CN101367716A

CN101367716A - 一类炭壳菌聚酮及其制法和用途

Info

Publication number: CN101367716A
Application number: CNA2007101919672A
Authority: CN
Inventors: 谭仁祥; 徐强; 张应烙; 赵蔚; 黎书华
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: CN101367716B

Abstract

一类新骨架炭壳菌聚酮(dalesconols)，它具有右述结构通式(I)。其中1，3，5，7，9，11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29为碳原子序数编号，R¹为H或OH，当R¹为H时，是炭壳菌聚酮A；当R¹为OH时，是炭壳菌聚酮B。炭壳菌聚酮(dalesconols)对Con A所致小鼠脾细胞增殖有很强的抑制作用，且对正常的小鼠脾细胞没有毒性，因此炭壳菌聚酮(dalesconols)可作为具有免疫抑制作用的化合物，并有望在制备相关新型药物中得到应用。

Description

一类炭壳菌聚酮及其制法和用途

技术领域

本发明涉及从大刀螳螂(Tenodera aridifolia)肠道菌光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholzii)液体发酵物中提取的一类新骨架炭壳菌聚酮(dalesconols)及其制法与免疫抑制作用。

背景技术

虽然微生物的次生代谢产物已被广泛研究，但一些特境微生物的代谢产物还是没有引起人们足够重视。昆虫肠道菌就是其中的一类特境微生物，关于其代谢产物研究得较少。据估计地球上约有3000万种昆虫，昆虫的多样性意味着其肠道菌的多样性，肠道菌的多样性为次生代谢产物提供了一个丰富的来源。

免疫抑制剂在器官移植、自身免疫病等中有重要作用。据报道一些昆虫真菌感染昆虫后能产生一些次生代谢产物抑制昆虫的免疫系统，据此日本学者Fujita等从冬虫夏草中分离得到一种免疫抑制剂ISP-I，该化合物的免疫抑制活性要比阳性对照环孢霉素A(CyA)强10-100倍(参见Fujita T，Hirose R，Yoneta M et al.J Med Chem，1996，39：4451)，因此昆虫真菌可能是筛选免疫抑制剂的一条重要途径。然而，到目前为止，尚未见从昆虫肠道菌光轮层炭壳(Daldinia eschscholzii)分离免疫抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于：

1.提供一类具有免疫抑制活性的新骨架炭壳菌聚酮(dalesconols)。

2.提供一种提取、分离炭壳菌聚酮(dalesconols)的方法。

3.提供一类本发明的炭壳菌聚酮(dalesconols)在制备免疫抑制剂药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种炭壳菌聚酮(dalesconols)，它具有下述结构通式(I)：

其中1，3，5，7，9，11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29为碳原子序数编号，R¹为H或OH，当R¹为H时，是炭壳菌聚酮A；当R¹为OH时，是炭壳菌聚酮B。

一种上述的炭壳菌聚酮(dalesconols)的制备方法，它包括下述步骤：

步骤1.将新鲜的从大刀螳螂(Tenodera aridifolia)肠道中分离、纯化得到的昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌菌丝体块接种到ME培养基(麦芽提取物20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，1L蒸馏水)上，于摇床上，在140rpm、28℃条件下培养3天作为种子液，

步骤2.然后将种子液接种于ME培养基中，在140rpm、28℃条件下发酵10天，

步骤3.将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1，

步骤4.将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2，

步骤5.对浸膏F2进行硅胶柱层析，先用10倍体积的氯仿洗脱，合并红色部分洗脱液得红色浸膏F3，

步骤6.然后用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液洗脱，合并红色部分洗脱液得红色浸膏F4，

步骤7.对浸膏F3，用甲醇重结晶得到外消旋炭壳菌聚酮A(dalesconol A)，用手性高压液相色谱法(手性柱：Chiralpak AS-H column；流动相：正己烷/异丙醇/醋酸＝60/40/0.1(v/v/v)；流速：0.6mL/min)分离得到一对对应异构体(+)-炭壳菌聚酮A[(+)-dalesconol A]和(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol A]，

