/空腹血糖观察例数×100％
餐后2h血糖(P2hBG)测试受试者试食前后食用100g精粉馒头后2h血糖值及计算餐后2h血糖下降百分率、餐后2h血糖有效率。
餐后2h血糖下降百分率＝(试食前餐后2h血糖值-试食后餐后2h血糖值)/试食前餐后2h血糖值×100％
餐后2h血糖下降有效率＝餐后2h血糖有效例数/餐后2h血糖观察例数×100％测试受试者试食前后糖化血红蛋白变化。
糖化血红蛋白下降百分率＝(试食前糖化血红蛋白-试食后糖化血红蛋白)/试食前糖化血红蛋白×100％
测试受试者试食前后血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)。
7、数据处理和结果判定
受试者试食前后各项会标结果采用配对t检验，试食组合对照组两组试验结果采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验。
功效判定：有效：(1)试验后空腹血糖恢复正常(≤5.6mmol/L)，或空腹血糖下降幅度≥10％；(2)试验后餐后2h血糖恢复正常(≤7.8mmol/L)，或餐后2h血糖下降幅度≥10％。无效：未达到有效标准。
根据国家食品药品监督管理局发布的“国食药监保化[2012]107号附件3辅助降血糖功能评价方法”中辅助降血糖人体试食试验指标判定空腹血糖结果、餐后2h血糖结果、糖化血红蛋白结果、血清胆固醇和血清甘油三酯。
空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白、血脂四项指标均无明显升高，且空腹血糖、餐后2h血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该受试样品具有辅助降血糖功能的作用。
8、结果判定
8.1试食前试食组与对照组均衡性比较
实际完成受试者为100例，试食组50例(男18例，女32例)，对照组50例(男19例，女31例)，经X2检验，试食组和对照组性别分布差异无统计学意义(P＞0.05)。年龄最大65岁，最小35岁。
表11试食前一般情况比较
表12实施前两组血糖及糖化血红蛋白水平比较(均值±标准差)
指标 对照组(n＝50) 试食组(n＝50)
FBG(mmol/L) 7.67±1.6 7.6±1.05
P2hBG(mmol/L) 11.82±3.29 11.86±2.14
糖化血红蛋白(％) 6.18±0.98 6.14±0.86
表13试食前两组服用降糖药种类情况
由以上数据可知，试食组受试者的年龄、病程与对照组受试者比较差异无统计学意义(P＞0.05)；试食组受试者试食前FBG、P2hBG及糖化血红蛋白值与对照组受试者试食前比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；试食组受试者试食前与对照组受试者试食前服药种类经X2检验，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.2所有受试者腹部B超、心电图、X线胸部透视检测基本未见异常。
8.3试食组与对照组试食前后一般状况观察
表14两组试食前后一般情况比较
表15试食前后两组血压及心率比较(均值±标准差)
由以上数据可知，大部分试食者一般情况良好，试验组试食前后精神状态、睡眠情况及饮食情况基本正常，大小便情况正常；试验组和对照组试食前后收缩压、舒张压及心率自身分别比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；该受试物对人体一般状况无不良影响。
8.4试食组与对照组试食前后血、尿、便常规观察
表16试食前后两组血常规指标改变(均值±标准差)
8.5试食组与对照组试食前后生化指标观察
表17试食前后两组生化指标改变(均值±标准差)
8.6试食组与对照组试食前后临床症状改善观察
表18试食前后两组临床症状改善情况比较
8.7试食组与对照组试食前后空腹血糖、餐后2h血糖观察
表19试食前后两组FBG值(mmol/L)比较(均值±标准差)
表20试食前后两组P2hBG值(mmol/L)比较(均值±标准差)
组别 试食前FBG值 试食后FBG值 FBG下降差值 FBG下降率(％)
对照组(n＝50) 11.82±3.29 11.56±3.29 0.25±1.99 0.83±14.53
试食组(n＝50) 11.86±2.14 10.49±2.15*# 1.37±1.79* 10.76±13.93*
*与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；
#试食后与试食前比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
由以上数据可知，试食组试食者试食后较试食前FBG值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组试食前后FBG值自身比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。试食后，试食组FBG值低于对照组且差异有统计学意义(P＜0.05)；试食组FBG平均下降差值及下降率分别为0.9mmol/L和10.92％，对照组FBG平均下降差值及下降率分别为0.1mmol/L和0.45％，试食组高于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。
试食组试食者试食后较试食前P2hBG值降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组试食前后P2hBG值自身比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.8试食组与对照组FBG和P2hBG值有效率
