CN102585023B

CN102585023B - 海参多糖的电离辐射降解法

Info

Publication number: CN102585023B
Application number: CN201210007582.7A
Authority: CN
Inventors: 陈士国; 吴念; 刘东红; 胡亚芹; 陈建初; 孙玉敬; 吴丹; 叶兴乾
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-03
Filing date: 2012-01-03
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2032-01-03
Also published as: CN102585023A

Abstract

本发明公开了一种海参多糖的电离辐射降解法，依次包括以下步骤：1)、将海参多糖完全溶于蒸馏水中，得到海参多糖的水溶液；2)、于常温下采用⁶⁰Co进行电离辐射降解海参多糖水溶液，吸收剂量为2kGy～200kGy；3)、将步骤2)的所得物经静置沉降或离心除去非降解沉淀得到清液；将清液干燥，得到低分子量的寡糖。采用本发明方法处理后所得的产物，分子量均匀、集中，分子量分布指数接近于1，产品的均一性较好。

Description

海参多糖的电离辐射降解法

技术领域

本发明涉及一种多糖类化合物的降解法，特别是涉及一种电离辐射降解海参多糖的方法。

背景技术

海参多糖主要有海参硫酸软骨素(sea cucumber chondroitin sulfate，SC-CHS)(J BiolChem 1996，271，(39)，23973-84；J Biol Chem 1988，263，(34)，18176-83；Journal ofBiological Chemistry 1991，266，(21)，13530-13536)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)(Carbohydr Res 1994，255，225-40)两种多糖，其中SC-CHS是从海参体壁中提取的一种多糖，可来源于多种海参，虽其化学结构不尽相同，但生物学活性相似。Yutaka Kariya(JBiochem 2002，132，(2)，335-43)对日本刺参中SC-CHS的进行提取，糖组成分析表明其中岩藻糖(Fuc)∶乙酰氨基半乳糖(GalNAc)∶葡萄糖醛酸(GlcA)∶硫酸根(SO₄ ^2-)为2.5∶0.47∶0.53∶1.73。Paulo Mourao(J Biol Chem 1996，271，(39)，23973-84)课题组提纯了L.grisea中的SC-CHS，糖组成分析表明其含有Fuc∶GalNAc∶GlcA∶SO₄ ^2-约为1∶1∶1∶2.7。

硫酸岩藻糖分支结构与SC-CHS的多种生物学活性相关，其特异性的空间排列是SC-CHS抗凝活性的基础，SC-CHS延长激活的部分凝血活酶时间(APTT)的作用明显强于具有相同硫酸化程度的线性岩藻糖同源性多聚体(Thromb Haemost 2008，100，(3)，420-8)。脱岩藻糖和脱硫酸酯后，SC-CHS丧失抗凝作用。Mourao(Thromb Res 2001，102，(2)，167-76；Thromb Res 1999，93，(3)，129-35)等在兔静脉血栓形成模型中进一步验证了硫酸岩藻糖支链对SC-CHS抗血栓活性的重要性。用人活化血清激活内源性凝血途径和纯化的FVIII激活外源性凝血途径后，静脉注射SC-CHS可减少血栓形成，而去除硫酸岩藻糖分支后，SC-CHS作用消失(Blood 2006，107，(10)，3876；Br J Haematol 1998，101，(4)，647-52)。硫酸岩藻糖支链还与SC-CHS降血脂(Atherosclerosis 1996，126，(2)，185-195)、促进脐静脉内皮细胞增殖和移位、促进血管再生作用相关(Mol Cancer Res 2002，1，(2)，96-102)。Lubor Borsig(J Biol Chem 2007，282，(20)，14984-91)等人发现支链岩藻糖还与其抑癌活性密切相关。

因此制备富含岩藻糖支链的低分子量海参硫酸软骨素具有重要的意义。目前海参硫酸软骨素(SC-CHS)的降解方法常见的有用稀酸法和氧化降解法。而先前Yutaka Kariya(JBiochem 2002，132，(2)，335-43)和Paulo Mourao(J Biol Chem 1996，271，(39)，23973-84)等课题组均采用了稀酸法制备寡糖方法，容易导致硫酸基和支链硫酸岩藻糖的脱落，影响相关的活性。而氧化分解法操作繁琐，过程难以控制，重现性差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、效率高的海参多糖的电离辐射降解法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种海参多糖的电离辐射降解法，依次包括以下步骤：