步骤8.对浸膏F4，进一步进行硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液洗脱得到外消旋炭壳菌聚酮B(dalesconol B)，用手性高压液相色谱法(手性柱：Chiralpak IAcolumn；流动相：甲基叔丁基醚/四氢呋喃/醋酸＝95/5/0.1(v/v/v)；流速：1.0mL/min)分离得到一对对应异构体(+)-炭壳菌聚酮B[(+)-dalesconol B]和(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol B]。

本发明的炭壳菌聚酮(dalesconols)对Con A所致小鼠脾细胞增殖有很强的抑制作用，且对正常的小鼠脾细胞没有毒性，因此炭壳菌聚酮(dalesconols)可作为具有免疫抑制作用的化合物，并有望在制备免疫抑制药物中得到应用。

与现有技术相比，本发明具有下述突出优点：

1.本发明的炭壳菌聚酮(dalesconols)是全新骨架化合物，可以作为具有免疫抑制作用的新药物或先导化合物。

2.本发明的炭壳菌聚酮(dalesconols)可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。

3.本发明利用生物法合成炭壳菌聚酮(dalesconols)对环境无污染。

附图说明

图1为炭壳菌聚酮A(dalesconol A)的单晶结构图；

图2为炭壳菌聚酮B(dalesconol B)的单晶结构图。

具体实施方式

通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。

实施例1：昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholzii)的分离与纯化

在无菌条件下解剖大刀螳螂(Tenodera aridifolia)，取出的螳螂肠道在75％酒精中表面消毒2分钟，无菌水漂洗3次，后加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，分别取各梯度稀释液0.2毫升涂布于MEA培养基(麦芽提取物20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，琼脂15g，1L蒸馏水)中，置于28℃恒温箱中培养，待菌体长出后，挑取菌落边缘菌丝纯化培养，得到昆虫肠道真菌，经广东省微生物研究所鉴定为光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholzii TL01)，现保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉珞珈山武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M207198，保存日期为2007.12.13.(保藏存活证明后补)。

实施例2：昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholzii)的液体发酵

活化昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholzii)，将新鲜的菌丝体块接种到1000mL锥形瓶中，每瓶含有400mL的ME培养基，接种5—6瓶于摇床上，在140rpm、28℃条件下培养3天作为种子液，然后将20mL种子液接种于含有400mL的ME培养基的1000mL锥形瓶中，在140rpm、28℃条件下发酵10天。

实施例3：炭壳菌聚酮(dalesconols)的提取与分离

实施例2中所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1。将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2，对浸膏F2进行硅胶柱层析，先用10倍体积的氯仿洗脱，合并红色部分洗脱液得红色浸膏F3，然后用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液洗脱，合并红色部分洗脱液得红色浸膏F4。对浸膏F3，用甲醇重结晶得到外消旋炭壳菌聚酮A(dalesconol A)，用手性高压液相色谱法(手性柱：ChiralpakAS-H column；流动相：正己烷/异丙醇/醋酸＝60/40/0.1(v/v/v)；流速：0.6mL/min)分离得到一对对应异构体(+)-炭壳菌聚酮A[(+)-dalesconol A]和(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol A]。对浸膏F4，进一步进行硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(体积比100/1)混合溶液洗脱得到外消旋炭壳菌聚酮B(dalesconol B)，用手性高压液相色谱法(手性柱：Chiralpak IAcolumn；流动相：甲基叔丁基醚/四氢呋喃/醋酸＝95/5/0.1(v/v/v)；流速：1.0mL/min)分离得到一对对应异构体(+)-炭壳菌聚酮B[(+)-dalesconol B]和(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol B]。

实施例4：炭壳菌聚酮(dalesconols)的结构鉴定

炭壳菌聚酮(dalesconols)的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱和X-ray单晶衍射分析而确定的。

光谱学数据如下：

炭壳菌聚酮A(dalesconol A)，红色针状晶体，熔点308-309℃；[α]²⁰ _D＝0°(c＝0.48inMeCN)；UV(MeOH)：λmax(logε)＝462(3.89)，338(4.17)，206(4.51)；IR