表21两组FBG值下降≥10％例数(有效例数)比较
组别 有效例数(人) 无效例数(人) 有效率(％)
对照组(n＝50) 6 44 12
试食组(n＝50) 18* 32 36*
表22两组P2hBG值下降≥10％例数(有效例数)比较
组别 有效例数(人) 无效例数(人) 有效率(％)
对照组(n＝50) 5 45 10
试食组(n＝50) 19* 31 38*
表23两组FBG值下降≥10％或P2hBG值下降≥10％例数(总有效例数)比较
组别 总有效例数(人) 无效例数(人) 总有效率(％)
对照组(n＝50) 6 44 12
试食组(n＝50) 19* 31 38*
*与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)
试食组受试者试食后FBG值下降≥10％有效例数和有效率均高于对照组，经X2检验，差异有统计学意义(P＜0.05)。试食组受试者试食后P2hBG值下降≥10％有效例数和有效率均高于对照组，经X2检验，差异有统计学意义(P＜0.05)。试食组受试者试食后FBG值下降≥10％或P2hBG值下降≥10％总有效例数和总有效率均高于对照组，经X2检验，差异有统计学意义(P＜0.05)。
8.9试食组与对照组试食前后糖化血红蛋白观察
表24试食前后两组糖化血红蛋白值(％)比较(均值±标准差)
由以上数据可知，试食组受试者试食前后糖化血红蛋白值自身比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。对照组试食前后糖化血红蛋白值自身比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。试食后，试食组糖化血红蛋白值与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.10试食组与对照组试食前后血脂观察
表25试食前后两组血脂观察(均值±标准差)
由以上数据可知，对照组和试食组受试者试食前后TC和TG基本在正常范围内，试食前后自身比较，TC和TG下降及试验后试食组TC和TG与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
试食组受试者在试食过程中未见过敏及不良反应。
本试验按受试者的糖化血红蛋白及血糖水平将选择的108名受试者随机分为试食组和对照组，对照组54例，试食组54例。试验结束时，两组中途共退出8例，其中对照组4例，试食组4例，对照组病例脱失率为7.4％，试食组病例脱失率为7.4％，两组实际完成本试验100例，总病例脱失率为7.4％。
实施例五：将实施例一中第1组制得的西洋参黄精组合物进行免疫功能测试，人拟用记录为166.7mg/kg·BM。
1、实验动物：SPF级健康昆明种雄性小鼠240只，体重18-22g(广西医科大学实验动物中心繁殖)，每40只小鼠为一组，共6组。免疫Ⅰ组，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验；免疫Ⅱ组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅲ组，进行脏/体比值测定，血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；免疫Ⅳ-Ⅵ组，分别进行碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定。动物实验室温度22-25℃，相对湿度55-70％。
2、剂量选择：根据人口服推荐用量，样品低、中、高剂量组分别为833、1667、3333mg/kg·BM(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)，设置一个阴性对照组，每组10只动物。分别称取样品12.5、25、50g，各加纯水至300mL，混匀后，配成41.67、83.33和166.67mg/mL浓度溶液，按0.2mL/10g·BM的体积给予相应剂量组动物灌胃，阴性对照组予以等体积的纯水，每天灌胃一次，连续灌胃30-35天。
3、实验所选试剂：RPMI1640培养液、小牛血清、2-ME、青霉素、链霉素、ConA、1mol/LHCl，异丙醇、MTT、Hank’s液(pH7.2-7.4)、PBS缓冲液(Ph7.2-7.4)，台酚蓝、DNFB、丙酮、硫化钡、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、绵羊红细胞(SRBC)、生理盐水、印度墨汁、0.1％碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Gimsa染液、YAC-1细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，1％冰醋酸，1％NP40。
4、实验方法：
脏器/体重比值测定：称重后处死小鼠，取出胸腔和脾脏，分别称重计算。
ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计算活细胞数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2,37℃二氧化碳孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸取上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
