CN105876576A - 一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料及其制备方法 - Google Patents
一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料及其制备方法，包括按以下比例的物质：100mL黑灵芝浓缩澄清液，0.1‑0.3g的赤藓糖醇、0.001‑0.005g的甜菊糖、0.02‑0.06g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠。制备方法包括原料预处理、黑灵芝提取液制备、黑灵芝提取液浓缩、澄清、黑灵芝饮料调配、灌装灭菌等步骤。本发明充分开发了黑灵芝提高免疫力的保健价值；能最大限度的提取黑灵芝多糖；保留了黑灵芝的特征风味；饮料稳定性高，最大限度地降低了加工保藏过程中饮料色变；工艺简单，设备要求低，易于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属食品加工领域，涉及食品饮料及其制备方法。
背景技术
灵芝，是中国重要的传统食用药材。现代研究表明，灵芝主要含有多糖、三萜类、核苷、甾醇、生物碱、氨基酸、微量元素等多种化学成分，具有抗肿瘤、保肝、调节免疫、抗衰老等生物活性。现在普遍认为，灵芝多糖在灵芝的免疫调剂作用中发挥着重要的作用，其在增强吞噬细胞的活性、抗原递呈细胞、体液免疫和细胞免疫发挥着广泛的作用。此外，灵芝三萜类在免疫调节作用中也发挥着重要作用。
黑灵芝，又名紫芝、玄芝、黑云芝等，是众多灵芝种类中的一种，据《神农本草经》记载“紫芝可治耳聋、利关节、保神、益精气、坚筋骨”。黑灵芝被称为灵芝中的极品，对人体保健具有的药用疗效远比其它种类的灵芝高。研究发现黑灵芝多糖、三萜等在提高机体免疫力方面发挥着重要作用。目前，市面上以其他种类灵芝为原料开发的产品种类很多，而黑灵芝作为具有极高药用疗效的食品原料，以其作为主要原料的功能产品则较少。
发明内容
本发明主要提供了具有提高机体免疫力作用的一种黑灵芝功能饮料的制备方法，保留了黑灵芝的特征风味，甘苦相宜，克服了饮料加工和保藏过程中的不稳定性。
根据《中国药典》中灵芝的推荐摄入量最大为12 g，本发明以成年人每日摄入黑灵芝量12 g为基础设计，以每日摄入100 mL饮料量进行黑灵芝功能饮料研发。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料，包括按以下比例的物质：
100mL黑灵芝浓缩澄清液，0.1-0.3g的赤藓糖醇、0.001-0.005g的甜菊糖、0.02-0.06g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠。
所述的黑灵芝浓缩澄清液为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。
本发明所述的黑灵芝饮料调配时添加的赤藓糖醇、甜菊糖、柠檬酸，按100mL黑灵芝浓缩澄清液计，赤藓糖醇最优添加量为0.2g、甜菊糖最优添加量是为0.003g，柠檬酸最优添加量是为0.06g。
本发明所述的一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料的制备方法，按如下步骤。
（1）原料预处理：黑灵芝子实体预先破碎至2 cm方块，再于95-105℃干燥3-4 h后进行粉碎，粉碎后的黑灵芝呈绒状。
（2）黑灵芝提取液制备：将上述步骤（1）处理好的绒状黑灵芝，按照料液比（kg/L）为1:20的比例加入水，搅拌至灵芝全部被水浸没，于沸水浴下提取2-3 h，400目网筛过滤、收集滤液。剩下的黑灵芝滤渣再以料液比（kg/L）为1:7.5的比例加入水，慢速搅拌至灵芝均匀散开，沸水浴提取1-2 h，400目网筛过滤、收集滤液，合并滤液后再离心（转速4000-4500r/min，时间10-15 min），得澄清金黄色黑灵芝提取液。
（3）黑灵芝提取液浓缩、澄清：将步骤（2）制备的黑灵芝提取液真空浓缩，得黑灵芝浓缩液。黑灵芝浓缩液再进行离心（转速3000-4000 r/min，时间10-15 min），得黑灵芝浓缩澄清液，使其终浓度为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。
