CN114478823A - 一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于辐照及中药活性成分提取技术领域，具体公开了一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，对三七废渣喷淋辐照增敏剂溶液后，经电子束辐照至剂量为30kGy～200kGy，得到辐照三七药渣；辐照三七药渣与水混合，经加热或超声提取得到三七多糖提取液；提取液减压浓缩加酸调至pH4.5，滤液中加入乙醇，醇沉的多糖沉淀物经冷冻干燥后得到活性多糖含量在70%以上的三七多糖。本发明可对三七多糖分子量进行精准调控，与未辐照加工的三七多糖相比，活性多糖含量提高了2～3倍以上，处理量大，产率高，能耗低，清洁无污染，可以大规模工业化生产，通过辐照技术进一步开发了三七多糖抗氧化抗衰老药用价值。

Description

一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法
技术领域
本发明属于辐照及中药活性成分提取技术领域，具体涉及一种辐照技术制备高抗衰老活性三七多糖的方法。
背景技术
三七多糖具有促进与加强网状内皮系统功能、增强免疫力、抗微波辐射、促进恢复创伤和促进骨缺损修复等作用，逐渐受到广泛关注。现阶段我国以三七为原料的中成药品种 400多个，批准文号3200个，涉及厂家1300座，并随着社会发展需求量不断扩大，三七常年种植面积为10万亩左右，产量9000吨。每年用于提取三七总皂苷的三七约为1000吨。三七残渣在提取之后被弃去，其中约有30-50万吨三七多糖未能得到有效利用。因此，从三七残渣中提取得到三七多糖并进行结构鉴定，对三七资源的二次开发具有显著意义。
由于三七纤维素组织非常致密，常规的提取方法难以有效地获得三七多糖。在工业弃置的三七药渣中依然含有大量的三七多糖，不但处理困难极易腐败，更会对环境造成严重的污染。虽然现有技术对三七提取后剩余的废料回收利用方式进行了一些研究，例如，文献1“有效利用三七总皂苷提取后的药渣提取三七多糖”，韦云川 等，《文山师范高等专科学校学报》第19卷 第4期；文献2“不同菌种发酵前后三七药渣中多糖的含量变化”，黄纯莹等，《食品安全质量检测学报》第11卷第10期。但是上述方法均存在三七多糖含量相对较低，三七废渣中多糖提取得率仅为3～6%，提取难度相对较高，生物活性较低，也不利于工业化生产。
根据国家统计局公布的第七次全国人口普查结果，到2020年，我国60岁及以上人口为26402万人，占18.70%，其中65岁及以上人口为19064万人，占13.50%。人口老龄化程度进一步加深，未来一段时期将持续面临人口老龄化不断加剧的压力。衰老是一个发生在生长和发育周期中的过程，与有机体组织结构和生理功能的丧失和退化有关。退化损伤被认为是造成衰老的主要机制之一，现有研究表明，三七多糖可以提高创伤机体的免疫功能，改善机体的免疫状况，具有增强机体超氧化物歧化酶活性及抑制羟自由基的能力，并通过提高体内抗氧化活性物质水平清除活性自由基，因此三七多糖在抗衰老领域具有巨大的药用潜力。
发明内容
为了提高三七附加价值，解决从提取三七皂苷后的三七药渣中难以取得三七多糖及含量较低的问题，本发明提供了一种活性多糖含量在70%以上的高抗衰老活性三七多糖的制备方法，不仅减少了环境污染和资源浪费，更能通过辐照技术进一步开发三七多糖抗氧化抗衰老药用价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，包括以下步骤：
A、辐照处理：对三七废渣喷淋辐照增敏剂溶液后，装入密封袋内，经电子束辐照，得到辐照三七药渣；
所述三七废渣为提取三七皂苷后的三七根块或粉状的药渣；
所述辐照增敏剂为过硫酸铵、过硫酸钾、抗坏血酸中的一种或多种，以每100ml水中加入3～6g增敏剂配制成溶液；
B、水提：将步骤A得到的辐照三七药渣与水混合，经加热或超声提取得到三七多糖提取液；
C、后处理：将步骤B得到的三七多糖提取液减压浓缩，浓缩液加酸调至pH4.5，过滤除去蛋白杂质，滤液中加入乙醇，醇沉得到的多糖沉淀物经冷冻干燥后得到活性多糖含量在70%以上的三七多糖。
进一步的，本发明步骤A中，辐照至剂量30kGy～200kGy，得到辐照三七废渣。
进一步的，本发明步骤B中，三七药渣与水的质量体积比为1kg:10～20L。
进一步的，本发明步骤B中，加热提取的温度为90～100℃，提取时间为2～3h；超声提取的功率为50～100w，提取时间为2～3h。
进一步的，本发明步骤C中，浓缩的程度以浓缩液与辐照三七废渣的用量计，所述辐照三七药渣的质量与浓缩液体积的比为1kg:1～2L。
进一步的，本发明步骤C中，所述酸为盐酸、柠檬酸、乙酸中的一种或多种。
进一步的，本发明步骤C中，加入的乙醇为95%乙醇或无水乙醇，乙醇的加入量为浓缩液体积的3~4倍。
进一步的，本发明步骤C中，冷冻干燥的方法为：将多糖沉淀物置于-25～-10℃下冷冻2～4h，将冷冻结束后得到的预冷冻料送入冷冻干燥机冻干。
进一步的，冷冻干燥机中冻干的条件为：温度-80～-65℃，真空度0.8～1.5mbar。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