1)、将海参多糖完全溶于蒸馏水中，得到海参多糖的水溶液；

2)、于常温下采用⁶⁰Co进行电离辐射降解海参多糖水溶液，吸收剂量为2kGy～200kGy；

3)、将步骤2)的所得物经静置沉降或离心除去非降解沉淀(蛋白质和残渣等)得到清液；将所述清液干燥，得到低分子量的寡糖。

作为本发明的海参多糖的电离辐射降解法的改进：海参多糖的水溶液中海参多糖的质量浓度为0.1％～10％。

作为本发明的海参多糖的电离辐射降解法的进一步改进：海参多糖为海参硫酸软骨素或海参岩藻聚糖硫酸酯。

作为本发明的海参多糖的电离辐射降解法的进一步改进：辐射剂量率为45kGy/min。

作为本发明的海参多糖的电离辐射降解法的进一步改进：海参多糖的水溶液中海参多糖的质量浓度为1％～2％，吸收剂量为20kGy～100kGy。

本发明的海参多糖的辐照降解法，其实质在于利用一定条件的电离辐射使海参多糖的糖苷键发生断裂，进而实现多糖降解。

本发明的海参多糖的辐照降解法，适合于所有海参多糖。经本发明的方法处理后，即，海参多糖水溶液辐照后所得低分子量寡糖的分子量分布指数范围1.20～1.40。

本发明的海参多糖的电离辐射降解法具有如下优点：

1、不引入无机盐，降解后无需脱盐即可经干燥得到最终产品；

2、不导致活性链的断裂或活性基团的脱落；可实现多糖分子量的连续均匀下降，通过控制辐照剂量及多糖浓度即可获得不同分子量的降解产物，且降解产物分子量分布指数接近于1；

3、不使用任何添加剂；方法稳定，重现性好；工艺简单，容易控制；节约能源、加工效率高；无环境污染。

综上所述，与传统的多糖降解方法如酸降解法、氧化降解法等相比，本法无需酸碱，故无后续中和、脱盐步骤，简化操作的同时减少了后续处理对产物的损耗，且不会导致多糖活性链的断裂或活性基团的脱落，极大有利于降解产物尤其是寡糖的制备；对降解产物分子量的控制可通过调节辐照剂量及多糖浓度实现，能够满足各分子量降解产物制备的需求，且产物分子量均匀、集中，分子量分布指数接近于1，产品的均一性较好。该法还同时具有重现性好、操作简便、成本低的优点。

具体实施方式

以下实施例中所用的菲律宾海参硫酸软骨素可根据2010年8月公开的陈士国《高温¹HNMR鉴别8种海参硫酸软骨素》中海参多糖的提取方法制备而得。

实施例1：海参多糖的电离辐射降解法：

称取四份菲律宾海参硫酸软骨素(每份均为50mg)，分别配制成水溶液，质量百分比浓度分别为：1％、2％、5％、10％。均用电离辐射处理，吸收剂量为50kGy，辐射剂量率为45kGy/min；辐照后静置1.5小时，非降解物沉降到容器底部，取上清液。

将上述4份上清液分别真空冷冻干燥(-40℃)，从而分别得低分子的硫酸软骨素(即，低分子量的寡糖)42mg、39mg、40mg、35mg。

采用HPLC高效凝胶渗透色谱(TSK3000，4000)测定不同浓度硫酸软骨素同一辐照剂量降解后的相对分子量及数均分子量、重均分子量、分子量分布指数。具体如表1所示。

表1

浓度(质量百分比)	未辐照	1％	2％	5％	10％
						数均分子量(KDa)	69.40	3.26	4.04	4.97	6.34
重均分子量(KDa)	122.18	4.00	4.89	6.51	8.68
						分子量分布指数	1.76	1.22	1.21	1.31	1.37

注：未辐照是指原始的菲律宾海参硫酸软骨素。

实施例2：海参多糖的电离辐射降解法：

称取5份菲律宾海参硫酸软骨素(每份均为50mg)，配制成水溶液，质量百分比浓度均为1％。分别用5种不同剂量电离辐射处理，吸收剂量依次为10KGy，20KGy，50KGy，100KGy，150KGy，辐射剂量率为45kGy/min；辐照静置后1.5小时，非降解物沉降到容器底部，取上清液。

将上述5份上清液分别真空冷冻干燥(-40℃)，从而分别得低分子的硫酸软骨素(即，低分子量的寡糖)39mg、38mg、42mg、41mg、37mg。

采用HPLC高效凝胶渗透色谱(TSK3000)测定不同辐照剂量下同一浓度硫酸软骨素降解后的相对分子量。具体如表2所示。

表2

辐照剂量(KGy)	未辐照	10	20	50	100	150
							数均分子量(KDa)	69.40	4.88	3.90	3.26	2.32	1.67
重均分子量(KDa)	122.18	6.45	4.94	4.00	2.90	2.19
							分子量分布指数	1.76	1.32	1.26	1.22	1.24	1.32

对比例1：将50mg菲律宾海参硫酸软骨素溶于1mL 0.2mol/L硫酸溶液中(使糖浓度为10mg/mL)，100℃水解1～6h，硫酸水解液采用Ba(OH)₂中和之后，取上清液分别真空冷冻干燥(-40℃)，从而分别得低分子的硫酸软骨素(3h)43mg、(6h)40mg。

采用高效液相色谱检测水解程度。具体如表3所示。

表3

酸降解时间	0h	3h	6h
				数均分子量(KDa)	69.40	10.23	6.49
重均分子量(KDa)	122.18	16.46	9.92
				分子量分布指数	1.76	1.61	1.53

对比例2：取菲律宾海参硫酸软骨素50mg与0.08gCu(AC)₂.H₂0一起溶于蒸馏水中，用2mol/L的NaOH调pH至7.5左右。加入9％的H₂O₂溶液，用水浴保持反应温度80℃恒定，反应中不断加入0.3mol/LNaOH保持反应液pH为7.5，5h后停止，加入H₂O₂。将反应液在60℃下放置一段时间使剩余H₂O₂全部消耗掉。当钛试剂测试反应液中已无H₂O₂后，将反应液中加入0.3mL 2mol/LNaOH，离心出去Cu²⁺。所得样品真空冷冻干燥后，两次脱盐，采用高效液相色谱检测水解程度。具体如表4所示。

表4

氧化降解时间	0h	0.5h	3h
				数均分子量(KDa)	69.40	8.00	5.02
重均分子量(KDa)	122.18	11.85	7.18
				分子量分布指数	1.76	1.48	1.43

对比例3：固态电离辐射处理菲律宾海参硫酸软骨素。分别取4份菲律宾海参硫酸软骨素(每份均为50mg)直接进行不同剂量电离辐射处理，吸收剂量依次为10KGy，20KGy，50KGy，100KGy，辐射剂量率为45kGy/min。采用HPLC高效凝胶渗透色谱(TSK3000)测定不同辐照剂量下同一浓度硫酸软骨素降解后的相对分子量。具体如表5所示。

表5

辐照剂量(KGy)	未辐照	10	20	50	100
						数均分子量(KDa)	69.40	68.9	58.45	40.67	21.26
重均分子量(KDa)	122.18	118.50	98.78	69.14	35.30
						分子量分布指数	1.76	1.72	1.69	1.70	1.66

活性检测实验：

精确称取各样品(实施例1～实施例2、对比例1～对比例3所得)各1.28mg溶于1mlTris-HCl缓冲液中，逐步稀释成浓度640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml待用。样品抑制内源性f.Xase活性检测：采用96孔板，各孔分别加入系列浓度的30μl的受试品溶液或对照溶剂后，顺次加入30μl f.VIII(2IU/ml)，30μl f.IXa(含f.IIa、PC/PS、Ca²⁺)，37℃孵育2min；加入30μl f.X(pH 8.5Tris-BSA缓冲液，含fibrin polymerization inhibitor)，精确孵育1分钟；加入30μl SXa-11(6mg/ml)，酶标仪检测OD 405nm，进行间隔时间的连续检测。具体如表6所示。

表6

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.海参多糖的电离辐射降解法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、将海参多糖完全溶于蒸馏水中，得到海参多糖的水溶液；所述海参多糖的水溶液中海参多糖的质量浓度为1％～2％；

所述海参多糖为海参硫酸软骨素；

2)、于常温下采用⁶⁰Co进行电离辐射降解海参多糖水溶液，吸收剂量为20kGy～100kGy；

3)、将步骤2)的所得物经静置沉降或离心除去非降解沉淀得到清液；将所述清液干燥，得到低分子量的寡糖。

2.根据权利要求1所述的海参多糖的电离辐射降解法，其特征是：所述辐射剂量率为45kGy/min。

3.根据权利要求2所述的海参多糖的电离辐射降解法，其特征是：所述海参多糖的水溶液中海参多糖的质量浓度为1％，吸收剂量为100kGy。