CN1259427C - 一种葡甘露寡聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是将质量分数为2%的魔芋精粉溶解在按纯酶计质量分数为1%的葡甘露寡聚糖酶液中水浴酶解得到，其中葡甘露寡聚糖酶是通过绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC3.2942的菌种在含有魔芋精粉的斜面培养基中培养，菌曲培养，酶液抽提等步骤得到的。本发明采用纯生物制备，制备工艺简单、安全，并且成本低，得到的葡甘露寡聚糖生物活性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种葡甘露寡聚糖的制备方法，具体来说涉及一种通过自制的葡甘露寡糖酶水解魔芋精粉制备葡甘露寡聚糖的方法。
背景技术
国内外目前制备葡甘露寡聚糖的方法多以微生物(主要是酵母)的细胞壁提取为主，因此受原材料来源匮乏，提取方法复杂及得率低等因素的制约，葡甘露寡聚糖的应用受到影响。由此，寻找来源丰富、制备工艺简单、得率高的途径来制备葡甘露寡聚糖就有着重大的意义了。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原材料来源丰富，制备工艺简单，高利率、高活性的葡甘露寡聚糖的制备方法。
本发明以资源丰富的魔芋精粉为原料，通过特定的自制的葡甘露寡聚糖酶，并以温和简单的工艺，制备高纯度、高活性的葡甘露寡聚糖，从而实现了本发明的目的。
本发明的葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)菌种培养：其中菌种是绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC3.2942，培养基以质量份数计，由蔗渣6份，麸皮2份，魔芋精粉0.5份，(NH4)2SO4 2份，KH2PO4 1份，MgSO4 0.05份，琼脂1.5份，水100份组成；以常规的方法制备斜面培养基培养菌种，得到斜面种；
(2)菌曲培养：将斜面种以常规方法制成孢子悬液，并将孢子悬液放入有培养基的瓶中28℃下进行4天菌曲培养，所述的培养基由质量比为1∶2.2的固体培养基和营养盐水组成，其中固体培养基以质量分数计，由蔗渣70％，麸皮27％，魔芋精粉3％组成，营养盐水以质量分数计，由(NH4)2SO4 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4 0.025％和水99.425％组成；
(3)酶液抽提：培养好的菌曲加32℃蒸馏水，30℃恒温浸提，过滤除渣，滤液离心分离，上清液为葡甘露寡聚糖酶粗酶液；
(4)魔芋精粉酶解：将葡甘露寡聚糖酶液用蒸馏水配成按纯酶计质量分数为1％的酶液，搅拌中加入质量分数为2％的魔芋精粉，溶解后置40℃水浴酶解2h，酶解结束后，80℃下维持20min灭酶活并冷却，得液体葡甘露寡聚糖。
本发明所用菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCC3.2942。
上述技术措施的优选方案和条件如下：步骤1所述的培养基的制备是先将琼脂用水煮溶，再将魔芋精粉，(NH4)2SO4，KH2PO4和MgSO4溶解，趁热加入蔗渣、麸皮充分混匀；
步骤2所述的培养基的制备方法是先将魔芋精粉加入营养盐水中溶涨，再与蔗渣和麸皮充分混匀；
步骤3的恒温浸提时间是2h，滤液在5000r/min的转速下离心时间是15min；所述的粗酶液最好提纯成固体酶粉，方法是在冰浴下边搅拌边缓慢地加入预冷乙醇，使乙醇浓度达65％，4℃下静置，最好静置3h，弃上层清液，沉淀在5000r/min的转速下离心，最好离心20min，得粗酶泥，粗酶泥用溶酶洗脱液溶解，溶酶洗脱液中酶泥和洗脱液的质量比是1∶8，其中洗脱液pH＝5.4，由硝酸钾、氯化钙、柠檬酸钠各2mg溶于1000mL水中制成；溶解后的酶液在5000r/min的转速下离心提纯，最好离心20min，得纯酶液。
本发明得到的液体葡甘露寡聚糖经过超滤或真空减压浓缩，浓缩液经喷雾干燥得到粉状葡甘露寡聚糖。
本发明采用纯生物制备，制备工艺简单、安全，并且成本低，得到的葡甘露寡聚糖生物活性高。
具体实施方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1：
将1.5g琼脂用100mL水煮溶，并将魔芋精粉0.5g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.05g溶解，趁热加入蔗渣6g、麸皮2g并充分混匀，将培养基铺开冷却，切成条状，适量装入试管中，0.11MPa灭菌30min摆成斜面，接入绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC3.2942，得到斜面种一支，并制得孢子悬液100mL。
