MX2008015971A - Sales de elsamitrucina estables adecuadas para formulaciones farmaceuticas. - Google Patents

Abstract

Se proveen formas cristalinas sólidas y estables de sales de elasamitrucina que son útiles para preparar formulaciones parenterales anti-neoplásticas. También se proveen métodos para tratar enfermedades neoplásticas en humanos usando formulaciones parenterales que incluyen cuando menos una sal de elsamitrucina estable.

Description

SALES DE ELSAMITRUCINA ESTABLES ADEC UADAS PARA FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Referencia cruzada a una solicitud relacionada Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente norteamericana no 1 1 /424,387 presentada el 1 5 de ju nio de 2006. El contenido de esta solicitud se incorpora aquí completamente como referencia . Cam po de la Invención La presente invención se refiere a sales estables de elsamitrucina y los métodos sintéticos relacionados. Específicamente, las sales estables, sólidas de elsamitrucina de la presente invención son convenientes para preparar soluciones útiles para la administración parenteral en el tratamiento de enfermedades neoplásticas. Antecedentes de la I nvención La elsamitrucina es un antibiótico antineoplástico heterocíclico aislado de la cepa bacteriana Gram positiva J907-21 de Actinomicetos como se describe en las patentes norteamericanas (USPN) 4.51 8.589 y 4.572.895 que se incorporan como referencia por lo que describen relacionado a la historia natu ral , a la composición química , a los métodos de preparación y a la bioactividad de la elsamitrucina . La elsamitrucina se intercala en el ADN en las secuencias ricas en g uanina-citosina (C-G) - e inhibe I topoisomerasa I y I I , dando por resultado rotu ras en las tiras simples e inhibición de de la replicación del ADN . La elsamitrucina posee actividad oncolítica significativa contra el cá ncer metastático de mama , de colón y recto, de pulmón de células no pequeñas y de ovario y en pacientes con linfoma no de Hodgkin recaído o refractario . La elsamitrucina se conoce qu ímicamente como benzo (h) (1 ) benzopirano (5.4.3-cde)( 1 )ebnzopyran-5, 1 2-diona, 1 0((2-O-(2-amino-2 ,6-didesoxi-3-0-metil-alfa-D-galactopiranosil)-6-desoxi-3-C-metil-R-D-galactopiranosil)oxi-6-hidroxi-1 -metilo, y tiene la estructura representada generalmente en la fórmula I . La elsamitrucina también se conoce como 1 0-O-elsaminosilelsarosilcartarina , BBM 2478A, BMY-28090, SP I-28090, BR N 521481 3, elsamicina A, elsamitrucin , y elsamitrucine.

La elsamitrucina se administra típicamente de forma parenterai (generalmente intravenosa) a los animales , incluyendo los humanos y se suministra como polvo liofilizado que se reconstituye con agua estéril para la inyección inmediatamente antes de uso. El polvo liofilizado de elsamitrucina de la técnica anterior se proporciona como un succcinato 1:1 formado in situ disolviendo la base de elsamitrucina en un solvente orgánico y después agregando el suficiente ácido succínico acuoso para formar una solución 1:1 de la base libre solubilizada a ácido. La suspensión de elsamitrucina-ácido succínico resultante después se ajusta a un pH de entre 3.5 y 4.5 y se mezcla con un agente volumétrico tal como manitol para realzar estabilidad antes de la liofilización (ver por ejemplo USPN 5.508.268). Las sales estables de elsamitrucina en forma del polvo (cristalino o amorfo) actualmente no están disponibles así todas las composiciones farmacéuticas de elsamitrucina altamente solubles deben prepararse in situ usando la base libre. Por lo tanto, hay una necesidad de sales estables de elsamitrucina que se pueden almacenar como polvos secos por períodos extendidos sin pérdida de actividad biológica. Por otra parte, hay también una necesidad de preparaciones farmacéuticas que incluyen sales estables de elsamitrucina que se pueden preparar sin el uso de la base libre y de solventes orgánicos correspondientes requeridos para solubilizar la base libre in situ. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona sales solubles en agua, sólidas de elsamitrucina útiles para preparar soluciones parenterales estables previstas para el uso en regímenes terapéuticos antineoplásticos. Además, se proporcionan los métodos para preparar las sales de elsamitrucina estables de la presente invención. En una modalidad de la presente invención el contra-ion de la sal estable, sólida de elsamitrucina se selecciona del grupo que consiste de, pero no se limita a, lactato, fumarato, maleato, succcinato, tartrato, tosilato, metanesulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato, fosfato, y otros. En otro aspecto de la presente invención las sales estables, sólidas de elsamitrucina pueden ser cristalinas o amorfas. En un aspecto de la presente invención, se proporciona una sal estable, sólida del tosilato de elsamitrucina. En otra más modalidad de la presente invención un método para tratar una enfermedad neoplástica incluye la administración de una formulación parenteral de elsamitrucina intravenosa a un ser humano en donde la formulación parenteral de elsamitrucina incluye por lo menos una sal sólida estable de elsamitrucina seleccionada del grupo que consiste de lactato, fumarato, maleato, succcinato, tartrato, tosilato, metansulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato y fosfato. Todavía otra modalidad de la presente invención incluye un método para tratar enfermedades neoplásticas en un ser humano que incluye el suministro de una formulación parenteral que consiste esencialmente de tosilato de elsamitrucina, un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente por lo menos un excipiente aceptado farmacéuticamente.

