CN103554304B - 用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，将鲟鱼脊骨烫浸，剔除软骨上少量残留物，切块、水洗、干燥、粉碎、过筛；加NaOH在温水浴中提取鲟鱼硫酸软骨素提取液；调pH加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶酶解、灭酶，调pH，用活性炭脱色，过滤；加入80%-95%乙醇，干燥、粉碎；用草酸降解，通过剂量为5-15kGy钴60γ射线辐照，调pH，加入乙醇，取沉淀，干燥，用行星式齿轮球磨机球磨，得分子量范围在5000至20000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品。本发明采用辐照降解结合超微粉碎技术，可以降低硫酸软骨素的分子量，提高硫酸软骨素的生物利用率，且物理方法简便易行，处理过程无污染，生产成本低、产品纯度高，适合工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素的制备方法，具体涉及一种用鲟鱼脊骨，采用辐照降解结合超微粉碎制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)是来自动物软骨组织的一类天然的酸性黏多糖。研究表明CS在心血管疾病、关节病的防治等方面具有重要的作用，作为保健食品或保健药品长期应用于防止冠心病、心绞痛、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血等疾病，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率，对肿瘤也具有抑制作用。CS也是国内外流行的保健品和化妆品以及医药品的重要原料。
随着鲟鱼养殖在我国迅猛发展，现在我国已成为世界第一鲟鱼养殖大国。尤其是鲟鱼的头、脊索、鳍中软骨占鱼体的10%左右，是比较理想的软骨来源。硫酸软骨素目前的生产工艺很多，但都有其不完善的地方。浓碱提取工艺产品颜色较深，且废碱液对环境的危害较大；稀碱提取工艺蛋白质含量和氮含量较高，生产周期较长；稀碱浓盐提取工艺，产率和纯度都不高。其中碱解一酶法生产的产品质量较高，且大大缩短了生产周期，但最佳的工艺条件没有确定，需要进一步优化提取条件，提高产品质量，缩减生产成本。多糖相对分子质量（简称分子量）的大小对其生物活性的发挥有着重要影响。低分子量硫酸软骨素具有生物利用率高和活性强的优点。目前国内采用辐照降解结合超微粉碎制备低分子量硫酸软骨素的方法还鲜有报到。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种可降低硫酸软骨素的分子量，提高硫酸软骨素的生物利用率，方法简便易行，处理过程无污染，生产成本低、产品纯度高，适合工业化大生产的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法。
本发明目的的实现方式为，用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，具体步骤如下：
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入60℃-100℃水中烫浸5-20分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，50℃-80℃干燥4-8h，粉碎，过20目的筛；
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加5-10倍量5%-10%的NaOH，于30-60℃的水浴中搅拌提取3-6h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至7-9，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶1.5%-5%，40℃-60℃保温水解3-6h，取出于80℃-100℃热水中灭酶；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合质量比1：1；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至6-8，加溶液体积10%-20%的活性炭于50℃-80℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至5-7，边搅拌边加入80%-95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%-80%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次，50℃-80℃控温干燥2-5h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%-15%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5%-15%，降解时间1-2小时，反应温度50-70℃，然后通过钴60γ射线辐照，调pH至5-7，边搅拌边加入80%-95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%-80%，室温静置过夜，取沉淀，于50℃-80℃干燥2-5h，利用行星式齿轮球磨机，球磨5～15h，得低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品；
钴60γ射线辐照剂量为5-15kGy。
本发明制备的鲟鱼硫酸软骨素产品分子量范围在5000至20000道尔顿之间，得率35%-40%。
本方法采用辐照降解结合超微粉碎技术，可以降低硫酸软骨素的分子量，提高硫酸软骨素的生物利用率，且物理方法简便易行，处理过程无污染，生产成本低、产品纯度高，适合工业化大生产。
具体实施方式
本发明的具体步骤是：
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入60℃-100℃水中烫浸5-20分钟，较佳的是投入90℃水中烫浸10分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，50℃-80℃干燥4-8h。较佳的是60℃干燥7h，粉碎，过20目的筛。
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加5-10倍量5%-10%的NaOH，于30-60℃的水浴中搅拌提取3-6h。较佳的是加7倍量10%的NaOH，于40℃的水浴中搅拌提取4.5h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；此条件下，硫酸软骨素的得率为30%-40%。
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至7-9，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶1.5%-5%，40℃-60℃保温水解3-6h，取出于80℃-100℃热水中灭酶；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合质量比1：1；
较佳的是调pH至8.5，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶2.5%，55℃保温水解5h。
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至6-8，加溶液体积10%-20%活性炭于50℃-80℃水浴脱色，过滤。