（4）黑灵芝饮料调配：按100mL黑灵芝浓缩澄清液计，加入0.1-0.3g的赤藓糖醇、0.001-0.005g的甜菊糖、0.02-0.06g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠，混合均匀后再进行均质处理，均质压力为15 MPa。
（5）灌装灭菌：将步骤（4）制备的黑灵芝饮料进行灌装，并于100℃条件下灭菌15min，即得黑灵芝饮料成品。
本发明所述的黑灵芝饮料调配时添加的羧甲基纤维素钠，能有效的减小该黑灵芝饮料在贮藏过程中的沉淀析出，提高稳定性。
本发明所述的黑灵芝饮料调配时添加的异抗坏血酸钠能最大限度的降低饮料在贮藏过程中色泽的变化。
本发明所述的黑灵芝饮料灌装时所采用的灭菌条件，能有效降低灭菌过程中黑灵芝饮料色泽的变化。
本发明所述的黑灵芝饮具有提高免疫功能的作用。
本发明的优点是：1. 遵循传统的水煎提取方式，结合现代加工保藏技术，充分开发了黑灵芝提高免疫力的保健价值；2. 采用热水浸提方式能最大限度的提取黑灵芝多糖，充分利用了黑灵芝多糖提高免疫力的药用价值；3. 保留了黑灵芝的特征风味，甘、苦相宜；4. 饮料稳定性高，最大限度地降低了加工保藏过程中饮料色变；5. 工艺简单，设备要求低，易于实现工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1。
包括以下步骤。
（1）原料预处理：黑灵芝子实体预先破碎至2 cm方块，再于95℃干燥4 h后进行粉碎，粉碎后的黑灵芝呈绒状。
（2）黑灵芝提取液制备：将步骤（1）处理好的绒状黑灵芝，按照料液比（kg/L）为1:20的比例加入水，搅拌至灵芝全部被水浸没，于沸水浴下提取2 h，400目网筛过滤、收集滤液。剩下的黑灵芝滤渣再以料液比（kg/L）为1:7.5的比例加入水，慢速搅拌至灵芝均匀散开，沸水浴提取2 h，400目网筛过滤、收集滤液，合并滤液后再离心（转速4000 r/min，时间15 min），得澄清金黄色黑灵芝提取液。
（3）黑灵芝提取液浓缩、澄清：将步骤（2）制备的黑灵芝提取液真空浓缩，得黑灵芝浓缩液。黑灵芝浓缩液再进行离心（转速3000-4000 r/min，时间10-15 min），得黑灵芝浓缩澄清液，使其终浓度为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。
（4）黑灵芝饮料调配：按100mL黑灵芝浓缩澄清液计，加入0.1g赤藓糖醇、0.005g的甜菊糖、0.02g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠，混合均匀后再进行均质处理，均质压力为15 MPa。
（5）灌装灭菌：将步骤（4）制备的黑灵芝饮料进行灌装，并于100℃条件下灭菌15min，即得黑灵芝饮料成品。
实施例2。
包括以下步骤。
（1）原料预处理：黑灵芝子实体预先破碎至2 cm方块，再于100℃干燥3.5 h后进行粉碎，粉碎后的黑灵芝呈绒状。
（2）黑灵芝提取液制备：将步骤（1）处理好的绒状黑灵芝，按照料液比（kg/L）为1:20的比例加入水，搅拌至灵芝全部被水浸没，于沸水浴下提取3 h，400目网筛过滤、收集滤液。剩下的黑灵芝滤渣再以料液比（kg/L）为1:7.5的比例加入水，慢速搅拌至灵芝均匀散开，沸水浴提取1 h，400目网筛过滤、收集滤液，合并滤液后再离心（转速4500 r/min，时间10 min），得澄清金黄色黑灵芝提取液。
（3）黑灵芝提取液浓缩、澄清：将步骤（2）制备的黑灵芝提取液真空浓缩，得黑灵芝浓缩液。黑灵芝浓缩液再进行离心（转速3000-4000 r/min，时间10-15 min），得黑灵芝浓缩澄清液，使其终浓度为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。。
（4）黑灵芝饮料调配：按100 mL黑灵芝浓缩澄清液计，加入0.2g的赤藓糖醇、0.003g的甜菊糖、0.04g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g异抗坏血酸钠，混合均匀后再进行均质处理，均质压力为15 MPa。