En una modalidad de la presente invención la enfermedad neoplástica que es tratada usando las formulaciones parenterales de elsamitrucina de la presente invención es linforma de no Hodgkin recaído o refractario. Éstos y otros objetos, ventajas y características de la invención serán entendidos y apreciados más completamente por la referencia a la especificación escrita. Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Representa el tosilato de elsamitrucina recristalizado a partir de la mezcla 1:1 de acetonitrilo:agua preparada de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS Antes de describir la invención, puede ser provechoso proporcionar una comprensión de ciertos términos que se utilizarán adelante. Análogos: Como se usa aquí "análogo" incluye los compuestos que tienen semejanza estructural a otro compuesto. Por ejemplo, el compuesto anti-viral aciclovir es un análogo de nucleósido y estructuralmente similar al nucleósido guanosina que se deriva de la base de guanina. Así el aciclovir ¡mita a la guanosina (es análogo biológicamente) e interfiere con la síntesis de ADN substituyendo (que compite con) residuos de guanosina en el ácido nucleico viral y previene la translación/la transcripción. Asi los compuestos que tienen semejanza estructural a otros (un compuesto padre) que imita la actividad biológica o química del compuesto padre son análogos.

No hay números mínimos o máximos de substituciones elementales o funcionales del grupo requeridas para calificar como un análogo según lo utilizado aquí considerando que el análogo es capaz de imitar, en una cierta manera relevante, ya sea de forma idéntica, complementa o competitiva, con las características biológicas o químicas del compuesto padre. Los análogos pueden ser, y frecuentemente son, los derivados del compuesto del padre (ver el "derivado" adelante). Los análogos de los compuestos descritos aquí pueden tener el igual, menor o mayor actividad que sus compuestos padre. Derivado: Según lo utilizado aquí un "derivado" es un compuesto hecho (derivado de) ya sea naturalmente o sintéticamente, de un compuesto padre. Un derivado puede ser un análogo (ver el "análogo" arriba) y puede poseer asi actividad química o biológica similar. Sin embargo, según lo se usa aquí, un derivado no tiene que necesariamente imitar la actividad del compuesto del padre. No hay números mínimos o máximos de substituciones elementales o funcionales del grupo requeridas para calificar como derivado. Como ejemplo, el ganclovir compuesto anti-viral es un derivado del aciclovir. Ganclovir tiene un espectro diferente de la actividad anti-viral del aciclovir así como diversas características toxicológicas. Derivados de los compuestos descritos aquí puede tener una actividad igual, menor, mayor o no similar a sus compuestos padre. Elsamitrucina: como se usa aquí, el término "elsamitrucina" se refiere a una composición antineoplástica que tiene un peso molecular de aproximadamente 825.83 DA y se conoce químicamente como benzo(h)(1 )benzopirano(5,4,3-cde)(1 )benzopiran-5,12- diona-10((2-O-(2-amino-2,6-didesoxi-3-O-metil-alpha-D-galactopiranosil)-6-desoxi-3-C-metil-beta-D-galactopiranosil)oxi)- 6-hidroxi-1 -metilo, y tiene la estructura representada generalmente en la fórmula I. La elsamitrucina también se conoce como 10-O-elsaminosilelsarosilcartarina, BBM 2478A, BMY-28090, SPI-28090, BRN 5214813, elsamicina A, el La elsamitrucina, y elsamitrucine. Ver USPN 4.518.589 y 4.572.895 para los métodos de aislar y de caracterizar la elsamitrucina de fuentes naturales. Ver también Konishi M, Sugawara K, Kofu F, Nishiyama Y, Tomita K, Miyaki T, Kawaguchi H. 1986. Elsamicinas, los nuevos antibióticos antitumorales se relacionada con chartreusina I. La producción, el aislamiento, la caracterización y la actividad antitumoral. J. Antibiot. (Tokio) junio; 39 (6): 784 - 91. Formulación farmacéutica: como se usa aquí el término formulación farmacéutica se refiere a una preparación aceptada farmacéuticamente que abarca una o más de las sales de elsamitrucina de la presente invención y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable por ejemplo, pero no limitado a agua para inyección, solución salina o solución salina de fosfato amortiguada. Por otra parte, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden también incluir estabilizadores, conservadores, acumuladores intermediarios o agentes terapéuticos adicionales. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier medio conocido para los expertos en la materia y se adaptan idealmente para la administración intravenosa o la inoculación en la piel, el músculo u otros tejidos del cuerpo. La formulación farmacéutica se puede considerar para la administración oral. Sal: Según lo se usa aquí una "sal" o "sales" incluyen cualquier compuesto que resulte del reemplazo de parte o todo el hidrógeno ácido de un ácido por un metal o un grupo que actúa como un metal. un compuesto cristalino iónico. En este caso, la sal es un producto de una base libre y un ácido orgánico que puedan existir como sólido estable y no incluye las pseudo sales, o las sales hechas in situ, que existen solamente en solución. Formas convenientes de la sal: Según lo se usa aquí, el término; "forma de sales adecuadas" significa una sal de elsamitrucina preparada en el estado sólido estable ya sea en forma amorfa o cristalina. Sólido o sal sólida: Como se usa aquí el término la sal sólida o sólido se refiere a una sal de elsamitrucina que existe en un estado sólido y que tiene humedad residual menor al 30%, humedad residual preferiblemente menor al 10% y preferiblemente humedad residual menor al 5%. Como se usa aquí "humedad" se refiere al agua o a un solvente orgánico. El término "sólido" también se utiliza aquí para distinguir las sales de elsamitrucina de la presente invención de las sales formadas in situ y que existen sobre todo en la fase acuosa.

