CN105738529B - 一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法 - Google Patents

一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，将半乳甘露聚糖不完全降解产物分级成若干分子量区间，测定各分子量区间的平均分子量及对应的半乳甘露聚糖不完全降解产物含量，以若干不同平均分子量的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物。该定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，具有科学、准确、易于操作等优点，可在科学研究、工业生产质量控制以及食品、饲料中半乳甘露低聚糖不完全降解产物的定量分析中广泛推广应用，具有很好的经济效益和社会效益。

Description

一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法
技术领域
本发明属糖生物工程领域，具体涉及一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法。
背景技术
半乳甘露聚糖是由甘露糖通过β-1,4-糖苷键形成直链、半乳糖以α-1,6-糖苷键形成支链的高聚合度杂多糖，是一种存在于田菁种子等植物中的天然植物多糖，可广泛应用于食品、饲料、材料、化工等领域。半乳甘露聚糖是一种水溶性多糖，但天然半乳甘露聚糖水溶液具有高粘度的特性，限制了其开发利用。近年来，随着糖生物工程的兴起，天然植物多糖的不完全降解产物因其特殊的生物学功能而作为功能性添加剂在食品、饲料上的应用受到了普遍关注。半乳甘露聚糖不完全降解产物是指聚合度高于2的天然半乳甘露聚糖降解产物，即半乳甘露聚糖不完全降解产物不包括降解产物中的单糖部分。半乳甘露聚糖不完全降解产物的生物学功能主要表现为对人或动物体肠道内双歧杆菌等有益菌的选择性增殖作用、阻断病原菌在消化道中定植、诱生免疫因子和可溶性膳食纤维等。半乳甘露聚糖不完全降解产物是由一系列不同分子量(聚合度)的半乳甘露低聚糖及短链半乳甘露聚糖组成的混合物，半乳甘露低聚糖及短链半乳甘露聚糖分子量不同，其生物学功能也不同。目前尚无半乳甘露聚糖不完全降解产物中不同聚合度单体组分的定量分析方法，常规的对含有少量不同聚合度单体组分的低聚糖成分定量分析，通常是采用中低压层析(FPLC)或制备色谱方法制备低聚糖单体组分，然后借助于高效液相色谱，在建立不同聚合度单体组分含量与色谱响应值之间的工作方程的基础上对低聚糖混合物中各单体组分进行定量分析。但半乳甘露聚糖不完全降解产物中，含有聚合度为2至80甚至更高聚合度单体组分的半乳甘露低聚糖及短链半乳甘露聚糖，而且相邻聚合度的半乳甘露聚糖降解产物除分子量相差162以外，其它理化性质十分相近，在如此复杂混合物中对理化性质十分相近的各单体组分进行分离，继而在建立各单体组分浓度与色谱响应值工作方程的基础上对混合物中各个组分进行定量分析，从目前技术手段或仪器设备来说都难以实现。因此，在科学研究、半乳甘露聚糖不完全降解产物工业生产与质量控制、含半乳甘露聚糖不完全降解产物的食品、饲料产品中功能性成分含量的评价中，急需建立一种半乳甘露聚糖不完全降解产物科学、准确的定量表征方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，将半乳甘露聚糖不完全降解产物分级成若干分子量区间，测定各分子量区间的平均分子量及对应的半乳甘露聚糖不完全降解产物含量，建立以若干不同平均分子量的半乳甘露聚糖降解产物的含量定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物，具有科学、准确等优点。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法：将半乳甘露聚糖不完全降解产物分级成若干分子量区间，测定各分子量区间的平均分子量及对应的半乳甘露聚糖不完全降解产物含量，以若干不同平均分子量的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物。
所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，半乳甘露聚糖不完全降解产物采用极性有机溶剂分级沉淀法制备若干分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，采用凝胶渗透色谱法测定各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量，采用高效液相离子色谱法定量分析各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量。
所述的半乳甘露聚糖不完全降解产物是指天然植物中的半乳甘露聚糖经生物(酶)或化学方法降解获得的不完全降解产物，包括短链半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖。
所述的极性有机溶剂包括乙醇、丙酮等可以对半乳甘露聚糖不完全降解产物分级沉淀的极性有机溶剂。
所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，采用冷冻干燥或真空干燥或室温干燥所述的极性有机溶剂分级沉淀制备的各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，获得固形物。
所述的各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的定量方法是采用4％稀硫酸水解各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，采用高效液相离子色谱法测定水解液中的单糖含量，并转换成半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量。
所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，采用高效液相离子色谱法定量单糖半乳糖和甘露糖。
所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，采用30-70％乙醇溶液分级沉淀制备若干分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物。
所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，具体工艺路线和参数如下：