（5）灌装灭菌：将步骤（4）制备的黑灵芝饮料进行灌装，并于100℃条件下灭菌15min，即得黑灵芝饮料成品。
实施例3。
（1）原料预处理：黑灵芝子实体预先破碎至2 cm方块，再于105℃干燥3 h后进行粉碎，粉碎后的黑灵芝呈绒状。
（2）黑灵芝提取液制备：将步骤（1）处理好的绒状黑灵芝，按照料液比（kg/L）为1:20的比例加入水，搅拌至灵芝全部被水浸没，于沸水浴下提取3 h，400目网筛过滤、收集滤液。剩下的黑灵芝滤渣再以料液比（kg/L）为1:7.5的比例加入水，慢速搅拌至灵芝均匀散开，沸水浴提取1 h，400目网筛过滤、收集滤液，合并滤液后再离心（转速4500 r/min，时间10 min），得澄清金黄色黑灵芝提取液。
（3）黑灵芝提取液浓缩、澄清：将步骤（2）制备的黑灵芝提取液真空浓缩，得黑灵芝浓缩液。黑灵芝浓缩液再进行离心（转速3000-4000 r/min，时间10-15 min），得黑灵芝浓缩澄清液，使其终浓度为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。。
（4）黑灵芝饮料调配：按100 mL黑灵芝浓缩澄清液计，加入0.3g的赤藓糖醇、0.001g的甜菊糖、0.06g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠，混合均匀后再进行均质处理，均质压力为15 MPa。
（5）灌装灭菌：将步骤（4）制备的黑灵芝饮料进行灌装，并于100℃条件下灭菌15min，即得黑灵芝饮料成品。
下面结合上述事例所得的成品，对本发明的黑灵芝功能饮料的免疫功能作进一步说明。
1、实验材料。
BALB/c雌性小鼠，18-20 g（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）；环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司）；红细胞裂解液（购自碧云天生物技术有限公司）；ConA（刀豆蛋白）及LPS（脂多糖）（美国 Sigma 公司）；Cell Counting Kit试剂盒（CCK-8）（日本同仁化学研究所）；胎牛血清（美国 HyClone 公司）；RPMI-1640培养基（北京索莱宝科技有限公司）；Anti-Mouse CD3 FITC、 Anti-Mouse CD4 PE、Anti-Mouse CD8 PE（美国eBioscience公司）。
2、实验仪器。
CO2培养箱、多功能酶标仪（美国Thermo公司）；BD FACSCalibur TM流式细胞仪（美国BD公司）；LD2X-40KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；1300ⅡA/B3 BHC生物安全柜（江苏净化集团安康公司）；3K15高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；HGC-24A超净工作台（吴江市净化设备厂）；XS205电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。
3、试验方法。
3.1实验动物分组及给药方法。
小鼠被随机分为五组，8只/组，分别为正常组、模型对照组、黑灵芝饮料低、中、高剂量组。静养一周后，正常组腹腔注射同体积生理盐水，其它各组小鼠连续3天腹腔注射剂量为80 mg/(kg.bw)环磷酰胺，建立免疫抑制小鼠模型。造模成功后，饮料组按照低、中、高剂量组分别灌胃0.2 mL黑灵芝饮料、0.2 mL一倍黑灵芝饮料浓缩液（将实例所得黑灵芝饮料真空浓缩至原体积1/2所得）、0.2 mL两倍黑灵芝饮料浓缩液（将实例所得黑灵芝饮料真空浓缩至原体积1/4所得），正常组、模型对照组灌胃相同体积的生理盐水。连续灌胃7天。
3.2小鼠脾淋巴细胞悬液的制备。
末次给药24 h后处死小鼠，无菌取下脾脏，加PBS缓冲溶液研磨，过200目网筛，加入红细胞裂解液去除无核细胞，用含10%（体积分数）胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，置于含5 % （体积分数）CO2、37℃的恒温孵育箱中4 h，以去除贴壁的细胞，即得到小鼠脾淋巴细胞悬液。
