CN105294874A - 一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。本发明以黑灵芝精制多糖PSG为原料，采用强阴离子交换树脂Q-Sepharose？Fast？Flow对PSG进行分离纯化，分别用不同浓度(0～2M)的氯化钠溶液分段洗脱，所得不同组分依次进行透析、冷冻干燥，得到具有免疫活性的黑灵芝酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖类多糖组分。本发明的特点是：1、强阴离子交换树脂能有效地将PSG中含有不同化学成分的组分分离；2、制备所得酸性多糖组分，其糖含量高、均一性好、免疫活性优于精制多糖PSG；3、本方法操作简单、快速高效、重现性好，所用洗脱液无毒无污染，可应用于黑灵芝免疫活性多糖的大规模制备。

Description

一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取分离技术领域，尤其涉及一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。

背景技术

灵芝是一种珍贵的药用真菌，具有滋补强身、扶正固本的功效，黑灵芝是灵芝属中的一个重要品种。大量研究表明多糖是灵芝的主要功能成分之一，黑灵芝多糖已被证实具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和抗糖尿病等生物活性，因此，在医药保健品等领域被认为具有广阔的开发前景。

多糖的分离纯化方法有多种，其中，氧化法和阴离子交换色谱法常用于多糖的脱色和初步分离；而精细分离常用的方法是凝胶柱层析法，该法按分子质量大小对多糖成分进行分级，可以得到分子质量分布较窄的多糖级分。灵芝多糖提取物成分复杂，除活性多糖外，还含有蛋白质和多酚类等杂质，给灵芝活性多糖的分离纯化带来很大麻烦。目前，灵芝多糖的分离纯化通常结合两到三种方法，这样可以得到纯度高、分布窄的多糖级分。如方积年“一种灵芝多糖及制备方法和应用”(专利号：CN1537867A)，该专利采用梯度洗脱阴离子交换色谱与凝胶柱层析联用法，获得了高纯度的活性多糖组分，该方法已广泛应用于赤灵芝多糖的分离纯化。

Q-SepharoseFastFlow是一种强阴离子交换树脂，根据分离物质所带电荷的多少来进行分级，能在较宽pH范围内对生物大分子进行有效分离；该树脂具有高通量、快速高效等特点，在多糖纯化领域主要应用于中性多糖和酸性多糖的分离，可实现大规模的制备。常见的梯度洗脱阴离子交换色谱可以在较短时间内对多糖进行初步分离，但很难制备性质均一的多糖组分；而凝胶柱层析法由于耗时长、稳定性差等问题，制约了灵芝多糖的分离效率，无法大量制备具有生物活性的多糖组分。本发明采用Q-SepharoseFastFlow作为分离介质，通过不同浓度盐溶液作为洗脱液进行分段洗脱，试图提供一种高效分离制备黑灵芝免疫活性多糖的方法，该方法可提高多糖纯度和富集免疫活性多糖组分的作用，操作简单、重现性好、效率高，克服了凝胶柱等分离技术效率低、耗时长、分离不彻底等的不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明由黑灵芝精制多糖制备免疫活性多糖的方法的具体步骤如下：

(1)粗多糖制备：黑灵芝子实体粉末经95％的食用乙醇浸泡24h后，过滤、干燥，将滤渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：40的比例混合，于90℃下搅拌浸提2h。提取液经过滤除杂后，真空浓缩至原体积的1/5，缓慢向浓缩液中加入无水乙醇，并不断搅拌，至乙醇终浓度为80％，置于4℃冰箱中醇沉过夜，离心，得到沉淀物，冷冻干燥即得黑灵芝粗多糖。

(2)精制多糖制备：将步骤(1)制备的粗多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，将Sevage试剂(氯仿与正丁醇按照体积为4：1的比例混合)按多糖溶液的1/3体积加入，混合、剧烈振摇搅拌后，以4500rpm的转速离心10min，除去蛋白层，多糖溶液继续用Sevage试剂处理，如此重复3～5次至无游离蛋白析出为止；多糖层经透析、浓缩后，采用80％乙醇醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，冷冻干燥得精制多糖PSG。

