CN115851852A - 一种海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，属于提取工艺技术领域。其包括以下步骤：收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮粉碎，随后加入复合酶解液，其中复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶之间的质量比为1：3：1，酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种，其中酿酒酵母、红酵母及曲霉菌之间的质量比为5：2：1，接着发酵48h，离心取上清液，选择30000Da以下的透析膜透析，回收膜上滞留液，真空冷冻干燥后粉碎。制备的低分子寡糖提取物具有较高抗氧化性、刺激作物多种酶活性的功能。同时制备的低分子寡糖的分子量维持在2000Da左右。
Description
技术领域
本发明属于提取工艺技术领域，具体地说，涉及一种改进的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法。
背景技术
低分子量寡糖是海藻生物发酵的降解产物，具有比大分子量聚糖更好的溶解性、生物相容性。不同分子量的寡糖具有不同的生物生理活性，所以制备不同分子量的寡糖对于海藻提取物应用于食品、医药等方面具有重要意义。目前制备低分子量寡糖的方法主要有化学法和生物法，化学法反应过程剧烈，不容易获得低分子量寡糖而且产物结构被修饰。酶法降解只是打断寡糖的β(1-4)糖甙键，一般不改变寡糖分子的残基结构，而专一性酶价格昂贵、不易大量获得，不适合低分子量寡糖的工业化生产；使用自由酶水解制备低分子量寡糖，酶在反应后不能重复使用，不经济，反应条件苛刻，产物含有0.1％(w/w)糖与酶蛋白的复合物，这种产物由于可以导致热原反应而不能将其应用于食品、医药等领域。
中国发明专利CN201911356905.1公开了一种低分子量紫菜多糖及紫菜寡糖的酶解制备方法，以干坛紫菜为原料，采用水提醇沉法提取紫菜多糖，利用特异性的紫菜多糖酶降解紫菜多糖制备低分子量紫菜多糖及紫菜寡糖。为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：一种低分子量紫菜多糖及紫菜寡糖的酶解制备方法，以干坛紫菜为原料，采用水提醇沉法提取紫菜多糖，利用特异性的紫菜多糖酶降解紫菜多糖制备低分子量紫菜多糖及紫菜寡糖。质谱分析结果表明，降解产物为二糖、四糖及六糖，其中二糖为主要产物。本发明改进了上述不足，提供了一种生物发酵与酶解复合的操作方法，有利于保护寡糖的活性并降低分子量，适合大规模使用。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，制备的低分子寡糖提取物具有较高抗氧化性、刺激作物多种酶活性的功能。同时制备的低分子寡糖的分子量维持在2000Da左右。以黄瓜作物进行测试，添加本申请后的叶片电导率和丙二醛 MDA 的含量都比未加的对照要低，而且，在本申请中复合酶解液的各个组分及用料比，以及复合菌种的合适选择及比例关系，都起到协同增效来提高胁迫能力的作用。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 10份-25份，
谷氨酰胺 15份-25份，
酵母粉 20份-30份，
蛋白胨 8份-18份，
甘露醇 5份-12份，
磷酸钙 1份-2份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在现有技术的基础上，引入复合酶解液与复合菌种，并在制备方法中尽可能保留活性成分，同时引入生物发酵萃取的工艺，各个参数条件之间协同增效，显现出优异性能，表现出超好的抗氧化效果。同时各种复合酶与复合菌种之间协同增效，刺激作物多种酶活性，通过显著提升可溶性糖及还原糖的含量以增强小麦对低温胁迫的抵抗能力。此外，以黄瓜作物进行测试，幼苗叶片电导率和 MDA 含量是衡量盐分渗透胁迫程度的重要指标。在盐分渗透胁迫下，细胞膜的通透性增强，电导率提高。同时，盐分胁迫使膜脂不饱和脂肪发生过氧化，生成MDA，所以，MDA含量越高，说明膜脂受损害越重。在180mM 的 NaCl 胁迫下，添加本申请后的实施例1、实施例2、实施例3的叶片电导率和丙二醛 MDA 的含量都比未加的对照要低，而且，从对比例1-4也可以看出在本申请中复合酶解液的各个组分及用料比，以及复合菌种的合适选择及比例关系，都起到协同增效来提高胁迫能力的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 10份，
谷氨酰胺 25份，
酵母粉 20份，
蛋白胨 18份，
甘露醇 5份，
磷酸钙 2份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
实施例2
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 25份，
谷氨酰胺 15份，
酵母粉 30份，
蛋白胨 8份，
甘露醇 12份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
实施例3
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 18份，
谷氨酰胺 20份，
酵母粉 25份，
蛋白胨 14份，
甘露醇 8份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
对比例1
