CN108623703A - 一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌技术领域，提供一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料；将所述辐照废料与水混合，加热提取，固液分离，得到粗多糖提取液；将粗多糖提取液干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。本发明用于提取的原料为灵芝孢子粉萃取废料，该废料中灵芝多糖的含量不足1％，且其中能溶于水、有机试剂的物质含量极少。采用本发明制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖中，活性多糖含量为78％以上，与以灵芝孢子粉为原料提取的灵芝孢子多糖相比，同样具有优秀的免疫调节功能以及保湿效果，可广泛应用于功能性食品、保健食品、药品及化妆品等领域。

Description

一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法
技术领域
本发明涉及真菌有效物质提取的技术领域，具体涉及一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法。
背景技术
灵芝孢子粉是灵芝(Ganoderma lucidum)生长成熟期从菌褶中弹射出来的极其微小的孢子，具有灵芝的全部遗传活性物质。将灵芝孢子收集后呈细末状，通称为灵芝孢子粉，其主要成分有多糖、腺嘌呤、核苷酸、有机锗、三萜类、麦角甾醇、维生素、胡萝卜素以及微量元素等，具有抗肿瘤、耐缺氧、提高免疫力等功效。其中灵芝孢子多糖对人体免疫系统具有调节作用，能够显著升高环磷酰胺免疫抑制小鼠的廓清指数活性。灵芝孢子多糖还具有良好的保湿作用，其保湿效果优于本领域常用的透明质酸。
现有研究表明，灵芝孢子粉中的有效物质不经过破壁难以获得，所以目前灵芝孢子粉的提取工艺流程大致为：灵芝孢子粉破壁-水加热提取-脱脂处理，剩余的细胞壁。由于在灵芝孢子粉有效物质的提取过程中经过了水和脱脂处理，废料中所含有的水和有机试剂可溶性成分较少，难以进一步利用，目前作为废物处理，造成了极大的资源浪费。
虽然一些研究对灵芝孢子粉提取后剩余的废料回收利用方式进行了一些研究，但是其研究针对的灵芝孢子粉萃取废料中多糖含量相对较高，比如贾红岩等人以脱脂提取后的灵芝孢子粉废料为原料进行灵芝孢子粗多糖提取，其废料中多糖含量在13.93％～19.94％之间(贾红岩,王晨光,张忠,等.灵芝孢子粉废料中粗多糖提取工艺的研究[J].食品工业科技,2016(11).)，提取难度相对较低。而灵芝孢子粉经过破壁、水提以及脱脂步骤后剩余的废料中多糖含量在1％以下，其提取难度较大，对于如何适用于工业化生产也提出了挑战。
发明内容
为了解决以经过水提、脱脂后的灵芝孢子粉萃取废料中有效物质难以取得的问题，本发明提供了一种以活性多糖含量在1％以下的灵芝孢子粉萃取废料为原料制备灵芝孢子多糖的方法。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，包括以下步骤：
(1)对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料；
所述灵芝孢子粉萃取废料为灵芝孢子粉经过破壁、水提和脱脂后剩余的灵芝孢子粉壁壳；
(2)将所述辐照废料与水混合，加热提取，固液分离，得到粗多糖提取液；
(3)将粗多糖提取液干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
优选的，所述步骤(1)中，辐照至剂量800kGy，得到辐照废料。
优选的，所述步骤(2)中辐照废料与水的质量体积比为1kg:30～40L。
优选的，所述步骤(2)中加热提取的温度为80～100℃，加热提取的时间为1～4h。
优选的，所述步骤(3)中干燥粗多糖提取液的方式为：将所述粗多糖提取液浓缩，得到的浓缩物冷冻干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
优选的，所述步骤(3)中，所述浓缩的程度以浓缩物与辐照废料的用量计，所述辐照废料的质量与所述浓缩物体积的比为1kg:1～2L。
