CN103980266B - 一种具有抗菌活性的化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来自海洋放线菌的具有抗菌活性的化合物及其制备方法，该化合物的结构如式I所示，该化合物具有显著的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑制作用好于盐酸四环素，且在碱性条件下抑菌作用增加，对于感染后机体环境pH增加的疾病具有很好的治疗前景。本发明还公开了具有抗菌活性的化合物的制备方法，由海洋放线菌和大肠杆菌共培养发酵产生，可通过对培养液进行乙酸乙酯或二氯甲烷萃取后，再有硅胶这层析和反相色谱分离纯化得到，易于操作和实施。

Description

一种具有抗菌活性的化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及细菌培养制备化合物领域，具体涉及一种具有抗菌活性的化合物及其制备方法。
背景技术
寻找新的活性好的抗生素是当今世界的一大难题。微生物是抗生素的主要来源，但是人们已经很难从现有菌株的二次代谢产物发现新抗生素，少数发现的新菌株，其二次代谢产物的抗菌活性往往也不太理想。海洋微生物中蕴藏着丰富的活性二次代谢产物，其研究开发，是解决当前陆地药用资源紧张的重要手段，对于人类重大疾病的治疗具有十分重要的意义。
海洋微生物能表达许多重要的次级代谢产物，但是在自然状态下，次级代谢产物表达的量极其微少或者不表达，只有在外界环境的刺激下，其表达的量才会增加。共培养作为增加微生物次级代谢产物表达的一种方式，是微生物活性二次代谢产物发现的重要研究手段。
申请公布号CN1371379A（申请号为00812158.3）的中国发明专利申请公开了一种从海洋放线菌中得到的新吲哚并咔唑生物碱，结构如式（1）所示，其中，R1是氢原子、含1到6个碳原子的烷基或含1到6个碳原子的烷氧基，R2是氢原子、含1到6个碳原子的烷基或含1到6个碳原子的烷氧基。该化合物或可药用的盐可用于制备治疗或预防哺乳动物恶性肿瘤的药物。该化合物通过放线菌菌种CLCO-002在适当的培养基中在受控条件下培养得到，该菌种在有氧和中温条件下于液体培养基中培养，温度为22℃至35℃，pH在6.0至8.0之间。
发明内容
本发明提供了一种结构新颖的具有抗菌活性的化合物，该新化合物利用共培养发酵方法，从海洋放线菌共培养发酵液中分离制备得到。该化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著，优于盐酸四环素。
一种具有抗菌活性的化合物，为式I结构的化合物；
本发明提供了一种式I结构的具有抗菌活性的化合物的制备方法，由海洋放线菌和大肠杆菌共培养发酵产生，再通过分离纯化得到，易于操作和实施。
一种具有抗菌活性的化合物的制备方法，包括以下步骤：
1）将海洋放线菌接种于发酵培养基中，静置培养5～10天，优选温度为25～30℃，得到接种有海洋放线菌的发酵培养基；
2）再将大肠杆菌接种于步骤1）中的接种有海洋放线菌的发酵培养基中，静置共培养10～20天，优选温度为25～30℃，得到共培养发酵液；
3）将共培养发酵液分离纯化得到式I结构的化合物，即具有抗菌活性的化合物。
步骤1）中，所述的发酵培养基，以1L计，由以下重量组分制成：
酵母提取物1-10g；
甘油1-15g；
海水余量；
通过酸碱缓冲液将该发酵培养基调节pH至7-8。
步骤1）中，所述的海洋放线菌，可采用现有技术，具体可采用市售产品，如采用北京北纳创联生物技术研究院出售的海洋链霉菌Streptomycessp.MCC1A03740。
步骤2）中，所述的大肠杆菌，可采用现有技术，具体可采用市售产品，如采用北京北纳创联生物技术研究院出售的大肠杆菌EscherichiacoliATCC35218，所述的大肠杆菌的接种体积为发酵培养基体积的0.1%-5%。
步骤3）中，所述的分离纯化包括：将共培养发酵液用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱层析，薄层检识得到所需要的馏分，再通过反相色谱纯化，得到式I结构的化合物。
所述的硅胶柱层析的条件：采用的流动相为体积比为10～2：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或体积比为100:0～2的二氯甲烷-甲醇溶液。所述的反相色谱纯化的条件：采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相为体积比为65～80：35～20甲醇-水的溶液或者35～50:65～50乙腈-水的溶液。
对本发明式I结构的具有抗菌活性的化合物进行了抗菌活性检测，该化合物显示出良好的抗菌活性，其对金黄色葡萄球菌的抑制作用优于阳性药物盐酸四环素，该新化合物在碱性条件下抗菌作用增加，由于许多抗生素在碱性条件下抗菌效果会减弱，因此，该化合物在特殊生理环境的抗菌治疗中有很好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明式I结构的具有抗菌活性的化合物，具有显著的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑制作用好于盐酸四环素，且在碱性条件下抑菌作用增加，对于感染后机体环境pH增加的疾病具有很好的治疗前景。
本发明提供的新化合物由海洋放线菌和大肠杆菌共培养发酵产生，可通过对培养液进行乙酸乙酯或二氯甲烷萃取后，再有硅胶这层析和反相色谱分离纯化，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的发酵方法与常规发酵方法高效液相色谱分析对比；