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至5-7，边搅拌边加入80%-95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%-80%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次，50℃-80℃控温干燥2-5h，粉碎；此条件下，所得硫酸软骨素得率为30％-50%。
较佳的是调pH至7，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，60℃控温干燥4h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%-15%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5%-15%，降解时间1-2小时，反应温度50-70℃，然后通过钴60γ射线辐照，钴60γ射线辐照剂量为5-15kGy。调pH至5-7，边搅拌边加入80%-95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%-80%，室温静置过夜，取沉淀，于50℃-80℃干燥2-5h，利用行星式齿轮球磨机，球磨5～15h，得分子量范围在5000至20000道尔顿之间的低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品。
较佳的是硫酸软骨素配成5%-15%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5%-10％草酸降解，然后通过8kGy钴60γ射线辐照，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，室温静置过夜，取沉淀，于60℃干燥4h，利用行星式齿轮球磨机，球磨10h。钴60γ射线辐照剂量为8kGy。
下面用具体实施例详述本发明。
实施例1：
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入90℃水中烫浸10分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，60℃干燥7h，粉碎，过20目的筛（颗粒大小≦0.9cm）；
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加7倍量6%的NaOH，于40℃的水浴中搅拌提取4.5h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至8.5，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶2.5%，55℃保温水解5h，取出于85℃热水中灭酶；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合质量比1：1；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至7，加溶液体积20%活性炭于60℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至7，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次60℃控温干燥4h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在10%，降解时间2小时，反应温度70℃，然后通过8kGy钴60γ射线辐照，调pH至7，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，室温静置过夜，取沉淀，于60℃干燥4h，利用行星式齿轮球磨机，球磨10h，得分子量为15000-20000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品，得率38%。
实施例2、同例1，不同的是，
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加8倍量6%的NaOH，于40℃的水浴中搅拌提取4.5h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至8.5，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶3.5%，60℃保温水解4h，取出于80℃热水中灭酶；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至6，加溶液体积20%活性炭于60℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至7，边搅拌边加入90%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次60℃控温干燥4h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在15%，降解时间2小时，反应温度70℃，然后通过10kGy钴60γ射线辐照，调pH至7，利用行星式齿轮球磨机，球磨15h，得分子量为10000-15000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品，得率39%。
实施例3、同例1，不同的是，
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入90℃水中烫浸20分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，70℃干燥6h，粉碎，过20目的筛（颗粒大小≦0.9cm）；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至8.5，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶5%，60℃保温水解5h，取出于80℃热水中灭酶；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至7，加溶液体积10%活性炭于50℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至5，边搅拌边加入80%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次60℃控温干燥4h，粉碎；
（6）然后通过15kGy钴60γ射线辐照，球磨15h，得分子量为5000-8000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品，得率40%。
实施例4、同例1，不同的是，
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入60℃水中烫浸5分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，50℃干燥4h，粉碎，过20目的筛（颗粒大小≦0.9cm）；