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：1：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 18份，
谷氨酰胺 20份，
酵母粉 25份，
蛋白胨 14份，
甘露醇 8份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
对比例2
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶之间的质量比为1：3；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 18份，
谷氨酰胺 20份，
酵母粉 25份，
蛋白胨 14份，
甘露醇 8份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
对比例3
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 18份，
谷氨酰胺 20份，
酵母粉 25份，
蛋白胨 14份，
甘露醇 8份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母之间的质量比为5：2。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
对比例4
海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 18份，
谷氨酰胺 20份，
酵母粉 25份，
蛋白胨 14份，
甘露醇 8份，
磷酸钙 1份。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、乳酸杆菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的乳酸杆菌之间的质量比为5：2。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
上述所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法中，
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
测试例
促作物抗胁迫（以小麦为例）
小麦种子用去离子水浸种8h后：播种于盆中，盆中装泥炭土与蛭石3：1（w/V）的混合介质，泥炭土中有机质含量72%，pH 6.5，总氮含量2.5%，总P2O5含量0.5%，总K2O含量0.32%，总Fe含量5%，C/N18，每个盆种植10棵麦苗。将麦苗置于气候室内生长，生长条件：昼夜温度20±1℃，昼夜时间16 h/8 h，光照强度400μmol·m-2·s-1，相对湿度60%。待麦苗出现第4片真叶（第三片叶全展）时，用15mL浓度为100mg/L的实施例1-3及对比例1-4制备的水溶液喷施叶片。喷施24h后将寡糖和对照处理的一半小麦幼苗移入到低温气候室进行低温胁迫。可溶性糖含量采用蒽酮法测定，还原糖含量用3,5-二硝基水杨酸法。
实施例1：25.6%、19.2%；
实施例2：26.2%、19.7%；
实施例3：26.4%、20.1%；
对比例1：22.1%、19.0%；
对比例2：21.2%、18.3%；
对比例3：17.9%、16.5%；
对比例4：15.4%、14.1%；
结合实验数据来看，本申请各种复合酶与复合菌种之间协同增效，刺激作物多种酶活性，通过显著提升可溶性糖及还原糖的含量以增强小麦对低温胁迫的抵抗能力。
促作物抗胁迫（以黄瓜为例）
黄瓜种子为华南农业大学园艺学院蔬菜系生产的华绿一号。挑选健康、干净、新鲜、饱满的黄瓜种子，用55℃的温水浸泡10分钟，自然冷却至室温继续浸泡5小时。然后播种在225ml装有干净沙子的纸杯内，每杯播三粒种子，浇透清水，置于光照培养箱内。昼夜温差为28- 16℃，光周期为12时/12时。待芽长出后，进行间苗，每杯保留两株苗。此后，每两天浇灌一次1/2的Hoagland营养液，待幼苗长至一叶一心时，开始在营养液中添加0、5、10、20mM的本申请实施例1-3及对比例1-4制备的相应提取物作为不同的处理，连续处理两次后，在以上各处理中再加入180mM的NaCl浇灌幼苗，渗透胁迫第4天后开始测相关的指标。其中指标包括叶片细胞质膜透性的测定与MDA含量的测定。
其中叶片细胞质膜透性的测定方法如下：
将叶子用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干叶片表面的水分，在叶子上取直径为5mm 的圆片 20 个，放入粗试管中加入双蒸水 10ml，真空抽透，抽放气三次，以使水与叶片紧密接触而电解质易于渗出，30 分钟后取出，在室温下静置两小时，用电导仪测电导值，为原电导值。将样品材料高温杀死 ( 100℃，10 分钟) ，再测电导值，为总电导值。电导率 =原电导值 / 总电导值×100%。
其中MDA含量的测定方法如下：
参考如下文献：“胡慧芳，马有会. 外源海藻糖提高黄瓜抗盐性的初步研究[J].长治学院学报，2007(5).”。
表1 测试结果
| 叶片导电率（%） | MDA含量（umol/L） | |
| 对照 | 30.6 | 0.331 |
| 实施例1 | 23.8 | 0.231 |
| 实施例2 | 23.2 | 0.225 |
| 实施例3 | 22.9 | 0.221 |
| 对比例1 | 28.4 | 0.256 |
| 对比例2 | 28.6 | 0.288 |
| 对比例3 | 29.4 | 0.294 |