优选的，步骤(3)所述冷冻干燥还包括预冷冻。
优选的，所述预冷冻的步骤为：将浓缩物置于-10～-25℃下冷冻1～3h，再在-70～-85℃下第二次冷冻2～4h，将第二次冷冻结束后得到的预冷冻料送入冷冻干燥机冻干。
优选的，所述冷冻干燥机中冻干的条件为：温度-80～-65℃，真空度0.8～1.5mbar。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料；将所述辐照废料与水混合，加热提取，固液分离，得到粗多糖提取液；将粗多糖提取液干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。本发明用于提取的原料为灵芝孢子粉萃取废料，该废料中可溶性灵芝多糖的含量不足1％，且灵芝孢子粉经过水提和脱脂处理后能溶于水、有机试剂的物质含量极少。本发明所述方法先对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照破坏细胞结构，使细胞内部的活性多糖进一步得到释放，能够显著提高废料中的活性多糖含量，辐照废料中活性多糖含量大于7％，使得辐照废料中的活性多糖含量与灵芝孢子粉原料(灵芝孢子粉原料中活性多糖含量一般在2％左右)所含活性多糖相比提高了3倍以上，降低多糖提取难度。
本发明所述制备方法的灵芝孢子粉壁壳粗多糖得率为6％以上。采用本发明提供的制备方法得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖中多糖含量为78％以上，与以灵芝孢子粉为原料提取得到的灵芝灵芝孢子粉壁壳粗多糖同样具有保湿效果优于透明质酸的功能，同样具有优秀的免疫调节功能以及保湿效果，可广泛应用于功能性食品、保健食品、药品及化妆品等领域，还提供了一种新的获取具有生物活性的灵芝孢子多糖的途径。
附图说明
图1为实施例5对灵芝孢子粉壁壳粗多糖的分子量分析图；
图2灵芝孢子粉壁壳粗多糖吸湿率与时间的变化关系图(RH＝43％)；
图3灵芝孢子粉壁壳粗多糖吸湿率与时间的变化关系图(RH＝81％)；
图4灵芝孢子粉壁壳粗多糖保湿率与时间的变化关系图(硅胶环境)。
具体实施方式
本发明提供了一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，包括以下步骤：
(1)对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料；
所述灵芝孢子粉萃取废料为灵芝孢子粉经过破壁、水提和脱脂后剩余的灵芝孢子粉壁壳；
(2)将所述辐照废料与水混合，加热提取，固液分离，得到粗多糖提取液；
(3)将粗多糖提取液干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
本发明所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法以灵芝孢子粉萃取废料为原料制备而成。在本发明中，所述灵芝孢子粉萃取废料为灵芝孢子粉经过破壁、水提和脱脂后剩余的灵芝孢子粉壁壳。经过破壁、水提和脱脂后的灵芝孢子粉壁壳占灵芝孢子粉总质量的50～60％，其中能够溶于有机溶剂和水中的可溶性部分极少，其中的灰分在1％左右，活性多糖含量在1％以下，多糖中以β-葡聚糖的含量较高为13％以上，因而从灵芝孢子粉萃取废料中直接提取多糖的难度大。本发明所述制备方法先通过辐照的方式进一步破坏废料中细胞壁结构，增加能够被提取的活性多糖含量，再进行水提，即可获得多糖含量高的灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料。优选的辐照至剂量600kGy～800kGy，得到辐照废料。在本发明所述辐照剂量下能将灵芝孢子粉萃取废料细胞内部残留的活性多糖释放出来，从而提高可被提取的灵芝孢子多糖数量，辐照处理灵芝孢子粉萃取废料可以有效增加水溶性多糖的含量，使辐照废料中活性多糖含量与灵芝孢子粉原料中的活性多糖相比提高3倍以上，达到6～7％。
得到所述辐照废料后，本发明将所述辐照废料与水混合，加热提取1～4h，固液分离，得到粗多糖提取液。所述辐照废料与水的质量体积比优选为1kg:30～40L，更优选为1kg:32～38L。