图2为本发明具有抗菌活性的化合物的1HNMR图谱；
图3为本发明具有抗菌活性的化合物的13CNMR图谱；
图4为本发明具有抗菌活性的化合物的HSQC图谱；
图5为本发明具有抗菌活性的化合物的HMBC图谱；
图6为本发明具有抗菌活性的化合物的1H-1HCOSY图谱。
具体实施方式
本发明海洋放线菌Streptomycessp.MCC1A03740和大肠杆菌EscherichiacoliATCC35218均采用北京北纳创联生物技术研究院的市售产品。
实施例1
一、化合物的发酵
1）将海洋放线菌Streptomycessp.MCC1A03740接种于500mL锥形瓶中，每瓶含200mL发酵培养基(以发酵培养基1L计，酵母提取物5g，甘油5g，余量为海水，通过酸碱缓冲液将该发酵培养基调节pH至7.5)中，在28℃下静置培养7天，得到接种有海洋放线菌的发酵培养基；
2）将经140转/分钟摇床培养24小时的大肠杆菌EscherichiacoliATCC35218接种于步骤1）的接种有海洋放线菌的发酵培养中，接种体积为1000μL，在28℃下共生静置培养15天，得到含有本发明具有抗菌活性的化合物的共培养发酵液。
本发明所得发酵培养液的高效液相色谱色谱分析如图1所示，与所应用菌株的单独培养发酵产物的高效液相色谱色谱分析对比可知，只有本发明所提供培养方法，才能生产式I结构的化合物。
二、化合物的制备
将含有本发明具有抗菌活性的化合物的共培养发酵液用等体积乙酸乙酯萃取2次，所得萃取液浓缩。将所得乙酸乙酯部位进行硅胶柱层析，用体积比为5:1的石油醚-乙酸乙酯体系等度洗脱，薄层检识含有新化合物的馏分，合并。所得馏分用反相高效液相色谱分离（SepaxAmethystC-18(5μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长230nm），采用的流动相为体积比为78：22甲醇-水体系以10mL/min等度洗脱，收集35min的色谱峰，回收溶剂，即可得本发明的具有抗菌活性的化合物。
三、化合物的鉴定
本发明具有抗菌活性的化合物（即式I结构的化合物）分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS推测为C26H19N3O3（[M-H]-420.1351,calculated420.1348）。红外光谱吸收为：3344cm-1（亚胺/酰胺）,2927cm-1,2855cm-1（饱和烷基氢）,1710cm-1（羰基）,1653cm-1（酰胺羰基）和746cm-1（邻位取代苯）。核磁共振数据及信号归属如表1所示，其标注如下（箭头表示碳-氢相关，加粗化学键表示氢-氢相关）：
表1（1HNMR400MHz，13CNMR100MHz,溶剂CDCl3）
δC δH(J in Hz) HMBC(C→H)
1,1’-NH 8.00,2H,br.s
2,2’ 123.2 6.90,2H,s 8
3,3’ 117.7 4/4’,8,9
3a,3a’ 126.8 5/5’,7/7’,2/2’,8
4,4’ 119.6 7.47,2H,d(7.9) 6/6’
5,5’ 119.5 7.04,2H,t(7.9) 7/7’
6,6’ 122.1 7.19,2H,t(7.9) 4/4’,7/7’
7,7’ 111.2 7.38,2H,d(7.9) 5/5’
7a,7a’ 136.6 4/4’,6/6’,2/2’
8 36.7 6.12,1H,s 2/2’
9 113.2 6.90,1H,s 8
10-NH
11 168.5 12,9
11a 130.0 14
12 126.9 7.601H,d(8.3) 14
13 119.3 6.88,1H,t(8.3) 15
14 131.5 7.26,1H,t(8.3) 12
15 117.5 6.98,1H,d(8.3) 13
15a 156.8 12,14
16-O
17 158.0 8,9
本发明具有抗菌活性的化合物的1HNMR（核磁共振氢谱）图如图2所示，本发明具有抗菌活性的化合物的13CNMR（核磁共振碳谱）图如图3所示，本发明具有抗菌活性的化合物的HSQC（异核单量子关系）图谱如图4所示，本发明具有抗菌活性的化合物的HMBC（多键碳氢关系）图谱如图5所示，本发明具有抗菌活性的化合物的1H-1HCOSY（氢-氢相关谱）图谱如图6所示，如图2、图3、图4、图5和图6所示，结合表1，表明，本发明得到的具有抗菌活性的化合物，为式I结构的化合物。
四、化合物的抗菌活性
抗菌活性检测采用96孔板法，将在MH培养基生长至600nm吸光度为0.5的待测大肠杆菌EscherichiacoliATCC35218和金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC43300菌液稀释1000倍后取190μL接种于96孔板中，加入不同浓度的本发明具有抗菌活性的化合物（即式I结构的化合物）的DMSO溶液，37℃培养12h，600nm测吸光度并计算抑制细菌的最低抗生素浓度（MIC）。
式I化合物和盐酸四环素的抗菌效果如表2（MIC，mg/mL）
由表2可知，本发明式I结构的具有抗菌活性的化合物，具有显著的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑制作用好于盐酸四环素，且在碱性条件下抑菌作用增加，对于感染后机体环境pH增加的疾病具有很好的治疗前景。