二硝基氟苯诱导的小鼠DTH实验(耳肿胀法)：实验结束前5天用硫化钡将小鼠腹部皮肤脱毛约3cm×3cm范围，用50μLDNFB溶液均匀涂抹致敏，5天后将10μLDNFB均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，24小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下8mm直径的耳片、称重，以左右耳重量只差值表示DTH的程度。
抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。将免疫后5天的小鼠处死，取脾脏置盛有Hank’s液的平皿内，磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min(2000r/min)，用Hank’s液洗涤2遍，最后将细胞悬浮在8mLHank’s液中。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100mL)加热溶解后，放45-50℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加入50μL10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配置)、25μL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/106脾细胞表示抗体生成细胞数。
血清溶血素的测定(血凝法)：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min(2000r/min)，用生理盐水将压积SRBC配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2mL。免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置1h，2000r/min离心10min，分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μL，再加入100μL0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。按下式计算抗体积数：
抗体积数＝(S1+2S2+3S3+······nSn)，式中1、2、3······n为对倍稀释的指数，S为凝集程度的级别。
小鼠碳廓清实验：经尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL0.1％Na2CO3溶液中，摇匀。以Na2CO3溶液作空白对照，以600nm波长测光密度值(OD)，将小鼠处死，取肝、脾脏，称重。按下式计算吞噬指数a。
a＝K1/3×体重/(肝重+脾重)式中K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)：给小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)的压积鸡红细胞悬液，每鼠1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，正中剪开腹壁皮肤，腹腔注入2mL生理盐水，转动鼠板1min，吸出腹腔洗液1mL，平均滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，用甲醇：丙酮(1:1)溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用纯水漂洗、晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
NK细胞活性测定(LDH测定法)：将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s洗液2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清，将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌纯水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s，1000r/min离心10min，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，用台酚兰染色计数活细胞数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL，此为效应细胞。取传代后24h生长良好的YAC-1细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL，此为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL。上述各项各设3个平行孔，置5％CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应8min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)值。按照下式计算NK细胞活性。
NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％
5、结果判定：爱细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。
5.1样品对小鼠体重的影响
表26增强免疫力功能实验小鼠体重(均值±标准差)
表27增强免疫力功能实验小鼠体重(均值±标准差)
由以上数据可知，实验初期、中期和末期，样品各剂量组小鼠的体重及实验期间小鼠的体重增长与阴性对照组间比较，差异均无显著性(P＞0.05)，表面该样品对小鼠的体重增长无明显影响。
