CN102746995A

CN102746995A - 制备isochromophilone VIII的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN102746995A
Application number: CN2012102286589A
Authority: CN
Inventors: 陈玉婵; 张玲; 李冬利; 王磊; 章卫民
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2012-07-03
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-03
Also published as: CN102746995B

Abstract

本发明公开了一种制备isochromophilone VIII的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明从海洋真菌Penicillium sp.FS60的液体发酵培养物中分离出具有抗肿瘤活性的isochromophilone VIII。本发明人通过实验发现，isochromophilone VIII对SF-268细胞、MCF-7细胞和NCI-H460细胞的IC₅₀值分别为7.17、6.36、22.27μg/mL，具有显著的抗肿瘤活性。因此本发明为研究与开发新型的抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋微生物资源提供了科学依据。

Description

制备isochromophilone VIII的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及利用海洋真菌Penicillium sp.FS60制备isochromophilone VIII的方法，以及化合物isochromophilone VIII在制备抗肿瘤药物中的应用和作为抗肿瘤药物活性成份方面的应用。

背景技术：

癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一。国际抗癌联盟发布的数据表明，2008年，全球有1270万人患癌，死亡人数高达760万。世界范围内因癌症死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效的措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增癌症病例，癌症死亡人数将达1700万。我国癌症发生率正处于快速上升时期，每年癌症发病人数约260万，死亡180万。癌症已成为中国城市和农村居民的第一死因，癌症带来的经济负担和对社会发展的不良影响也日益突显。在癌症的三大疗法中，药物治疗占有主要位置。

海洋是一个物种和资源丰富的世界，具有多样的化合物，是手性底物的资源库。生长在海洋这一特殊环境中的海洋生物，在其生长和代谢过程中，产生并积累了大量具有特殊化学结构并具特殊生理活性和功能的物质，是开发新型药物的重要资源。海洋抗肿瘤天然产物在海洋药物研究中一直占据主导地位，不仅开展得最早而且具有扎实的研究基础。学者预言，最有前途的抗癌药将来自海洋。现已发现海洋生物提取物中至少有10%具有细胞毒活性，美国每年有1500个新化合物从海洋中分离出来，其中1%具抗肿瘤作用。目前已有多个海洋抗癌药物进入临床或临床前研究阶段。

化合物isochromophilone VIII，其结构式如式(Ⅰ)所示：

化合物isochromophilone VIII最早公开于文献“Yang DJ,Hiroshi T,Noriko T,et al.New isochromophilones VII and VIII produced by Penicillium sp.FO-4164[J].J Antibiot,1995,49(3):223-229.”，该文献测试了该化合物对抑制二酰甘油酰基转移酶（DGAT）和卵磷脂-胆固醇-酰基转移酶（ATAC）的活性，半数抑制浓度（IC₅₀值）分别为127μM和47μM。但到目前为止，在国内外文献报道中，均未涉及化合物isochromophilone VIII具有抗肿瘤活性的报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种化合物isochromophilone VIII的制备方法。

本发明的化合物isochromophilone VIII的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：化合物isochromophilone VIII是从海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物中分离制备得到的。

所述的化合物isochromophilone VIII从海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物中分离制备得到的，具体步骤如下：

（1）制备海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体干燥后粉碎用乙醇或乙醇水溶液浸提，浓缩浸提液至无乙醇，再用水悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后得浸膏；

（2）浸膏经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂，从体积比100：0~0：100梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为5：1洗脱下来的馏分，经反相硅胶柱层析，以甲醇-水体积比80：20作为洗脱剂洗脱，再经纯化后得到化合物isochromophilone VIII。

所述的步骤（1）制备海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物具体步骤为：挑取Penicillium sp.FS60的菌丝接种于半海水马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按10%的接种量接种于半海水马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、120r/min条件下培养7天，而制得Penicillium sp.FS60的液体发酵培养物，所述的半海水马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的海水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO₄1.5g、维生素B₁10mg、用水补足至1000mL。

所述的乙醇水溶液优选为体积分数98%的乙醇水溶液。

所述的纯化是用高效液相色谱和制备薄层层析纯化。

本发明通过实验发现，化合物isochromophilone VIII对SF-268细胞、MCF-7细胞和NCI-H460细胞的IC₅₀值分别为7.17、6.36、22.27μg/mL，阳性对照物顺铂对上述三种肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.68、1.84、0.34μg/mL。此结果表明：本发明的化合物isochromophilone VIII具有显著的抗肿瘤活性。