(1)在搅拌条件下在含半乳甘露聚糖不完全降解产物的水溶液中逐步添加占分离体系10％-65％的乙醇，固液分离、洗涤、干燥，获得固形物，测定分水含量并称重；
(2)分别将步骤(1)获得的固形物配制成1g/L溶液，采用凝胶渗透色谱(GPC)法测定平均分子量；
(3)分别采用4％的稀硫酸水解步骤(1)获得的固形物，采用高效液相离子色谱法测定水解液中的单糖含量，并转换成半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量；
(4)极性有机溶剂最后一次分级沉淀、固液分离，得到固形物和上清液；固形物按步骤(2)和(3)测定半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和定量；上清液减压蒸发除去其中的乙醇后，加入酿酒酵母发酵除去其中的单糖半乳糖和甘露糖，10000转/分离心10min，固液分离，获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的二次上清液；二次上清液减压蒸发、干燥获得固形物，固形物按步骤(2)和(3)测定半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和定量；
(5)步骤(2)测定的各级分半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和步骤(3)测定的各级分的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量，以及步骤(4)测定的最后一次分级获得的固形物和上清液中半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和含量，为定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的结果。
有益效果：与现有技术相比，本发明提出的半乳甘露聚糖不完全降解产物的定量表征方法，将半乳甘露聚糖不完全降解产物分级成若干分子量区间，测定各分子量区间的平均分子量以及对应的半乳甘露聚糖不完全降解产物含量，以若干平均分子量的半乳甘露聚糖降解产物的含量定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物，具有科学、准确、易于操作等优点，可在科学研究、工业生产质量控制以及食品、饲料中半乳甘露低聚糖不完全降解产物的定量分析中广泛推广应用，具有很好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是半乳甘露聚糖酶解液上清液30％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为39.317min；
图2是半乳甘露聚糖酶解液上清液35％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为39.645min；
图3是半乳甘露聚糖酶解液上清液37.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为40.283min；
图4是半乳甘露聚糖酶解液上清液40％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为40.918min；
图5是半乳甘露聚糖酶解液上清液42.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为41.128min；
图6是半乳甘露聚糖酶解液上清液45％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为41.517min；
图7是半乳甘露聚糖酶解液上清液47.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为41.710min；
图8是半乳甘露聚糖酶解液上清液50％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为41.981min；
图9是半乳甘露聚糖酶解液上清液52.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为42.252min；
图10是半乳甘露聚糖酶解液上清液55％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为42.449min；
图11是半乳甘露聚糖酶解液上清液57.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为42.630min；
图12是半乳甘露聚糖酶解液上清液60％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为42.999min；
图13是半乳甘露聚糖酶解液上清液62.5％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为43.193min；
图14是半乳甘露聚糖酶解液上清液65％乙醇浓度分级沉淀物GPC图；峰尖保留时间为44.04min；
图15是半乳甘露聚糖酶解液上清液65％乙醇浓度分级沉淀后离心上清液(分级液)发酵除去单糖后固液分离、上清液浓缩、干燥得到的固形物GPC图，峰尖保留时间为45.781min。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，不同分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定。色谱条件如下：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8×300mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8×300mm)和Waters UltrahydrogelTM 120(7.8×300mm)三柱依次串联，保护柱：WatersUltrahydrogelTM Guard Column(6×40mm)，检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60mL/min，柱温：65℃，进样体积：10.0μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定。