5.2样品对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
表28实验小鼠的免疫器官脏器/体重比值(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 胸腺/体重(％) P值 脾脏/体重(％) P值
3333 10 0.218±0.02 0.953 0.379±0.03 0.893
1667 10 0.221±0.016 0.755 0.382±0.025 0.975
833 10 0.213±0.018 0.986 0.377±0.024 0.832
阴性对照 10 0.215±0.011 — 0.386±0.029 —
样品各剂量组小鼠的胸腺/体重及脾脏/体重比值与阴性对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)，表面该样品对小鼠的免疫器官重量无明显影响。
5.3样品对小鼠的细胞免疫的影响
5.3.1样品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响
表29小鼠淋巴细胞转化实验结果(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 淋巴细胞增殖能力(OD值) P值
3333 10 0.168±0.067 0.04
1667 10 0.157±0.049 0.109
833 10 0.137±0.063 0.438
阴性对照 10 0.104±0.045 —
样品各剂量组小鼠的脾淋巴细胞转化能力均高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P＜0.05)，表面该样品具有促进小鼠的脾淋巴细胞增殖、转化能力的作用。
5.3.2样品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
表30小鼠迟发型变态反应(DTH)实验结果(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 左右耳片重量差值(mg) P值
3333 10 19.57±3 0.003
1667 10 17.03±2.73 0.239
833 10 16.76±2.68 0.335
阴性对照 10 14.82±3.34 —
样品各剂量组小鼠的左右耳片重量差值均高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异具有非常显著性(P＜0.05)，表面样品具有促进小鼠的迟发型变态反应的作用。
5.4样品对小鼠的体液免疫的影响
5.4.1样品对小鼠的抗体生成细胞数的影响
表31抗体生成细胞检测实验结果(均值±标准差)
样品各剂量组小鼠的溶血空斑数高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(P＜0.05)，表面该样品具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖的作用。
5.4.2样品对小鼠血清溶血素的影响
表32样品对小鼠溶血素测定结果(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 抗体积数 P值
3333 10 137.3±7.6 0.002
1667 10 131.2±6.7 0.175
833 10 128±8.2 0.722
阴性对照 10 125.2±6.3 —
样品各剂量组小鼠的抗体积数高于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组的差异具有非常显著性(P＜0.01)，表明该样品具有提高小鼠的血清溶血素水平的作用。
5.5样品对小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
5.5.1样品对小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清的影响
表33样品对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清实验结果(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 抗体积数 P值
3333 10 7.13±0.59 0.003
1667 10 6.88±0.53 0.026
833 10 6.58±0.65 0.221
阴性对照 10 6.07±0.83 —
由以上结果可知，样品各剂量组小鼠的吞噬指数高于阴性对照组，且高、中剂量组与阴性对照组的差异具有显著性(分别P＜0.01和P＜0.05)，表面该样品具有促进小鼠的单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。
5.5.2样品对小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
表34小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果(均值±标准差)
剂量组(mg/kg·BW) 动物数(只) 吞噬率(％) 吞噬率数据转换 P值 吞噬指数 P值
3333 10 25.2±3.7 0.525±0.043 0.166 0.48±0.11 0.456
1667 10 24.1±2.7 0.513±0.031 0.607 0.48±0.06 0.51
833 10 23±2 0.5±0.024 0.997 0.46±0.05 0.808
阴性对照 10 22.8±2.6 0.497±0.031 — 0.43±0.09 —