Estable: Como se usa aquí "estable" se refiere a una sal de elsamitrucina o una formulación parenteral que contiene sal de elsamitrucina (hecha por un método diferente a la formación in situ de sal) en donde la sal de elsamitrucina conserva los datos de RMN que muestran un cociente cercano la perfección 1:1 de la sal (no indicando así ninguna descomposición en el de estado sólido) durante el secado a temperaturas elevadas de 75°C durante nueve horas o preferiblemente 98°C durante la noche. Por otra parte, la estabilidad según se usa aquí se refiere a que la sal de elsamitrucina contenida en una formulación parenteral conserve por lo menos el 90% de su actividad antineoplástica según lo determinado por la prueba in vitro de inhibición del crecimiento (ver el ejemplo 4) por lo menos 24 meses en la forma sólida y por 18 meses en la forma líquida a una temperatura de almacenamiento conveniente. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona las sales solubles en agua, sólidas de elsamitrucina útiles para preparar las formulaciones farmacéuticas estables previstas para el uso en regímenes terapéuticos antineoplásticos. Además, también se proporcionan métodos para preparar sales de elsamitrucina estables. En una modalidad de la presente invención las sales de elsamitrucina estables de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste de, pero no se limita a, lactato, fumarato, maleato, succcinato, tartrato, tosilato, metansulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato, fosfato, y otros. Las sales de elsamitrucina de la presente invención son sólidos estables y pueden ser cristalinas o amorfas. La elsamitrucina y los antibióticos estructuralmente relacionados se enlazan a las zonas ricas den GC en el ADN, con una preferencia clara por B-ADN sobre Z-ADN. Inhiben la síntesis del ARN y causan la escisión de una sola tira del ADN por medio de la formación de radicales libres. La elsamitrucina se puede también considerar como el inhibidor más potente de topoisomerasa II hasta ahora descrito y puede inhibir la formación de varios complejos de proteína de ADN. La elsamitrucina se enlaza a las regiones promotoras P1 y P2 del oncogeno c-myc inhiben el atascamiento del factor de la transcripción Sp1, así inhibiendo la transcripción. La elsamitrucina ha demostrado actividad en pacientes con linfoma no de Hodgkin recaído o refractario y actividad in vivo contra una amplia gama de neoplasmas de murina incluyendo leucemia P388, leucemia L1210, y melanoma B16 y M5076, así como contra los xenoinjertos MX1 y HCT1 16 (ver por ejemplo pruebas de Raber MN, Newman RA, Newman BM, Gaver RC, fase I de Schacter LP1992 farmacología clínica de elsamitrucina. Cáncer Res. 15 de marzo; 52 (6): 1406-10). Además, el tratamiento experimental de linfoma no de Hodgkin recaído o refractario ha demostrado que la toxicidad asociada a la elsamtrucina es relativamente baja y consiste principalmente en astenia, náusea y vomito y no incluye mielosupresión. La actividad de elsamitrucina y su carencia de mielosupresión sugieren una utilidad en esta enfermedad especialmente cuando se combina con otros agentes probados, (ver a Alien SL, Schacter LP, Lichtman SM, Bukowski R, Fusco D, Hensley M, O' Dwyer P, Mittelman A, Rosenbloom B, Huybensz S. 1996. El estudio fase II de elsamitrucina (BMY-28090) para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin recaído o refractario. Invest. New Drugs 14 (2): 213-7. La actividad in vitro de elsamitrucina también fue investigada con respecto a la de doxorubicina (DX) en dos variedades de células sensibles de cáncer de mama: un linaje positivo al receptor de estrógeno (ER + , MCF7) y un linaje negativo al receptor del estrógeno (ER-, MDA-MB- 231), y en un sublinaje resistente a DX- (MCF7DX). La actividad de los dos fármacos también fue investigada en 19 especímenes clínicos de cáncer de pecho de pacientes no tratados. Los fármacos fueron probados en las concentraciones farmacológicamente relevantes, según lo calculado por el área bajo la curva para una exposición de 3 h a la dosis mortal produciendo una mortalidad del 10% (LD10) en ratones, y a concentraciones de diez a cien veces. En linajes sensibles a DX, una mayor inhibición de incorporación de precursor de ARN y ADN, así como de la proliferación celular, causada por elsamitrucina que por DX. Por otra parte, el efecto antiproliferativo fue diez veces mayor en el ER + MCF7 que en el linaje celular ER-MDA-MB-231 (IC50: 0.25 contra 0.21 microgramos/ml). La elsamitrucina presentó una resistencia cruzada a DX en el sublinaje de MCF7DX. En especímenes clínicos, los efectos sobre la incorporación del precursor de ADN fueron observados más a menudo para la elsamitrucina que para DX en las mismas concentraciones del fármaco. La sensibilidad in vitro a la elsamitrucina fue más pronunciada para los tumores ER+ que para los ER-: las concentraciones de inhibición mínimas del fármaco fueron de 0.1 y 3.5 microgramos/ml, respectivamente, en los dos grupos. Estos resultados in vitro indicarían un papel prometedor de elsamitrucina en el tratamiento clínico, principalmente de los enfermos con cáncer de mama e ER+ (ver Silvestrini R, Sanfilippo O, Zaffaroni N, De