在本发明中，所述加热提取的温度优选为80～100℃，更优选为90～95℃；所述加热提取时间优选为2～3h。本发明对具体的加热提取方式无特殊限定，采用本领域公知的加热提取手段即可。
在本发明中，所述固液分离方式优选为离心；进一步的，所述离心速率优选为8000～12000r/min，更优选为10000r/min；所述离心时间优选为10～30min，更优选为15min。
得到所述粗多糖提取液后，本发明将所述粗多糖提取液浓缩，将得到的浓缩物冷冻干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
在本发明中，所述浓缩物的质量与所述辐照废料体积的比为1kg:1～2L，更优选为1kg:1.5L。本发明所述浓缩方式优选为减压浓缩；更优选的，所述减压浓缩的压力为50～150mbar，更进一步优选为80mbar；所述减压浓缩的温度为40～60℃，更进一步优选为50℃。
在本发明中，所述冷冻干燥的步骤为：-10～-25℃下冷冻1～3h，再在-70～-85℃下冷冻2～4h，送入冷冻干燥机冻干。本发明所述冷冻干燥的产物中含水量为2～5％，更优选为3％。
在本发明中，所述冷冻干燥机中冻干的条件优选为：温度-80～-65℃，真空度0.8～1.5mbar。所述温度更优选为-70℃；所述真空度更优选为1.0mbar。
本发明所述制备方法的灵芝孢子粉壁壳粗多糖得率在7％以上，制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖中多糖含量在78％以上，具有显著的灵芝多糖活性和功能，可直接作为灵芝多糖的原料，为灵芝多糖提供一种新的提取途径。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
试验材料：本发明实施例中采用的灵芝孢子粉萃取废料1号和2号样品S*G150360(1号)、S*G150403(2号)，均由浙江寿仙谷医药股份有限公司提供，样品1号和2号均是灵芝孢子粉经过破壁、热水提取、脱脂处理后剩余的物料。
辐照装置：清华同方10MeV、20kW电子加速器。
实施例1灵芝孢子粉壁壳废料的成分测定
1、水分和灰分测定：分别取1号、2号样品，按照按GB/T 12531-1990食用菌水分标准进行水分测定，按照GB 12532-1990食用菌灰分测定标准进行灰分测定。
结果显示：1号、2号样品的水分含量分别为8.20％、14.8％，灰分含量分别为0.99％、1.04％。
2、蛋白和氨基酸含量测定：分别取1号、2号样品，按照GB 5009.5-2010方法进行蛋白含量测定，按照GB/T 5009.124-2003方法进行氨基酸含量的测定。
结果显示：1号、2号样品的总蛋白含量分别为24.58％和23.08％，氨基酸的含量分别为7.04％和6.45％。
由结果可以看出，灵芝孢子粉萃取废料中的蛋白质总量和氨基酸总量有较大的差异，分析其原因为：灵芝孢子粉壁壳中含有10～20％的几丁质，总蛋白的测定方法(GB5009.5-2010)为凯氏定氮法。而凯氏定氮法是对强酸水解后的产物进行测定，以样品中的有机氮含量折算出蛋白质含量，由于几丁质为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的多糖，在凯氏定氮法测定过程中几丁质所含有的N元素也被计算在内，造成了蛋白含量测定结果偏高，因而灵芝孢子中的蛋白含量应以氨基酸总量的测定结果为准。
3、灵芝多糖含量的检测：采用苯酚-硫酸法对样品1、2中的多糖含量进行测定。
分别称取样品1号、2号样品1g于带塞三角瓶中，加入100mL蒸馏水，沸水浴2h，冷却定容，得到提取液。分别取1mL提取液于12000r/min下离心15min，取上清液，以葡聚糖为标准品，用苯酚-硫酸法测总糖含量。
测定结果：由于灵芝孢子粉萃取废料已经经过了热水提取，其中所含有的大部分单糖、寡糖等被提取出去，因而在灵芝孢子粉萃取废料中无需考虑其中的单糖、寡糖等干扰成分，基本不影响多糖含量的测定。因此，本次试验采用总糖含量替代多糖含量进行分析，测定的1号、2号样品活性多糖含量分别为0.72％和0.64％。
4、β-葡聚糖含量的测定：采用Megazyme公司β-葡聚糖检测试剂盒,通过酶法和酸水解的试剂盒方法测定1号、2号样品中β-葡聚糖的含量。
测定结果：1号、2号样品中均含有较高的β-葡聚糖，分别占总的活性多糖含量的15.18％和13.28％。