由以上数据可知，样品各剂量组小鼠的腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数均高于阴性对照组，但各剂量组的吞噬率及吞噬指数与阴性对照组的差异均无显著性(P＞0.05)，表面该样品对小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬能力无明显的促进作用。
5.6样品对小鼠的NK细胞活性的影响
表35样品对小鼠NK细胞活性测定结果(均值±标准差)
由以上数据可知，样品各剂量组小鼠的NK细胞活性与阴性对照组接近，各剂量组与阴性对照组的差异均无显著性(P＞0.05)，表面样品对小鼠的NK细胞活性无明显影响。
实施例六：将实施例一中第1组制得的西洋参黄精组合物进行缓解体力疲劳功能动物试验，人拟用量为2.4g/60kg·BW。
1、18-22g雄性SPF级昆明种小鼠160只(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，在SPF级动物实验室进行试验，试验温度为20-25℃，相对湿度为40-70％。
2、本实验设置四个大组，分别用于负重游泳试验、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸测定。每组40只，每大组又分对照组及低、中、高三个剂量组(每组10只)，剂量分别为0.2、0.4、0.8g/kg·BW，即相当于人拟用剂量的5倍、10倍、20倍。称取受试物4g、8g和16g，并加蒸馏水至400mL，分别灌胃低、中、高剂量组小鼠，灌胃量为0.2mL/10g·BW，对照组给予等量植物油，各组经口灌胃，每日一次，连续给予30天后进行测试。
3、实验方法：(1)负重游泳试验：小鼠连续经口灌胃受试物30天，末次给予受试样品30min后，将尾根部负荷5％体重铅皮，水深30cm，水温25℃，进行游泳试验，记录小鼠入水至力竭身亡时的游泳时间。(2)血清尿素氮测定：小鼠连续经口灌胃受试物32天，末次给予受试样品30min后，在30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后从眼球处采全血，分离血清，然后进行尿素氮含量测定(尿素氮试剂盒购自北京九强生物技术有限公司)。(3)肝糖原测定：小鼠连续经口灌胃受试物30天，末次给予受试样品30min后处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg加入8mLTCA后每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管以3000r/min离心15min，取上清液1mL放入10mL的离心管中每管加入95％的乙醇4mL充分混匀，用干净塞子塞上室温下竖立过夜，沉淀完全后将试管于3000r/min离心15min，倒掉上清液并使试管倒立放置10min，用2mL的蒸馏水溶解糖原震荡至完全溶解，将10mL蒽酮试剂加入各管，置于冷水中冲凉，达到冷水温度后，浸于沸水浴15min后，置于冷水中冲凉，试管到达室温后，用紫外分光光度计在620nm波长下测定吸光度，计算肝糖原含量。
每100g肝组织中的糖原(mg)＝DU/DS*0.5*提取液体积/肝组织克数*100*0.9
4、血乳酸测定：小鼠连续经口灌胃受试物32天，末次给予受试样品30min后采小鼠尾血约10μL，放入预填充的小测试管内，用红细胞裂解液将样本处理，冰浴保存。将采血后小鼠放入30℃的水中不负重游泳10min后立即采血，休息20min后再次采血，三次的采血量及处理方法相同。然后用乳酸仪测定血乳酸。根据以下公式计算血乳酸曲线下面积：血乳酸曲线下面积＝1/2×(游泳前血乳酸值+游泳后0min的血乳酸值)×10+1/2×(游泳后0min的血乳酸值+游泳后休息20min的血乳酸值)×20＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)
5、试验结果：
5.1受试物对实验小鼠体重的影响：
表36实验一组小鼠体重(g，均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 初期体重 中期体重 末期体重 增重
对照组 10 20.3±1.1 30.6±1.2 35±1.1 14.7±1.3
0.2 10 20.2±1.4 31±1.1 34.7±1.3 14.5±1.9
0.4 10 19.7±1.2 31.5±1.1 34.9±1.3 15.2±1.7
0.8 10 20.3±1.6 31.3±1.3 35.6±1.2 15.3±1.5
表37实验二组小鼠体重(g，均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 初期体重 中期体重 末期体重 增重
对照组 10 19.5±1.3 30.3±1.1 35.4±1.3 15.9±1.6
0.2 10 20.3±1.1 31.3±1.3 34.9±1.4 14.6±1.4
0.4 10 19.9±1.1 31.2±1.4 35.5±1.1 15.6±1.8
0.8 10 19.7±1 30.9±1.4 35±1.1 15.3±1.6
表38实验三组小鼠体重(g，均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 初期体重 中期体重 末期体重 增重
对照组 10 20.3±1.2 31.2±0.9 35.3±1.1 15±1.4
0.2 10 19.4±1.2 31±1.2 35.6±1.2 16.2±1.8
0.4 10 20.2±1.1 31.3±1.1 34.5±1.2 14.3±1.7
