CN112592412B - 一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用 - Google Patents

一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用。本发明通过细胞实验证明所述岩藻聚糖硫酸酯能显著促进粒细胞‑巨噬细胞系造血祖细胞集落的形成，同时能促进骨髓基质细胞的增殖。通过体内实验进一步表明，所述岩藻聚糖硫酸酯能明显抑制环磷酰胺所致的小鼠白细胞的减少，中性粒细胞减少和血小板减少，提高小鼠的骨髓有核细胞数量。本发明中提供的岩藻聚糖硫酸酯具有拮抗化疗药物引起的骨髓抑制作用，可以作为一种功能性组分用于防治白细胞减少症的药物及功能制品开发。

Description

一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药 物和功能性制品中的应用
技术领域
本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用。
技术背景
白细胞减少症(Leukopenia)是肿瘤放化疗过程中常见的一种副作用，是指外周血液中的白细胞数目持续低于4×109个/L。若不及时治疗可继发严重感染并出现并发症等，严重威胁人类健康。因此抵抗癌症治疗引起的白细胞减少，是提高抗癌治疗质量的关键性因素。目前，临床上治疗白细胞减少症的药物主要有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、腺嘌呤、鲨肝醇等，然而他们的应用伴随着高治疗成本或大量的副作用，如发烧、骨痛和肌痛。因此，开发价廉效佳且低毒副作用的升高白细胞药物是临床上的迫切需要。
海洋糖类化合物是海洋药物开发的重要源泉，也是药物研究领域的热点。海茸岩藻聚糖硫酸酯主要来源于褐藻，是一类具有广泛生物活性的海洋硫酸多糖，在抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化及免疫调节方面均有较好的活性。国内外学者已经报道了很多关于岩藻聚糖硫酸酯的制备及应用的专利，如ZL 201410029573.7公开了一种低分子岩藻聚糖硫酸酯的制备及在治疗糖尿病肾病中的作用，CN11748045 A公开了一种亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯抗疱疹病毒作用及应用。CN370411288A公开了一种海参岩藻多糖在抗凝及刺激造血中的应用。但是，目前尚无关于海茸来源岩藻聚糖硫酸酯在制备治疗白细胞减少症及血小板减少症药物及功能制品方面的研究和应用报道。
发明内容
针对现有技术中治疗白细胞减少症的药物疗效不理想且价格昂贵的缺点，本发明提供了一种海茸岩藻聚糖硫酸酯及其在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用。本发明提供的海茸岩藻聚糖硫酸酯具有良好的抑制环磷酰胺所致的小鼠白细胞减少、中性粒细胞减少和血小板减少的作用，并能升高小鼠骨髓有核细胞的数量，促进骨髓基质细胞的增殖，显著促进粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞集落(colony forming unit-granulocyte/macrophage,CFU-GM)的形成。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种海茸岩藻聚糖硫酸酯，所述海茸岩藻聚糖硫酸酯来源于海茸，主链为α-1,3和α-1,4交替连接的岩藻糖，主链岩藻糖C2或C4羟基被硫酸基部分取代；所述主链岩藻糖C2或C4位还链接有以下支链：(1)支链由末端链接和1,4链接的岩藻糖组成，其中C4位羟基被硫酸基取代；和/或(2)支链由末端链接和(1→4)和(1→6)链接的半乳糖组成，其中(1→6)链接的半乳糖C4位羟基被硫酸基取代。
对上述技术方案的进一步改进：所述岩藻聚糖硫酸酯分子量为40～2000kDa，硫酸基含量5％～25％，所述岩藻糖的含量为10％～80％,所述半乳糖的含量为5％～30％。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯还含有葡萄糖、葡萄糖酸酸、N-乙酰氨基半乳糖、木糖、鼠李糖和甘露糖中的一种或多种。
对上述技术方案的进一步改进：所述葡萄糖的含量为1％～30％，所述葡萄糖酸酸的含量为5％～15％，所述N-乙酰氨基半乳糖的含量为2％～15％，所述木糖的含量为2％～10％，所述鼠李糖的含量为3％～15％，所述甘露糖的含量为1％-35％。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8中岩藻糖：半乳糖：葡萄糖的摩尔比为26.4：7.1：1.0，重均分子量为48.9kDa，硫酸基含量76.35％。