Marco C, Catania S. 1992. Actividad de un análogo de chartreusina, la elsamitrucina sobre las células de cáncer de mama. Anticancer Drugs. Dec; 3(6):677-81 ). La patente número 5.508.268 de los Estados Unidos publicada el 16 de abril de 1996 a Nassar y otros, asignada a Bristol-Myers Squibb (de aquí en aelante la patente 268) describe formulaciones parenterales que incluyen una base de elsamitrucina, un ácido orgánico, un estabilizador y un almacén intermediario. Las composiciones de elsamitrucina descritas aquí fueron preparadas usando varios ácidos orgánicos incluyendo hidroclórico, L (+) -láctico, L-tartárico, D-glucurónico, metano-sulfónico, adípico y succínico siendo el preferido el ácido succínico. Las composiciones de elsamitrucina se preparan según las enseñanzas de un ejemplo que se presenta en la columna 4 líneas 5-30. En este ejemplo solamente se describe la sal del succcinato. Específicamente, la patente 268, de acuerdo con su descripción, la sal de elsamitrucina se forma ¡n situ usando un ácido orgánico conjuntamente con por lo menos un agente reductor (conservador) y el pH ajustado a aproximadamente 4. La solución resultante fue filtrada y conservada en el estado líquido para la prueba de estabilidad. En otras modalidades descritas en la patente 268 el ácido orgánico, la base de elsamitrucina, el agente reductor y otros excipientes farmacéuticos convenientes tales como pero sin limitarse a los azúcares, se mezclan en la solución y la composición resultante se liofiliza. Sin embargo, la patente 268 no describe, no discute ni enseña las sales sólidas estables de elsamitrucina. En contraste agudo con las enseñanzas de la patente 268 los actuales inventores han descubierto los métodos que proporcionan las sales sólidas estables de elsamitrucina hechas usando base de elsamitrucina y ácidos orgánicos seleccionados. Las composiciones resultantes hechas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención son polvos sólidos, secos o parcialmente secados de la sal de elsamitrucina, en comparación con los liofilizantes descritos en la patente 268. Así, las composiciones de la sal de elsamitrucina de la presente invención son sales verdaderas en las soluciones de estado sólido, no soluciones in situ que contienen una mezcla solubilizada de base y ácido orgánico. La presente invención ofrece numerosas ventajas sobre las mezclas formadas in situ según lo descrito en la patente 268. Primero, las sales de elsamitrucina hechas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención pueden ser analizadas cuidadosamente con respecto a las impurezas y ser refinadas según sea necesario para cumplir con regulaciones gubernamentales excesivamente altas. Por otra parte, las sales verdaderas de la presente invención se pueden pesar exactamente y disolver en portadores farmacéuticos convenientes tales como agua para inyección. Las propias sales seleccionadas son extremadamente estables cuando son almacenadas en el de estado sólido y tienen períodos de vida de anaquel extensos al igual que sus soluciones solubilizadas correspondientes. Así, las soluciones parenterales se pueden preparar usando las sales de elsamitrucina de la presente invención y almacenar por periodos de tiempo extendidos. Los ejemplos siguientes se proporcionan como modalidades ilustrativas de la presente invención. Debe entenderse que las sales secas, o casi secas estables de elsamitrucina de la presente invención no están limitadas por los ejemplos siguientes. Las enseñanzas de los ejemplos que siguen se pueden utilizar por los químicos farmacéuticos con habilidad ordinaria como guía en la producción de otras variaciones que dan lugar a las mismas composiciones según lo descrito aquí. Ejemplos MÉTODOS PARA FABRICAR SALES DE ELSAMITRUCINA EJEMPLO 1 PREPARACIÓN INICIAL DE SALES ESTABLES DE ELSAMITRUCINA DE LA PRESENTE INVENCIÓN Pequeños lotes de sales de elsamitrucina fueron preparados antes de la optimización y aumentan proporcionalmente. Fueron seleccionados ocho contra-iones basados en ácidos orgánicos, éstos incluyen ácido láctico, ácido maleico, ácido succínico, ácido L-tartárico, ácido p-toluenesulfónico (también designadas aquí como p-TSA o tosilato), el ácido benzoico, salicílico, y los ácidos sulfúricos. Tres solventes se seleccionaron en base a los métodos anteriores de selección conocidos para los expertos en la materia de la química farmacéutica, los solventes seleccionados incluyen dioxano, dimetilformamida (DMF), y ácido acético (AcOH). Una combinación adicional de p-TSA/MeOH se incluye para un total de veinticinco variaciones de reacciones. A cada frasco de reacción fueron agregados 3.0 x 10"5 mol de base de elsamitrucina. La base de elsamitrucina fue disuelta en 0.25 mL de DMF o de AcOH a 55°C, 1.5 ml_. del dioxano a 80°C, o de 12 ml_. de MeOH en 70°C y se agita durante cinco minutos para asegurar la disolución. Cada frasco entonces fue cargado con 245-270 µ?_ de una solución del dioxano 0.126 M de uno de los ácidos orgánicos enumerados arriba (ver tabla 1) que corresponden a 1.05 equivalentes de cada uno de los ocho ácidos (el ácido tartárico fue dispensado en una mezcla 1:1 de metanol/agua debido a su insolubilidad en dioxano).