3.3对脾淋巴细胞亚群的影响。
调节小鼠脾淋巴细胞悬液的细胞浓度为5×106个/mL，1000 rpm/min离心5min，弃上清后加入PBS缓冲溶液清洗。一组加入荧光抗体试剂Anti-Mouse CD3 FITC、 Anti-MouseCD4 PE进行双染，另一组加入荧光抗体试剂Anti-Mouse CD3 FITC、 Anti-Mouse CD8 PE进行双染，放于4℃冰箱避光孵育30min。PBS缓冲溶液清洗两次，离心弃上清，每管加入0.5mLPBS缓冲溶液，吹打使细胞重悬，于流式细胞仪上检测。
3.4对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响。
调节小鼠脾淋巴细胞悬液的细胞浓度为5×105个/mL，每孔100μL脾细胞悬液于96孔板中。设置Con A组、LPS组、空白组对照组，Con A组加终浓度为5 μg/mL的Con A溶液和细胞悬液，LPS组加终浓度为10 μg/mL的LPS溶液和细胞悬液，空白对照组只加入细胞悬液，每组设3个副孔。于5% CO2、37℃培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，再在5%CO2、37℃培养箱中培养3 h，在酶联免疫检测仪上450 nm处测OD值。
细胞增殖率=（实验组OD值-对照组OD值）/实验组OD值×100%。
3.5脾淋巴细胞上清IL-2、IL-4、TNF-α、NO含量检测。
调节脾淋巴悬液的细胞浓度5×106个/mL，加入6孔培养板中，置于5%CO2、37℃恒温孵育箱中培养48 h，于转速为1000 rpm/min下离心5 min，收集各孔的培养上清。用ELISA法测定培养上清中细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的含量，具体的实验操作步骤按照ELISA试剂盒的说明书进行。采用硝酸还原酶法测定培养上清中NO的含量，具体的实验操作按照NO试剂盒操作。
3.6小鼠血清中IL-2、TNF-α含量检测。
用ELISA 法测定培养上清中细胞因子IL-2、TNF-α的含量，具体的实验操作步骤按照ELISA试剂盒的说明书进行。
3.7数据分析。
测定结果数据均用表示，用SPSS 19.0软件对结果分析，组间差异显著性采用单因素方差分析进行统计学分析，P＜0.05 为差异有显著性意义。
4、实验结果。
4.1黑灵芝功能饮料对脾淋巴细胞亚群的影响。
由实验结果可知，模型组与正常组相比，CD3+、CD4+、CD8+含量和CD4+/CD8+的比值均有明显下降。与模型组相比，黑灵芝饮料各剂量组的CD3+、CD4+ 、CD8+含量和CD4+/CD8+的比值均有所增加，且随着黑灵芝功能饮料的剂量增加而增加。说明黑灵芝免疫功能饮料能提高免疫抑制小鼠脾淋巴亚群CD3+、CD4+、CD8+的含量和CD4+/CD8+比值。
表1小鼠脾淋巴细胞亚群测定结果
注：与正常对照组相比：a表示差异显著（P<0.05），b表示差异极显著（P<0.01）；与模型对照组相比，c 表示差异显著(P<0.05)，d表示差异极显著(P<0.01)。
4.2黑灵芝功能饮料对ConA和LPS刺激小鼠脾T、B淋巴细胞增殖的影响。
由测定结果可知，与正常组对比，模型组小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖率明显降低。与模型组对比，饮料各组的小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖率有所增加，且随着剂量的增加而增加。说明黑灵芝功能饮料能提高免疫抑制小鼠脾淋巴细胞转化能力。
表2脾T、B淋巴细胞增殖率的测定结果
注：与正常对照组相比：a表示差异显著（P<0.05），b表示差异极显著（P<0.01）；与模型对照组相比，c 表示差异显著(P<0.05)，d表示差异极显著(P<0.01)。
4.3黑灵芝功能饮料脾淋巴培养细胞上清IL-2、IL-4、TNF-α、NO含量的影响。