| 对比例4 | 30.3 | 0.311 |
同时，以黄瓜作物进行测试，幼苗叶片电导率和 MDA 含量是衡量盐分渗透胁迫程度的重要指标。在盐分渗透胁迫下，细胞膜的通透性增强，电导率提高。同时，盐分胁迫使膜脂不饱和脂肪发生过氧化，生成MDA，所以，MDA含量越高，说明膜脂受损害越重。从上表1知，在180mM 的 NaCl 胁迫下，添加本申请后的实施例1、实施例2、实施例3的叶片电导率和丙二醛 MDA 的含量都比未加的对照要低，而且，从对比例1-4也可以看出在本申请中复合酶解液的各个组分及用料比，以及复合菌种的合适选择及比例关系，都起到协同增效来提高胁迫能力的作用。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (10)
1.一种海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
其包括以下步骤：
（1）收集海藻细胞，超速离心沉淀，使用液氮进行粉碎；
（2）对于步骤（1）粉碎后得到的粉末，加入复合酶解液进行处理；
（3）酶解后离心取上清液，制备海藻提取物基质并加入复合菌种进行发酵处理；
（4）对步骤（3）发酵处理后得到的溶液，离心取上清液，并进行透析，最后真空冷冻干燥，即可。
2.根据权利要求1所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的超速离心的转速为30000rpm；
步骤（1）中所述的液氮粉碎后的粒度为2000目。
3.根据权利要求1所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的粉末与所述的复合酶解液之间的质量体积比为5：23；
步骤（2）中所述的复合酶解液的质量浓度为20mg/L。
4.根据权利要求3所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的复合酶解液包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，所述的纤维素酶、所述的半纤维素酶、所述的果胶酶之间的质量比为1：3：1；
步骤（2）中所述的复合酶解液的酶解温度为40℃。
5.根据权利要求1所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（3）中酶解后离心的转速为20000rpm；
步骤（3）中所述的海藻提取物基质，以重量份计，包括以下组分：
葡萄糖 10份-25份，
谷氨酰胺 15份-25份，
酵母粉 20份-30份，
蛋白胨 8份-18份，
甘露醇 5份-12份，
磷酸钙 1份-2份。
6.根据权利要求5所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的复合菌种包括酿酒酵母、红酵母及曲霉菌，所述的复合菌种与所述的海藻提取物基质之间的质量比为1：80。
7.根据权利要求6所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的酿酒酵母、所述的红酵母及所述的曲霉菌之间的质量比为5：2：1。
8.根据权利要求7所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（3）中发酵处理的时间为48h；
步骤（3）中发酵处理的温度为37℃。
9.根据权利要求1所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（4）中离心的离心力为12000g；
步骤（4）中透析的透析膜的孔径为30000Da以下；
步骤（4）中透析后回收膜上滞留液。
10.根据权利要求1所述的海藻生物发酵产物低分子寡糖提取方法，其特征在于：
步骤（4）中真空冷冻干燥的压力为1Pa；
步骤（4）中真空冷冻干燥的时间为24h。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101891904A (zh) * | 2010-06-23 | 2010-11-24 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种海带寡糖及其制备方法和它的应用 |
| CN105622293A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-06-01 | 青岛海大生物集团有限公司 | 一种酶解发酵法制备抗盐碱专用海藻生物水溶肥料的方法 |
| CN106755188A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-05-31 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种褐藻寡糖单体的制备方法及褐藻寡糖 |
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| CN111876453A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-03 | 威海康博尔生物药业有限公司 | 一种海藻寡糖的制备方法 |
-
2023
- 2023-02-21 CN CN202310142189.7A patent/CN115851852A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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