因此，本发明的第二个目的是提供化合物isochromophilone VIII在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物优选为抗神经癌、乳腺癌或肺癌的药物。

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含化合物isochromophilone VIII作为活性成分。

所述的抗肿瘤药物优选为抗神经癌、乳腺癌或肺癌的药物。

本发明的第四个目的是提供海洋真菌Penicillium sp.FS60在制备化合物isochromophilone VIII中的应用。

本发明的第五个目的是提供海洋真菌Penicillium sp.FS60，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011413。

本发明从海洋真菌Penicillium sp.FS60中制备分离得到化合物isochromophilone VIII，该化合物isochromophilone VIII具有抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

本发明的Penicillium sp.FS60于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011413。

附图说明：

图1是化合物1（isochromophilone VIII）的¹H-NMR谱；

图2是化合物1（isochromophilone VIII）的¹³C-NMR谱；

图3是化合物1（isochromophilone VIII）的DEPT135谱；

图4是化合物1（isochromophilone VIII）的¹H-¹H COSY谱；

图5是化合物1（isochromophilone VIII）的HSQC谱；

图6是化合物1（isochromophilone VIII）的HMBC谱；

图7是化合物1（isochromophilone VIII）的HR-ESIMS谱。

具体实施方式：

下面通过具体实施例来对本发明做进一步的阐述，但是本发明并不受限于下面的实施例。

实施例1：

一、海洋真菌Penicillium sp.FS60的分离纯化和鉴定

本发明的海洋真菌Penicillium sp.FS60是从采自南海（16°24.278′N,112°10.390′E）955m深处的沉积物中分离得到的，经ITS序列分析鉴定，其ITS区片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，GenBank基因登录号为：EU076956，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于青霉属真菌（Penicillium sp.），命名为Penicillium sp.FS60。该菌于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011413。

二、Penicillium sp.FS60的液体发酵

培养基为半海水马铃薯葡萄糖液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：用500mL的海水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO₄1.5g、维生素B₁10mg、用水补足至1000mL，121℃高压灭菌20min，冷却待用。

挑取适量的Penicillium sp.FS60的菌丝接种于半海水马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液。然后将种子液按10%的接种量接种于装有500mL半海水马铃薯葡萄糖液体培养基的1000mL三角瓶中，共发酵100L，28℃、120r/min条件下培养7天，制得Penicillium sp.FS60的液体发酵培养物。

三、化合物isochromophilone VIII的制备

100L液体发酵培养物经离心得发酵液和菌丝体。菌丝体置于55℃烘箱烘干、粉碎，用体积分数98%的乙醇水溶液冷浸提取多次至提取液基本无色，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加500mL水悬浮，再用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取物，在40℃下减压浓缩得浸膏55.3g。

浸膏进行硅胶柱层析（硅胶200-300目），以石油醚-乙酸乙酯从体积比100：0~0：100梯度洗脱，用薄层色谱（TLC）检测（显色剂为茴香醛-浓硫酸试剂），合并相似组分。将以石油醚-乙酸乙酯体积比为5:1洗脱下来的馏分经反相硅胶柱层析，以甲醇-水体积比80：20作为洗脱剂洗脱，收集馏分再经HPLC制备，用250×10mml.D.的ODS-A柱（YMC-Pack，AA12S05-2510WT），以甲醇-水体积比为85：15作为洗脱剂，流速2ml/min洗脱，收集保留时间为22.5min的馏分，再经制备薄层色谱，用体积比为2:1的石油醚-丙酮为展开剂展开，显色为橙黄色，收集比移植Rf在0.6–0.7之间的馏分，制得目标化合物1（10mg）。