(3)多糖的分离纯化：将步骤(2)中的精制多糖PSG溶于蒸馏水中，配成3～5mg/mL的溶液，离心(5000rpm的转速离心10min)，除去不溶物；将20～30mL多糖溶液加入阴离子交换柱(色谱柱规格为1.5x10cm)中，使样品与树脂充分交换10min；第一阶段用纯水洗脱未被吸附的样品，吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同组分，对水透析脱盐、浓缩、冷冻干燥，得5个不同级分(图1)，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂。

(4)通过对不同组分的中性糖、糖醛酸、蛋白质和酚类物质的含量测定，结果显示F_0.2为主要的酸性多糖组分，糖含量高于85％，HPLC检测显示其为单一对称峰，由此表明F_0.2是一种高纯度的多糖组分，分子质量测定为12.73KDa；通过高效阴离子交换色谱HPAEC-PAD分析F_0.2组分的糖组成，显示其主要由葡萄糖(81.5％)和葡萄糖醛酸(15.6％)组成，含有少量半乳糖和甘露糖(图2)；甲基化结合GC-MS和NMR波谱分析其糖连接方式，结果表明F_0.2是一种酸性的β-(1→3,1→6)-葡聚糖类多聚糖；细胞活性试验筛选表明F_0.2的体外免疫活性优于精制多糖PSG和其他组分。细胞活性试验筛选方法为：采用小鼠巨噬细胞RAW264.7作为靶细胞，通过测定不同多糖组分刺激细胞释放NO的能力来快速筛选具有体外免疫活性的多糖组分。

本发明的积极效果如下：

1、高通量分离纯化介质Q-SepharoseFastFlow能有效地将PSG中含有不同化学成分的组分分离；

2、有效富集了具有免疫活性的酸性多糖组分，该组分糖含量高、均一性好、免疫活性优于精制多糖PSG；

3、本发明简化了黑灵芝多糖分离纯化的流程，显著缩短了纯化时间，提高了纯化效率，可应用于样品的大规模制备。

附图说明

图1黑灵芝精制多糖PSG的分离纯化流程。

图2黑灵芝免疫活性多糖F_0.2的单糖组成结果。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

黑灵芝多糖采用如下方案进行提取与精制：

称取黑灵芝子实体粉末500g，置于玻璃搅拌缸中，向其中加入10L95％的食用乙醇，室温下搅拌浸泡24h。滤渣过滤、干燥，转入提取罐中，向其中加入20L蒸馏水，于90℃下搅拌浸提2h，冷却后，提取液经过滤除杂后，真空浓缩至4L；将浓缩液转入醇沉罐中，缓慢向浓缩液中加入16L的无水乙醇并不断搅拌，而后控制温度在4℃左右醇沉过夜，4500rpm转速离心，沉淀物冻干，即黑灵芝粗多糖，得率为7.1％。

称取黑灵芝粗多糖1.0g，溶于300mL蒸馏水中，待完全溶解后，转入1L分液漏斗中，加入100mL的Sevage试剂(氯仿与正丁醇以4：1(v/v)比例混合)，剧烈振摇10min后，以4500rpm的转速离心10min，除去蛋白层，多糖溶液层继续用Sevage试剂处理，重复5次至无游离蛋白析出为止；多糖层用截流分子量8000Da的透析袋对水透析3d，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和无水乙醚分别洗涤两次后，冷冻干燥得精制多糖PSG，样品回收率为35.0％。

黑灵芝多糖采用如下实施例进行分离纯化：

实施例1。

称取精制多糖PSG样品60mg，溶于蒸馏水中，配制成浓度为3.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心10min)除去不溶物；将离心上清液20mL缓慢转入Q-SepharoseFastFlow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换10min；待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂，样品回收率分别为：7.9％，22.5％，16.3％，25.8％和15.0％，在该分离条件下纯化60mg样品的时间为1h。