0.8 10 19.9±1.3 31.7±1.2 34.8±0.9 15±1.2
表39实验四组小鼠体重(g，均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 初期体重 中期体重 末期体重 增重
对照组 10 19.9±1.3 30.9±1.4 35.3±1.7 15.5±1.7
0.2 10 20±1.4 31±0.9 35.4±1 15.4±1.8
0.4 10 20.3±1.2 31.3±1.3 34.7±1.3 14.5±1.9
0.8 10 20.4±1.2 31.5±0.8 34.9±1.2 14.6±1.8
5.2受试物对小鼠负重游泳时间的影响：
表40受试物对小鼠负重游泳时间的影响(均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 游泳时间(秒) P值
对照组 10 1830.9±222.1 —
0.2 10 1903±253 0.83
0.4 10 2110.2±275.3 0.03
0.8 10 2010.5±168.9 0.22
5.3受试物对小鼠不负重游泳90min后血清尿素氮的影响
表41受试物对小鼠90min后血清尿素氮的影响(均值±标准差)
5.4受试物对小鼠肝糖原含量的影响
表42受试物对小鼠肝糖原含量的影响(均值±标准差)
组别(g/kg·BW) 动物数(只) 肝糖原(mg/100g肝组织) P值
对照组 10 2612.06±517.77 —
0.2 10 2800.29±331.79 0.652
0.4 10 2957.14±465.23 0.201
0.8 10 3190.63±403.8 0.014
5.5受试物对小鼠血乳酸水平的影响
表43受试物对小鼠血乳酸水平的影响(均值±标准差)
由以上数据可知，经口给予不同剂量的受试物30天后，负重游泳试验中，高剂量组动物游泳时间长于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。血清尿素氮试验中，中剂量组小鼠血清尿素氮低于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。血乳酸测定实验中，中、高剂量组小鼠血乳酸曲线下面积小于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。按照《保健食品检验与评价技术规范》，本发明制得的藻类组合物具有缓解动物体力疲劳的作用。
实施例七：安全性能测试。
1、对实施例一中第1组制得的藻类组合物进行如下安全性能测试，人拟用量为7g/60kg·BW·日。
2、动物实验：所用SPF级昆明种小鼠和Wistar种大鼠由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供(分别用于小、大鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验)，SPF级实验动物室温度20-25℃，湿度40-70％RH。
3、经口急性毒性试验
3.1小鼠经口急性毒性试验(MTD)：选用18-22gSPF级昆明种小鼠20只，雌雄各半，以20g/kg·BW的剂量，经口两次给药(称取样品100g，加蒸馏水至200mL，浓度为0.5g/mL)，灌胃量为0.2mL/10g·BW，灌胃前禁食16h，给药后连续观察14天。记录中毒表现及死亡情况。
3.2大鼠经口急性毒性试验(MTD)：选用180-220gSPF级昆明种小鼠20只，雌雄各半，以20g/kg·BW的剂量，经口两次给药(称取样品100g，加蒸馏水至200mL，浓度为0.5g/mL)灌胃量为2mL/100g·BW，灌胃前禁食16h，给药后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。
4、遗传毒性试验：
4.1Ames试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四柱试验菌株进行试验。用苯巴比妥和β-萘黄酮诱导大鼠后制备的肝匀浆作为体外代谢活化系统。称取样品0.5g，加蒸馏水至10mL，混匀后在121℃、20分钟高压灭菌，混匀后为①液。取①液2mL，加蒸馏水8mL，混匀后为②液；取②液2mL，加蒸馏水8mL，混匀后为③液；取③液2mL，加蒸馏水8mL，混匀后为④液；取④液2mL，加蒸馏水8mL，混匀后为⑤液(受试物浓度分别为50、10、2、0.4、0.08mg/mL)。试验设8、40、200、1000、5000μg/皿5个剂量，同时设空白对照及阳性对照。在顶层琼脂中加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物和0.5mLS9混合液(需要代谢活化时加入)，混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量及对照均做3个平行样。在37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是溶剂对照菌落数2倍以上，并具有剂量-反应关系者则定为阳性。整套试验在相同条件下重复进行一次。
4.2小鼠骨髓细胞微核试验：采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验。用体重25-30g小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。以40mg/kg·BW剂量的环磷酰胺为阳性对照(称取环磷酰胺40mg，加无菌生理盐水至10mL，间隔24h两次经腹腔注射给药，给药量为0.1mL/10g·BW)。剂量设计分别为2.5、5、10g/kg·BW，分别称取受试物5g、10g、20g，各加蒸馏水至40mL，充分混匀，浓度分别为0.125、0.25、0.5g/mL，灌胃量为0.2mL/10g·BW，对照组给等量蒸馏水。末次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)，微核发生率以含微核的PCE千分率计，并进行统计处理，统计方法用t检验，若方差不齐或方差齐但变异系数过大，改用秩和检验；另外计算PCE/NCE比例。