本发明提供了所述海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，包括以下步骤：
(1)将南极海茸洗净，烘干，粉碎，过筛制备得到藻粉；
(2)按照料液比1：5～1：20，加入CaCl2溶液(0.02～0.2mol/L)或稀盐酸(0.01～0.1mol/L)，提取2～4h，将提取液离心，收集上清液，除去藻渣；
(3)将上清液减压浓缩，向其中加入95％乙醇，至乙醇浓度为20％～30％，静置过夜，除去沉淀；向上清液中继续加入95％乙醇，至终浓度为70％以上，静置过夜，将获得的沉淀脱水后于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖；
(4)所述粗多糖经超滤分级或阴离子交换色谱柱，用浓度范围为0～2mol/L的NaCl溶液依次梯度洗脱，硫酸-苯酚法在490nm处检测吸光度，收集NaCl溶液洗脱组分，浓缩除盐，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯。
本发明还提供了海茸岩藻聚糖硫酸酯在制备防治白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯采用口服给药方式，剂量为100mg/kg-200mg/kg。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯显著增加白细胞减少症小鼠的白细胞数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯可增加白细胞减少症小鼠的中性粒细胞数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯可增加白细胞减少症小鼠的血小板数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯显著增加白细胞减少症小鼠的淋巴细胞数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯显著增加白细胞减少症小鼠骨髓有核细胞数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯显著增加小鼠骨髓有核细胞数量。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯明显促进粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞集落(CFU-GM)的形成。
对上述技术方案的进一步改进：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯明显促进骨髓基质细胞(BMSC)的增殖。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗白细胞减少症的药物或功能性制品，所述药物或功能性制品含有所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯。
本发明的优点和有益效果体现在：本发明提供了一种海茸来源的天然岩藻聚糖硫酸酯，通过单糖组成分析、红外光谱分析、甲基化分析和核磁共振波谱分析技术，完成其组成分析和结构表征。本发明具体通过实验证明了所述海茸岩藻聚糖硫酸酯能明显增加环磷酰胺所致的白细胞减少症小鼠白细胞数量、中性粒细胞数量和血小板数量，提高骨髓有核细胞数量，提高CFU-GM的形成，促进骨髓基质细胞的增殖。本发明通过一系列实验证明提供的海茸岩藻聚糖硫酸酯可以用于制备防治白细胞减少症的药物及功能制品。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯核磁分析图谱。
图2表明本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯和墨角藻来源岩藻聚糖硫酸酯对小鼠骨髓DNA含量的影响。
图3表明本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯对正常小鼠CFU-GM数量的影响。
图4表明本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺造模骨髓抑制小鼠CFU-GM数量的影响。
图5表明本发明所述不同理化性质海茸岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺造模骨髓抑制小鼠CFU-GM数量的影响。
图6表明本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺造模骨髓抑制小鼠骨髓基质细胞增殖的影响。
图7表明本发明所述不同理化性质的海茸岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺造模骨髓抑制小鼠骨髓基质细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1、海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备(方法1)