以下实施例中，甘露糖和半乳糖浓度采用高效液相离子交换色谱法测定。色谱条件如下：色谱仪：戴安离子色谱仪ICS-5000，色谱柱：Dionex AminoPac PA10(2×250mm)，保护柱：Dionex AminoPac PA10(2×50mm)，检测器：电导检测器，流动相：3mmol/L氢氧化钠，流动相流速：0.20mL/min，柱温：30℃，进样体积：10.0μL，外标法测定。
以下实施例中，有机溶剂分级沉淀物中半乳甘露聚糖不完全降解产物定量测定方法为：称取0.3000g绝干沉淀物于水解瓶中，加入87.000mL4％的H2SO4于121℃下反应1h，反应结束后用50％NaOH调节反应液pH值为1～3，用蒸馏水定容至一定体积V0，在ICS-5000离子交换色谱仪上测定稀释液中甘露糖和半乳糖浓度CA1和CA2，沉淀物中半乳甘露聚糖降解产物质量计算如下：
式中：V0为样品水解、中和、定容后的稀释液的体积，mL；CA1为酸解稀释液中甘露糖浓度，g/L；CA2为酸解稀释液中半乳糖浓度，g/L；m沉淀物为不同有机溶剂浓度下沉淀物干重，g；0.9为聚糖和单糖的转化系数。
实施例1
一种半乳甘露聚糖不完全降解产物的定量表征方法，具体步骤如下：
(1)半乳甘露聚糖提取物制备。
风干田菁胚乳片机械粉碎，按1:50固液比加入蒸馏水，于50℃抽提24h后，于10000转/分条件下离心10min，获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经真空干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。
(2)内切甘露聚糖酶选择性水解半乳甘露聚糖制备半乳甘露聚糖不完全降解产物。
称取步骤(1)中的半乳甘露聚糖提取物20.0g于2L酶反应罐中，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、1mol/L柠檬酸缓冲液使反应液体积为1000mL，充分混合均匀，于底物浓度10％、酶加量20U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8、50℃条件下反应24h，酶水解反应结束后，将酶水解物置于100℃下处理10min，使内切甘露聚糖酶失活，于10000转/分条件下离心10min，上清即为含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液。
(3)半乳甘露聚糖不完全降解产物的分级分离
取步骤(2)中的半乳甘露聚糖酶解上清液1000mL，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为10％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用10％(v/v)的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
(4)取步骤(3)固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为15％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用15％(v/v)的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
(5)取步骤(4)固液分离后的上清液，按步骤(4)的方法循环进行，通过在上一级分离后的上清液中加入乙醇，使得分离体系中的乙醇浓度依次为20％、25％、30％、35％、40％、42.5％、45％、47.5％、50％、52.5％、55％、57.5％、60％、62.5％和65％，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用与分离体系中相同浓度的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
(6)最后一次分离获得的上清液，
取最后一次分级沉淀、固液分离后的上清液，于70℃、160mbar下减压旋转蒸发除去其中的乙醇，在除去乙醇的上清液中加入10g/L酿酒酵母发酵12h，完全除去其中的单糖半乳糖和甘露糖，10000转/分条件下离心10min，固液分离获得二次上清液。二次上清液于70℃、160mbar下减压旋转蒸发、干燥后获得固形物，测定固形物中的水分含量并称重。固形物用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。
实验结果如表1，不同平均分子量的半乳甘露聚糖不完全降解产物的GPC色谱图如图1-图15。
表1半乳甘露聚糖酶解上清液乙醇分级沉淀物平均分子量及其定量分析结果
结果表明，半乳甘露聚糖经内切甘露聚糖酶不完全降解获得的半乳甘露聚糖不完全降解产物通过乙醇分级沉淀可获得不同分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，并可采用凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相离子色谱法测定不同分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和定量。从而可以实现用不同平均分子量的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量来表征半乳甘露聚糖不完全降解产物。表征结果如下：半乳甘露聚糖经内切甘露聚糖酶的酶解产物中，半乳甘露聚糖不完全降解产物中平均分子量分别为13.41、10.22、7.73、7.60、6.51、6.34、5.73、5.26、4.93、3.91、3.54、3.12、2.91和2.47的半乳甘露聚糖不完全降解产物占酶解产物总糖的质量百分比分别为15.03％、27.49％、11.96％、4.56％、2.11％、1.28％、1.56％、1.95％、1.45％、0.56％、5.68％、0.78％、5.62％和5.9％。

Claims (7)