(cm^-1)：3063.1，3036.1，2958.5，2910.4，1644.7，1629.6，1608.6，1585.9，1552.0，1518.8，1473.8，1452.6，1411.8，1396.0，1266.7，1216.6，1161.3，852.0，820.9，772.8cm^-1；HRESIMS：m/z 463.1180[M+H]⁺，calculated for C₂₉H₁₉O₆，463.1176；¹H and¹³C NMR data见表1；(+)-炭壳菌聚酮A[(+)-dalesconol A]：[α]²⁰ _D＝+485.87°(c＝0.066in MeCN)；CD(MeCN)λmax(Δε)216(-55.18)，233.1(+28.79)，265.4(-11.60)，323.1(+4.75)；(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol A]：[α]²⁰ _D＝-487.76°(c＝0.070in MeCN)；CD(MeCN)λmax(Δε)216216(+52.52)，233.2(-27.16)，265.1(+11.33)，320.1(-4.62).

炭壳菌聚酮B(dalesconol B)，红色针状晶体，熔点344-346℃；[α]²⁰ _D＝0°(c＝0.48inMeCN)；UV(MeOH)：λmax(logε)＝459(3.80)，337(4.08)，206(4.46)；IR

(cm^-1)：3177.1，3068.1，2923.4，2852.6，1648.6，1611.8，1558.0，1523.6，1475.1，1450.3，1219.5，1198.6，1167.4，846.2cm^-1；EIMS m/z(relative intensity)：478.9(8.59％)，477.9(M⁺，100％)，434.9(2.01％)，416.9(10.18％)，409.9(6.62％)；HREIMS m/z 478.1062，calculated for C₂₉H₁₈O₇，478.1053；¹H and¹³CNMR data见表1；(+)-炭壳菌聚酮B[(+)-dalesconol B]：[α]²⁰ _D＝+613.4°(c＝0.028in MeCN)；CD(MeCN)λmax(Δε)215.1(-43.69)，248.1(+11.62)，296.9(-20.75)，345.3(+6.75)；(-)-炭壳菌聚酮B[(-)-dalesconol B]：[α]²⁰ _D＝-613.8°(c＝0.043in MeCN)；CD(MeCN)λmax(Δε)215.2(+41.41)，247.5(-10.84)，296.7(+19.21)，346.1(-6.09).

表1.炭壳菌聚酮A(dalesconol A)and炭壳菌聚酮B(dalesconol B)¹H and¹³C NMR的数据(溶剂：DMSO)

S：单峰，d：双重峰，t：三重峰，dd：四重峰，m：多重峰，br：宽单峰

炭壳菌聚酮A(dalesconol A)的X-ray单晶衍射分析：C₂₉H₁₈O₆，M462，空间群为P2(1)/c，晶胞参数a＝11.607(2)，b＝11.607(2)，α＝90.00°，β＝108.12(3)°，γ＝90.00°；晶胞体积

晶胞内分子数Z＝4。R_f和Rw值分别为0.0761，0.1242。用MoKα辐射、石墨单色器。用ω扫描方式，获得独立衍射点4334个。在微机上用直接法(SHELXS-97)解析出炭壳菌聚酮A(dalesconol A)的单晶结构(见附图1)。

炭壳菌聚酮B(dalesconol B)的X-ray单晶衍射分析：C₂₉H₁₈O₇，M 478，空间群为P2(1)/n，晶胞参数a＝8.7130(17)，b＝18.567(4)，

a＝90.00°，β＝94.78(3)°，γ＝90.00°；晶胞体积

晶胞内分子数Z＝4。R_f和Rw值分别为0.1142，0.1853。用MoKα辐射、石墨单色器。用ω扫描方式，获得独立衍射点4495个。在微机上用直接法(SHELXS-97)解析出炭壳菌聚酮B(dalesconol B)的单晶结构(见附图2)。

实施例5：MTT法测定炭壳菌聚酮(dalesconols)免疫抑制活性及其细胞毒活性

1)免疫抑制活性

取Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，无菌摘取脾脏，置于盛有5mL、RPMI1640培养基(4℃)的培养皿中，用镊子轻轻撕碎，使细胞进入溶液并分散成单个细胞，过滤，4℃、1000rpm离心5min，除去上清，加入0.17M Tris-0.75％NH₄Cl溶液20mL，离心，以除去红细胞，再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤2次，计数，调成5×10⁵cells/mL，细胞存活率大于99％。