将海茸洗净，烘干，粉碎，过20目筛。准确称取藻粉200g，按照料液比1：10，加入0.05mol/L的稀盐酸2L，60℃提取4h。将提取液4000rpm离心15min，收集上清液，除去藻渣。提取上清液减压浓缩至总体积的1/5，向其中加入95％乙醇，至乙醇浓度为20％，静置过夜，获得沉淀组分HR-1。向上清液中继续加入95％乙醇，至终浓度为70％，静置过夜，将获得的沉淀于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖。粗多糖配制成浓度为2％的水溶液，采用30kDa超滤膜分级后，滤出液浓缩干燥，即得HR-2。
实施例2、海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备(方法2)
将海茸洗净，烘干，粉碎，过20目筛。准确称取藻粉200g，按照料液比1：20，加入0.1mol/L的CaCl2 2L，70℃提取4h。将提取液4000rpm离心15min，收集上清液，除去藻渣。提取上清液减压浓缩至总体积的1/5，向其中加入95％乙醇，至乙醇浓度为20％，静置过夜，除去沉淀。向上清液中继续加入95％乙醇，至终浓度为70％，静置过夜，将获得的沉淀于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖。粗多糖配制成浓度为2％的水溶液，采用30kDa超滤膜分级后，滤出液浓缩，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-3。
实施例3、海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备(方法3)
将海茸洗净，烘干，粉碎，过20目筛。准确称取藻粉200g，按照料液比1：10，加入0.2mol/L的氯化钙-0.05mol/L稀盐酸混合溶液2L，50℃提取4h。将提取液4000rpm离心15min，收集上清液，除去藻渣。提取上清液减压浓缩至总体积的1/5，向其中加入95％乙醇，至乙醇浓度为30％，静置过夜，除去沉淀。向上清液中继续加入95％乙醇，至终浓度为80％，静置过夜，将获得的沉淀于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖。粗多糖经阴离子交换色谱柱QSepharose Fast Flow，用浓度为0、0.5和2mol/L NaCl依次洗脱各2个柱体积，硫酸-苯酚法在490nm处检测吸光度，收集0.5和2mol/L NaCl洗脱组分，浓缩除盐，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-4和HR-5。
实施例4、海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备(方法4)
本发明采用氯化钙水溶液提取法从褐藻-南极海茸中提取得到粗多糖，再进一步经阴离子交换色谱法分离纯化获得本发明中的海茸岩藻聚糖硫酸酯。
将海茸洗净，烘干，粉碎，过20目筛。准确称取藻粉200g，按照料液比1：10，加入0.1mol/L的CaCl2 2L，65℃提取4h。将提取液4000rpm离心15min，收集上清液，除去藻渣。提取上清液减压浓缩至总体积的1/5，向其中加入95％乙醇，至乙醇浓度为20％，静置过夜，除去沉淀。向上清液中继续加入95％乙醇，至终浓度为70％，静置过夜，将获得的沉淀于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖。粗多糖经阴离子交换色谱柱Q Sepharose Fast Flow，用浓度为0、0.5、1、2mol/L NaCl依次洗脱各2个柱体积，硫酸-苯酚法在490nm处检测吸光度，收集0.5、1、2mol/L NaCl洗脱组分，浓缩除盐，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-6、HR-7和HR-8。
此外，采用方法4制备获得的墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯。2mol/L NaCl洗脱组分，浓缩除盐，冷冻干燥即得到墨角藻岩藻聚糖硫酸酯FUC-4。
实施例5、海茸岩藻聚糖硫酸酯的理化性质测定及结构表征
1、理化性质及单糖组成分析
采用HPGPC法测定实施例1～实施例4制备获得的海茸岩藻聚糖硫酸酯和墨角藻来源岩藻聚糖硫酸酯FUC-4分子量，采用PMP-柱前衍生HPLC法测定单糖组成，采用氯化钡-明胶比浊法测定样品硫酸根含量。本发明制得的海茸岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量，硫酸根，单糖组成结果如表1所示。
