CN102452916A - 一类新芳香聚酮及其提取方法和应用 - Google Patents
一类新芳香聚酮及其提取方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域,具体涉及从大刀螳螂(Tenoderaaridifolia)肠道菌光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholzii)液体发酵物中提取的一类新骨架炭壳菌芳香聚酮化合物及其制法和应用。
背景技术
自1929年弗来明从真菌中发现青霉素以来,人们一直试图从微生物中寻找人类急需的新药源分子,但研究的对象长期集中于来自土壤、水体等环境微生物,从中分离得到的化合物往往是已知化合物,出现全新骨架活性化合物的几率已经很低,趋同的环境和重复的研究使得新天然药物的发现率从上世纪80年代开始逐年下降。但与此同时,近年来在制药领域的进步使得人们对药用活性物质的来源与特性有了更高的要求,已有结构特征的化合物不能适应疾病谱的快速变化,而传统来源天然产物发现的途径也难以满足具有新结构特征或新作用机制化合物发现的需要。因此,为了发现新型天然药源分子,寻找新的特境微生物资源显得尤为必要。昆虫肠道菌就是其中的一类特境微生物,关于其代谢产物研究得较少。据估计地球上约有3000万种昆虫,昆虫的多样性意味着其肠道菌的多样性,肠道菌的多样性为次生代谢产物提供了一个丰富的来源。
我们已从大刀螳螂(T. aridifolia)肠道菌光轮层炭壳菌(D. eschscholzii)液体发酵物中提取到一类具有免疫抑制活性的新骨架炭壳菌聚酮dalesconols A 和 B (参见Y. L. Zhang, H. M. Ge, W. Zhao et al.,Angew. Chem. Int. Ed.2008,47, 5823–5826.),对该菌的次生代谢产物继续研究,我们又得到5个新聚酮化合物,其中4个是新骨架类化合物,这些化合物具有很好的抗氧化或免疫抑制活性。
发明内容
本发明需要解决的问题是:
1.提供一类具有抗氧化或免疫抑制活性的新炭壳菌芳香聚酮化合物;
2.提供一种提取、分离新炭壳菌芳香聚酮的方法;
3.炭壳菌芳香聚酮在抗氧化剂或免疫抑制药物中的应用。
本发明技术方案:
其中化合物1-4为新骨架化合物,5为新化合物。
新炭壳菌芳香聚酮化合物制备方法,包括下述步骤:
步骤1. 将新鲜的从大刀螳螂(Tenoderaaridifolia)肠道中分离、纯化得到的昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌菌丝体块接种到ME培养基(麦芽提取物20 g,蔗糖20 g,蛋白胨1 g,1 L 蒸馏水)上,于摇床上,在140 rpm、28 ℃条件下培养3天作为种子液;然后将种子液接种于ME培养基中,在140 rpm、28 ℃条件下发酵10天;
步骤2. 将步骤1所得发酵液经纱布过滤,滤液用乙酸乙酯萃取3次,真空浓缩干燥得黑色粗浸膏;
步骤3. 将步骤2得到的粗浸膏悬浮于水,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏;
步骤4. 对步骤3所得浸膏进行硅胶柱层析分段,采用氯仿/甲醇梯度洗脱(100:0, 100:1, 100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32)得到7个洗脱部分F1-F7;
步骤5. 然后对7个洗脱部分F1-F7反复采用硅胶柱层析、反相C-18柱层析以及凝胶柱层析分离纯化得到五个新化合物1-5;
步骤6. 其中化合物1、2和4为外消旋体,采用手性高压液相色谱法分离得到正负两种对映体。
本发明的炭壳菌芳香聚酮化合物具有抗氧化或对Con A所致小鼠脾细胞增殖有很强的抑制作用,且对正常的小鼠脾细胞没有毒性,因此所分到底炭壳菌聚酮可在抗氧化剂或免疫抑制药物中得到应用。
与现有技术相比,本发明具有下述突出优点:
1. 本发明的炭壳菌芳香聚酮是全新骨架或新化合物,可以作为具有抗氧化或免疫抑制作用的新药物或先导化合物;
