CN107247111A - 一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法，属于药材检测领域。该方法包括以下步骤：以银翘散和淡竹叶标准品分别作为第一样品和第二样品，取等量第一样品和第二样品分别作为试验组和对照组，并进行以下处理：将两种分别溶解于醇溶液中，过滤；取等量第一样品的滤液和第二样品的滤液点样于同一硅胶薄层板，然后用展开剂展开，干燥后置于紫外光条件下显色。展开剂为二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂。对比试验组和对照组在紫外光条件下的显色斑点在硅胶薄层板上的位置。上述检测方法对淡竹叶具有优异的展开性能，硅胶薄层板上斑点的分离度较佳，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。

Description

一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法
技术领域
本发明涉及药材检测领域，且特别涉及一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法。
背景技术
银翘散是清代著名温病学家吴瑭(鞠通)所创制的名方，载于其所著的《温病条辨》一书中，现收录于《中华人民共和国兽药典》2015年版二部。本药由金银花、连翘、薄荷、荆芥等10味药材组成，是“银翘公英汤”、“银菊白虎汤”和“银花解毒汤”三方加减化裁而得。银翘散的处方包括：金银花60g、连翘45g、薄荷30g、荆芥30g、淡豆豉30g、牛蒡子45g、桔梗25g、淡竹叶20g、甘草20g，具有辛凉解表、清热解毒的功效，在兽药临床上主要用于治疗风热感冒、咽喉肿痛以及疮痈初起。
2015年版《中华人民共和国兽药典》二部中银翘散的质量标准仅有显微鉴别和金银花的薄层鉴别，很难控制其质量，保证产品的安全性、有效性与质量可控性。但现有技术中公开的淡竹叶薄层鉴别方法的效果较差，不能满足需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法，该测定方法对淡竹叶具有优异的展开性能，硅胶薄层板上斑点的分离度较佳，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法，其包括以下步骤：
以银翘散和淡竹叶标准品分别作为第一样品和第二样品，取等量第一样品和第二样品分别作为试验组和对照组，并进行以下处理：
将第一样品和第二样品分别溶解于醇溶液中，过滤。
取等量第一样品的滤液和第二样品的滤液点样于同一硅胶薄层板，然后用展开剂展开，干燥后置于紫外光条件下显色。
上述展开剂为二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水以体积比2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7混合后的混合溶剂。
对比试验组和对照组在紫外光条件下的显色斑点在硅胶薄层板上的位置。
本发明实施例的银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法的有益效果是：以体积比为2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，能针对性地对淡竹叶所含成分进行充分展开，且能避免银翘散中的其它组成成分对淡竹叶成分的展开产生影响。此检测方法展开效果较佳，色斑分离度良好，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供的银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法，主要包含取样、样品处理、展开和显色等步骤。
薄层色谱检测方法是色谱法中的一种，其原理为：利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
该检测方法是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值(Rf)。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下(吸附剂、展开剂、板层厚度等)，化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。
此外，薄层色谱可适用小量样品(几到几十微克甚至0.01μg)的分离，也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。
具体地，本实施例中将含有淡竹叶的银翘散作为第一样品(试验组)，然后将第一样品溶解于醇溶液中，过滤，取滤液。因甲醇溶液价格低廉且较易够买，故上述醇溶液优选为甲醇溶液。此外，第一样品还可溶解于其它具有挥发性的有机溶剂中，如氯仿。第一样品不宜溶解于水溶液中，其原因在于：水分子与吸附剂的相互作用力较弱，当它占据了吸附剂表面上的活性位置时，就使吸附剂的活性降低，而使斑点扩散，最后得到的分离效果则较差。
作为可选地，第一样品可按以下方式溶解于甲醇溶液中：取2g含有淡竹叶的银翘散，溶于10mL的甲醇溶液中。该比例下大部分的银翘散的有效成分均能溶解于甲醇溶液中。
进一步地，为了在减少甲醇用量的同时，能够提高银翘散的溶解度，本实施例中在将第一样品溶解于甲醇溶液中后，还将其置于超声条件下处理，超声时间例如可以为25-35min，优选为30min。然后再将超声后的溶液进行过滤，去除滤渣，收集滤液。经超声处理后，第一样品中的所有醇溶性物质均完全溶解于甲醇溶液中，从而确保了银翘散中的淡竹叶物质得以充分溶解，利于提高检测结果的准确性。
因后续点样所用的滤液量较少，本实施例中还可将滤液蒸干，然后再用少量甲醇溶剂，例如2mL进行溶解，得到浓度较高、体积较少的样品溶液。经过蒸干浓缩再溶解后的样品溶液更利于点样和展开，以避免点样时样品浓度较低或较浓影响展开效果，造成拖尾或斑点分离度差的现象。
将上述滤液点样于硅胶薄层板。硅胶为极性吸附剂，具有较大的吸附量，本实施例选择硅胶薄层板，能针对性地分离酸性和中性物质。上述硅胶薄层板可以自行购买，也可自制。若硅胶薄层板购自市面，使用前则可以将其于110℃的条件下活化25-35min。若为自制，则尽量使硅胶薄层板表面均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破损及污染。