所得岩藻聚糖硫酸酯为分子量为40～2000kDa、硫酸基含量5％～25％的岩藻聚糖硫酸酯。所制备得到的岩藻聚糖硫酸酯单糖组成主要包括含量为10％～80％的岩藻糖(Fuc)和含量为5％～30％的半乳糖(Gal)，还含有含量为1％～35％的甘露糖(Man)、含量为1％～30％的葡萄糖(Glc)、含量为5％～15％的葡萄糖醛酸(GlcA)、含量为2％～15％的N-乙酰氨基半乳糖(GalN)、含量为2％～10％的木糖(Xyl)和含量为3％～15％的鼠李糖(Rha)中的一种或几种，本发明所述的含量以峰面积归一化法计。
表1海茸岩藻聚糖硫酸酯理化性质及单糖组成分析结果
Figure BDA0002812840470000061
2、海茸岩藻聚糖硫酸酯结构表征
分别采用红外光谱分析，核磁共振波谱分析和甲基化分析方法对纯化后的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8进行结构表征。
(1)红外光谱分析：HR-8红外图谱中，1256cm-1处为不对称O＝S＝O伸缩振动，表明多糖中存在硫酸基。在820-840cm-1之间的特征吸收，表明硫酸酯可能位于C-2/C-3的赤道位置，也可能存在于C-4的轴向位置。
表2海茸岩藻聚糖硫酸酯(HR-8)红外光谱分析
Figure BDA0002812840470000071
(2)甲基化分析。甲基化实验结果(表3所示)表明，HR-8主要由1→3和1→4连接的岩藻糖组成，存在少量的1→2连接的岩藻糖。海茸岩藻聚糖硫酸酯中存在1→6和1,4,6-连接的半乳糖，1→6-连接的半乳糖残基的C4位羟基可能被硫酸化。海茸岩藻聚糖硫酸酯中存在少量1→3和1,3,6-连接的葡萄糖。
表3海茸岩藻聚糖硫酸酯(HR-8)甲基化GC-MS分析实验结果
Figure BDA0002812840470000072
PMAA：部分甲基化糖醇乙酸酯
(3)核磁波谱分析。通过核磁共振分析进一步表征HR-8的结构(图1)。在1H-NMR和13C-NMR的局部放大细节中观察到再低场区五个质子和碳信号(图1A和1B)。HR-8的信号归属见表4。在δ99.5/5.43、δ100.2/5.39、δ101.8/5.35、δ101.4/5.31和δ100.6/5.23处的C-1/H-1交叉峰分别归属于残基A-E(表4)。结果表明，HR-8中存在以下残基：→4)-α-L-Fuc(2SO3 -)-(1→，→4)-α-L-Fuc-(1→，→3,4)-α-L-Fuc-(1→，→3)-α-L-Fuc(4SO3 -)-(1→和α-L-Fuc(4SO3 -)-(1→，与甲基化结果一致。通过HMBC图谱分析(图1C)，可发现H-1A-C-4C、H-1D-C-4A、H-1E-C-4C和H-1D-C-3C之间的连接信号，表明存在A-(1→4)-C，D-(1→4)-A连接。因此，HR-8分子结构主链为3-α-L-Fuc和4-α-L-Fuc残基的交替链接，即→3)-α-L-Fuc-(1→4)-α-L-Fucp-(1→4)-α-L-Fuc-(1→)，在C-4或C-2位置硫酸化，在C-4位上存在α-L-Fuc(4SO3 -)-(1→分支结构。
表4海茸岩藻聚糖硫酸酯(HR-8)的NMR结构分析结果
Figure BDA0002812840470000081
实施例6、不同海藻来源的岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少症的作用
按照国际公认的方法，评价了本发明所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯和墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少症的作用。
小鼠腹腔注射环磷酰胺造成白细胞减少症模型，观察海茸岩藻聚糖硫酸酯对小鼠外周血中白细胞数量的影响，并测定小鼠骨髓DNA含量以反映骨髓有核细胞数量。
具体实验方法如下：昆明种小鼠70只，按体重随机分为7组，正常对照组，模型对照组，碳酸锂阳性对照组(150mg/kg)，海茸岩藻聚糖硫酸酯(HR-8)两个剂量组(低剂量组100mg/kg，高剂量组200mg/kg)，墨角藻来源岩藻聚糖硫酸酯(FUC-4)两个剂量组(低剂量组100mg/kg，高剂量组200mg/kg)。各组动物灌胃(ig)给药，正常组和模型组给予蒸馏水。给药第9天，除正常对照组外，各组均腹腔注射(ip)环磷酰胺60mg/kg，连续3天，末次给环磷酰胺后第3天，进行以下实验：
(1)各组动物取血进行血象分析，结果见表5。表5中，除正常组外，其余各组均注射环磷酰胺造模。正常组和模型组给予水，阳性药组灌胃给予碳酸锂，剂量为150mg/kg；海茸岩藻聚糖硫酸酯低、高两个剂量组的剂量分别为100mg/kg、200mg/kg。墨角藻岩藻聚糖硫酸酯低、高两个剂量组的剂量分别为100mg/kg、200mg/kg。