由上述分析结可知，在灵芝孢子粉萃取废料中最值得利用的是多糖，特别是其中含量较高的β-葡聚糖。
实施例2
本次试验对辐照处理对多糖含量的影响进行验证
分别取1号样品、2号样品各500g，经电子束辐照至剂量为500kGy，得到辐照废料；
采用苯酚-硫酸法对多糖含量进行测定，具体操作同实施例1中的多糖含量测定步骤，测定结果显示，1号样品、2号样品制备得到的辐照废料中多糖含量分别为7.78％和6.38％。
由结果可以看出，对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理后，其中的水溶性多糖含量得到了显著提高，与实施例1中测定的多糖含量相比，经过辐照后的辐照废料中多糖含量提高了8倍以上，约为灵芝孢子粉原料的活性多糖含量的3倍以上，为后续的灵芝孢子多糖的提取提供了充分基础。
实施例3
称取灵芝孢子粉萃取废料1号样品500g，经电子束辐照至剂量为500kGy，得到辐照废料。取100g辐照废料与4L蒸馏水混合，在100℃下提取2h后离心，过滤得到上清液，即为粗多糖提取液。
在100mbar、50℃下对得到的粗多糖提取液进行减压浓缩至0.1L，将浓缩的液体置于-20℃下冷冻2h，再放入-80℃下冷冻3h，放入冷冻干燥机中冻干，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖7.03g。
对制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖进行多糖含量，方法如实施例1所示的多糖含量测定步骤，结果显示，其活性多糖含量为78.59％。
实施例4灵芝孢子粉壁壳粗多糖的分子量的分析
1、试验方法：高效液相色谱联用多角度激光散射仪分析法(HPSEC-MALLS)
2、样品前处理：精密称取实施例3制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖10mg，加入1.5mL流动相，使其充分溶解，样品液12000rpm离心20min，取上清液，进样分析。
所述流动相为：0.15mol/L NaNO3和0.05mol/L NaH2PO4溶液(pH＝7，0.02％叠氮钠)。
3、分析条件：
仪器：美国Waters HPLC高效液相色谱仪(Waters2695)；
色谱柱：日本TOSOH TSK-gel G6000PWXL(7.8mm×300mm)和TSK-gel G4000PWXL(7.8mm×300mm)凝胶柱串联后分析；
柱温：35℃；
流速：0.5mL/min；
激光检测器光源波长选用623.8nm。
多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。
4、数据处理：使用Astra(version6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量。
试验结果：
分子量分析结果见图1，具体分子量测定数据见表1。
表1灵芝孢子粉壁壳粗多糖的分子量分析结果
注：组分Peak1～3依次对应图1中的1～1、2～2、3～3三个区间的峰。
如图1所示，本发明所述方法制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖主要有三个糖峰，且分子量分布范围较宽。根据表1的数据可知，本发明制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖的主要分子量分布范围在2千到30万道尔顿。其中占比最多的为低分子量组分(千级)，达到72.7％；其次为中等分子量组分(万级)，为27.0％；大分子量组分(10万级)的占比较少，仅为0.3％左右。
实施例5吸湿保湿功效测定(以透明质酸为对照)
吸湿性实验：精密称取实施例3制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖各0.2g，共两份，分别加入直径3cm的称量皿中，将称量皿分别置于放有硫酸铵饱和溶液(相对湿度RH＝81％)和放有饱和碳酸钾溶液(RH＝43％)的干燥器中，放置时间为1、3、6、12、24、48、72h，分别称量样品放置前质量(W0)和放置后质量(Wn)。根据下式计算吸湿率：吸湿率/％＝100(Wn-W0)/W0，结果见图2和表2、图3和表3。