实施例2。

称取精制多糖PSG样品100mg，溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心10min)除去不溶物；将离心上清液20mL缓慢转入Q-SepharoseFastFlow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换10min；待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂，样品回收率分别为：8.4％，23.1％，14.0％，26.5％和15.4％，在该分离条件下纯化100mg样品的时间为1h。

实施例3。

称取精制多糖PSG样品150mg，溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心10min)除去不溶物；将离心上清液30mL缓慢转入Q-SepharoseFastFlow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换10min；待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂，样品回收率分别为：8.1％，22.8％，15.2％，25.3％和16.1％，在该分离条件下纯化150mg样品的时间为1h。

实施例4。

采用Superdex-200prepgrade凝胶柱(26x60cm)对PSG进行分级。称取精制多糖样品100mg溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心10min)除去不溶物。上样体积为2.0mL，超纯水作为洗脱液，流速为1.0mL/min，部分收集器收集，每管收集5mL，紫外检测器(280nm)和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况，苯酚-硫酸法跟踪检测每管的糖含量。根据洗脱曲线，合并同一级分的洗脱液，分别透析、浓缩、冻干，得均一多糖组分PSG-1和PSG-2，样品回收率分别为10.3％和4.8％，在该分离条件下纯化100mg样品至少需要48h。

下面结合上述具体实施例中所得样品，对本发明所述的黑灵芝多糖免疫功能活性、基本理化性质和结构特征作进一步说明。

1。材料与方法

单糖标准品：鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(Ga1A)；没食子酸、氢氧化钠、醋酸钠、苯酚、硫酸、咔唑、无水乙醇等。以上试剂至少为国产分析纯。

小鼠巨噬细胞系RAW264.7，DMEM培养液、RPMI1640培养液、PBS等细胞实验试剂购于Gibco-Invitrogen公司

2。主要仪器与设备

ICS-5000离子色谱仪(美国Dionex公司)、TU-1900紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)等。

3。实验方法

3.1.体外免疫活性筛选

采用小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的能力来评价实施例中不同多糖组分的体外免疫活性。操作步骤如下：RAW264.7接种在DMEM培养液(含有10％的胎牛血清FCS，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素)中，于37℃培养箱(5％CO₂)中孵育培养至细胞对数生长期，将细胞密度用RPMI1640培养液稀释至5x10⁵个/mL，吸取180μL稀释的细胞液于96孔板中，于培养箱中培养2h，再对应的加入20μL不同浓度的样品(0、125、250和500μg/mL)、1μg/mL的阳性对照LPS以及空白对照PBS刺激细胞48h。吸取经刺激后的细胞上清液50μL加入另一96孔板中，同时设置NaNO₂标准溶液组(0、10、20、40、60、80、100μmol/mL)，再对应加入50μLGriess试剂(含有1％(w/v)的磺胺，0.1％(w/v)的萘乙二盐酸盐和2％(v/v)的磷酸)，混匀后，显色10min，用微孔紫外分光光度计在543nm下测定吸光度。样品空白中，细胞液用RPMI1640培养液取代，其它操作与实验组一致。

3.2.化学成分分析

以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定样品中中性糖的含量。样品平行测定三次，取平均值。

以葡萄糖醛酸为标准品，采用硫酸-咔唑法测定样品中糖醛酸的含量。样品平行测定三次，取平均值。

以牛血清蛋白(BSA)为标准品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。样品平行测定三次，取平均值。

以没食子酸为换算当量，采用修正的Folin–Ciocalteu法测定总酚含量。分别向96孔板中加入25μL的没食子酸标准或多糖样品溶液，再对应加入125μL的Folin-Ciocalteu试剂，混匀后反应10min，加入125μL的7.5％Na₂CO₃溶液(质量分数)，25℃放置30min，在765nm下用微孔紫外分光光度计测定(EL340,Bio-TekInstrumentsInc.,Winooski,VT,USA)。结果以每克样品干重中没食子酸当量的百分比表示，所有标准和样品平行三次。