Tabla 1 La temperatura inicial se mantuvo durante diez minutos y entonces se red ujo gradualmente a la temperatura ambiente a un índice de 20°C/hora para DMF y AcOH , de 30°C/hora para el dioxano y de 25°C/hora para MeOH . Los sólidos fueron formados en los frascos con dioxa no/ácido L-tartárico, dioxano/p-TSA, dioxano/ácido sulfúrico, y AcOH/ ácido sulfú rico. Los sólidos fueron recolectados por filtración y se secaron al vació a 50°C y 30 pulgadas Hg . Los frascos en donde los sólidos no se formaron fueron concentrados al estado seco con u na corriente del nitrógeno y secados al vació en 50°C y 30 pulgadas Hg. El metanol fue eliminado al vacío y el residuo resultante fue secado bajo alto vacío a la temperatura ambiente . Todas las muestras fueron analizadas por la difracción de rayos X (XRPD), calorimetría de exploración diferencial (DSC), y análisis termogravimétrico (TGA) para determinar la cristalinidad de las sales. Los sólidos cristalinos fueron obtenidos de dioxano/ ácido sulfú rico y de AcOH/ ácido sulfúrico; los sólidos semicristalinos fueron obtenidos de dioxano/ ácido L-ta rtárico , dioxano/p-TSA, DM F/ácido láctico, DM F/ ácido maleico, DM F/ ácido L-tartárica , DMF/ ácido benzoico, DMF/ ácido sulfúrico, AcOH/ ácido láctico, de AcOH/p-TSA, y AcOH/ácido benzoico. Los otros sólidos se encontró que eran amorfos por XRPD. Ejemplo 2 Optimización de la preparación de la sal de elsamitrucina Las siguientes tres sales de elsamitrucina hechas de acuerdo con las enseñanzas del ejemplo 1 fueron seleccionadas para mejorar el desarrollo. Las sales seleccionadas fueroan tartrato de elsamitrucina, sulfato de elsamitrucina y tosilato de elsamitrucina. Éstos fueron seleccionados porque cada uno proporcionó sólidos cristalinos o semicristalinos que se precipitaron durante el proceso de enfriamiento, que pueden permitir un mejor aislamiento y purificación (en caso de necesidad) de la sal y los presta así más convenientes para las técnicas de fabricación a mayor escala. Sin embargo, su selección para los propósitos del ejemplo 2 no se debe considerar una limitación. El ácido L-tartárico, el ácido sulfúrico y el p-TSA fueron disueltos en dioxano. A los recipientes de reacción convenientes se introdujeron 1 .7 x 10"~4 mol de la base de elsamitrucina que fue disuelta en 7.5 mL. del dioxano en 80°C, y se agita durante cinco minutos para asegurar la disolución. Entonces a cada frasco se le agregaron entonces 350-380 pL de una solución de 0.5 M de ácido orgánico en el dioxano que correspondía a aproximadamente 1.05 equivalente cada uno de los tres ácidos (Tabla 2).

Tabla 2.

La temperatura inicial se mantuvo durante diez minutos y entonces se reduce gradualmente a la temperatura ambiente a un índice de 30°C/hora para el dioxano. Los sólidos se formaron después de la adición de ácido a los frascos con dioxano/ ácido L-tartárico y dioxano/ácido sulfúrico y para la precipitación de dioxano/p-TSA ocurrida d urante el proceso de enfriamiento. Después de la filtración los sólidos fueron secados al vació en 50°C y 30 pulgadas Hg . Las muestras se analizaron por XRPD , DSC, y TGA para determinar la cristalinidad (tabla 3) , y otras características físicas. Como muestra la tabla 3, todos los sólidos en el ejemplo 2 fueron semicristalinos, contenido hasta aproximadamente 5% del solvente residual y ten ían una consistencia pastosa debido a la alta cantidad de solvente que fue conservado en los sólidos debido a la precipitación rápida. En otra modalidad las sales de elsamitrucina de la presente invención fueron prepa radas usando un método más lento de precipitación descrito antes. A los recipientes de reacción se introdujeron 7.6 x 10"5 mol de base de elsamitrucina y de 5 ml_. de dioxano a 80°C. Después de que la mezcla fuera agitada durante cinco minutos para asegurar la disolución de la base, µ?.400 de una solución acuosa 0.2 M de ácido tartárico que corresponda a 1.05 equivalente fueron agregados a la base disuelta de elsamitrucina. La temperatura fue mantiene a 80°C durante diez minutos y entonces los recipientes fueron refrescados a la temperatura ambiente a un índice de 30°C/hora. Durante la fase de enfriamiento se presentó la precipitación. Los sólidos fueron recolectados por filtración y secados al vació en 50°C y 30 pulgadas Hg. Las muestras fueron analizados por XRPD, DSC, y TGA para determinar las características físicas [Tabla 3, OVL-A-55 (1) y OVL-A-55 (2)]. La primera muestra [dioxano/ácido sulfúrico, OVL-A-55 (1)] se cristalizaron por XRPD, pero contenía 3.6% de solvente residuales según el análisis TGA y tres picos endotérmicos en la curva DSC. La segunda muestra [dioxano/ácido L-tartárico, OVL-A-55 (2)] fue semicristalina. Las siguientes sales de elsamitrucina fueron preparadas en un ambiente acuoso como sigue. A los recipientes de reacción se le agregaron 100 mg de la base de elsamitrucina, 1.05 equivalente del ácido correspondiente (p-TSA, ácido succínico, y L-tartárico fue agregado como sólidos; el ácido sulfúrico fue disuelto en 0.5 mL de agua) y del agua (10 mL. para el ácido del p-TSA, succínico, y L-tartárico, 9.5 mL ácido sulfúrico). Las suspensiones fueron calentadas a 80°C con agitación de diez minutos para formar una solución clara y entonces una llanura en rampa a la temperatura ambiente a un índice de 30°C/hora. Después de agitar durante la noche en los experimentos