由表5可见，小鼠腹腔注射环磷酰胺60mg/kg，连续3天，可使小鼠外周血白细胞明显下降，与正常对照组比较，有极显著性差异。小鼠经海茸岩藻聚糖硫酸酯灌胃14天，两个剂量组都能升高白细胞减少症小鼠的白细胞数量，与模型组比较有极显著性差异，P<0.01。从表5还可以看出，本发明所述海茸岩藻聚糖硫酸酯升高白细胞的作用优于阳性药碳酸锂，且优于墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯(FUC-4)。
表5不同来源岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺抑制小鼠血细胞的影响
Figure BDA0002812840470000091
Figure BDA0002812840470000092
与正常对照组比较，##，P<0.01。与模型组比较，*，P<0.05；**，P<0.01。
(2)小鼠处死后，置75％酒精中消毒，无菌条件下分离一侧股骨，剪开股骨两端，用1mL无菌注射器吸取0.005mol/L CaCl2溶液(10mL)将骨髓细胞冲出，置于15mL离心管中，4℃冰箱放置30min，2500rpm/min离心15min，弃上清，加0.2mol的HClO4(3mL)充分混合，90℃加热15min，冷却，过滤，滤液用紫外分光光度计测定紫外吸收OD值，结果见图2。图2中，分组及给药情况同表5。纵坐标表示小鼠骨髓DNA含量。与正常对照组比较，##，P<0.01。与模型组比较，*，P<0.05，**，P<0.01。
从图2可以看出，各组动物骨髓DNA含量的变化趋势与外周血中白细胞的变化趋势一致。正常动物的一侧股骨的骨髓DNA含量记为100％，注射环磷酰胺后，模型组动物股骨中骨髓DNA含量明显降低，与正常组比较，有极显著性差异。所述海茸岩藻聚糖硫酸酯两个剂量组均能明显增加小鼠骨髓DNA含量，与模型组比较，有显著和极显著性差异(P＜0.05和P<0.01)，且优于墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯(FUC-4)。
实施例7、海茸岩藻聚糖硫酸酯体外给药对粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞集落(CFU-GM)的影响
利用体外琼脂培养法，研究了海茸岩藻聚糖硫酸酯体外给药，对正常小鼠骨髓细胞和环磷酰胺抑制小鼠骨髓细胞CFU-GM的影响。
(1)对正常小鼠骨髓细胞CFU-GM形成的作用：取正常小鼠，分离骨髓细胞，取RPMI-1640培养液将骨髓细胞调整至浓度1×106/mL进行集落培养。实验组分别加不同浓度的药物，使其终浓度分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，对照组加同体积的RPMI-1640培养液。将上述培养体系加入24孔板中，每孔0.5mL，置37℃、5％CO2培养箱中培养。7天后，在倒置显微镜下进行集落计数，凡含50个以上细胞的集落即为一个CFU-GM集落。结果见图3。图3中，正常组为不加药的对照组；海茸岩藻聚糖硫酸酯五个给药组的剂量分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，纵坐标表示CFU-GM集落的数量。与正常对照组比较，**，P<0.01；*，P<0.05。
从图3可以看出，利用琼脂体外培养法，海茸岩藻聚糖硫酸酯能明显促进CFU-GM集落的形成，与正常对照组比较，有显著性差异。
(2)对环磷酰胺抑制小鼠骨髓细胞CFU-GM形成的作用：分别取环磷酰胺处理的小鼠和正常小鼠，常规分离骨髓细胞，取RPMI-1640培养液将骨髓细胞调整至浓度1×106/mL进行集落培养。实验组分别加阳性药碳酸锂和不同浓度的药物(6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)，培养7天后，在倒置显微镜下进行集落计数。结果见图4。图4中纵坐标表示CFU-GM集落的数量。与正常对照组相比，##，P<0.01；与模型对照组相比，**，P<0.01；*，P<0.05。
琼脂体外培养法形成的每一个造血祖细胞集落都来源于一个细胞。粒细胞是由粒-巨噬系造血祖细胞增殖分化而来的，因此体外培养观察CFU-GM的形成，可以反映白细胞生成能力的大小。CFU-GM越多，说明机体有更多的造血祖细胞，也就有更多的细胞来发育分化为白细胞。
从图4可以看出，100μmol的环磷酰胺可明显抑制小鼠骨髓CFU-GM的形成，与正常组比较，有显著性差异。海茸岩藻聚糖硫酸酯能明显升高CFU-GM的数量，与模型组比较，有极显著性差异。并且在6.25μg/mL到25μg/mL范围内，有明显的量效关系，即随着药物浓度的增加，其促进CFU-GM的作用逐渐增强，到25μg/mL时达到最大作用。
(3)研究了不同理化性质海茸岩藻聚糖(HR-1,HR-3和HR-8)体外给药，对环磷酰胺抑制小鼠骨髓细胞CFU-GM形成的作用。