把(NH4)2SO4 1.1g，KH2PO4 0.11g，MgSO4 0.055g加入218.735g蒸馏水中制成220g营养盐水。将魔芋精粉3g加入营养盐水中溶涨，再与蔗渣70g，麸皮27g充分混匀，得到的培养基分装于1000mL三角瓶中，每瓶装培养基100g，0.11MPa灭菌30min。然后每三角瓶接入孢子悬液8mL，摇匀后28℃培养4天，得到菌曲。
培养好的菌曲每三角瓶加32℃蒸馏水150mL，30℃恒温浸提2h，过滤除渣，滤液5000r/min离心15min，上清液为粗酶液。酶液用95％预冷乙醇沉淀提取。冰浴下边搅拌边缓慢地加入预冷乙醇，使乙醇浓度达65％，4℃下静置3h，弃上清，沉淀在5000r/min离心20min，得粗酶泥，硝酸钾、氯化钙、柠檬酸钠各2mg溶于1000mL水中配成pH5.4的溶酶洗脱液，按酶泥∶洗脱液＝1∶8的比例将酶泥用溶酶洗脱液溶解后，5000r/min离心20min提纯，得提纯浓酶液，冷冻干燥后将1g的纯葡甘露寡聚糖酶用97g蒸馏水配成酶液，搅拌中加入2g魔芋精粉，溶解后置40℃水浴酶解2h，酶解结束后，80℃下维持20min灭酶活，冷却，得液体葡甘露寡聚糖。液体葡甘露寡聚糖经过真空减压浓缩，浓缩液经喷雾干燥得到粉状葡甘露寡聚糖。
实施例2：
实施例1得到的液体葡甘露寡聚糖经中国广州分析测试中心的HPLC测定，检得葡甘露寡糖的含量是16.5g/L。
Claims (7)
1.一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)菌种培养：其中菌种是绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC3.2942，培养基以质量份数计，由蔗渣6份，麸皮2份，魔芋精粉0.5份，(NH4)2SO42份，KH2PO41份，MgSO40.05份，琼脂1.5份，水100份组成，制备斜面培养基培养菌种，得到斜面种；
(2)菌曲培养：将斜面种制成孢子悬液，并将孢子悬液放入有培养基的瓶中28℃下进行4天菌曲培养，所述的培养基由质量比为1∶2.2的固体培养基和营养盐水组成，其中固体培养基以质量分数计，由蔗渣70％，麸皮27％，魔芋精粉3％组成，营养盐水以质量分数计，由(NH4)2SO40.5％，KH2PO40.05％，MgSO40.025％和水99.425％组成；
(3)酶液抽提：培养好的菌曲加32℃蒸馏水，30℃恒温浸提，过滤除渣，滤液离心分离，上清液为葡甘露寡聚糖酶粗酶液；
(4)魔芋精粉酶解：将葡甘露寡聚糖酶液用蒸馏水配成按纯酶计质量分数为1％的酶液，搅拌中加入质量分数为2％的魔芋精粉，溶解后置40℃水浴酶解2h，灭酶活并冷却得液体葡甘露寡聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是步骤1所述的培养基的制备是先将琼脂用水煮溶，再将魔芋精粉，(NH1)2SO4，KH2PO4和MgSO4溶解，趁热加入蔗渣、麸皮充分混匀。
3.根据权利要求1所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是步骤2所述的培养基的制备方法是先将魔芋精粉加入营养盐水中溶涨，再与蔗渣和麸皮充分混匀。
4.根据权利要求1所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是步骤3的恒温浸提时间是2h，滤液在5000r/min离心15min。
5.根据权利要求1或4所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是所述的粗酶液提纯成纯酶液，其方法由以下步骤组成：
在冰浴下边搅拌边缓慢地加入预冷乙醇，使乙醇浓度达65％，4℃下静置3h，弃上层清液，沉淀在5000r/min离心20min，得粗酶泥，粗酶泥用溶酶洗脱液溶解，溶酶洗脱液中酶泥和洗脱液的质量比是1∶8，其中洗脱液pH＝5.4，由硝酸钾、氯化钙、柠檬酸钠各2mg溶于1000mL水中制成，溶解后的酶液在5000r/min离心20min，得纯酶液。
6.根据权利要求1所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是步骤4所述的灭菌活是在80℃下维持20min。
7.根据权利要求1或2或3或4或6所述的一种葡甘露寡聚糖的制备方法，其特征是步骤4所述的液体葡甘露寡聚糖经过超滤或真空减压浓缩，浓缩液经喷雾干燥得到粉状葡甘露寡聚糖。
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