a la temperatura ambiente no se formaron precipitados. El agua fue retirada bajo flujo moderado de nitrógeno a 35°C. La precipitación se observo en el experimento p-TSA después del retiro de un tercio del agua, este sólido fue filtrado y secado al vació a 50°C y 30 pulgadas Hg. El filtrado también fue analizado. Los otros tres frascos fueron evaporados hasta el estado seco y se secaron al vació en 50°C y 30 pulgadas de Hg. Los resultados mostraron que los sólidos producidos eran semicristalinos con un alto contenido amorfo [Tabla 3, OVL-A-47 (1), OVL-A-47 (2-1), OVL-A-47 (3), y OVL-A-65]. Tabla 3 (x)- exotermia Ejemplo 3 Cristalización de la sal del tosilato de elsamitrucina usando microscopía En una platina para microscopio, 1 -2 mg de tosilato amorfo de elsamitrucina fue dispersado con la ayuda de una espátula y se coloco una cubre platina . Se aplicaron gotas de solvente del lado del cubre platina para permitir que el solvente fluja debajo de la cubierta y disuelva el fármaco. El fármaco en contacto con el solvente fue almacenado a la temperatura ambiente y examinado debajo del microscopio con u na amplificación 1 00x o 400x. Los solventes usados fueron alcohol isopropilo , metanol , etanol , acetonitrilo , acetona , glicol de propileno , tetrah idrofu rano, diclorometano y mezclas 1 : 1 de alcohol isopropilo, metanol , etanol, acetonitrilo , acetona con agua . Los cristales en forma de aguja o de barras fueron observados debajo del microscopio en los solventes - etanol, metanol, propilenglicol, alcohol isopropilo, acetona , y todas las mezclas agua:solvente. El examen microscópico de las muestras indicó que la sal del tosilato de elsamitrucina se volvió cristalina en por lo menos un solvente. Ejemplo 4 Microcristalización de SA, p-TSA y sales de HCI de elsamitrucina Una pequeña cantidad de la sal (1-2 mg) fue colocada en una platina del microscopio y cubierta con un cubre platina. Varias gotas del solvente fueron agregadas en el borde de la cubierta de modo que la acción capilar succionara el solvente entre la platina y el cubre-platina. Si el material fue disuelto parcialmente, la platina fue calentada lentamente en una placa caliente hasta que la mayor parte del sólido se hubiera disuelto. Cada platina fue enfriada a la temperatura ambiente para permitir la cristalización lenta. Para la cristalización se utilizaron mezclas 1:1 de metanol, etanol, alcohol isopropilo y acetonitrilo en agua. Cada sal en todos los cuatro diferentes sistemas de solventes produjo cristales de elsamitrucina. Los cristales de la sal de tosilato de elsamitrucina demostraron birrefringencia bajo luz polarizada plana según lo representado en la figura 1. Ejemplo 5 Aumento proporcional de la recristalización de la sal de p-TSA La recristalización de la sal de p-TSA fue realizada con la evaporación lenta en un tubo de Craig. La sal de p-TSA fue disuelta en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y agua a temperaturas elevadas. Después de la filtración caliente en el tubo de Craig, el solvente de la reacción fue evaporado lentamente, lo que produjo el precipitado. Debajo del microscopio, se observó que el hábitat cristalino tenía forma de aguja. Los cristales fueron aislados por filtración y secados al vacío. Se observó que el materiales transparente a XRD, lo que fue confirmado mediante microscopía. En el análisis de calorimetría de exploración diferencial, el material mostró un derretimiento seguido por la degradación o la cristalización a 183°C y 186°C, respectivamente. El análisis de RMN 1H mostró que la muestra tiene una proporción API a contra-ión (p-TSA) de 1:1. La solubilidad de la sal del p-TSA en agua fue comprobada por HPLC después de agitar la mezcla a la temperatura ambiente durante seis horas. Se encontró que la solubilidad de la sal p-TSA en agua es 15.6 mg/mL (tabla 5, lote # OVL-A-137). La solubilidad de la sal de p-TSA en pH 4 (amortiguador de benzoato) es 14.7 mg/ml (tabla 5, OVL-A-143). Tabla 4 Nota de Conteo Concentración Factor Concentración Sal Concentración laboratorio de la muestra de en el MW (mg/mL) Número de PLC (M) dilución recipiente de lote OVL-A-137 1191856 9.45269E-05 200 0.018905385 825.83 15.612634 OVL-A-143 1126074 8.9459E-05 200 0.017891806 825.83 14.77559 Las sales de elsamitrucina preparadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención fueron probadas en cuanto estabilidad. Dos muestras de la sal aislada del p-TSA (40 mg cada uno) fueron colocadas en un horno al vacío a 75°C durante nueve horas. Después de esta exposición, la muestra #1 fue extraída, la temperatura fue aumentada a 98°C y la segunda muestra fue secada durante la noche. Los datos del RMN demostraron una proporción perfecta 1:1 de la sal, de tal forma que no hubo ninguna descomposición en el de estado sólido durante el secado a temperaturas elevadas. La pérdida de peso por TGA fue de aproximadamente 2.5% para ambas muestras. El análisis de Karl Fischer indicó que las dos porciones todavía tenían agua presente: la muestra #1 tenía un contenido de agua 4.0% y la #2 tenía 4.6%. La sal de p-TSA (16 mg) de elsamitrucina fue disuelta en 1.6 mL del amortiguador de benzoato (pH 4) y se agito a 50°C durante diez días. Las muestras para HPLC y MS fueron tomadas los días 3, 5, y 10. No se encontró ninguna evidencia de producto de la descomposición por MS (pico en 282) o