4.3小鼠精子畸形试验：用体重25-35g的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组，每组5只。以40mg/kg·BW剂量的环磷酰胺为阳性对照(称取环磷酰胺40mg，加无菌生理盐水至10mL，腹腔注射，给药量为0.1mL/10g·BW)每天一次，连续5天。样品剂量设计分别为2.5、5、10g/kg·BW，分别称取受试物5、10、20g，各加蒸馏水至40mL，充分混匀，浓度分别为0.125、0.25、0.5g/mL，灌胃量为0.2mL/10g·BW，每日灌胃一次，连续5天，对照组给等量蒸馏水，于首次给予受试物后的第35天颈椎脱臼处死动物，取双侧附睾，置盛有2mL生理盐水平皿中，用眼科剪纵向剪开，静止3min，过滤后常规涂片，甲醇固定5min，1％伊红染色。每只动物检查1000个精子，计数各类型畸形精子。统计方法用t检验，若方差不齐或方差齐但变异系数过大，改用秩和检验。
5、测试结果
5.1急性毒性试验：
表44受试物对小鼠的急性毒性(均值±标准差)
表45受试物对大鼠的急性毒性(均值±标准差)
由以上数据可知，以20g/kg·BW的剂量灌胃两种性别的大、小鼠，观察14天。实验期间未见明显的中毒表现，观察期内无死亡，尸检中主要脏器未见异常。受试物对两种性别的大、小鼠的急性经口毒性(MTD)均大于20g/kg·BW。
5.2遗传毒性试验：
5.2.1Ames试验结果
表46受试物Ames试验结果(第一次实验)
注：以上结果为三个平皿回变菌落数的平均数±标准差。
表47受试物Ames试验结果(重复实验)
注：以上结果为三个平皿回变菌落数的平均数±标准差。
由以上数据可知，对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加与不加S9时，受试物各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数2倍，亦无剂量-反应关系。试验结果为阴性。
5.2.2小鼠骨髓细胞微核试验结果
表48受试物对小鼠骨髓微核发生率的影响(均值±标准差)
*与阴性对照组比较，P＜0.05
由以上数据可知，受试物各剂量组微核率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，而环磷酰胺组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。受试物各剂量组嗜多染红细胞占红细胞总数的比例不少于对照组的20％，未见明显的细胞毒性。故受试物对小鼠骨髓细胞微核不产生影响。
5.3小鼠精子畸形试验
表49受试物对小鼠精子畸形变形率的影响(均值±标准差)
*与阴性对照组比较，P＜0.05
受试物各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。因此，未见受试物对小鼠精子畸形试验产生影响。
由以上数据可知，本品对两种性别的大、小鼠经口急性毒性(MTD)均大于15g/kg·BW，根据《保健食品检验与评价技术规范》急性毒性分级标准，本样品属于无毒级。
实施例八：西洋参黄精组合物30天喂养试验
1、人拟用剂量为7g/60kg·BW·日。
2、实验动物：选用体重61-80g，SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。SPF级实验动物房，温度20-25℃，相对湿度为40-70％RH。
3、实验方法：剂量分别为2.92、5.83、11.67g/kg·BW(分别相当于人拟用剂量的25倍、50倍、100倍)。将大鼠随机分为三个受试物组及对照组，每组20只，雌雄各半。分别称取样品116.8g、233.2g、466.8g各加蒸馏水稀释至600mL充分混匀。经口灌胃，每次灌胃前均真当混匀，低、中剂量组灌胃量为0.5mL/100g·BW,高剂量组因为摄入量较高，无法按0.5mL/100g·BW的灌胃量灌胃，因此按照样品比重(0.94g/mL)计算得出其灌胃量0.64mL/100g·BW。对照组给予0.5mL/100g·BW植物油，每天1次，连续进行30天。动物单笼喂养，自由饮食，每周剂量大鼠进食量、体重，连续观察30天。实验结束时，取血测定各项指标，动物取血前一晚禁食，不禁水。
4、观察指标：
4.1一般情况观察：每天观察动物的外冠、行为、毒性表现和死亡情况。每周称体重、进食量，计算每周食物利用率、总食物利用率、总进食量及总增重。
4.2血液学检查：实验末期，眼内眦取血测定血红蛋白含量(Hgb)、红细胞(RBC)及白细胞(WBC)计数，包细胞分类(淋巴、单核、中性粒、嗜酸、嗜碱)，所用仪器为SysmexXT-2000i五分类血球计数仪。
4.3生化指标测定：实验末期，眼内眦取血测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)
肌酐(CRE)。试剂盒均由北京九强生物技术有限公司提供。
4.4大体观察及病理组织检查：实验末期动物禁食16h后称重，颈椎脱臼处死，观察各主要脏器及胸、腹腔大体病理改变。取出全部动物的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸，称重并计算脏器系数。取出对照组和高剂量组动物的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸(或卵巢)、胃及十二指肠，用4％甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色，在光镜下进行组织学检查。