分别取环磷酰胺处理的小鼠和正常小鼠，常规分离骨髓细胞，取RPMI-1640培养液将骨髓细胞调整至浓度1×106/mL进行集落培养。实验组分别加阳性药碳酸锂和不同海茸岩藻聚糖(25μg/mL)，培养7天后，在倒置显微镜下进行集落计数。结果见图5。图5中纵坐标表示CFU-GM集落的数量。与正常对照组相比，##，P<0.01；与模型对照组相比，**，P<0.01。
从图5可以看出，在相同剂量下，海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8明显升高CFU-GM的数量，与模型组比较，有极显著性差异，而HR-1和HR-3作用不明显。
实施例8、海茸岩藻聚糖硫酸酯对骨髓基质细胞(BMSC)增殖的影响
采用MTT法，研究了海茸岩藻聚糖硫酸酯对环磷酰胺抑制小鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖的影响。
(1)取环磷酰胺抑制小鼠(小鼠腹腔注射环磷酰胺60mg/kg，连续3d第4d进行试验，分离骨髓细胞，用20％FBS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml。取96孔板，每孔加入160μL细胞悬液，再分别加入40μL不同浓度的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8，使终浓度分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，空白对照组加等体积的培养液。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养7天后，MTT法测定骨髓基质细胞的增殖。结果见图6。图6中，各组为相对模型对照组的增殖率，海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8给药组的剂量分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL。与模型对照组比较，**，P<0.01；*，P<0.05。
骨髓基质细胞是造血微环境中起重要作用的部分，它对造血干/祖细胞起支持和营养作用，并调节造血干细胞和祖细胞的增殖和分化。促进BMSC的增殖可维持正常的造血微环境，调节和恢复造血功能。
从图6可以看出，五个浓度组的海茸岩藻聚糖硫酸酯对小鼠骨髓基质细胞有明显的促进增殖作用，效果优于阳性药碳酸锂。并且在6.25μg/mL到50μg/mL范围内，有明显的量效关系，即随着药物浓度的增加，其促进BMCS增殖的作用逐渐增强，到50μg/mL时达到最大作用。
(2)研究了不同理化性质海茸岩藻聚糖(HR-1,HR-3和HR-8)体外给药，对环磷酰胺抑制小鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖的影响。
细胞处理同上所述，取96孔板，每孔加入160μL细胞悬液，再分别加入40μL不同的海茸岩藻聚糖硫酸酯，使化合物终浓度分别为12.5μg/mL和25μg/mL，空白对照组加等体积的培养液。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中培养7天后，MTT法测定骨髓基质细胞的增殖，结果见图7。各组为相对模型对照组的增殖率，与对模型对照组比较，**，P<0.01；*，P<0.05。
从图7中可知，海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-1,HR-3和HR-8在12.5μg/mL和25μg/mL两个剂量下均能显著促进BMCS增殖，其中HR-8效果最优。
综上，本实验结果表明海茸岩藻聚糖硫酸酯能明显抑制环磷酰胺引起所致的小鼠白细胞的减少，提高小鼠骨髓有核细胞的数量，促进小鼠骨髓基质细胞(BMSC)的增殖，对正常小鼠和环磷酰胺抑制小鼠的CFU-GM的形成，均有促进作用。以上结果说明，海茸岩藻聚糖硫酸酯对造血系统的作用是多方面的，既有直接的促进造血祖细胞增殖的作用，又有间接通过促进造血微环境来提高机体造血功能的作用。
本发明的产品来源于海藻，具有资源丰富、成本低廉和安全性高等诸多优点，在动物水平和细胞水平上证明其具有较好的升高白细胞和血小板的作用，为开发临床上有效的，价格低廉，无毒副作用的防治白细胞减少症和血小板减少症药物提供了理论依据。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种海茸岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将南极海茸洗净，烘干，粉碎，过筛制备得到藻粉；
（2）按照料液比1：5~1：20，加入0.02mol/L~0.2mol/L的CaCl2溶液，提取2h~4h，将提取液离心，收集上清液，除去藻渣；
（3）将上清液减压浓缩，向其中加入95%乙醇，至乙醇浓度为20%~30%，静置过夜，除去沉淀；向上清液中继续加入95%乙醇，至终浓度为70%以上，静置过夜，将获得的沉淀脱水后烘干，获得粗多糖；