HPLC. Ejemplo 6 Escalación de la formación de sal de HCI La elsamitrucina (mg 200) se disolvió en 1 mL de acetonitrilo/agua (1:1) y se calentó a 75°C dando por resultado una mezcla muy espesa. Una solución de 1 M HCI en agua (0.321 mL, 1.05 eq.) fue agregada a la mezcla para formar una solución clara. La mezcla entonces se enfrió lentamente a la temperatura ambiente a un índice de 25°C/h con agitación muy suave. Después de agitar a la temperatura ambiente durante aproximadamente 6 horas, los sólidos obtenidos fueron aislados por filtración y secados al vació a 50°C y 30 pulgadas de Hg para producir 187.5 el mg (rendimiento de 88.86%) de la sal de HCI. Los análisis de DSC y de XRD confirmaron la naturaleza cristalina de la sal. Ejemplo 7 Actividades inhibitorias del crecimiento in vitro de elsamitrucina y de la sal de tosilato de elsamitrucina. El experimento siguiente confirma que las sales de elsamitrucina preparadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención conservan su actividad antineoplástica in vitro cuando son comparadas con la base de elsamitrucina. El tosilato de elsamitrucina y la elsamitrucina fue probado in vitro usando: B16F10 (murina de pulmón), HCT 1 16 (colon humano), HT29 (colon humanos) y SK-MES-1 (carcinoma humano del pulmón de células no-pequeñas). La inhibición del crecimiento de las células fue evaluada en placas de micro-cultivo con 96 pozos con un análisis semiautomatizado de MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). El carcinoma pulmonar de células no-pequeñas SK-MES-1, células de melanoma de murina B16F10, HCT 1 16 y carcinomas de colon humanos HT29 (colectivamente "cultivas celulares de prueba") fueron mantenidos en RPMI 1640 amortiguado complementado con suero fetal de becerro, antibióticos y otros factores de crecimiento apropiados tales como glutamina. Las células de prueba (1,500-2.000 células/pozo) fueron sembradas en una placa de microcultivo con 96 pozos con un total volumen de 100 µ?_/????. Después de la incubación durante la noche en una incubadora humedecida en 37°C con 5% C02 y 95%aire, las soluciones de elsamitrucina se diluyen a varias concentraciones con RPMI 1640, se agregaron a cada uno de los pozos en un volumen de 100 pl_. La base de elsamitrucina y las soluciones de tosilato de elsamitrucina (soluciones de elsamitrucina) fueron preparadas y almacenadas en un congelador de -20°C. Las soluciones se descongelaron no más que 10 veces durante todo el experimento. Las placas del cultivo celular sembradas con las células de prueba y las diferentes concentraciones de soluciones de elsamitrucina fueron colocadas en una incubadora humedecida a 37°C, con C02 y 95% de aire durante 5-10 días. Las placas entonces fueron centrifugadas brevemente, y 100µ? del medio del crecimiento fueron eliminados. Los cultivos celulares fueron incubados con 50µ? del reactivo MTT (1 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco™) durante 4 horas a 37°C. El precipitado de formazan púrpura resultante fue solubilizado con 200 L de 0.04 N HCI en isopropanol. La absorbencia fue monitoreada a una longitud de onda de 595 nm, y a una longitud de onda de la referencia de 650 nm, usando un lector del mocroplacas TECAN® GENios. En todos los experimentos, los datos de la absorbencia fueron adquiridos para cada agente en dos rangos de concentración traslapados. En la mayoría de los casos, el estudio fue repetido usando rangos de concentración más amplios.

Los resultados de cada prueba fueron almacenados e importados en PRISM® 3.03 para el análisis gráfico y la determinación de los valores IC50. Todos los resultados fueron representados gráficamente como porcentaje de la absorbencia controlada contra la concentración del fármaco. Los valores IC50 fueron estimados con PRISM® 3.03 usando análisis de regresión no linear para adaptar los datos a la curva sigmoidea de la respuesta a la dosis descrita por la ecuación cuatro-logística siguiente: Superior - Inferior Y = + Inferior 1 + (X/IC50)n Superior es el porcentaje máximo de la absorbencia de control, la parte inferior es el porcentaje mínimo de la absorbencia del control a la concentración más alta del agente, Y es la absorbencia observada, X es la concentración del agente, IC50 es la concentración de agente que inhiba crecimiento de la célula por el 50% comparado a las células del control, y n es la pendiente de la curva. La tabla 4 muestra que la sal de elsamitrucina y el tosilato de elsamitrucina posee esencialmente el mismo efecto antiproliferativo sobre las variedades de células probadas. Así según lo mostrado en la figura 4, las sales de elsamitrucina hechas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención se puede esperar que tengan una actividad antineoplástica in vivo equivalente o superior a las composiciones terapéuticas hechas usando base de elsamitrucina solas. El tosilato de elsamitrucina presenta un IC50 que esté dentro de preferiblemente aproximadamente el 20%, más preferiblemente aproximadamente el 15% y lo más preferiblemente aproximadamente el 10% de una cantidad similar de una base de elsamitrucina. TABLA 5: Actividades inhibitorias del crecimiento in vitro de la sal de elsamitrucina y de elsamitrucina p-TSA contra el carcinoma de pulmón humano de células no-pequeñas SK-MES-1. Melanoma de murina B16F10 y células de carcinoma de colon humano HCT 1 16 y HT29.