1、基于从提取三七皂苷后的三七药渣中直接提取多糖难度大，本发明提供了一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，先对三七废渣进行辐照敏化处理破坏废料中细胞壁结构，既降低药渣纤维素密度，同时也降解多糖分子量，从而共同促进多糖溶出，增加能够被提取的活性多糖含量，不仅具有较低的辐照加工剂量，更能获得高提取率，并显著提高废渣中的活性多糖含量。与常规提取活性多糖（如CN107880146A一种低分子量、高溶解度黄芪多糖的制备方法及其产品和应用）相比提高了2～3倍以上，降低了多糖提取难度，从而可快速获得高抗衰老活性三七多糖。
2、本发明采用剂量为30kGy～200kGy的电子束对三七药渣进行辐照敏化处理，可对三七多糖分子量精准调控，再通过水提、减压浓缩、加酸过滤除去蛋白等大分子杂质、醇沉提取并除去小分子杂质的处理过程，进而可获得活性多糖含量在70%以上的高抗衰老活性的三七多糖。
3、本发明对三七废渣进行辐照处理，处理量大，产率高，能耗低，清洁无污染，可以大规模工业化生产。与未辐照加工的三七多糖相比，辐照制备三七多糖具有优异的抗衰老效果，能够降低衰老EC细胞活性氧水平，提高细胞的超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT含量，是一种潜在的抗衰老药物。
附图说明
图1为本发明不同辐照计量下制备的三七多糖的分子量分布图；
图2为本发明不同辐照计量下制备的三七多糖对H2O2诱导衰老EC细胞活性氧（ROS）水平的影响关系图；
图3为本发明不同辐照计量下制备的三七多糖对H2O2诱导衰老EC细胞超氧化物歧化酶（SOD）的影响关系图；
图4为本发明不同辐照计量下制备的三七多糖对H2O2诱导衰老EC细胞过氧化氢酶（CAT）的影响关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取过硫酸铵4.56g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照30kGy后，加入15L水80W超声提取3h，收集提取液并减压浓缩至1.5L，浓缩液加入盐酸和柠檬酸调节pH至4.5，过滤析出大分子蛋白杂质等不溶物后，滤液中加入无水乙醇4.5L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-10℃下冷冻4h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-75℃，真空度0.8mbar的条件下冻干得活性多糖含量为72.89%的三七多糖87.5g，得率6.38%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为185.4kD，为具有抗衰老活性的三七多糖。
实施例2
取抗坏血酸3.42g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照50kGy后，加入15L水100W超声提取2h，收集提取液并减压浓缩至1.5L，浓缩液加入乙酸调节pH至4.5，过滤析出大分子蛋白杂质等不溶物后，滤液中加入95%乙醇4.5L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-10℃下冷冻4h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-80℃，真空度0.8mbar的条件下冻干得活性多糖含量为76.25%的三七多糖108.2g，得率8.25%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为138.4kD，为具有高抗衰老活性的三七多糖。
实施例3
取过硫酸钾5g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照150kGy后，加入10L水50W超声提取3h，收集提取液并减压浓缩至2L，浓缩液加入柠檬酸调节pH至4.5，过滤析出大分子蛋白杂质等不溶物后，滤液中加入无水乙醇6L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-15℃下冷冻3h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-70℃，真空度1.0mbar的条件下冻干得活性多糖含量为72.71%的三七多糖186.5g，得率13.56%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为45.8kD，为具有高抗衰老活性的三七多糖。
实施例4
取抗坏血酸1.71g，过硫酸铵2.28g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照100kGy后，加入10L水加热至90℃提取2h，收集提取液并减压浓缩至1L，浓缩液加入盐酸调节pH至4.5，过滤析出大分子蛋白杂质等不溶物后，滤液中加入无水乙醇3L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-20℃下冷冻3h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-75℃，真空度1.2mbar的条件下冻干得活性多糖含量为74.52%的三七多糖169.1g，得率12.6%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为58.3kD，为具有高抗衰老活性的三七多糖。
实施例5
取抗坏血酸1.71g，过硫酸钾2.70g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照200kGy后，加入20L水100W超声提取3h，收集提取液并减压浓缩至1L，浓缩液加入柠檬酸调节pH至4.5，过滤析出不溶物后，滤液中加入95%乙醇4L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-15℃下冷冻3h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-65℃，真空度1.5mbar的条件下冻干得活性多糖含量为70.33%的三七多糖205.6g，得率14.46%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为43.0kD，为具有高抗衰老活性的三七多糖。
从上述实施例1-5及图1-图4可知，本发明采用剂量为30kGy～200kGy的电子束对三七药渣进行辐照敏化处理，能够精准调控三七多糖分子量，在获得更高得率提高多糖产量的同时，也获得了更高活性的多糖。
三七废渣经辐照敏化处理及后处理，活性多糖含量得到明显提升，上述实施例1-5制得的三七多糖中活性多糖含量均在70%以上。而且随着辐照剂量的增加，三七多糖的得率也有显著提高。
实施例6
取过硫酸钾5.41g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照5kGy后，加入20L水加热至100℃提取2h，收集提取液并减压浓缩至2L，浓缩液加入乙酸调节pH至4.5，过滤析出不溶物后，滤液中加入95%乙醇7L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-25℃下冷冻2h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-65℃，真空度1.5mbar的条件下冻干得活性多糖含量为73.75%的三七多糖76.1g，得率5.61%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为230.7kD。
从图1-图4可以看出，使用5kGy的电子束对三七药渣进行辐照敏化处理，三七多糖的抗衰老活性与未经辐照处理相比并无统计学意义上更高的活性。
对比例1
本对比例为在实施例4的基础上，未进行辐照处理。
取抗坏血酸1.71g，过硫酸铵2.28g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，作为未辐照对照组，直接加入10L水加热至90℃提取2h，收集提取液并减压浓缩至1L，浓缩液加入盐酸调节pH至4.5，过滤析出不溶物（主要为大分子蛋白杂质）后，滤液中加入无水乙醇3L，将醇沉得到的多糖沉淀物置于-20℃下冷冻3h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-75℃，真空度1.2mbar的条件下冻干得活性多糖含量为65.68%的三七多糖53.9g，得率3.54%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为246.8kD。
与实施例4相比，三七药渣未经辐照处理，三七多糖的得率明显降低，由12.60%下降至3.54%，下降了3.56倍，提取难度加大，提取得到的是大分子量的三七多糖，其多糖活性也明显降低（参见图1-图4）。
对比例2
本对比例为在实施例4的基础上，未经后处理。
取抗坏血酸1.71g，过硫酸铵2.28g，溶解在100ml水后喷淋至1000g三七药渣上，经电子束辐照100kGy后，加入10L水加热至90℃提取2h，收集提取液并减压浓缩至1L，浓缩液加入盐酸调节pH至4.5，过滤析出大分子蛋白杂质等不溶物后，直接将滤液置于-20℃下冷冻3h，得到的预冷冻料再送入冷冻干燥机中在温度-75℃，真空度1.2mbar的条件下冻干得活性多糖含量为59.26%的三七多糖209.6g，得率12.42%；经凝胶渗透色谱测得其分子量为65.2kD。
与实施例4相比，经辐照处理后的三七药渣直接水提、加酸除去大分子蛋白等杂质，未经醇沉后处理，三七多糖的得率变化不大，仅由12.60%下降至11.42%，但活性多糖含量明显降低，由74.52%下降至59.26%。因为只辐照不处理，杂质多，糖活性低；而只后处理（醇沉）不辐照，不能调控分子量，进而无法获得低分子量高活性多糖。
实验例1
辐照制备三七多糖对H2O2诱导衰老EC细胞ROS、SOD和CAT的影响
在96孔板中加入EC细胞，与200µM H2O2共孵育24h后，加入1mg/L三七多糖共孵育24h。
1、将用RPMI-1640培养基按照1:1000的比例稀释DCFH-DA荧光探针，加入已经稀释了的DCFH-DA荧光探针后，置于37℃细胞培养箱内孵育20分钟，用移液枪吸除 DCFH-DA，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，于荧光显微镜在480nm下观察ROS水平，结果如图2所示。结果表明：辐照制备的三七多糖能够降低衰老EC细胞活性氧（ROS）水平，且辐照剂量对多糖活性具有明显的调控作用。
2、收集三七多糖共孵育24h EC细胞悬液，超声处理，每次5s，持续20次，每次间隔10s，然后采集上清液200μL，通过SOD试剂盒进行检测，确定其含量，结果如图3所示。结果表明：辐照制备的三七多糖能够提高细胞的超氧化物歧化酶SOD含量，且辐照剂量对多糖抗衰老活性具有明显的调控作用。