较佳地，本实施例中的硅胶薄层板为硅胶G薄层板。其原因在于一般的硅胶薄层板因硅胶薄层的机械性较差，故使用时在硅胶中加入5-20％的石膏，也即上述硅胶G薄层板。石膏起粘合作用，具有较好的耐腐性特点，将其加入硅胶薄层中，能提升硅胶薄层的机械性能。
点样可用毛细管或点样器械将滤液点样于上述硅胶薄层板上。点样的好坏直接影响分离效果，本实施例中优选点样成圆点状或条带状，当点样为圆点状时，圆点状的直径优选为不大于4mm，最佳为不大于2mm，以提高后期的展开效果，避免拖尾现象。
然后，用展开剂展开。展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素综合考虑。目前淡竹叶的薄层鉴别所采用的展开剂组合种类多样，但由于不同药物中各组成成分不同，各成分在展开过程中会相互影响，因此，适用于其他药物的淡竹叶薄层鉴别用的展开剂的组合方式和组成比例并不能够完全适合于银翘散中淡竹叶的鉴别。
由于淡竹叶含有大量黄酮类化合物和生物活性多糖和其它有效成分，如酚酸类化合物、蒽醌类化合物和萜类内酯，主要功能因子为黄酮糖苷和香豆素类内酯。鉴于此，综合考虑淡竹叶成分与银翘散中所含的其它物质的性质，本实施例中的展开剂优选为二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水混合后的混合溶剂。
作为可选地，上述二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水例如可以以体积比2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7混合。优选地，二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水以体积比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5混合。
按上述优选体积比混合所得的展开剂能针对性的对淡竹叶所含成分进行展开，且银翘散中的其它组成成分对淡竹叶成分的展开基本无影响，展开效果较佳。
将展开剂盛放于展开容器(如展开缸或展开槽)中，将点样后的薄层板再放入盛有展开剂的展开容器内，较佳地，薄层板浸入展开剂的深度为距原点5mm。
作为可选地，本实施例中的展开时间例如可以控制在15-30min，优选地，展开时间为20min。展开时间控制在此范围，可避免时间过短造成斑点分离不明显。
展开后，干燥薄层板，然后置于紫外光条件下显色。有荧光的物质或显色后可激发荧光的物质可在紫外光灯下观察荧光斑点。
本实施例中例如可将干燥后的薄层板置于波长为360-370nm的紫外光条件下显色。最佳地，将干燥后的薄层板置于波长为365nm的紫外光条件下显色。
根据样品中化合物组分的极性，不同化合物在薄层板上移动的距离不同，极性强的化合物会“粘”在极性的硅胶上，在薄层板上移动的距离比较短；而非极性的物质将会在流动的溶剂相中保留较长的时间，从而在板上移动较大的距离。化合物在薄层板上的移动距离大小用Rf值来表达，由此，可以根据Rf值来确定化合物的类型等。
此外，本实施例中以淡竹叶标准品作为第二样品。
取与第一样品等量的第二样品(对照组)，按照上述第一样品的处理步骤和方法，对第二样品进行相同的处理。值得说明的是，本实施例中第一样品和第二样品在获得滤液后，是取等量第一样品的滤液和第二样品的滤液点样于同一硅胶薄层板，然后展开、干燥和显色。
对比经相同处理后的试验组和对照组在硅胶薄层板上相对应的位置是否有相同颜色的斑点。有则说明试验组和对照组所含化合物成分一致，无则说明试验组和对照组所含化合物成分不一致。
为了提高本检测方法的准确性，实施例中还设置了阴性比对组，该阴性比对组为不含淡竹叶的银翘散。取与第一样品及第二样品等量的阴性比对组，并按照上述第一样品、第二样品的处理步骤和方法进行相同处理。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的甲醇溶液中，过滤，取滤液。将滤液点样于硅胶G薄层板，点样成直径为4mm的圆点状，然后用体积比2:4.6:2.3:0.6:1.3的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开15min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为360nm的紫外光条件下显色。
以淡竹叶标准品作为对照组，并按照上述步骤和方法进行相同处理。对比经相同处理后的试验组和对照组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例2
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的氯仿溶液中，过滤，取滤液。将滤液点样于硅胶G薄层板，点样成直径为2mm的圆点状，然后用体积比2.4:5:2.7:1:1.7的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开30min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为370nm的紫外光条件下显色。
分别以淡竹叶标准品和不含淡竹叶的银翘散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例3
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的甲醇溶液中，超声25min，然后过滤，取滤液。将滤液点样于硅胶G薄层板，点样成直径为3mm的圆点状，然后用体积比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开17.5min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为363nm的紫外光条件下显色。
分别以淡竹叶标准品和不含淡竹叶的银翘散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例4