由测定结果可知，与正常组对比，模型组IL-2、IL-4、TNF-α和NO的含量均有明显的下降。与模型组对比，中剂量和高剂量饮料组的IL-2、IL-4和NO含量均有明显增加，低剂量组无显著性差异，而各剂量饮料组的TNF-α含量均显著性增加，且随着剂量的增加而增加。表明黑灵芝功能饮料具有促进免疫抑制小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、TNF-α和NO的作用。
表3脾淋巴培养细胞上清IL-2、IL-4、TNF-α、NO含量的测定结果
注：与正常对照组相比：a表示差异显著（P<0.05），b表示差异极显著（P<0.01）；与模型对照组相比，c 表示差异显著（P<0.05），d表示差异极显著（P<0.01）。
4.4黑灵芝功能饮料对脾淋巴细胞血清IL-2和TNF-α含量的影响。
由测定结果可知，模型组相比于正常组小鼠血清中的IL-2和TNF-α的含量显著降低，而黑灵芝功能饮料组的各剂量组相比于模型组显著升高，且随着剂量的增加而增大。说明黑灵芝功能饮料能提高免疫抑制小鼠的血清中IL-2和TNF-α的含量。
表4小鼠血清中IL-2和TNF-α含量测定结果
注：与正常对照组相比：a表示差异显著（P<0.05），b表示差异极显著（P<0.01）；与模型对照组相比，c 表示差异显著(P<0.05)，d表示差异极显著(P<0.01)。
综上所述，以环磷酰胺诱导的免疫抑制模型小鼠研究实验中，黑灵芝功能饮料能提高模型小鼠胸腺指数及脾淋巴亚群CD3+、CD4+、CD8+的含量和CD4+/CD8+比值，促进脾淋巴细胞分化，提高脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、 TNF-α等细胞因子和NO的能力，提高血清中IL-2和TNF-α的含量水平。上述结果表明，以黑灵芝为原料研制的黑灵芝功能饮料具有提高机体免疫功能的作用。
Claims (3)
1.一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料，其特征是包括按以下比例的物质：
100mL黑灵芝浓缩澄清液，0.1-0.3g的赤藓糖醇、0.001-0.005g的甜菊糖、0.02-0.06g的柠檬酸，0.04g的羧甲基纤维素钠，0.03g的异抗坏血酸钠；
所述的黑灵芝浓缩澄清液为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料。
2.根据权利要求1所述的一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料，其特征是按100mL黑灵芝浓缩澄清液计，赤藓糖醇添加量为0.2g、甜菊糖添加量是为0.003g，柠檬酸添加量是为0.06g。
3.权利要求1或2所述的一种具有提高免疫功能的黑灵芝饮料的制备方法，其特征是按如下步骤：
（1）原料预处理：黑灵芝子实体预先破碎至2 cm方块，再于95-105℃干燥3-4 h后进行粉碎，粉碎后的黑灵芝呈绒状；
（2）黑灵芝提取液制备：将上述步骤（1）处理好的绒状黑灵芝，按照料液比（kg/L）为1:20的比例加入水，搅拌至灵芝全部被水浸没，于沸水浴下提取2-3 h，400目网筛过滤、收集滤液；剩下的黑灵芝滤渣再以料液比（kg/L）为1:7.5的比例加入水，慢速搅拌至灵芝均匀散开，沸水浴提取1-2 h，400目网筛过滤、收集滤液，合并滤液后再按转速4000-4500 r/min、时间10-15 min条件离心，得澄清金黄色黑灵芝提取液；
（3）黑灵芝提取液浓缩、澄清：将步骤（2）制备的黑灵芝提取液真空浓缩，得黑灵芝浓缩液；黑灵芝浓缩液再按转速3000-4000 r/min、时间10-15 min的条件进行离心，得黑灵芝浓缩澄清液，使其终浓度为每100 mL浓缩澄清液对应12 g黑灵芝原料；
（4）黑灵芝饮料调配：将黑灵芝浓缩澄清液、赤藓糖醇、甜菊糖、柠檬酸、羧甲基纤维素钠、异抗坏血酸钠按比例混合均匀后再进行均质处理，均质压力为15 MPa；
（5）灌装灭菌：将步骤（4）制备的黑灵芝饮料进行灌装，并于100℃条件下灭菌15 min，即得黑灵芝饮料成品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160824 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |