CN112375154A - 一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法 - Google Patents

一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其具体步骤如下：首先以电子束辐照褐藻粉，然后加入酮类溶剂，过滤后取滤渣；利用热水浸提滤渣，取滤液减压浓缩后加入醇类溶剂，过滤并取沉淀；将沉淀溶解于水中，利用阴离子交换树脂提纯，减压浓缩后即获得所述褐藻多糖硫酸酯；本申请首次应用电子辐照技术提取褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，提高了褐藻多糖硫酸酯的提取率，同时降低了水提的温度，确保褐藻多糖硫酸酯大分子结构完整，为后续褐藻多糖硫酸酯的进一步开发利用奠定了基础。

Description

一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法
技术领域
本申请涉及化合物制备领域，特别是一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法。
背景技术
我国是世界上海带(Laminaria japonica)养殖量最大的国家，并作为传统 食品和中药原料。海带等褐藻中含有丰富的岩藻聚糖硫酸酯(Fuciodan)，除传 统的药用外，在传统的加工中含有大量的岩藻聚糖硫酸酷的残渣，通常都没有进 一步的加工利用而被丢弃,这不仅污染了自然环境,还使宝贵的天然资源没有得 到充分地利用,造成极大的浪费。
现有研究发现从褐藻中提取的褐藻多糖硫酸酯(又称岩藻聚糖硫酸酯、岩藻 多糖硫酸酯等)是一种褐藻中特有的含有硫酸酯的天然水溶性活性多糖。岩藻聚 糖硫酸酯是一种含有硫酸醋的水溶性杂聚糖，是褐藻中特有的一种化学组分。研 究发现岩藻聚糖硫酸酯在医学方面具有独特的功效，具有抗凝血、抗肿瘤、抗病 毒、抗血栓、抗HIV、提高免疫力、降血脂等生物活性，是陆地植物成分所无法 比拟的，而且岩藻聚糖硫酸酯的化学性质尤其是分子量、硫酸根含量和岩藻糖含 量对它的活性影响很大，因此，岩藻聚糖硫酸酯成为当今天然海洋药物主攻的重 点之一。而且岩藻聚糖硫酸酯来源丰富，成本低廉，在日本、美国作为预防和治 疗癌症及血栓疾病的药已进入市场。德国和挪威也分别开展了该物质在抗HIV及抑制白细胞生长方面的研究。
岩藻多聚糖硫酸酯是一类独特的结合有硫酸基团的多糖，其单糖主要由L- 岩藻糖及木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖、少数含有阿拉伯糖组成，其 糖醛酸以葡萄糖醛酸或甘露糖醛酸为主，有的含有半乳糖醛酸，其岩藻糖含量占 12.9％-4.62％、硫酸基含量为14.3％-38.1％和糖醛酸含量0.62％-20.2％。通过NMR 分析，发现其碳链骨架是α-l,3连接岩藻糖；有高度的分支，分支主要是α-1,2 连接的单一单元。硫酸酯基主要在O-4位上，部分在O-2位上，部分α-1,3连 接的岩藻糖残基O-2位已被乙酰化。岩藻聚糖硫酸酯[(C6H10O7S)n]的分子量从几 万到几十万不等。
目前褐藻多糖硫酸酯常规提取分离纯化工艺步骤如下(以海带为例)：海带 →干燥→粉碎→海带粉→加丙酮→过滤→滤渣→干燥→热水提取(80～95℃)→ 滤液→减压浓缩→乙醇→沉淀→褐藻多糖硫酸酯粗品→阴离子交换树脂→褐藻 多糖硫酸酯精品(Nishino,T.et al:Carbohydr.Res.1989,186:119-129.)。 由于海带质地坚韧，细胞壁较厚，现有的海带岩藻聚糖硫酸酯常规提取分离纯化 工艺和方法提取率不高，常规的提取率只有4～8％不等，同时，其硫酸酯生物活 性基团遇酸或碱或遇长时间的高温不稳定，而现有80-95℃的水提方式，可能对 部分硫酸酯基团产生水解或破坏，故传统的提取分离纯化工艺方法容易使其失去 硫酸酯基而失去生物活性，进而限制了褐藻多糖硫酸酯的应用。因此，如何在保 证硫酸酯大分子基团完整性的前提下提高其提取效率，已成为本领域亟待解决的 技术难题。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一种利用电子束辐照技术提取海带岩藻聚糖硫酸 酯的方法，提取率较传统的工艺和方法提高至2～3倍，并能保持硫酸酯基团原有 结构和组成不被破坏。本申请是通过如下技术方案实现的：
一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其具体步骤如下：
1)以电子束辐照褐藻粉(优选60目)，获得辐照后的褐藻粉；
2)向辐照后的褐藻粉中加入酮类溶剂，过滤并取滤渣，干燥，获得干燥后的滤 渣；
3)向干燥后的滤渣中加入热水浸提，取滤液减压浓缩后，加入醇类溶剂，其沉 淀即为褐藻多糖硫酸酯粗品；
1)将褐藻多糖硫酸酯粗品溶解于水中，利用阴离子交换树脂提纯，减压浓缩后 即获得所述褐藻多糖硫酸酯。
进一步，上述褐藻多糖硫酸酯的提取方法中，步骤2)所述的酮类溶剂为丙酮。
进一步，上述褐藻多糖硫酸酯的提取方法中，步骤3)所述的醇类溶剂为乙醇。
进一步，上述褐藻多糖硫酸酯的提取方法中，步骤1)所述以电子束辐照褐藻 粉是指，以5-10kGy的剂量进行辐照。
进一步，上述褐藻多糖硫酸酯的提取方法中，步骤3)所述热水的温度为65-70℃，浸提时间为2-12h。
进一步，上述褐藻多糖硫酸酯的提取方法中，步骤1)所述褐藻粉为海带粉、
本申请首次应用电子辐照技术提取褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，提高了褐藻 多糖硫酸酯的提取率，同时降低了水提的温度，确保褐藻多糖硫酸酯大分子结构 完整，为后续褐藻多糖硫酸酯的应用开发奠定了基础。
附图说明
图1为实施例2电子束辐照对海带褐藻多糖硫酸酯提取量的影响结果示意图。
图2为海带通过电子束辐照(10kGy)处理后提取分离纯化得到的海带褐岩藻聚糖硫酸酯多糖红外吸收光谱图(IR,KBr压片)。
具体实施方式
实施例中电子辐照设备为金辉辐射10MeV/20KW大功率辐照加速器，购自中核 (兴化)辐照技术有限公司。
实施例1提取带褐藻多糖硫酸酯
工艺一：采用海带褐藻多糖硫酸酯常规提取分离纯化工艺(具体提取步骤参 见文献“Nishino,T.et al:Carbohydr.Res.1989,186:119-129.”)，其制备 方法如下：
海带(市场购买，100克)→干燥(60℃)→粉碎→海带粉(60目)→加 丙酮(2,000mL,分三次浸泡，每次12h)→过滤→滤渣→干燥(60℃)→热水 提取(水4L，分三次浸泡，80～95℃)→滤液→减压浓缩(65℃以下)→乙 醇(乙醇浓度分别达到30、70、85％)→沉淀→褐藻多糖硫酸酯粗品→配成3％ 的多糖水溶液→阴离子交换树脂(Q-Sepharose FF的阴离子交换树脂，分别用 H20、1.0mol/L和2.0mol/L的NaCI溶液进行分步洗脱)→减压浓缩(65℃ 以下)→冷冻干燥→褐藻多糖硫酸酯精品(褐色粉末)；
工艺二：利用电子束辐照技术提取褐藻多糖硫酸酯
海带(市场购买，100克)→干燥(60℃)→粉碎→海带粉(60目)→电 子束辐照(5kGy)→加丙酮(2,000mL,分三次浸泡，每次12h)→取三次浸泡 液一并进行过滤→滤渣→干燥(60℃)→热水提取(水4L，分三次浸泡，65～ 70℃，三次总浸泡时间分分别为0、2、4、8、10、12h)→取三次浸泡液一并进 行过滤，取滤液→减压浓缩(65℃以下)→乙醇(乙醇浓度分别达到30、70、 85％)→沉淀(褐藻多糖硫酸酯粗品)→加水配成3％的多糖水溶液→阴离子交换 树脂(Q-Sepharose FF的阴离子交换树脂，分别用H20、1.0mol/L和2.0mol/L 的NaCI溶液进行分步洗脱)→减压浓缩(65℃以下)→冷冻(约-60℃)干燥 →褐藻多糖硫酸酯精品。
工艺三：利用电子束辐照技术提取褐藻多糖硫酸酯
除采用10kGy剂量进行电子束辐照外，工艺三其他提取步骤方法与工艺二相同。
实施例2海带褐藻多糖硫酸酯提取工艺比较