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的甲醇溶液中，超声35min，然后过滤，取滤液。将滤液点样于硅胶G薄层板，点样成直径为1.5mm的圆点状，然后用体积比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为368nm的紫外光条件下显色。
分别以淡竹叶标准品和不含淡竹叶的银翘散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例5
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的甲醇溶液中，超声30min，然后过滤，取滤液。将滤液点样于硅胶G薄层板，点样成条带状，然后用体积比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为365nm的紫外光条件下显色。
分别以淡竹叶标准品和不含淡竹叶的银翘散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
实施例6
以含有淡竹叶的银翘散为第一样品(试验组)并对其进行以下处理：取2g第一样品溶于10mL的甲醇溶液中，超声30min，然后过滤，取滤液。将滤液蒸干，再用2mL甲醇溶解，得到点样样品。将点样样品点样于硅胶G薄层板，点样成直径为2mm的圆点状，然后用体积比2.2:4.8:2.5:0.8:1.5的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，对点样后的硅胶G薄层板展开20min。展开后，干燥薄层板，然后置于波长为365nm的紫外光条件下显色。
分别以淡竹叶标准品和不含淡竹叶的银翘散作为对照组和阴性比对组，按上述试验组的处理步骤和方法对对照组和阴性比对组均进行相同处理。对比经相同处理后的试验组、对照组和阴性比对组的薄层色谱相对应的位置是否有相同颜色的斑点。
试验例1
按实施例1-6的方法对银翘散中的淡竹叶成分进行薄层色谱检测。实施例1-6的结果均显示：试验组和对照组在薄层色谱对应的位置均出现了相同颜色(红色)的斑点，且色斑分离度极佳。此外，实施例2-6的结果还显示阴性对比组的薄层色谱在试验组显色斑点对应的位置未出现相同颜色(红色)的斑点，说明该阴性对比组对试验组未产生干扰，也即说明银翘散中的其它组成成分对淡竹叶成分的检测效果无影响，验证了本检测方法的可行性。
试验例2
本试验例就实施例6中展开剂的溶剂组成比例进行改变，用体积比2.2:4.8:2.5:0.8:0.6的二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水的混合溶剂作为展开剂，其余处理均相同。按本试验例处理后所得结果显示：试验组和阴性对比组在薄层色谱对应的位置均出现了相同颜色的斑点，阴性对比组对试验组的结果干扰严重。
说明按此配比的展开剂对银翘散中的淡竹叶成分进行薄层层析检测，会造成阴性对比组对试验组产生干扰，也即说明银翘散中的其它组成成分对淡竹叶成分的检测效果有影响。
因此，进一步验证了实施例6中银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法的可行性。
综上所述，本发明实施例的银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法对淡竹叶具有优异的展开性能，硅胶薄层板上斑点的分离度较佳，检测过程中干扰因素少，检测结果准确。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种银翘散中淡竹叶的薄层色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
以含有淡竹叶的银翘散和淡竹叶标准品分别作为第一样品和第二样品，取等量所述第一样品和所述第二样品分别作为试验组和对照组，并进行以下处理：将所述第一样品和所述第二样品分别溶解于醇溶液中，过滤；
取等量所述第一样品的滤液和所述第二样品的滤液点样于同一硅胶薄层板，然后用展开剂展开，干燥后置于紫外光条件下显色；
所述展开剂为二甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲酸和水以体积比2-2.4:4.6-5:2.3-2.7:0.6-1:1.3-1.7混合后的混合溶剂；
对比所述试验组和所述对照组在紫外光条件下的显色斑点在所述硅胶薄层板上的位置。
2.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述硅胶薄层板为硅胶G薄层板。
3.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述二甲苯、所述乙酸乙酯、所述丙酮、所述甲酸和水的体积比为2.2:4.8:2.5:0.8:1.5。
4.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，展开时间为15-30min。
5.根据权利要求4所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，展开时间为20min。
6.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，显色是在波长为360-370nm的紫外光条件下进行。
7.根据权利要求6所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，显色是在波长为365nm的紫外光条件下进行。
8.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述样品溶解于所述醇溶液中后，于超声条件下处理25-35min，然后再过滤。
9.根据权利要求8所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述样品溶解于所述醇溶液中后，于超声条件下处理30min，然后再过滤。
10.根据权利要求1所述的薄层色谱检测方法，其特征在于，所述醇溶液为甲醇溶液。
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潘春晖 等: "清瘟败毒散的质量标准提升研究", 《中国畜牧兽医》 *

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