2. 本发明的炭壳菌芳香聚酮可以利用微生物进行液体发酵生产,工艺简便,周期短,成本低,来源有保证;
3. 本发明利用生物法合成炭壳菌芳香聚酮对环境无污染。
附图说明
图1为化合物1的单晶结构图(去除一个水分子)。
图2为化合物2的单晶结构图(去除一个水分子)。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1:昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholzii)的分离与纯化
在无菌条件下解剖大刀螳螂(Tenoderaaridifolia),取出的螳螂肠道在75%酒精中表面消毒2分钟,无菌水漂洗3次后加少量无菌水在无菌研钵中研磨,用无菌水对研磨液梯度稀释成10-1,10-2,10-3,10-4,分别取各梯度稀释液0.2毫升涂布于MEA培养基(麦芽提取物20 g,蔗糖20 g,蛋白胨1 g,琼脂 15 g,1 L 蒸馏水)中,置于28 ℃恒温箱中培养,待菌体长出后,挑取菌落边缘菌丝纯化培养,得到昆虫肠道真菌,经广东省微生物研究所鉴定为光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholzii),现保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:武汉珞珈山武汉大学内),保藏编号为CCTCC NO: M 207198,保存日期为2007.12.13.。
实施例2:昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholzii)的液体发酵
活化昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldiniaeschscholzii),将新鲜的菌丝体块接种到1000 mL 锥形瓶中,每瓶含有400 mL的ME培养基,接种5-6瓶于摇床上,在140 rpm、28 ℃条件下培养3天作为种子液,然后将20 mL种子液接种于装有400 mL的ME培养基的1000 mL 锥形瓶中,在140 rpm、28 ℃条件下发酵10天。
实施例3:炭壳菌芳香聚酮的提取与分离
实施例2中所得发酵液经纱布过滤,滤液用乙酸乙酯萃取3次,真空浓缩干燥得黑色粗浸膏。将粗浸膏悬浮于水,先用石油醚萃取3次除去浸膏中的油脂部分,再用乙酸乙酯萃取剩余母液3次,合并乙酸乙酯萃取液经减压浓缩得浸膏300克,对该浸膏进行硅胶柱层析粗略分段,采用氯仿/甲醇梯度洗脱,体积比100:0, 100:1, 100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32得到7个洗脱部分F1-F7。继续对浸膏F2进行硅胶柱层析分离,采用氯仿/甲醇系统梯度洗脱,体积比200:0, 200:1, 200:2, 200:4得到4个洗脱部分F2A-F2D。对F2B进行凝胶柱层析(洗脱剂甲醇)得到灰色沉淀,沉淀过滤后在甲醇中重结晶,纯化得到灰色晶体1(75 mg)。同样对F2C也进行凝胶柱层析(洗脱剂甲醇)分离得到红色针状晶体3(13 mg)。对第三部分浸膏F3进行再次的硅胶柱层析分离,洗脱剂采用氯仿/甲醇系统,体积比100:1, 100:2, 100:4,分离得到3个部分F3A-F3C。对F3A再进行硅胶柱层析分离,洗脱剂采用石油醚/丙酮系统体积比100:40,分离得到黄色固体粉末5(14 mg)。对浸膏F4进行再次的硅胶柱层析分段,采用氯仿/甲醇系统梯度洗脱,体积比100:2, 100:4, 100:8,分离得到3个部分F4A-F4C。对F4A进行凝胶柱层析(洗脱剂甲醇)得到红色晶体4(22 mg)。对浸膏F5进行反相C-18柱层析分离,采用水/甲醇体系梯度洗脱,体积比60:40, 50:50, 40:60得到3个洗脱部分F5A-F5C。对F5B部分进行凝胶柱层析(洗脱剂甲醇)分离得到红色晶体2(75 mg)。化合物1、2和4为外消旋体,采用手性高压液相色谱法分别获得正负旋两种对映异构体。具体分离条件见下表:
表1.手性高压液相色谱分离化合物1、2和4的条件
化合物 | 手性柱型号 | 手性柱大小 | 柱温 (°C) | 流动相(v/v/v) |
1 | Chiralpak IA | 0.46×15 cm | 35 | 正己烷/乙醇/三氟乙酸=60/40/0.1 |
2 | Chiralpak OD-H | 0.46×15 cm | 35 | 正己烷/异丙醇/乙二胺=80/20/0.1 |
4 | Chiralpak IC | 0.46×25 cm | 35 | 甲醇/三氟乙酸=100/0.1 |
实施例4:炭壳菌芳香聚酮的结构鉴定
新炭壳菌芳香聚酮的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱和(或)X-ray单晶衍射分析而确定的。
光谱学数据如下:
表2.化合物1(溶剂:DMSO)的1H及13C NMR 的数据
S:单峰,d:双重峰,t:三重峰,dd:四重峰,m:多重峰,br:宽单峰,下同。
表3.化合物2和3的1H及13C NMR 的数据(溶剂:DMSO)
表4.化合物4的1H及13C NMR 的数据(溶剂:DMSO)
表5.化合物5的1H及13C NMR 的数据(溶剂:acetone-d 6)
化合物1的X-ray单晶衍射分析:C30H20O8,M508.46,空间群为P21/n,晶胞参数;晶胞体积V= 2263.99(10),晶胞内分子数Z=4。Rf和Rw值分别为0.0612,0.1530。用MoKα辐射、石墨单色器。用ω扫描方式,获得独立衍射点18234个。 在微机上用直接法(SHELXS-97)解析出化合物1的单晶结构(见附图1)。
化合物2的X-ray单晶衍射分析:C20H16O7,M368.33,空间群为P-1,晶胞参数;晶胞体积V= 814.3(3),晶胞内分子数Z=2。Rf和Rw值分别为0.0511,0.1517。用MoKα辐射、石墨单色器。用ω扫描方式,获得独立衍射点3194个。 在微机上用直接法(SHELXS-97)解析出化合物2的单晶结构(见附图2)。
实施例5:化合物1及其拆分对映异构体清除DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)自由基活性的试验结果。
吸取一定浓度的样品溶液0.5 mL,分别加入150 μM DPPH无水甲醇液3.5 mL,摇匀后于室温下避光静置30 min,于517 nm 波长处测定各反应液的吸光值。无水甲醇作试剂空白,阳性对照为丁基羟基茴香醚(BHA),重复三次实验。按下式计算样品对DPPH 自由基的抑制率:抑制率( %) =[ (Ab–As) / Ab ]×100 %
式中:Ab为DPPH与试剂空白混合液的吸光值;As为DPPH与样品混合液的吸光值。
化合物1及其拆分对映体对DPPH的清除作用见表8,从表中数据可看出:1、(+)-1和(–)-1的IC5分别为16.9、25.6和33.3μM,其活性与阳性对照丁基羟基茴香醚(BHA)相当(IC5为17.6μM)。以上结果提示,化合物1、(+)-1和(–)-1具有很强的清除自由基活性,因此这类炭壳菌芳香聚酮有望成功用于制备抗氧化剂。
表8.化合物1及其拆分对映体清除DPPH自由基活性
Compound | DPPH radical IC50(μM) |
1 | 16.9 |
(+)-1 | 25.6 |
(–)-1 | 33.3 |
丁基羟基茴香醚 (BHA) | 17.6 |
实施例6:MTT法测定炭壳菌芳香聚酮免疫抑制活性及其细胞毒活性。
1)免疫抑制活性。
取Balb/c小鼠(6-8周龄,雌性),无菌摘取脾脏,置于盛有5 mL、RPMI1640培养基(4 ℃)的培养皿中,用镊子轻轻撕碎,使细胞进入溶液并分散成单个细胞,过滤,4 ℃、1000 rpm离心5 min,除去上清,加入0.17 M Tris-0.75% NH4Cl溶液20 mL,离心,以除去红细胞,再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤2次,计数,调成5×105cells/mL,细胞存活率大于99%。