取5×10⁵cells/well置96孔培养板中，加入2.5μg/mL刀豆蛋白(ConA)及不同浓度的供试化合物，同时设空白及阳性对照，置37℃，5％CO₂，培养72小时。终止培养前4h加入5mg/mL3-4，5-二甲基-2-噻唑-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)20μL，4小时后1000rpm离心5min，吸去上清，每孔加入200μL二甲亚砜，震荡，待完全溶解后在酶联免疫测定仪上于540nm测吸光度。所有实验均设三次重复。

2)细胞毒活性

测定方法同上面免疫抑制活性测定方法，只是不加入刀豆蛋白(Con A)，其它都一样。

3)细胞生长抑制率计算方法

不管是免疫抑制活性还是细胞毒活性，都采用下列公式计算细胞生长抑制率。

生长抑制率＝(1—用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

然后根据不同药物浓度的生长抑制率计算出药物的半数抑制浓度(IC₅₀)。

免疫抑制活性测试结果(表2)表明：炭壳菌聚酮(dalesconols)免疫抑制活性IC₅₀均小于0.6μg/mL，可与阳性对照环孢霉素A CyA)相比较，且对正常的小鼠脾细胞没有毒性(IC₅₀均大于80μg/mL)；炭壳菌聚酮A(dalesconol A)、(+)-炭壳菌聚酮A[(+)-dalesconol A]和炭壳菌聚酮B(dalesconol B)的选择性(选择指数SI均大于276)比阳性对照好，(-)-炭壳菌聚酮A[(-)-dalesconol A]、(+)-炭壳菌聚酮B[(+)-dalesconol B]和(-)-炭壳菌聚酮B[(-)-dalesconol B]选择性(选择指数SI均大于138)可以与阳性对照相比较。

表2.炭壳菌聚酮(dalesconols)对Con A所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用

^[a]药物对Con A所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用.^[b]选择指数(SI)：为药物对正常小鼠脾细胞的细胞毒作用(cytotoxicity)的IC₅₀与药物对Con A所致小鼠脾细胞增殖的抑制作用的IC₅₀的比值。

以上结果提示，炭壳菌聚酮(dalesconols)具有很强的免疫抑制活性且对正常细胞没有毒性，因此本发明的炭壳菌聚酮(dalesconols)有望成功用于制备新型免疫抑制剂。

Claims

1.一类炭壳菌聚酮，其特征是具有下述结构通式：

其中：1，3，5，7，9，11，13，15，17，18，19，21，23，25，27，29为碳原子序数编号，R¹为H或OH，当R¹为H时，是炭壳菌聚酮A；当R¹为OH时，是炭壳菌聚酮B。

2.一种权利要求1所述的炭壳菌聚酮A或炭壳菌聚酮B的制备方法，其特征是它包括下述步骤：

步骤1.将新鲜的昆虫肠道真菌光轮层炭壳菌菌丝体块接种到ME培养基上，于摇床上，在140rpm、28℃条件下培养3天作为种子液，

步骤6.然后用体积比为100/1的氯仿/甲醇混合溶液洗脱，合并红色部分洗脱液得红色浸膏F4，

步骤7.对浸膏F3，用甲醇重结晶得到外消旋炭壳菌聚酮A，

步骤8.对浸膏F4，进一步进行硅胶柱层析，用体积比为100/1氯仿/甲醇混合溶液洗脱得到外消旋炭壳菌聚酮B。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：步骤7得到的外消旋炭壳菌聚酮A用手性高压液相色谱法分离得到一对对映异构体：(+)-炭壳菌聚酮A和(-)-炭壳菌聚酮A。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：步骤8得到的外消旋炭壳菌聚酮B用手性高压液相色谱法分离得到一对对映异构体：(+)-炭壳菌聚酮B和(-)-炭壳菌聚酮B。

5.根据权利要求1所述的炭壳菌聚酮在制备免疫抑制剂药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的炭壳菌聚酮在制备免疫抑制剂药物中的应用，其特征是：所述的炭壳菌聚酮是炭壳菌聚酮A或炭壳菌聚酮B。