1、分别按实施例1中工艺一、二、三海带褐藻多糖硫酸酯提取分离纯化工艺进行实验，比较电子束辐照前后海带褐藻多糖硫酸酯精品重量(mg)。
检测结果见表1，2，3及图1：
表1海带粉(60目，100克)无电子束辐照(工艺一)褐藻多糖硫酸酯重量(克)
Figure BDA0002756701840000041
表2海带粉(60目,100克)电子束辐照(5kGv)(工艺二)褐藻岩藻多糠硫酸酯 重量(克)
Figure RE-GDA0002840364170000042
表3海带粉(60目，100克)电子束辐照(10kGv)(工艺二)褐藻多糖硫酸酯重 量(克)
Figure RE-GDA0002840364170000043
Figure RE-GDA0002840364170000051
表1、2、3及图1的结果表明，海带粉经电子束辐照(5～10kGy)后，能使海带 褐藻多糖硫酸酯的提取率增至2倍以上。
2、海带褐藻多糖硫酸酯纯度测定
按文献苯酚-硫酸法(张惟杰:糖复合物生化研究技术.第一版.浙江:浙江 大学出版社,1994,16-20.)分别对提取工艺一、二所得到的海带褐藻多糖硫酸 酯进行纯度测定，测定结果如表4所示。
表4.海带岩藻多糖硫酸酯纯度(％)
Figure BDA0002756701840000052
3、海带褐藻多糖硫酸酯硫酸根基团含量测定：
按文献方法(Dodgson,K.S.；et al:A note on the determination of estersulfate content of sulfated polysaccharides.Bioehem.J.1962, 84:106-110.)分别对提取工艺一、二所得到的海带褐藻多糖硫酸酯进行硫酸根基 团含量测定，测定结果见如表5所示：
表5.海带岩藻多糖硫酸酯硫酸根含量分析(％)
Figure BDA0002756701840000053
4、海带褐藻多糖硫酸酯结构确定：
实施例2中海带经电子束辐照(10kGy)所获得的海带褐藻多糖硫酸酯的红外吸 收光谱(IR,KBr压片)如图2所示：
由图2可见，利用辐照技术提取后的海带褐藻多糖硫酸酯的红外吸收光谱 (IR)与文献(姚兰等：食品研究与开发，2006,27(7):89-91)完全一致，表明 海带褐藻多糖硫酸酯结构经电子束辐照(10kGy)后无变化，保持原有结构，即 电子束辐照(10kGy)对海带褐藻多糖硫酸酯结构无影响。
上述检测结果显示，电子束辐照(5～10kGy)能使海带褐藻多糖硫酸酯的提 取率增至2倍以上，同时，对海带褐藻多糖硫酸酯的结构没有影响。

Claims (6)

1.一种褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)以电子束辐照褐藻粉后，加入酮类溶剂，过滤后取滤渣；
2)向滤渣中加入热水浸提，过滤，取滤液减压浓缩后加入醇类溶剂，取沉淀；
3)将沉淀溶解于水中，利用阴离子交换树脂提纯，减压浓缩后即获得所述褐藻多糖硫酸酯。
2.根据权利要求1所述褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，步骤1)所述以电子束辐照海带粉是指，以5-10kGy的剂量进行辐照。
3.根据权利要求2所述褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，步骤2)所述的酮类溶剂丙酮。
4.根据权利要求2所述褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，步骤3)所述的醇类溶剂为乙醇。
5.根据权利要求2所述褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，步骤2)所述热水的温度为65-70℃。
6.根据权利要求2所述褐藻多糖硫酸酯的提取方法，其特征在于，步骤2)所述浸提时间为2-12h。
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