A menos que se indicará lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, las características tales como peso molecular, las condiciones de la reacción, y así sucesivamente usadas en la especificación y las reivindicaciones debe entenderse que son modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos dispuestos en la especificación siguiente y las reivindicaciones anexas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las características deseadas que se pretende sean obtenidas por la presente invención. Por lo menos, y sin pretender limitar el uso de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico se debe por lo menos interpretar a la luz del número de dígitos significativos descritos y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. A pesar de que eso los rangos y los parámetros numéricos que disponen el alcance amplio de la invención son aproximaciones, los valores numéricos dispuestos en los ejemplos específicos se describen de la forma más exacta posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, intrínsecamente contiene ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas medidas de prueba los términos un y una y el, la y referencias similares usadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) debe ser interpretado para cubrir el singular y el plural, a menos que se indicase lo contrario aquí o claramente por el contexto. La indicación de rangos de valores simplemente se considera que sirve como método corto para referirse individualmente a cada uno de los valores separados que caen dentro de la gama. A menos que se indicase aquí lo contrario, cada valor individual se incorpora en la especificación como si fuera descrito individualmente aquí. Todos los métodos descritos aquí se pueden realizar en cualquier orden conveniente a menos que se indicase lo contrario aquí o de otra manera claramente por el contexto. El uso de cualesquiera y de todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo "tal como") se pretende que simplemente ilustre mejor la invención y no plantee una limitación en el alcance de la invención reclamada de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación se debe interpretar como indicación de cualquier elemento esencial para la práctica de la invención y que no haya sido reivindicado. Las agrupaciones de elementos alternativos o modalidades de la invención descrita aquí no deben ser interpretadas como limitaciones. Cada miembro del grupo puede ser referido y ser reclamado individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo o de otros elementos encontrados aquí. Se prevé que uno o más miembros de un grupo pueden ser incluidos, o suprimidos de, un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando ocurre cualquier inclusión o cancelación, se considera que la especificación contiene al grupo modificado satisfaciendo así la descripción escrita de cualesquiera y todos los grupos de arkush usados en las reivindicaciones anexas. Las modalidades preferidas de esta invención se describen aquí, incluyendo el mejor método conocido por los inventores para realizar la invención. Por supuesto, las variaciones en esas modalidades preferidas llegarán a ser evidentes para aquellos con experiencia en la técnica después de la lectura de la descripción precedente. Los inventores esperan que los expertos empleen las variaciones tales de la forma apropiadas, y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera a la descrita específicamente aquí. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema descrito en las reivindicaciones anexas según lo permitido por ley aplicable. Por otra parte, cualquier combinación de los elementos descritos antes en todas las variaciones posibles es abarcada por la invención a menos que se indicase lo contrario aquí o de otra manera claramente por contexto. Además, se han hecho referencias a las patentes y a las publicaciones impresas en esta descripción. Cada una de las referencias arriba citadas y las publicaciones impresas aquí son incorporadas individualmente por la referencia en su totalidad. Finalmente, debe ser entendido que las modalidades de la invención descrita aquí son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden ser empleadas están dentro del alcance de la invención. Así, a modo de ejemplo, pero no de la limitación, las configuraciones alternativas de la presente invención se pueden utilizar de acuerdo con las presentes enseñanzas. Por consiguiente, la presente invención no se limita precisamente a lo que se muestra y se describe.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1. Una sal sólida estable de elsamitrucina.
2. 2. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 1 en la cual el contra-ión se selecciona del grupo que consiste de lactato, fumarato, maleato, succcinato, tartrato, tosilato, metanosulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato y fosfato.
3. 3. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 2 en la cual la sal de elsamitrucina es succcinato de elsamitrucina.
4. 4. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 2 en la cual la sal de elsamitrucina es tartrato de elsamitrucina.
5. 5. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 2 en la cual la sal de elsamitrucina es tosilato de elsamitrucina.
6. 6. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 2 en la cual la sal de elsamitrucina es salicilato de elsamitrucina.
7. 7. La sal sólida estable de elsamitrucina según la reivindicación 2 en la cual la sal de elsamitrucina es sulfato de elsamitrucina.
8. 8. Una formulación parenteral que incluye por lo menos una sal sólida estable de elsamitrucina seleccionada del grupo que consiste de lactato, fumarato, maléate, succcinato, tartrato, tosilato, metansulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato y fosfato.
9. 9. La formulación parenteral según la reivindicación 8 que además incluye un portador farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste de agua para inyección, solución salina y solución salina amortiguada con fosfato.
10. 10. La formulación parenteral según la reivindicación 8 en la cual la sal de elsamitrucina es succcinato de elsamitrucina.
11. 11. La formulación parenteral según la reivindicación 8 en la cual la sal de elsamitrucina es tartrato de elsamitrucina.
12. 12. La formulación parenteral según la reivindicación 8 en la cual la sal de elsamitrucina es tosilato de elsamitrucina.
13. 13. La formulación parenteral según la reivindicación 8 en la cual la sal de elsamitrucina es salicilato de elsamitrucina.
14. 14. La formulación parenteral según la reivindicación 8 en la cual la sal de elsamitrucina es sulfato de elsamitrucina.
15. 15. Un método para tratar una enfermedad neoplástica en un mamífero que incluye: proporcionar una formulación parenteral de elsamitrucina que contenga por lo menos una sal sólida estable de elsamitrucina seleccionada del grupo que consiste de lactato, fumarato, maleato, succcinato, tartrato, tosilato, metanosulfonato, benzoato, salicilato, clorhidrato, sulfato y fosfato; y administrar la formulación parenteral de elsamitrucina intravenosamente.
16. 16. El método según la reivindicación 15 en la cual la etapa consiste en proporcionar una formulación parenteral que consiste esencialmente de tosilato de elsamitrucina, un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente por lo menos un excipiente aceptado farmacéuticamente.
17. 17. El método según la reivindicación 15 en la cual la enfermedad neoplástica es linfoma no de Hodgkin recaído o refractario.
18. 18. Una formulación parenteral que incluye tosilato de elsamitrucina y un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente por lo menos un excipiente aceptado farmacéuticamente.
19. 19. Una sal cristalina sólida estable del tosilato de elsamitrucina.
20. 20. Una sal cristalina sólida estable de mesilato de elsamitrucina.
21. 21. Una sal cristalina sólida estable de clorhidrato de elsamitrucina.