1.一种定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于：将半乳甘露聚糖不完全降解产物分级成若干分子量区间，测定各分子量区间的平均分子量及对应的半乳甘露聚糖不完全降解产物含量，以若干不同平均分子量的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物；其中，所述的半乳甘露聚糖不完全降解产物是指天然植物中的半乳甘露聚糖经生物方法或化学方法降解获得的不完全降解产物，包括短链半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖；各级分半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量、各级分的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量、最后一次分级获得的固形物和上清液中半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和含量，为定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的结果。
2.根据权利要求1所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，半乳甘露聚糖不完全降解产物采用极性有机溶剂分级沉淀法制备若干分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，采用凝胶渗透色谱法测定各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量，采用高效液相离子色谱法定量分析各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量；
其中，极性有机溶剂分级沉淀法为使用浓度依次为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、42.5％、45％、47.5％、50％、52.5％、55％、57.5％、60％、62.5％和65％乙醇进行分级沉淀；
凝胶渗透色谱法的色谱条件为：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：WatersUltrahydrogel TM 2000、Waters Ultrahydrogel TM 250和Waters UltrahydrogelTM 120三柱依次串联，保护柱：Waters UltrahydrogelTM Guard Column，检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60mL/min，柱温：65℃，进样体积：10.0μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定；
高效液相离子交换色谱法测定色谱条件为：色谱仪：戴安离子色谱仪ICS-5000，色谱柱：Dionex AminoPac PA10，保护柱：Dionex AminoPac PA10，检测器：电导检测器，流动相：3mmol/L氢氧化钠，流动相流速：0.20mL/min，柱温：30℃，进样体积：10.0μL，外标法测定。
3.根据权利要求2所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，采用冷冻干燥或真空干燥或室温干燥所述的极性有机溶剂分级沉淀制备的各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，获得固形物。
4.根据权利要求1所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，所述的各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的定量方法是采用4％稀硫酸水解各分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物，采用高效液相离子色谱法测定水解液中的单糖含量，并转换成半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量。
5.根据权利要求1所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，采用高效液相离子色谱法定量单糖半乳糖和甘露糖。
6.根据权利要求1所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，采用30-70％乙醇溶液分级沉淀制备若干分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物。
7.根据权利要求1所述的定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)在搅拌条件下在含半乳甘露聚糖不完全降解产物的水溶液中逐步添加占分离体系10％-65％的乙醇，固液分离、洗涤、干燥，获得固形物，测定分水含量并称重；
(2)分别将步骤(1)获得的固形物配制成1g/L溶液，采用凝胶渗透色谱GPC法测定平均分子量；
(3)分别采用4％的稀硫酸水解步骤(1)获得的固形物，采用高效液相离子色谱法测定水解液中的单糖含量，并转换成半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量；
(4)极性有机溶剂最后一次分级沉淀、固液分离，得到固形物和上清液；固形物按步骤(2)和(3)测定半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和定量；上清液减压蒸发除去其中的乙醇后，加入酿酒酵母发酵除去其中的单糖半乳糖和甘露糖，10000转/分离心10min，固液分离，获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的二次上清液；二次上清液减压蒸发、干燥获得固形物，固形物按步骤(2)和(3)测定半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和定量；
(5)步骤(2)测定的各级分半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和步骤(3)测定的各级分的半乳甘露聚糖不完全降解产物的含量，以及步骤(4)测定的最后一次分级获得的固形物和上清液中半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量和含量，为定量表征半乳甘露聚糖不完全降解产物的结果。
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特定聚合度魔芋低聚糖的筛选与制备技术研究;李文超;《万方数据 学位论文》;20150730;第1.2.1、1.3部分 *
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