3.3.单糖组成分析

采用仪器ICS-5000离子色谱仪分析单糖组成。准确称取5.0mg样品，加入0.5mL超纯水使其溶解。以0.5mL12MH₂SO₄溶液在冰浴条件下搅拌30min，再加入2mL超纯水，将样品置于100℃油浴2h。水解液稀释，过0.22μm滤膜后用离子色谱仪分析。

色谱柱：CarboPacPA20分析柱(3×150mm)，CarboPacPA20分析柱(3×30mm)；淋洗液：250mmol/LNa0H溶液、100mol/L醋酸钠溶液；流速：0.5mL/min；进样量：10.0μL；柱温：35℃；再生液：200mmol/LNaOH溶液。

3.4.甲基化分析

称取干燥的多糖样品2-3mg于反应瓶中，加入1mL无水DMSO，搅拌溶解，至样品彻底溶解、溶液澄清为止。加入20mg干燥的氢氧化钠粉末于DMSO溶液，室温下搅拌3h后，转移至冰浴中，滴加0.3mL无水碘甲烷，然后于室温下搅拌反应2.5h。甲基化反应结束后，加入几滴水终止反应，用1mL二氯甲烷萃取甲基化后的多糖，二氯甲烷层用水洗3-4次以除去未完全甲基化的多糖，弃水层，二氯甲烷层过无水硫酸钠柱，收集用氮气吹干。向干燥的甲基化多糖中加入0.5mL4.0M的三氟乙酸，密封置于100℃中水解6h，而后取出冷却，氮气吹干。向水解物中加入0.3mL水，搅拌溶解后，加入5mg硼氘化钠，室温下搅拌还原过夜。还原后的水解物中滴加醋酸，至无气泡产生，氮气吹干，再依次用10％醋酸甲醇溶液和纯甲醇除尽还原过程中产生的硼酸。最后向干燥的水解还原产物中加入0.5mL醋酐乙酰化2h，得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。PMAA经氮气吹干后复溶于二氯甲烷中，进行GC-MS分析。

GC-MS条件GC-MS系统为THERMO1310GC-ISQLTMS，配有TG-200MS毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm膜厚)，GC程序升温条件为：160℃保持2min，以2℃/min的速度升温至210℃，再以5℃/min的速度升至240℃，最后保持20min。MS扫描范围为m/z35-400。

3.5.核磁共振分析

称取样品50mg，溶于5mL重水中进行交换，冻干，重复3次。重水交换后的样品至于真空干燥箱中干燥5-6h(80℃)，在干燥环境下，加入0.5-1mL重水，充分溶解，低速离心，将均一的上清液转移至核磁管中以备NMR测试。采用BrukerAVIII600NMR仪扫描样品的1D/2DNMR波谱，¹HNMR扫描频率为600.10MHz，¹³CNMR扫描频率为151.01MHz，COSY、TOCSY、HSQC和HMBC采用Bruker标准脉冲程序，所有测试均在295K下进行。三甲基丙酸作为化学位移内标物。

4。实验结果

细胞活性筛选试验结果表明：在不同实施例中，F_0.2组分刺激RAW264.7细胞释放NO的能力最强，均优于精制多糖PSG，这表明PSG经分离纯化后，免疫活性组分富集在了F_0.2组分中。与凝胶柱分离的组分比较，F_0.2组分的活性略优于PSG-1，两者均优于精制多糖PSG。

