CN111499671A - 羊脑中几种不同类型神经节苷脂的提取制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种从羊脑中提取不同类型神经节苷脂的制备方法。属于生物化学和天然药物化学领域。方法以羊脑为原料，依次进行组织破碎匀浆、有机溶剂选择性提取、大孔树脂选择性吸附和解析、离子交换树脂层析分离、硅胶层析分离，获得GM1、GD1a、GD1b、GT1b。人脑天然神经节苷脂中主要类型为GM1、GD1a、GD1b、GT1b，在神经细胞的生理活动中协同产生作用，其中GM1已作为药品用于治疗神经细胞损伤。研究神经节苷脂中的GM1、GD1a、GD1b、GT1b提取制备具有重要意义。羊脑在我国资源丰富，开发利用羊脑，提高其经济价值，也很有意义。
Description
技术领域
本项发明所涉及的是一种从羊脑中提取几种不同类型神经节苷脂的制备方法，几种不同类型神经节苷脂包括但不限于GM1、GD1a、GD1b、GT1b。本项发明属于生物化学和天然药物化学领域。
背景技术
神经节苷脂是哺乳动物细胞中的重要物质，特别存在于神经元细胞的胞膜中，是神经细胞膜的天然组成部分，以大脑细胞中含量最为丰富，是一类含有唾液酸的糖鞘脂。神经节苷脂家族有几十种类型，分子组成有差别，分子结构相似，结构中都含有一定数目的糖环、脂肪链和唾液酸基团。
科学研究证明：神经节苷脂在神经细胞的分化、发育、神经元的可塑性、突触的传递和对增加创伤后的神经细胞的树突生成起重要作用。中枢神经系统的神经元首先在内质网合成神经节苷脂的亲脂部分，然后在内质网和高尔基体连接葡萄糖形成神经节苷脂的中性糖类主链。尔后又在糖基和唾液酸基转换酶作用下再加入中性糖和唾液酸，合成了基本唾液酸四己糖乳类神经节苷脂和唾液酸四己糖神经节系列神经节苷脂。
由于酰基鞘氨醇蛋白位于细胞膜双脂层内，而碳水化合物极性朝向细胞外，这种物理上的不对称性及其化学结构的差异，使得神经节苷脂类物质与细胞外多种信息相互作用。细胞膜神经节苷脂类物质浓度不是静止不变的，而是依据神经节苷脂极性基团的动态作用、Ca2+浓度以及细胞表面糖蛋白的含量等变化，这些细胞膜神经节苷脂类物质能导致局部细胞膜结构的改变。另外，细胞膜神经节苷脂还能影响细胞膜表面的糖蛋白和细胞嵌入蛋白。因此神经细胞膜神经节苷脂类物质变化对调节神经元对细胞内外信息传递具有重要意义。
科研人员经过大量的研究实验，采取各种方法提取制备外源性的神经节苷脂，并研究应用于对人的脑卒中神经细胞损伤、中枢神经损伤、周围神经损伤、老年性痴呆、帕金森氏症的治疗和修复。国际上从上世纪七十年代始对神经节苷脂中的GM1的理化性质及其对大鼠神经细胞损伤模型的作用机理进行了大量深入的研究，九十年代末批准作为药物在临床上使用。我国研究人员从九十年代开始对GM1的性质和作用机理进行了系统性研究，九十年代末进入临床研究，在2005年，我国药监部门批准作为药品进入临床应用，现有多家制药企业制备生产GM1药品。
目前已有几种从牛脑和猪脑中提取制备神经节苷脂中的GM1的方法，主要包括以下几种方法：
南开大学(中国发明专利，公告号：CN85102590A)发明的分离纯化制备神经节苷脂工艺是将细胞匀浆清液浓缩后透析，再用无机吸附或离子交换树脂柱分离纯化。