4.5统计方法：各组数据采用方差分析进行统计分析，方差不齐者采用数据转换，如转换后仍不齐则采用非参数统计。
4.6西洋参黄精组合物30天喂养试验结果
4.6.1实验动物一般情况观察结果
表50受试物对大鼠体重影响(g，均值±标准差)
表51受试物对大鼠每周进食量的影响(g，均值±标准差)
表52受试物对大鼠每周食物利用率的影响(％，均值±标准差)
表53受试物对大鼠总食物利用率的影响(均值±标准差)
由以上数据可知，按照以上剂量灌胃大鼠30天，动物未出现拒食现象。各组动物每周食物利用率、总食物利用率、体重和增重与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.6.2受试物对大鼠血液学指标的影响
表54受试物对大量血液学指标的影响(均值±标准差)
表55受试物对大鼠白细胞分类的影响(％，均值±标准差)
由以上数据可知，实验末期血液学的各项指标均在本检测单位正常值范围内，只有雄性动物低、高剂量组嗜碱性粒细胞百分率高于对照组(P＜0.05)，但无生物学意义；其余各剂量及各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.6.3受试物对大鼠生化指标的影响
表56受试物对大鼠生化指标的影响(均值±标准差)
表57受试物对大鼠生物指标的影响(均值±标准差)
由以上数据可知，实验末期试验动物各项生化指标均在本检测单位正常值范围内，只有雄性动物低剂量组CRE低于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。其余各剂量组各项指标与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.6.4受试物对大鼠脏器的影响
表58受试物对大鼠脏器重量的影响(g，均值±标准差)
表59受试物对大鼠脏体比的影响(％，均值±标准差)
大体解剖观察未发现异常。各组动物脏器重量及脏体比值与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.6.5病理组织学检查：
将高剂量组和对照组全部动物主要脏器进行病理组织学检查，每组20只，雌雄各半。
表60受试物对大鼠主要肝脏病理组织的影响
大体解剖未见异常：
肝脏：被膜完整，无明显纤维组织增生。肝小叶存在，间质未见结缔组织增生。肝中央静脉、肝小动、静脉未见异常。部分动物汇管区可见少量小圆形炎细胞浸润对照组3/20(雄2只，雌1只)，高剂量组2/20(雌2只)。两组比较无明显差别。脾脏：两组动物脾脏包膜完整，红、白髓结构清晰，红髓脾窦红细胞充盈，白髓生发中心活跃及脾小结中央动脉管壁未见增厚或变性。两组比较无明显差别。肾脏：两组动物肾脏包膜完整，皮髓质结构清楚，肾小球提及将未见缩小或扩大，数目未见减少。肾小管上皮细胞未见变性、坏死或脱落，管腔中未见管型及结石，肾间未见纤维组织增生。个别动物肾间质可见少量小圆形炎细胞浸润，对照组3/20(雄2只、雌1只)，高剂量组1/20(雄1只)。两组比较无明显差别。胃：前胃角化良好，胃粘膜完整，未见出血、糜烂、溃疡及脱落，腺体未见增生、化生或萎缩，固有层、肌层及浆膜层未见异常。前后胃交界处无明显异常。十二指肠：粘膜完整，未见出血、糜烂、溃疡及脱落，固有膜肠腺丰富，未见增生、化生或萎缩，固有层、肌层及浆膜未见异常。两组比较无明显差别。睾丸：睾丸被膜完整，曲细精管可见各级生精细胞存在且分布正常，腔中可见发育良好的精子细胞及精子，间质未见显著改变。两组比较无明显差别。卵巢：卵巢可见不同生长发育阶段的卵泡细胞及黄体、白体，均未见异常。两组比较无明显差别。通过镜下观察高剂量组与对照组比较，未发现与样品相关的病理组织学改变，固未对中、低剂量组进行组织病理学检查。

Claims (9)

1.一种西洋参黄精组合物，其特征在于：包括以下以重量份数表示的组分：黄精35-300份；西洋参10-100份；L-阿拉伯糖300-1000份；木糖醇120-500份。
2.根据权利要求1所述的西洋参黄精组合物，其特征在于：包括以下以重量份数表示的组分：黄精50-100份；西洋参20-60份；L-阿拉伯糖500-750份；木糖醇150-300份。
3.根据权利要求1或2任一项所述的西洋参黄精组合物，其特征在于：黄精选择黄精粉和/或黄精提取物；西洋参选择西洋参粉和/或西洋参提取物。
4.根据权利要求1或2任一项所述的西洋参黄精组合物，其特征在于：按照如下方法制得：
西洋参、黄精和麦芽糊精过60-200目筛，搅拌混合10-30min制得第一混合物；
L-阿拉伯糖和木糖醇搅拌混合形成第二混合物；
第一混合物和第二混合物搅拌均匀后制得西洋参黄精组合物。
5.一种西洋参黄精制剂，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的西洋参黄精组合物，还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的西洋参黄精制剂，其特征在于：所述制剂为粉剂、口服液或者颗粒剂中的一种。
7.根据权利要求1-4任一项所述的西洋参黄精组合物或者权利要求5-6任一项所述的西洋参黄精制剂，用于降血糖。
8.根据权利要求1-4任一项所述的西洋参黄精组合物或者权利要求5-6任一项所述的西洋参黄精制剂，用于提高免疫力。
9.根据权利要求1-4任一项所述的西洋参黄精组合物或者权利要求5-6任一项所述的西洋参黄精制剂，用于抗疲劳。
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