Claims (6)

1.一种具有抗菌活性的化合物，其特征在于，为式I结构的化合物；
2.根据权利要求1所述的具有抗菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将海洋放线菌接种于发酵培养基中，静置培养5～10天，得到接种有海洋放线菌的发酵培养基；
所述的海洋放线菌为海洋链霉菌Streptomycessp.MCC1A03740；
所述的发酵培养基，以1L计，由以下重量组分制成：
酵母提取物1-10g；
甘油1-15g；
海水余量；
通过酸碱缓冲液将该发酵培养基调节pH至7-8；
2)再将大肠杆菌接种于步骤1)中的接种有海洋放线菌的发酵培养基中，静置共培养10～20天，得到共培养发酵液；
所述的大肠杆菌为大肠杆菌EscherichiacoliATCC35218；
3)将共培养发酵液分离纯化得到式I结构的化合物，即具有抗菌活性的化合物。
3.根据权利要求2所述的具有抗菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的大肠杆菌的接种体积为发酵培养基体积的0.1％-5％。
4.根据权利要求2所述的具有抗菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的分离纯化包括：将共培养发酵液用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱层析，薄层检识得到所需要的馏分，再通过反相色谱纯化，得到式I结构的化合物。
5.根据权利要求4所述的具有抗菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的硅胶柱层析的条件：采用的流动相为体积比为10～2：1的石油醚-乙酸乙酯溶液或体积比为100:0～2的二氯甲烷-甲醇溶液。
6.根据权利要求4所述的具有抗菌活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述的反相色谱纯化的条件：采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相为体积比为65～80：35～20甲醇-水的溶液或者体积比为35～50:65～50乙腈-水的溶液。
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CN103497181B (zh) * 2013-09-30 2016-03-30 承德医学院 作为糖原磷酸化酶抑制剂的苯并氮杂卓酮类化合物、其制备方法及医药用途

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