华东理工大学(中国发明专利，公告号：CN1570080A)发明的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1的制备方法，采用发酵菌种为厄菌属(Oerskovia sp.)和溶黄嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineolytica)对无GM1神经节苷脂底物转化，将神经节苷脂提取物中的其它组份发酵转化成GM1。
重庆紫禾医药技术开发有限公司公司采用猪脑丙酮粉的方法提取制备单一的神经节苷脂GM1(中国发明专利，公告号：CN102731584A)。
东北师范大学(中国发明专利，公告号：CN104342469B)发明的一种生物转化多唾液酸四己糖神经节苷脂为单唾液酸四己糖神经节脂(GM1)的方法。用细菌简单高效水解多唾液酸四己糖神经节苷脂混合物制备GM1。所用菌种为纤维属，名为Cellulosimicrobiumsp.21。
神经节苷脂家族有几十种类型，分子组成有差别，分子结构相似，结构中都含有一定数目的糖环、脂肪链和唾液酸基团，在神经细胞的生理活动中协同产生作用，协调神经细胞的分化、发育、神经元的可塑性、突触的传递和对增加创伤后的神经细胞的树突生成，因而单一的使用某一种神经节苷脂来治疗神经细胞损伤有所不足。科学实验证明人脑中天然神经节苷脂中四种主要类型为GM1、GD1a、GD1b、GT1b，约占神经节苷脂的87％，牛脑和猪脑中上述成分的比例和人脑的数据也很接近。因此，研究提取制备神经节苷脂中GM1、 GD1a、GD1b、GT1b具有重要意义。羊脑在我国资源丰富，充分开发综合利用羊脑，提高其经济价值，也很有意义。
目前未见提取制备几种不同类型神经节苷脂的文献资料报道，也未见从羊脑中提取制备几种不同类型神经节苷脂的文献资料报道。
发明内容
3.1定义
当在本文中使用时，以下术语具有下列含义：
“神经节苷脂”指本领域技术人员已知的任何神经节苷脂。
“GM1、GD1a、GD1b、GT1b”指本领域技术人员已知的各自具有特定分子组成和分子结构的四种单一的神经节苷脂，都含有糖环、脂肪链和唾液酸基团。
3.2发明的实施方式
本项发明所涉及的是一种从羊脑中提取几种不同类型神经节苷脂的制备方法。在实施方式中，以羊脑组织为原料，依次进行组织预处理、选择性提取、大孔树脂选择性吸附和解析、离子交换层析、硅胶层析，分别获得GM1、GD1a、GD1b、GT1b。
在本发明中使用的羊脑应在羊屠宰后尽快采集。在其它实施方式中，所述羊脑被冷藏，直到进一步处理，即在约2°～8℃的温度下保存。在其它实施方式中，所述羊脑被冷冻储藏，直到进一步处理。即在约-20°～-80℃的温度下保存。本发明包含在提取制备之前使用本领域技术人员已知的标准技术对羊脑进行传染性疾病，包含但不限于炭疽、口蹄疫、绵羊痘、狂犬病、伪狂犬病等人畜共患疾病的病毒性病原体的筛选，选用无疫病的检验合格的羊脑。
所述实施方式中羊脑组织可以是完整的羊脑或可以选自羊脑的任意部分
通过所述实施方式预处理步骤可以根据本领域技术人员已知的方法对羊脑组织进行病毒灭活处理、清洗和破碎。
a.取经过预处理的羊脑，粉碎匀浆，加入氯仿/甲醇混合液，搅拌提取，收集上清液。
b.取大孔树脂装柱，前述上清液加入适量的水后上样，上样完毕，用间苯二酚试液检出，后用水清洗树脂，甲醇解吸，浓缩后丙酮沉淀。
c.上述沉淀用氯仿-甲醇-水混合液溶解，取上清液，浓缩后丙酮沉淀，冻干。
d.取离子交换树脂填料装柱，甲醇冲洗后以缓冲液C冲洗和缓冲液A冲洗，将前述沉淀溶解上样，样品用缓冲液A溶解，控制电导率在适当范围，以缓冲液A复平衡，缓冲液B洗脱，收集洗脱液，浓缩，丙酮沉淀(缓冲液A：氯仿-甲醇-水，缓冲液B：氯仿-甲醇-0.26MNaAc，缓冲液C：氯仿-甲醇-2M NaAc)。
e.取硅胶装柱，将上述沉淀用氯仿/甲醇/水混合液溶解上样，再用流动相洗脱，分部收集洗脱液，以HPLC检测各收集瓶，合并GM1、GD1a、GD1b、GT1b各自的收集流份，分别浓缩，方便丙酮沉淀，冻干
本发明从羊脑中分离纯化制备不同类型神经节苷脂的操作步骤是将羊脑细胞破碎匀浆，以有机溶剂选择性提取，再用大孔吸附树脂富集附匀浆清液中的全部神经节苷脂成分，离子交换树脂分离纯化提取到神经节苷脂混合总脂，实现浓缩、脱盐、纯化，最后用硅胶层析分离不同类型神经节苷脂，分部收集GM1、GD1a、GD1b、GT1b。
具体实施方式
实施例1：
选取经过炭疽、口蹄疫、绵羊痘、狂犬病、伪狂犬病等人畜共患疾病检验合格的新鲜羊脑，除去碎骨、脑膜、血管等杂质，纯水清洗后用组织捣碎机粉碎。称取粉碎后的羊脑10kg，加入3倍量的氯仿/甲醇(氯仿∶甲醇＝1∶2.5)混合液，搅拌提取20分钟，收集上清液。按上述条件再提取2次，合并上清液，加入约1/3量提取液的水混匀，放置12小时过夜，吸取上层提取液待用。
时过夜，吸取上层提取液待用。
实施例2：
采用水浴装置、5升不锈钢桶、搅拌器，取实施例1上层提取液，在搅拌下加入0.2％量的NaOH粉末，于80℃水解15分钟，取上层液备用。
实施例3：
大孔树脂常规处理后，取树脂5kg装柱，将实施例2上层液反复上样8～10次，上样完毕，取流出液，用间苯二酚试液检出(间苯二酚试液：取间苯二酚0.2g，加水10ml溶解，加90ml浓盐酸和0.25ml 0.1mol\L的硫酸铜溶液，混匀，室温放4小时后，放入冰箱避光保存)，后先用10～20倍注体积的纯水冲洗树脂至清，再以20％甲醇冲洗2～3个体积，换甲醇解吸。洗脱液旋转蒸发器减压浓缩，蒸发温度50～70℃，开启真空泵将洗脱液浓缩至原有体积的1/10，3倍体积丙酮沉淀，-20℃放置，低温离心，取沉淀，放入冻干机中干燥36小时，得神经节苷脂粗品。
实施例4：
取实施例3神经节苷脂粗品用氯仿-甲醇-水(4∶8∶3)混合液溶解(按1∶50溶解)，取上清液，浓缩，用5倍体积丙酮沉淀，冻干得样品1。
配制缓冲液A：氯仿-甲醇-水(30∶60∶8)，
缓冲液B：氯仿-甲醇-0.26M NaAc(30∶60∶8)
缓冲液C：氯仿-甲醇-2M NaAc(30∶60∶8)
样品1用缓冲液A溶解，量取QFF离子交换树脂2L，装柱，甲醇冲洗1倍柱体积，缓冲液C冲洗1倍柱体积，缓冲液A冲洗2倍柱体积，上样，电导控制在0.5ms/cm以下，用缓冲液A平衡2倍柱体积，缓冲液B洗脱4倍柱体积，收集洗脱液。
洗脱液用减压旋转蒸发仪浓缩至小体积，5倍体积丙酮沉淀，-20℃放置，10℃以下离心，取沉淀，冷冻干燥，得样品2。
实施例5：
取硅胶1kg，用流动相氯仿/甲醇/0.1M NaAc(55∶45∶3.5)湿法装柱，用流动相平衡1倍柱体积。将实施例4样品2用氯仿/甲醇/水(50∶50∶3.5)充分溶解后，上样，流速 20ml/min，再用流动相洗脱，2倍柱体积后分部收集洗脱液，每100ml收集一瓶，5倍柱体积时结束洗脱。应用HPLC用氨基键合硅胶为填充剂，采用梯度洗脱，流动相A为2mmol/L KH2PO4溶液(pH5.6)∶乙腈(17∶68)，流动相B为10mmol/L KH2PO4溶液(pH5.6)∶乙腈(20∶ 60)，0～7min/A，7min～60min/A→A∶B(66∶34)，60min～80min/A∶B(66∶34)→A∶B(34∶66)。检测波长为225nm，检测各收集瓶，分别合并GM1、GD1a、GD1b、GT1b各收集瓶，分别减压浓缩至小体积，分别加入5倍体积冷丙酮神经节苷脂形成沉淀，分别10℃以下离心收集沉淀，冷冻干燥48小时，即得几种类型神经节苷脂。
实施例6：
取硅胶1kg，用流动相氯仿/甲醇/水(70∶40∶5)湿法装柱，将实施例4样品2用适量流动相溶解后，等体积分成20份上样，以上述流动相洗脱，收集洗脱液，流速10～15 毫升/分，TLC(采用色谱硅胶60板，迁移溶液：氯仿∶甲醇∶0.2％氯化钙＝55∶45∶10，显色剂：间苯二酚0.2g，盐酸(36％)90ml，五水硫酸铜2.5％(w/v)0.23ml，水10ml，用乙醇按1∶2体积稀释。)检测流出液，分别合并GM1、GD1a、GD1b、GT1b各收集瓶，分别减压浓缩至小体积，分别加入5倍体积冷丙酮神经节苷脂形成沉淀，分别10℃以下离心收集沉淀，冷冻干燥48小时，即得几种类型神经节苷脂。
Claims (10)
1.本项发明所涉及的是一种从羊脑中提取几种不同类型神经节苷脂的制备方法。
2.权利要求1所说的羊脑是指人工饲养的任何品种的羊的大脑组织的全部或部分。
3.权利要求1所说的神经节苷脂指本领域技术人员已知的任何类型的神经节苷脂。
4.权利要求1所说的几种不同类型神经节苷脂是指GM1、GD1a、GD1b、GT1b，是本领域技术人员已知的四种各自具有特定分子组成和分子结构的神经节苷脂，分子结构中都含有一定数目的糖环、脂肪链和唾液酸基团。
5.实施例1中的氯仿/甲醇混合液中氯仿∶甲醇的比例是5∶1至1∶8之间的任何比例。
6.实施例4中的缓冲液
缓冲液A中氯仿∶甲醇∶水的比例是2∶1∶0.4至1∶3∶0.2之间的任何比例。
缓冲液B中氯仿∶甲醇∶0.26M NaAc的比例是2∶1∶0.4至1∶3∶0.2之间的任何比例。
缓冲液C中氯仿∶甲醇∶2M NaAc的比例是2∶1∶0.4至1∶3∶0.2之间的任何比例。
7.实施例5中流动相氯仿∶甲醇∶0.1M NaAc的比例是1∶2∶0.05至2∶1∶0.1之间的任何比例。
8.实施例6中流动相氯仿∶甲醇∶水的比例是3∶1∶0.1至1∶2∶0.2之间的任何比例。
9.实施例4中所说的“离子交换树脂”是Sepharos Fast 4 Flow和Q Sepharos FastFlow离子交换树脂。
10.实施例3所说的“大孔树脂”指是本领域技术人员已知的大孔树脂，型号为非极性和弱极性。
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