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加10倍量5%的NaOH，于30℃的水浴中搅拌提取6h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至7，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶1.5%，40℃保温水解6h，取出于90℃热水中灭酶；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至8，加溶液体积15%活性炭于60℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至6，边搅拌边加入85%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为60%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次50℃控温干燥5h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在8%，降解时间2小时，反应温度50℃，然后通过5kGy钴60γ射线辐照，调pH至5，边搅拌边加入80%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50%，室温静置过夜，取沉淀，于50℃干燥5h，利用行星式齿轮球磨机，球磨5h，得分子量为12000-20000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品，得率35%
实施例5、同例1，不同的是，
（1）制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入60℃水中烫浸20分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，80℃干燥7h，粉碎，过20目的筛（颗粒大小≦0.9cm）；
（2）提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤（1）得到的鲟鱼脊骨颗粒加5倍量5%的NaOH，于80℃的水浴中搅拌提取4h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
（3）鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤（2）得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至7，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶5%，60℃保温水解3h，取出于100℃热水中灭酶；
（4）脱色工艺：将步骤（3）灭酶的溶液调pH至7，加溶液体积10%活性炭于80℃水浴脱色，过滤；
（5）将步骤（4）所得滤液调pH至7，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为80%，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次80℃控温干燥2h，粉碎；
（6）低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤（5）得到的硫酸软骨素配成5%溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5%，降解时间1小时，反应温度60℃，然后通过10kGy钴60γ射线辐照，调pH至6，边搅拌边加入95%乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70%，室温静置过夜，取沉淀，于80℃干燥2h，利用行星式齿轮球磨机，球磨12h，得分子量为16000-20000道尔顿低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品，得率36%。
Claims (6)
1.用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备鲟鱼脊骨颗粒：将鲟鱼脊骨投入60℃-100℃水中烫浸5-20分钟，取出，剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，切成2-5cm长度小块，水洗两次，50℃-80℃干燥4-8h，粉碎，过20目的筛；
(2)提取鲟鱼硫酸软骨素：将步骤(1)得到的鲟鱼脊骨颗粒加5-10倍量5％-10％的NaOH，于30-60℃的水浴中搅拌提取3-6h，得鲟鱼硫酸软骨素提取液；
(3)鲟鱼硫酸软骨素的酶解：将步骤(2)得到的鲟鱼硫酸软骨素提取液调pH至7-9，加胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶1.5％-5％，40℃-60℃保温水解3-6h，取出于80℃-100℃热水中灭酶；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合质量比1：1；
(4)脱色工艺：将步骤(3)灭酶的溶液调pH至6-8，加溶液体积10％-20％的活性炭于50℃-80℃水浴脱色，过滤；
(5)将步骤(4)所得滤液调pH至5-7，边搅拌边加入80％-95％乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50％-80％，室温静置过夜，取沉淀无水乙醇脱水两次，50℃-80℃控温干燥2-5h，粉碎；
(6)低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备工艺：将步骤(5)得到的硫酸软骨素配成5％-15％溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5％-15％，降解时间1-2小时，反应温度50-70℃，然后通过钴60γ射线辐照，调pH至5-7，边搅拌边加入80％-95％乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为50％-80％，室温静置过夜，取沉淀，于50℃-80℃干燥2-5h，利用行星式齿轮球磨机，球磨5～15h，得低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品；
钴60γ射线辐照剂量为5-15kGy。
2.根据权利要求1所述的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于在所述的步骤(1)中投入90℃水中烫浸10分钟，取出，切成小块，水洗两次，60℃干燥7h。
3.根据权利要求1所述的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于在所述的步骤(2)中以7倍量6％的NaOH为溶剂溶解鲟鱼脊骨颗粒，于40℃的水浴中搅拌提取4.5h。
4.根据权利要求1所述的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于在所述的步骤(3)中将步骤(2)得到的浸提液调pH至8.5，加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶2.5％，55℃保温水解5h。
5.根据权利要求1所述的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于在所述的步骤(5)中滤液调pH至7，加入95％乙醇至体系的乙醇浓度为70％，无水乙醇脱水2次，60℃控温干燥4h。
6.根据权利要求1所述的用鲟鱼脊骨制备低分子量鲟鱼硫酸软骨素的方法，其特征在于在所述的步骤(6)中硫酸软骨素配成5％-15％溶液，加入草酸使体系草酸浓度控制在5％-10％草酸降解，通过照剂量为8kGy钴60γ射线辐照，调pH至7，边搅拌边加入95％乙醇至醇沉体系的乙醇浓度为70％，室温静置过夜，取沉淀，于60℃干燥4h，利用行星式齿轮球磨机，球磨10h，得低分子量鲟鱼硫酸软骨素产品；
钴60γ射线辐照剂量为8kGy。
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