取5×105cells/well置96孔培养板中,加入2.5μg/mL刀豆蛋白 (Con A) 及不同浓度的供试化合物,同时设空白及阳性对照,置37 ℃,5% CO2,培养72小时。终止培养前4 h 加入5 mg/mL 3-4,5-二甲基-2-噻唑-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 20μL,4小时后1000 rpm 离心5 min,吸去上清,每孔加入 200μL 二甲亚砜,震荡,待完全溶解后在酶联免疫测定仪上于540 nm 测吸光度。阳性对照为环孢菌素A,所有实验均设三次重复。
2)细胞毒活性
测定方法同上面免疫抑制活性测定方法,只是不加入刀豆蛋白 (Con A),其它都一样。
3)细胞生长抑制率计算方法
不管是免疫抑制活性还是细胞毒活性,都采用下列公式计算细胞生长抑制率:
生长抑制率=(1—用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
然后根据不同药物浓度的生长抑制率计算出药物的半数抑制浓度(IC50)。
免疫抑制活性测试结果(表9)表明:化合物5的免疫抑制活性的免疫抑制活性(IC50= 0.025μg mL-1)要比阳性对照环孢菌素A的活性(IC50= 0.06μg mL-1)要好,但其毒性要比环孢菌素A大约50倍;化合物(+)-1、2、(+)-2、(–)-2、3的免疫抑制活性较强,其IC50值分别为5.96、15.88、1.72、5.56和5.00μg mL-1,而且其毒性均很小(IC50> 80μg mL-1);化合物4、(+)-4和(–)-4的免疫抑制活性均较强(IC50< 80μg mL-1),而且(+)-4的免疫抑制活性要比(–)-4强。
表9.炭壳菌芳香聚酮对Con A 所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用
[a]药物对Con A 所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用。[b]选择指数(SI):为药物对正常小鼠脾细胞的细胞毒作用 (cytotoxicity)的IC50与药物对Con A 所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用的IC50的比值。
以上结果提示,炭壳菌芳香聚酮化合物(+)-1、2-5、(+)-2、(–)-2、(+)-4和(–)-4具有较强的免疫抑制活性,这些炭壳菌聚酮有望成功用于制备免疫抑制作用的新药物或先导化合物。
Claims (3)
2.一种权利要求1所述的炭壳菌芳香聚酮的制备方法,其特征是由以下步骤构成:
步骤1. 将新鲜的昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌菌丝体块接种到ME培养基上,于摇床上,在140 rpm、28 ℃条件下培养3天作为种子液;
步骤2. 然后将种子液接种于ME培养基中,在140 rpm、28 ℃条件下发酵10天;
步骤3. 将步骤2所得发酵液经纱布过滤,滤液用乙酸乙酯萃取,真空浓缩干燥得黑色粗浸膏;
步骤4. 将步骤3得到的粗浸膏悬浮于水,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏;
步骤5. 对步骤4所得浸膏进行硅胶柱层析分段,采用氯仿/甲醇梯度洗脱(100:0, 100:1, 100:2, 100:4, 100:8, 100:16, 100:32)得到7个洗脱部分F1-F7;
步骤6. 然后对7个洗脱部分F1-F7反复采用硅胶柱层析、反相C-18柱层析以及凝胶柱层析分离纯化得到五个新化合物1-5。
3.根据权利要求1所述的炭壳菌芳香聚酮在制备抗氧化或免疫抑制剂药物中的应用。
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