表2灵芝孢子粉壁壳粗多糖吸湿率与时间的变化关系(RH＝43％)
时间(h) 0 1 3 6 12 24 48 72
透明质酸 0 4.15 5.83 7.71 9.00 10.67 12.07 11.58
灵芝孢子粉壁壳粗多糖 0 2.88 4.90 5.94 7.21 8.28 8.23 8.23
表3灵芝孢子粉壁壳粗多糖吸湿率与时间的变化关系(RH＝81％)
时间(h) 0 1 3 6 12 24 48 72
透明质酸 0 8.86 16.55 20.81 29.28 32.58 37.61 37.56
灵芝孢子粉壁壳粗多糖 0 4.12 7.65 9.89 14.83 20.48 23.66 23.60
保湿性实验：将已置于RH＝81％环境内72h保持恒重的样品转移，置于装有干硅胶的干燥器内进行保湿实验。放置时间为1、3、6、12、24、48、72h，分别称量放置前样品含水重量(H0)和放置后样品含水重量(Hn)。根据下式计算保湿率：保湿率/％＝100Hn/H0，结果见图4和表4。
表4灵芝孢子粉壁壳粗多糖保湿率与时间的变化关系(硅胶环境)
时间(h) 0 1 3 6 12 24 48 72
透明质酸 100 96.14 92.65 85.22 81.77 76.89 75.47 75.54
灵芝孢子粉壁壳粗多糖 100 96.27 91.67 88.68 86.67 84.75 83.87 83.87
由此结果可以看出，本发明制备得到的灵芝孢子粉壁壳粗多糖具有较好的保湿效果，其保湿性在6h至72h优于透明质酸，其与直接从灵芝孢子粉中提取得到的灵芝灵芝孢子粉壁壳粗多糖作用效果相似，可直接作为灵芝孢子多糖原料使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，包括以下步骤：
(1)对灵芝孢子粉萃取废料进行辐照处理，经电子束辐照至剂量为500kGy～900kGy，得到辐照废料；
所述灵芝孢子粉萃取废料为灵芝孢子粉经过破壁、水提和脱脂后剩余的灵芝孢子粉壁壳；
(2)将所述辐照废料与水混合，加热提取，固液分离，得到粗多糖提取液；
(3)将粗多糖提取液干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
2.根据权利要求1所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，辐照至剂量800kGy，得到辐照废料。
3.根据权利要求1所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中辐照废料与水的质量体积比为1kg:30～40L。
4.根据权利要求3所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加热提取的温度为80～100℃，加热提取的时间为1～4h。
5.根据权利要求1所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥粗多糖提取液的方式为：将所述粗多糖提取液浓缩，得到的浓缩物冷冻干燥，得到灵芝孢子粉壁壳粗多糖。
6.根据权利要求5所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述浓缩的程度以浓缩物与辐照废料的用量计，所述辐照废料的质量与所述浓缩物体积的比为1kg:1～2L。
7.根据权利要求5所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述冷冻干燥还包括预冷冻。
8.根据权利要求7所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述预冷冻的步骤为：将浓缩物置于-10～-25℃下冷冻1～3h，再在-70～-85℃下第二次冷冻2～4h，将第二次冷冻结束后得到的预冷冻料送入冷冻干燥机冻干。
9.根据权利要求7或8所述利用辐照制备灵芝孢子粉壁壳粗多糖的方法，其特征在于，所述冷冻干燥机中冻干的条件为：温度-80～-65℃，真空度0.8～1.5mbar。
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