化学成分和结构分析结果显示：在不同实施例中，Fw、F_0.1和PSG-2均是以α-(1,6)-半乳糖为主的中性多糖，不含或含有少量的糖醛酸、蛋白质和酚类物质；F_0.2和PSG-1为以β-(1,3)-葡萄糖和β-(1,6)-葡萄糖为主的酸性多糖，含有少量的蛋白质和酚类物质；而F_0.5和F₂中的中性糖和糖醛酸含量逐渐降低，蛋白质和酚类物质的含来逐渐增加，其中F₂以蛋白质为主，含量达33.0％。

上述结果表明：阴离子交换色谱法可将黑灵芝免疫活性多糖富集在以β-(1,3)-葡萄糖和β-(1,6)-葡萄糖为主的酸性葡聚糖F_0.2级分中，其在分离纯化中的回收率为14.0％。该法与凝胶柱层析法制备PSG-1比较，具有回收率高、分离时间短、重现性好、易操作等特点，可应用于样品的大规模制备。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述的方法是：黑灵芝精制多糖PSG通过强阴离子交换色谱进行分离纯化，依次采用纯水和氯化钠溶液作为流动相进行分段洗脱，分离得到黑灵芝中性多糖、酸性多糖、酚类和蛋白组分，通过细胞活性试验快速筛选出黑灵芝免疫活性多糖组分。

2.如权利要求1所述的高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述的灵芝精制多糖PSG的制备方法如下：

(1)粗多糖制备：

黑灵芝子实体粉末经95％的食用乙醇浸泡24h后，过滤、干燥，将滤渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：40的比例混合，于90℃下搅拌浸提2h，提取液经过滤除杂后，真空浓缩至原体积的1/5，缓慢向浓缩液中加入无水乙醇，并不断搅拌，至乙醇终浓度为80％，置于4℃冰箱中醇沉过夜，离心，得到沉淀物，冷冻干燥即得黑灵芝粗多糖；

(2)精制多糖制备：

将步骤(1)制备的粗多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，将Sevage试剂(氯仿与正丁醇按照体积为4：1的比例混合)按多糖溶液的1/3体积加入，混合、剧烈振摇搅拌后，以4500rpm的转速离心10min，除去蛋白层，多糖溶液继续用Sevage试剂处理，如此重复3～5次至无游离蛋白析出为止；多糖层经透析、浓缩后，采用80％乙醇醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，冷冻干燥得精制多糖PSG。

3.如权利要求1所述的高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

将精制多糖PSG溶于蒸馏水中，配成3～5mg/mL的溶液，离心(5000rpm的转速离心10min)，除去不溶物；将20～30mL多糖溶液加入阴离子交换柱中，使样品与树脂充分交换10min；第一阶段用纯水洗脱未被吸附的样品，吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1,0.2,0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min，分别收集不同组分，对水透析脱盐、浓缩、冷冻干燥，得5个不同级分，分别记为Fw,F_0.1,F_0.2,F_0.5和F₂；然后通过细胞活性试验快速筛选出，F_0.2的多糖成分为黑灵芝免疫活性多糖组分。

4.如权利要求1所述的高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述强阴离子交换色谱的分离条件如下：色谱柱填料为Q-SepharoseFastFlow树脂，色谱柱规格为1.5×10cm，样品溶液浓度为3～5mg/mL，进样量为20～30mL，流动相依次为5倍柱体积的纯水、0.1、0.2、0.5和2M的氯化钠溶液，洗脱流速控制在10mL/min；分别收集不同阶段的洗脱液，透析脱盐、浓缩、冷冻干燥，得到5个不同的多糖组分。

5.如权利要求1所述的高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述细胞活性试验筛选方法为：采用小鼠巨噬细胞RAW264.7作为靶细胞，通过测定不同多糖组分刺激细胞释放NO的能力来快速筛选具有体外免疫活性的多糖组分。

6.如权利要求1所述的高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法，其特征在于：所述的黑灵芝免疫活性多糖组分是由0.2M氯化钠溶液洗脱得到，糖含量高于85％，化学结构为酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖类多聚糖，分子质量Mw为12.73KDa，体外免疫活性优于精制多糖PSG。