（4）所述粗多糖经阴离子交换色谱柱，用浓度为0、0.5、1、2 mol/L NaCl依次梯度洗脱，硫酸-苯酚法在490 nm处检测吸光度，收集2 mol/L NaCl溶液洗脱组分，浓缩除盐，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8。
2.权利要求1所述的制备方法制得的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8。
3.一种海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8，其特征在于：所述HR-8分子结构主链为3-α-L-Fuc和4-α-L-Fuc残基的交替链接，在C-4或C-2位置硫酸化，在C-4位上存在α-L-Fuc（4SO3 -）-（1→分支结构；硫酸根含量23.13%，分子量Mw为48.9kDa，葡萄糖 2.9%，半乳糖 20.8%，岩藻糖76.3%。
4.权利要求2或3所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8在制备防治化疗引起的白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用。
5.根据权利要求4所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8在制备防治化疗引起的白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用，其特征在于：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯增加白细胞减少症小鼠的白细胞数量、中性粒细胞数量和血小板数量。
6.根据权利要求4所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8在制备防治化疗引起的白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用，其特征在于：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯增加白细胞减少症小鼠的淋巴细胞数量。
7.根据权利要求4所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8在制备防治化疗引起的白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用，其特征在于：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯增加小鼠骨髓有核细胞数量。
8.根据权利要求4所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8在制备防治化疗引起的白细胞减少症的药物和功能性制品中的应用，其特征在于：所述海茸岩藻聚糖硫酸酯能促进粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞集落的形成和骨髓基质细胞的增殖。
9.一种用于预防和/或治疗化疗引起的白细胞减少症的药物或功能性制品，其特征在于，所述药物或功能性制品含有权利要求2或3所述的海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-8。
10.海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-1或HR-3在制备防治化疗引起的白细胞减少症药物和功能制品中的应用，其特征在于：所述HR-1或HR-3是通过促进骨髓基质细胞增殖达到防治化疗引起的白细胞减少症；
所述HR-1通过以下制备方法制得：
（1）将南极海茸洗净，烘干，粉碎，过筛制备得到藻粉；
（2）按照料液比1：5~1：20，加入0.01~0.1mol/L稀盐酸，提取2~4h，将提取液离心，收集上清液，除去藻渣；
（3）将上清液减压浓缩，向其中加入95%乙醇，至乙醇浓度为20%~30%，静置过夜，获得沉淀组分即海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-1；
所述HR-3通过以下制备方法制得：
（1）将南极海茸洗净，烘干，粉碎，过筛制备得到藻粉；
（2）按照料液比1：5~1：20，加入0.02~0.2mol/L的CaCl2溶液，提取2~4h，将提取液离心，收集上清液，除去藻渣；
（3）将上清液减压浓缩，向其中加入95%乙醇，至乙醇浓度为20%~30%，静置过夜，除去沉淀；向上清液中继续加入95%乙醇，至终浓度为70%以上，静置过夜，将获得的沉淀脱水后于50℃烘箱中烘干，获得粗多糖；
（4）所述粗多糖经30kDa超滤膜分级，滤出液经浓缩，冷冻干燥即得到海茸岩藻聚糖硫酸酯HR-3。
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