3、收集三七多糖共孵育24h EC细胞悬液，超声处理，每次5s，持续20次，每次间隔10s，然后采集上清液200μL，通过CAT试剂盒进行检测，确定其含量，结果如图4所示。结果表明：辐照制备的三七多糖能够提高细胞的过氧化氢酶CAT含量，且辐照剂量对多糖抗衰老活性具有明显的调控作用。

Claims (10)

1.一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、辐照处理：对三七废渣喷淋辐照增敏剂溶液后，装入密封袋内，经电子束辐照，得到辐照三七药渣；
所述三七废渣为提取三七皂苷后的三七根块或粉状的药渣；
所述辐照增敏剂为过硫酸铵、过硫酸钾、抗坏血酸中的一种或多种，以每100ml水中加入3～6g增敏剂配制成溶液；
B、水提：将步骤A得到的辐照三七药渣与水混合，经加热或超声提取得到三七多糖提取液；
C、后处理：将步骤B得到的三七多糖提取液减压浓缩，浓缩液加酸调至pH4.5，过滤除去蛋白杂质，滤液中加入乙醇，醇沉得到的多糖沉淀物经冷冻干燥后得到活性多糖含量在70%以上的三七多糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤A中，经电子束辐照至剂量30～200kGy，得到辐照三七废渣。
3.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤B中，三七药渣与水的质量体积比为1kg:10～20L。
4.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤B中，加热提取的温度为90～100℃，提取时间为2～3h。
5.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤B中，超声提取的功率为50～100w，提取时间为2～3h。
6.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤B中，根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤C中，浓缩的程度以浓缩液与辐照三七废渣的用量计，所述辐照三七药渣的质量与浓缩液体积的比为1kg:1～2L。
7.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤C中，酸为盐酸、柠檬酸、乙酸中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤C中，所用乙醇为95%乙醇或无水乙醇，乙醇的加入量为浓缩液体积的3~4倍。
9.根据权利要求1所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述步骤C中，冷冻干燥的方法为：将多糖沉淀物置于-25～-10℃下冷冻2～4h，将冷冻结束后得到的预冷冻料送入冷冻干燥机冻干。
10.根据权利要求9所述的一种利用辐照制备高抗衰老活性三七多糖的方法，其特征在于：所述冷冻干燥机中冻干的条件为：温度-80～-65℃，真空度0.8～1.5mbar。
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Title
冯士令: "三七多糖结构及其延长秀丽线虫寿命作用机制的研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *
冯士令: "三七多糖结构及其延长秀丽线虫寿命作用机制的研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, no. 03, 15 March 2020 (2020-03-15), pages 1 *
唐木涛等编: "《核与辐射突发事件医学应急救援》", 31 January 2015, 人民军医出版社, pages: 51 *
方晓晖等: "抗坏血酸对猴头菇炉葡聚糖表观黏度及结构特征的影响", vol. 39, no. 2, pages 32 - 39 *
李世超等: "辐照对无花果多糖分子量、结构及抗氧化活性的影响", vol. 32, no. 2, pages 16 *
焦圣兵等: "抗坏血酸增敏—石墨炉原子吸收光谱法测定痕量铊的方法研究", vol. 43, no. 3, pages 2 *
王金亭等主编: "《生物化学实验教程（第二版）》", 31 July 2020, 华中科技大学出版社, pages: 22 *
陈谧: "三七多糖的结构分析及抗衰老活性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
陈谧: "三七多糖的结构分析及抗衰老活性研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 05, 15 May 2021 (2021-05-15), pages 1 - 181 *

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CN114478823B (zh) 2023-10-10

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