化合物1经质谱和核磁共振波谱分析，其结构鉴定如下：

化合物1具有以下理化和波谱特性：黄色固体。正离子ESI-MS m/z:395[M+H]^＋,417[M+Na]^＋,结合¹H-和¹³C-NMR数据提示其分子式为C₂₁H₂₇O₅C1。¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ:7.00(1H,d,J=15.6Hz,H-2′),6.17(1H,d,J=8.5Hz,H-4),6.15(1H,d,J=15.6Hz,H-1′),5.61(1H,d,J=9.8Hz,H-4′),4.98(1H,d,J=10.0Hz,H-8),4.48(1H,dd,J=10.8,5.0Hz,H-1),3.84(1H,dd,J=13.6,10.8Hz,H-1),3.41(1H,m,H-8a),2.51(1H,m,H-5′),2.20(3H,s,H-8〞-CH₃),1.84(3H,s,H-3′-CH₃),1.45(2H,m,H-6′),1.32(3H,s,H-7-CH₃),1.01(3H,d,J=6.6Hz,H-5′-CH₃),0.87(3H,t,J=7.4Hz,H-6′-CH₃);¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)δ:188.88(C-6),171.59(C-8〞),164.25(C-3),147.04(C-4′),146.84(C-4a),142.11(C-2′),133.42(C-3′),119.87(C-1′),119.00(C-5),101.86(C-4),75.32(C-7),74.36(C-8),68.63(C-1),36.63(C-8a),35.64(C-5′),30.75(C-6′),20.19(C-5′-CH₃),20.03(C-8′-CH₃),19.59(C-7-CH₃),12.07(C-3′-CH₃), 11.86(C-6′-CH₃)。上述数据与文献[Yang DJ,Hiroshi T,Noriko T,et al.New isochromophilones VII and VIII produced by Penicillium sp.FO-4164[J].J Antibiot,1995,49(3):223-229.]中isochromophilones VIII的记载值基本一致。

经过上述方法分离的目标化合物1为isochromophilone VIII，其结构式如式(Ⅰ)所示：

实施例2：

采用SRB法[Skehan P,Storeng R,Dominic S.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].JNatl Cance Inst，]测试化合物isochromophilone VIII的抗肿瘤活性。

1、试验用试剂：将本发明制备的化合物isochromophilone VIII用二甲基亚砜（DMSO）溶解得浓度为10mg/mL的母液，再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。

本实验所用肿瘤细胞株为神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7和非小细胞肺癌细胞NCI-H460。

2、实验方法：取对数生长期的NCI-H460、SF-268、MCF-7细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI-1640培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％CO₂培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL一定浓度的上述化合物isochromophiloneVIII的溶液，阴性对照加20μLRPMI-1640培养基，以顺铂作阳性对照。置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h后，加入50μl50%冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1%冰醋酸配制的SRB4mg/ml溶液100μL/孔，室温中染色30min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μL/孔10mmol/ml的Tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值（A），用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)=(1-A_样品组／A_对照组)×100％。

3、实验结果：本发明制备的化合物isochromophilone VIII对SF-268细胞、MCF-7细胞和NCI-H460细胞的IC₅₀值分别为7.17、6.36、22.27μg/mL，阳性对照物顺铂对上述三种肿瘤细胞株的IC₅₀值分别为0.68、1.84、0.34μg/mL。此结果表明：本发明的化合物isochromophilone VIII具有显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

Claims

1.海洋真菌Penicillium sp.FS60，其保藏编号为：CCTCC NO：M2011413。

2.一种化合物isochromophilone VIII的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：化合物isochromophilone VIII是从权利要求1所述的海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物中分离制备得到的。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的化合物isochromophilone VIII从海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物中分离制备得到的，具体步骤如下：

（1）制备权利要求1所述的海洋真菌Penicillium sp.FS60的发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体干燥后粉碎用乙醇或乙醇水溶液浸提，浓缩浸提液至无乙醇，再用水悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后得浸膏；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）制备海洋真菌Penicilliumsp.FS60的发酵培养物具体步骤为：挑取Penicillium sp.FS60的菌丝接种于半海水马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按10%的接种量接种于半海水马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、120r/min条件下培养7天，而制得Penicillium sp.FS60的液体发酵培养物，所述的半海水马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的海水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO₄1.5g、维生素B₁10mg、用水补足至1000mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的乙醇水溶液为体积分数98%的乙醇水溶液，所述的纯化是用高效液相色谱和制备薄层层析纯化。

6.化合物isochromophilone VIII在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗神经癌、乳腺癌或肺癌的药物。

8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含化合物isochromophilone VIII作为活性成分。

9.根据权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗神经癌、乳腺癌或肺癌的药物。

10.权利要求1所述的海洋真菌Penicillium sp.FS60在制备化合物isochromophilone VIII中的应用。